Potencial anti-inflamatório e antioxidante do Heparinoide isolado do camarão Litopenaeus vannamei

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

BÁRBARA MONIQUE DE FREITAS VASCONCELOS

POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTIOXIDANTE DO

HEPARINOIDE ISOLADO DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei

NATAL

2018

BÁRBARA MONIQUE DE FREITAS VASCONCELOS

POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTIOXIDANTE DO

HEPARINOIDE ISOLADO DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei

Dissertação apresentada ao

Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Orientadora: Profª Drª Suely Ferreira Chavante

Co-orientadora: Profª Drª Monique Gabriela das Chagas Faustino Alves

NATAL

2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências – CB

Vasconcelos, Bárbara Monique de Freita.

Potencial anti-inflamatório e antioxidante do Heparinoide isolado do camarão Litopenaeus vannamei / Bárbara Monique de Freitas Vasconcelos. - Natal, 2018.

59 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em

Bioquímica.

Orientadora: Profa. Dra. Suely Ferreira Chavante. Coorientadora: Profa. Dra. Monique Gabriela das Chagas Faustino Alves.

1. Glicosaminoglicanos - Dissertação. 2. Espécies Reativas - Dissertação. 3. Heparina - Dissertação. 4. Citocinas -

Dissertação. 5. Inflamação - Dissertação. I. Chavante, Suely Ferreira. II. Alves, Monique Gabriela das Chagas Faustino. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 547.459.5

BÁRBARA MONIQUE DE FREITAS VASCONCELOS

POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTIOXIDANTE DO

HEPARINOIDE ISOLADO DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei

Dissertação apresentada ao

Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Dedico esta obra

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelas oportunidades que me foram dadas na vida, principalmente por ter conhecido pessoas e lugares interessantes, mas também por ter vivido fases

difíceis, que foram matérias-primas de aprendizado.

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) por gerar oportunidades aos alunos potiguares formando grandes profissionais.

Ao Departamento de Bioquímica e Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular pela infra-estrtura e excelentes professores sempre solícitos a

auxiliar na formação dos alunos.

À minha orientadora Suely Ferreira Chavante pela dedicação, paciência e ensinamentos comigo. A aprendizagem ao seu lado foi significativa para minha vida

acadêmica e pessoal. O seu comprometimento com a pesquisa e a academia são inspiradores. Meu muito obrigado por tudo!

Á minha co-orientadora Monique Gabriela pelo auxílio no desenvolvimento da pesquisa.

Aos professores do DBQ por todos os conhecimentos transmitidos durante o curso.

À A minha mãe, Josenita, por ter me dado a oportunidade de estar aqui nunca deixar-me sentir ausência de afeto. Pelo amor incondicional, carinhos, conselhos e

amizade e determinação que serviram de inspiração para mim. Te amo! A minha tia e mãe, Goretti, sempre me buscando na escola, me vestindo, me dando

carinho e amor. Seus incentivos e exemplos foram fundamentais na minha formação.

Aos meus parentes de forma geral, pelo carinho e apoio na minha formação. Em especial a Tia Fatinha por toda ajuda e acolhimento neste período.

Aos colegas e amigos do GAGs, Isabella, Mirella, Arlen Matheus pela ajuda nos experimentos e companhia.

À Lais Palhares, pela amizade, carinho e profissionalismo. Toda ajuda pessoal e profissional que me destes foram essenciais a conclusão deste trabalho, obrigado

por tudo!

Ao colegas de pós-graduação pelo apoio, em especial a Jefferson pelo auxílio nos experimento.

Aos amigos natalenses, vocês foram o meu porto seguro neste período, me fizeram sentir parte de uma família. Meu muito obrigado.

Aos amigos mossoroenses, Ivo, Caio, Rafael, nosso quarteto foi separado fisicamente, mas o sentimento e o carinho sempre permaneceram. A todos que de forma direta ou indireta permitiram a realização desta pesquisa.

“Quando a educação não é libertadora, o sonho do oprimido é ser opressor!”

Paulo Freire #ELENÃO #ELEJAMAIS

POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTIOXIDANTE DO HEPARINOIDE ISOLADO DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei

RESUMO

A resposta inflamatória é um processo de defesa do organismo, contudo sua atuação exacerbada gera um desequilíbrio, fazendo-se necessário o uso de compostos anti-inflamatórios. Entretanto, devido aos efeitos colaterais causados pelo uso prolongado desses medicamentos, tem-se intensificado a busca por novas moléculas que modulem a inflamação. CNOSiderando que um heparinoide previamente isolado do camarão Litopenaeus vannamei tem demonstrado capacidade de interferir em diferentes etapas da inflamação, foi despertado o nosso interesse em avaliar o efeito desse composto sobre a produção de citocinas e metabólitos reativos, os quais estão elevados durante o processo inflamatório. Para isso, avaliamos a migração leucocitária e os níveis de citocinas em modelo de peritonite induzida por LPS. Em seguida, investigamos a citotoxicidade do composto, produção de óxido nítrico e espécies reativas intracelular em macrófagos induzidos por LPS. Por fim, realizamos a os testes antioxidantes, determinando a quelação de íon ferroso, bem como a inibição das espécies reativas, ânion superóxido e radical hidroxil. Além disso, avaliamos a peroxidação lipídica e o radical DPPH. Os resultados de purificação mostraram que o heparinoide, denominado HL-GAG foi extraído de forma eficiente. O composto também reduziu 50% da migração leucocitária, ao sítio de injúria, além de reduzir os níveis de todas as citocinas testadas, com destaque para o TNF-α que apresentou uma redução de 57%. O HL-GAG manteve a viabilidade celular em 90%, mesmo na maior concentração (100µg/mL), reduziu a produção de óxido nítrico, e das espécies reativas intracelular, sugerindo uma possível atuação antioxidante. Nos ensaio de quelação de íon ferroso, o HL-GAG reduziu os níveis deste íon em 48% a 100µg/mL. O composto também diminuiu a produção de ânion superóxido e radical hidroxil. Na peroxidação lipídica, o HL-GAG inibiu cerca de 58% da oxidação de lipídios, na menor concentração testada (25 µg/mL). Com relação ao DPPH, o HL-GAG apresentou uma redução de 70% aproximadamente na menor concentração. Portanto, podemos sugerir que o HL-GAG estaria modulando a resposta inflamatória via citocinas e mecanismos antioxidantes.

Palavras-chave: Glicosaminoglicanos, espécies reativas, inflamação, citocinas, heparina

POTENTIAL ANTIOXIDANT AND ANTI-INFLAMMATORY OF HEPARINOID ISOLATED SHRIMP Litopenaeus vannamei

ABSTRACT

The inflammatory response is a process of defense of the organism, however its exacerbated action generates an imbalance, making necessary the use of anti-inflammatory compounds. The search for new molecules that act on the anti-inflammatory and antioxidant response has intensified. In this scenario, HL-GAG, purified from shrimp has demonstrated ability to modulate various processes of the inflammatory response, an interest in evaluating the production of cytokines and the reactive metabolites has arise, since these molecules have their production increased during the process inflammatory. For this, we evaluated the leukocyte migration and the levels of cytokines in a model of peritonitis induced by LPS. Then, we investigated a compound cytotoxicity, nitric oxide production and intracellular reactive species in LPS-induced macrophages. Lastely, by performing the antioxidants of the testes, determining a chelation of ferrous ions, as well as an inhibition of reactive species, superoxide anion and hydroxyl radical. In addition, we evaluated lipid peroxidation and radical DPPH. The purification results related to HL-GAG were extracted efficiently. The compound also reduced the leukocyte rate by 50%, to the injury site. In addition to reducing the levels of all cytokines tested, with emphasis on TNF-α, which decreased by 57%. HL-GAG maintained 90% cell viability, even at the highest concentration (100 μg/mL), reduced the production of nitric oxide, and intracellular reactive species, suggesting an antioxidant action. In the ferrous ion chelation test, HL-GAG reduced the levels of this ion by 48% at 100 μg/mL. The compound also decreased the production of superoxide anion and hydroxyl radical. In lipid peroxidation, HL-GAG inhibited about 58% of lipid oxidation at the lowest concentration tested (25 μg/mL). With respect to DPPH, HL-GAG showed a reduction of approximately 70% in the lowest concentration. Therefore, we may suggest that HL-GAG would be modulating the inflammatory response via cytokines and antioxidant mechanisms.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Rolamento Leucocitário... 14

FIGURA 2. Unidade Dissacarídea da heparina... 19

FIGURA 3. Camarão Litopenaeus vannamei... 23

FIGURA 4. Processo de extração de glicosaminoglicanos do cefalotórax do camarão... 24

FIGURA 5. Processo de fracionamento dos GAGs isolados do camarão... 25

FIGURA 6. Processo de purificação do heparinóide extraído do camarão... 26

FIGURA 7. Perfil eletroforético das frações obtidas após fracionamento... 32

FIGURA 8. Purificação do GAG... 33

FIGURA 9. Contagem total de leucócitos... 34

FIGURA 10. Contagem diferencial de leucócitos... 35

FIGURA 11. Produção de citocinas estimuladas por LPS em camundongos C57BL/6... 36

FIGURA 12. Viabilidade celular... 37

FIGURA 13. Produção de óxido nítrico... 38

FIGURA 14. Avaliação das espécies reativas intracelular... 39

FIGURA 15. Avaliação do potencial de quelação de ferro... 40

FIGURA 16. Avaliação do sequestro do radical superóxido... 41

FIGURA 17. Avaliação do sequestro do radical hidroxil... 42

FIGURA 18. Avaliação da peroxidação lipídica... 43

SUMÁRIO 1 – Introdução... 13 2 – Objetivos...22 3 – Materiais e Métodos...23 4 – Resultados...32 5 – Discussão...45 6 – Conclusões... 50 7 – Referências... 51

1 INTRODUÇÃO

A inflamação é um processo de defesa do organismo contra dano traumático, infeccioso, tóxico ou autoimune, que cNOSiste em uma ação intrincada, altamente regulada e coordenada de várias moléculas e tipos celulares. Esse processo é importante na remoção de microrganismos ou irritantes, e na potencialização do reparo tecidual, promovendo cura e recuperação do tecido (KUMAR et al., 2005). Desta forma, quando devidamente regulada, a inflamação tem a função de defender o organismo e recuperá-lo após remoção do agressor.

O processo inflamatório apresenta diversas etapas, sendo o recrutamento leucocitário uma característica essencial da resposta inflamatória. Essa etapa, no qual os leucócitos migram do sangue ao sítio de injúria, através do endotélio é chamado de diapedese, tendo início com a ligação e rolamento dos leucócitos ao endotélio vascular, firme aderência ao vaso, degradação da membrana basal e, por fim, migração da célula de defesa ao tecido lesado (Figura 1) (ASHLEY et al., 2012). Diversas moléculas regulam esse extravasamento celular, como membros das famílias das selectinas (L-, P- e E- selectinas) são essenciais à adesão dos leucócitos ao endotélio.

As moléculas de selectinas reconhecem em seus ligantes regiões relacionadas ao sialil LewisX_{. A ligação envolve a participação de resíduos sulfatos e} diminui a velocidade do fluxo dos leucócitos, proporcionando o rolamento pelo endotélio (WANG et al., 2002). As células endoteliais ativadas pela exposição à trombina, histamina ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) expressam P-selectina em sua superfície, que irão reconhecer seus ligantes, iniciando o processo de rolamento. A L-selectina é expressa constitutivamente nos leucócitos e interage com o heparam sulfato (HS) das células endoteliais. A E- selectina é expressa pelas células do endotélio quando ativadas (YOUNG, 2008). Essas ligações favorecem a redução da velocidade no fluxo de leucócitos pelos vasos, ocasionando sua ativação que, por sua vez, proporciona a expressão das integrinas, permitindo uma melhor fixação a parede endotelial e migração ao local da inflamação (YOUNG, 2008). Outras moléculas de adesão também estão associadas à fixação do leucócito à parede do vaso, como as moléculas de adesão vascular (VCAM-1) e moléculas de adesão intracelular (ICAM-1).

Figura 1. Rolamento leucocitário. Fonte: Adaptado de ASHLEY, 2012.

Para que o leucócito migre ao tecido danificado, é necessária a degradação proteolítica de alguns componentes da matriz extracelular, a qual é realizada principalmente pelas enzimas elastase e metaloproteinases de matriz (MMPs) (WILD et al., 2017). As MMPs são endopeptidases dependentes de cálcio e zinco que apresentam diversas funções no processo inflamatório, dentre elas a degradação da matriz. Essas enzimas são produzidas por células estruturais, como fibroblastos, células endoteliais e por células inflamatórias, como macrófagos e neutrófilos. A MMP-2 e MMP-9 são cruciais neste papel de degradação, sendo portanto, enzimas centrais na migração leucocitária (WILD et al., 2017). A elastase é secretada por neutrólfilos, degrada basicamente a elastina, um componente da matriz extracelular (BIHLET et al., 2017).

Além dos componentes da matriz extracelular, outras proteínas envolvidas no processo inflamatório são alvos de MMPs e elastase. Estudos demonstram que essas enzimas são responsáveis pela ativação de algumas citocinas, como a interleucina 1β (IL-1β) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (LEE et al., 2015, VICTONI et al., 2016). A MMP-2, MMP-3 e MMP-9 clivam e ativam o precursor da IL-1β; além disso, clivam o proTNF-α (precursor do TNF-α) que está associado à membrana, tornando-o solúvel (LEE et al., 2015).

As citocinas são pequenos peptídeos liberados por células que possuem um efeito específico na interação e comunicação entre determinadas células, podem

agir de forma autócrina, parácrina ou endócrina. Essas proteínas são produzidas por diversas células, sendo os linfócitos T auxiliares e os macrófagos seus principais produtores (WIESELER-FRANK, 2004). As citocinas podem ser classificadas como pró-inflamatórias, aquelas que ativam as células efetoras da inflamação e estimulam a liberação de mediadores inflamatórios, como as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs respectivamente); e anti-inflamatórias, aquelas citocinas que regulam respostas pró-inflamatórias (HUSAIN et al., 2015).

Entre as citocinas pró-inflamatórias, a IL-1β, TNF-α e IL-6 são as principais reguladoras da resposta inflamatória, sendo responsáveis pela adesão leucocitária, quimiotaxia e produção de outros mediadores inflamatórios (WRIGHT, 2010). A IL-1 é a citocina central da inflamação e apresenta duas formas: IL-1β que é sua forma secretada e IL-1α que é expressa na membrana. A IL-1β é responsável pelos sintomas da inflamação, como dor e febre, recrutamento neutrofílico, ativação de linfócitos, além de induzir a expressão de outros mediadores pró-inflamatórios, como TNF-α, IL-8, IL-10, a própria IL-1 e IL-6 (MASTERS et al., 2010).

A IL-6 é outra citocina pirogênica (causa febre), sendo responsável pela proliferação e diferenciação de células T e B, tornando esta última, uma célula secretora de anticorpo. Além disso, atua diferenciando células mielóides em macrófagos. Essa citocina induz a transcrição de fatores associados a várias vias metabólicas em resposta à inflamação e ainda participa ativamente de processos da inflamação crônica, pois a elevação de seus níveis está associada a artrite reumatoide e diabetes (SRIRANGAN et al., 2015). A IL-6 é secretada por macrófagos e monócitos em resposta a estímulos de outras citocinas como IL-11 e TNF-α (HUSAIN et al., 2015).

Com relação ao TNF-α, esta citocina é responsável pela ativação dos linfócitos, estimulação da liberação de enzimas proteolíticas por macrófagos e produção de outras proteínas pró-inflamatórias, como IL-6 e IL-13. Apesar de ser liberada majoritariamente por macrófagos, outras células, como linfócitos T, células tumorais e neutrófilos, também sintetizam esta citocina. Além disso, a produção de TNF-α está diretamente relacionada ao aumento de óxido nítrico (NO) na célula (FALEIRO, 2011).

O TNF-α é responsável por ativar a enzima óxido nítrico sintase induzível (NOSi) que produz o NO (NANDI et al., 2010). O mecanismo pelo qual a NOSi é ativada, não é completamente conhecido, contudo estudos indicam que o TNF-α

ativaria o fator de transcrição NF-kB, que por sua vez seria o responsável por promover a ativação da expressão da NOSi. Esta enzima quando ativada, induz a produção de ON pelas células, principalmente os macrófagos (BOGDAN et al., 2015). A NOSi, através da oxidação da L-arginina, produz NO, que é uma ERN (BOGDAN et al., 2015). Este é um metabólito reativo e, uma vez liberado no citoplasma, é responsável por elevar a permeabilidade de membranas intracelulares e promover a liberação de outras espécies reativas, como o ânion superóxido e radical hidroxil, que são EROs (JAKUBOWSKA et al., 2016).

As EROs e ERNs são formadas por diversas vias metabólicas. Na mitocôndria, vias de redução do oxigênio são capazes de produzir EROs e ERNs em um processo conhecido como “burst” respiratório, que ocorre durante a respiração celular. Outra forma de produção destas espécies se dá através da ação das células do sistema imune, que ao serem ativadas tornam-se capazes de converter oxigênio molecular em espécies reativas (DUQUE, DESCOTEAUX, 2014).

Essas EROs estão envolvidas em diversos processos biológicos, desde a respiração, sinalização e processos de defesa do organismo, como a inflamação. O oxigênio, devido à sua própria configuração, tende a receber um elétron de cada vez e formar compostos intermediários altamente reativos, destacando-se o radical ânion superóxido (O2•–) e o radical hidroxil (OH•) (BARREIROS et al., 2006).

O ânion O2•– é gerado pela redução do oxigênio molecular (O2) através de uma catálise enzimática realizada pela NADPH oxidase, xantina oxidase ou pela cadeia transportadora de elétrons da mitocôndria (MITTAL et al., 2014). O O2•– tem importantes funções nos processos biológicos. Ele é responsável por defesa do organismo contra microrganismos invasores, sendo gerado por células de defesa do nosso organismo, principalmente os macrófagos durante a resposta inflamatória. Além disso, funciona como sinalizador molecular por meio da sua capacidade de oxidar grupos -SH em ligações dissulfeto, podendo ativar e desativar enzimas que contenham cisteína (SILVA, 2014). Quando em solução aquosa, ele é dismutado, produzindo uma molécula de peroxido e outra de oxigênio. Esse processo é acelerado na presença da enzima superóxido dismutase (SOD) (SILVA, 2014).

Na presença de íon férrico (Fe3+_{), o ânion O}

2•– é convertido a O2, produzindo o íon ferroso (Fe2+_{), reação conhecida como Haber-Weiss. Esse Fe}2+ _{interage com o} peróxido de hidrogênio convertendo essa espécie reativa em OH•, OH- _{e Fe}3+

(Reação de Fenton) (MITTAL et al., 2014). Dessa forma, ocorre a formação de um ciclo, culminando sempre na produção de mais espécies reativas, como o radical OH• que é formado pela reação de Fenton, sendo o mais deletério ao organismo e, devido a sua meia-vida muito curta dificilmente pode ser sequestrado in vivo. Este radical está associado ao ataque de moléculas por abstração de hidrogênio e por adição a insaturações. Contudo, pode facilmente ser sequestrado in vitro por inúmeras moléculas devido à sua alta reatividade (FORRESTER et al., 2018).

O OH• causa danos a várias biomoléculas e estruturas celulares (DNA, RNA, proteínas, lipídios e membranas celulares). Esse metabólito reativo, ataca a cadeia lipídica em sítios susceptíveis, convertendo-o em novo centro de radical livre. O carbono radicalar facilmente adiciona oxigênio, gerando o radical lipídio-peroxila, processo conhecido como peroxidação lipídica (SILVA, 2014). Este é um processo no qual as ERO agridem os ácidos graxos polinsaturados dos fosfolipídeos das membranas das células, desintegrando-as e gerando desequilíbrio a célula, sendo um importante mecanismo na resposta inflamatória aguda, pois gera a eliminação do patógeno invasor (LATUNDE-DADA, 2017). O OH• é conhecido na literatura como iniciador da peroxidação lipídica, mas estudos tem demonstrado que os íons de ferro desempenham papel importante neste processo, seja pela reação de Fenton ou na catálise da própria peroxidação convertendo hidroperóxidos lipídicos (LOOH) em radicais altamente reativos (alcoxila, LO. _{e peroxila, LOO}._{), que por sua vez, iniciam} nova cadeia de reações (LATUNDE-DADA, 2017).

De forma geral, essas espécies reativas são importantes no processo inflamatório, pois auxiliam na destruição do micro-organismo invasor ao destruir suas membranas, levando a um colapso celular. Além disso, estudos tem associado as EROs e ERNs à ativação do fator de transcrição NF-kB (FORRESTER et al., 2018).

O fator NF-kB apresenta função essencial na fisiologia normal do organismo. No entanto, sua elevada expressão deste fator pode implicar na patogenicidade de vários processos, incluindo a inflamação (HEYNINCK et. al., 2003). A produção de metabólitos reativos de oxigênio por macrófagos durante a injúria tecidual e/ou invasão de microorganismos ativa o fator NF-kB, que contribui na expressão de várias moléculas pró-inflamatórias, dentre elas as citocinas relacionadas à ativação da resposta inflamatória aguda (FORRESTER et. al., 2018). Desta forma, é evidente que o processo inflamatório é um ciclo e os metabólitos reativos são capazes de se propagar e manter a resposta inflamatória.

Deste modo, o papel das citocinas e metabólitos reativos está intimamente relacionado durante a resposta inflamatória. As citocinas são essenciais na sinalização das células de defesa, culminando na ativação de respostas intracelulares, como a produção de EROs e nitrogênio, principalmente em macrófagos e neutrófilos.

Embora essas respostas sejam importantes para a defesa do nosso corpo, elas precisam ser eficientemente reguladas para evitar o desenvolvimento de doenças inflamatórias, como peritonite ou sepse. A peritonite pode ser desencadeada por diversas causas, como complicações no pós-operatório ou até mesmo manifestação espontânea, no caso de pacientes cirróticos. Essa inflamação é uma das respostas agudas mais graves do leito hospitalar, podendo se desenvolver e tornar-se uma resposta inflamatória sistêmica, levando o paciente à morte (COELHO, 2013).

Quando ocorre uma resposta exagerada, é necessário o uso de fármacos anti-inflamatórios. Dentre esses fármacos, os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) são muito utilizados na clínica para o controle do processo inflamatório. Entretanto, o uso prolongado desses medicamentos causa efeitos colaterais graves, como anemia ferropriva, úlceras gástricas, toxicidade hepática e renal, bem como hemorragias no trato gastrointestinal. Portanto, a busca por compostos naturais que sejam capazes de modular a resposta inflamatória e apresentem menores efeitos colaterais, tem se intensificado.

Neste cenário, estudos tem mostrado que a heparina (HEP), um glicosaminoglicano presente nos tecidos de vertebrados e invertebrados, apresenta elevado potencial anti-inflamatório. Esse composto é reconhecido pela sua atividade anticoagulante muito bem definida, tendo seu uso clínico bastante difundido. Estruturalmente, é formado por unidades alternadas de glicosamina N-sulfatados e ácido urônico, este podendo alternar entre ácido glicurônico ou idurônico. A glicosamina pode ainda ser sulfata nas posições C-6 e mais raramente em C-3; no caso do ácido urônico, pode haver a presença de grupos 2-O-sulfato (Figura 2). Além disso, a heparina possui a maior quantidade de cargas negativas, tendo um grau de sulfatação médio de 2.5 (DREYFUSS et al., 2009). Devido a essa estrutura, tem apresentado várias aplicações biotecnológicas (KAMHI et al., 2013; CASU et al., 2015).

Figura 2: Principal unidade dissacarídica da heparina. Fonte: Bioinfo/UFC.

Além de ser usada no tratamento e prevenção de distúrbios tromboembolísticos devido ao seu potencial anticoagulante, diversos estudos mostraram que a heparina inibe várias etapas do processo inflamatório. Dentre elas, a heparina consegue reduzir a migração leucocitária in vitro e in vivo, principalmente por interagir com as selectinas; o que tem sido atribuído à presença de sulfatos na estrutura do GAG (WANG et al., 2002; YOUNG, 2008). Além disso, também reduz a expressão de MAC-1 e ICAM-1, moléculas essenciais à forte adesão do leucócito ao endotélio. Estudos demonstram que a heparina é capaz de reduzir a atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) e elastases (BRITO et al., 2008 e COELHO, 2013). Isso evidencia, que a heparina é capaz de modular a diapedese, reduzindo a migração de leucócitos ao tecido lesado.

Entretanto, esta não é a única atuação da heparina na inflamação, a HEP também reduz a produção de citocinas pró-inflamatórias. Estudos mostram que essa molécula é capaz de reduzir os níveis de IL-1β, TNF-α e IL-6, por vários mecanismos (LI et al., 2015). A heparina pode inibir a translocação do fator NF-κB para o núcleo, impedindo que o mesmo ative a transcrição os genes para produção das citocinas (THOURANI et al., 2000; HOCHART et al., 2006). Além disso, esse composto pode se ligar às próprias citocinas, impedindo-as de se ligar aos receptores celulares e, dessa forma, não há sinalização (KOLLER et al., 2001). A redução dos níveis de citocina pela modulação da caveolina-1 ainda não possui mecanismo conhecido (LIU et al., 2015). A heparina também reduz a molécula midkine (MK) importante no

recrutamento de leucócitos, por induzir a produção de quimiocinas e atuar como quimiotático para neutrófilos (WECKBACH et al., 2011). Além de atuar inibindo as citocinas, a heparina também é capaz de reduzir os níveis de EROs e ERNs das células. A heparina consegue interagir com NOSi e inativá-la, reduzindo a produção de NO nos macrófagos e neutrófilos (MU et al., 2012; HASSANIN et al., 2014). Além disso, o GAG reduz a produção de Fe2+_{, ânion superóxido e radical hidroxil,} culminando na redução da peroxidação lipídica (MUSATOV et al., 2013). Alguns miméticos da heparina, como a enoxaparina (heparina de baixo peso molecular) também são capazes de reduzir a peroxidação lipídica (MANDUTEANU et al., 2003; ETTELAIE et al., 2011; SHAKER et al., 2018).

Apesar do grande potencial anti-inflamatório da heparina, sua utilização ainda é limitada devido a sua potente ação anticoagulante e capacidade de interferir no equilíbrio hemostático, levando ao desenvolvimento de quadros hemorrágicos sérios (WANG et al., 2002). Diante disso, tem-se buscado moléculas que mimetizem estruturalmente a heparina, mantendo sua aplicação biotecnológica, porém com reduzidos efeitos colaterais.

Em meio a esse cenário, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado à caracterizar a estrutura de diferentes GAGs para a prospecção de suas atividades biológicas. O primeiro GAG purificado e caracterizado estruturalmente do cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei foi uma molécula muito semelhante à heparina, um heparinoide denominado HL-GAG (BRITO et al., 2008; CHAVANTE et al., 2014). O HL-GAG apresenta uma maior proporção de unidades dissacarídicas dissulfatadas (glucosamina N,6-O sulfato ligado ao ácido glicurônico) em relação à heparina. Além disso, como uma elevada quantidade de 3-O sulfatação nos resíduos de glicosamina. A massa molecular 36 kDa do HL-GAG foi determinado pela cromatografia por exclusão de tamanho de alta performance (HP-SEC) (CHAVANTE et al., 2014). Com relação as bioatividades, o HL-GAG apresentou potencial anticoagulante, com reduzidos efeitos sobre a hemostasia (BRITO et al., 2008). Além disso, esse composto apresentou potencial anti-inflamatório, reduzindo o recrutamento leucocitário, diminuindo a atividade de MMPs e elastase, enzimas importantes na migração e sinalização, pois atuam degradando a matriz extracelular e ativam citocinas (BRITO et al., 2008; COELHO, 2013). O HL-GAG também é capaz de interagir com fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), fator transformador de crescimento beta (TGF-β), ambos fatores de crescimento,

indicando que o composto atua na última fase do processo inflamatório, o reparo tecidual (DREYFUSS et al., 2010).

Diante das evidências das atividades biológicas do HL-GAG e, o presente trabalho mostra uma abordagem experimental para investigar o efeito do HL-GAG e sobre a migração leucocitária em modelo de peritonite induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e a ação deste composto sobre alguns mediadores envolvidos na resposta inflamatória, tais como TNF-α, IL-1β, IL-6, óxido nítrico e algumas espécies reativas de oxigênio.

2 – OBJETIVOS 2.1 - Geral

Avaliar o efeito do HL-GAG sobre a migração de leucócitos, produção de citocinas e metabólitos reativos de oxigênio e nitrogênio em microambiente de inflamação.

2.2 - Específicos

Obter o HL-GAG do cefalotórax do camarão Litopaneaus vannamei;

Avaliar seu efeito sobre a migração leucocitária em modelo de peritonite aguda induzida por LPS;

Verificar o efeito do HL-GAG sobre a produção de citocinas pró-inflamatórias; Investigar o efeito do HL-GAG sobre a produção do oxido nítrico;

3- MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 – Cultura de Células e Animais

Macrófagos murinos (RAW 264.7) cultivados em meio de cultura Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen, San Diego, CA, USA), contendo 10% de soro fetal bovino (Cultilab, Campinas, SP, Brazil) e antibióticos, foram mantidos a 37°C, 5% de CO2. Toda a cultura foi realizada em fracos estéreis (Sarsterd).

Camundongos machos da linhagem C57BL/6 provenientes do Biotério da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte foram utilizados para os ensaio de inflamação em modelo de peritonite. Todos os animais foram mantidos com livre acesso à água e alimentos, em condições controladas de iluminação (ciclos de 12 horas claro/escuro) e temperatura (22°C). Os experimentos realizados com esses animais foram previamente aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da mesma universidade (Protocolo N° 003/2018).

3.2 - Material Biológico Camarão Litopenaeus vannamei

O material biológico utilizado como matéria prima para extração do polissacarídeo foi o cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei (Figura 3), conhecido como camarão branco do pacífico. O material foi cedido pela empresa Enseg Indústria Alimentícia LTDA, localizada na BR 304, Macaíba-RN, sendo mantido sob refrigeração até seu processamento.

Figura 3: Camarão Litopenaeus vannamei.

3.3 – Extração dos glicosaminoglicanos sulfatados de Litopenaeus vannamei.

Para obtenção do HL-GAG, inicialmente foi realizada a extração dos GAGs, conforme Brito e colaboradores (2008). Inicialmente, o material biológico foi desidratado em estufa a 60°C, triturado e submetido à delipidação com acetona durante uma semana, sendo denominado pó-cetônico. Posteriormente, foi realizada

a proteólise pela adição de NaCl 1,0 M e maxatase (enzima proteolítica) ao pó cetônico obtido. A mistura foi incubada por 24 horas e mantida a 60°C em pH 8. Em seguida foi filtrada e a resina de troca iônica (Lewatit®) foi adicionada ao filtrado para complexação dos GAGs, sendo mantida à temperatura ambiente por 24 horas, sob agitação. Para descomplexação, a resina foi eluída com NaCl 3M, e a este filtrado foi adicionado metanol P.A. para a precipitação e a mistura foi mantida por 18h à 4°C. Após esse período, realizou-se a centrifugação (8000 rpm a 4°C) dos filtrados, obtendo um extrato bruto de GAGs denominado F-3M.

Figura 4: Processo de extração de glicosaminoglicanos do cefalotórax do camarão.

3.4 – Fracionamento com acetona

A fração F-3,0 M foi submetida a fracionamento usando volumes crescentes de acetona, de acordo com Dietrich et. al.,(1999). A fração F3,0 M foi tratada com diferentes proporções acetona e mantida a 4 ºC por 18 horas, originando as frações F-0,5A, F-0,7A e F1,0 A, sendo então centrifugada e seca a vácuo (Figura 5).

Figura 5: Processo de fracionamento dos GAGs isolados do camarão. Fonte: Brito, 2008.

3.5 – Comportamento eletroforético

Após fracionamento com acetona as frações obtidas foram analisadas por eletroforese em gel de agarose em sistema de tampão sistema com 1,3-diaminopropano acetato (PDA)

3.5.1 - Sistema 1,3-diaminopropano acetato (PDA)

As amostras foram aplicadas em lâminas de gel de agarose (0,6%) em tampão PDA 0,05 M, pH 9. O sistema PDA, em virtude do grau de interação de diamina com os glicosaminoglicanos, permite discriminar por ordem decrescente de migração: condroitim sulfato 4- e 6-sulfatos (CS), dermatam sulfato (DS), heparam sulfato (HS) juntamente com heparina, ou seja, os compostos que mais interagem com a diamina apresentam menor mobilidade eletroforética. A corrida foi realizada a 100 V por 1h em cuba refrigerada a 4°C utilizando-se como indicador de corrida o vermelho de cresol.

O gel foi fixado com CETAVLON (0,1%) por no mínimo 2 horas, seco sob corrente de ar quente e corado com solução corante. Depois de retirado o excesso do azul de toluidina com solução descorante, o gel foi seco a temperatura ambiente.

3.6 – Purificação do HL-GAG extraído do camarão

A fração que apresentou migração semelhante à heparina de mamíferos foi aplicada em uma coluna de troca iônica DEAE-Sephacel, sendo eluída em NaCl nas concentrações de 0,5, 0,8 e 1,0 M. As frações obtidas foram analisadas por dosagem de ácido urônico para detectar a presença de GAGs e, aquelas onde a presença foi detectada, foram reunidas e liofilizadas. Em seguida, as frações contendo ácido urônico foram submetidas a cromatografia de gel filtração em Sephadex G-25 para a retirada do sal presente na amostra, e novamente liofilizadas, como resumido na figura 6.

Figura 6: Processo de purificação do HL-GAGe extraído do camarão. Fonte: Brito, 2008.

3.7 – Efeito do HL-GAG sobre o influxo de células a cavidade peritoneal

O potencial anti-inflamatório dos GAGs foi analisado pelo modelo de peritonite induzida com lipopolissacarídeo (LPS). O LPS é um agente responsável pela inflamação aguda na cavidade peritoneal com o influxo de neutrófilos e produção de citocinas pró-inflamatórias. O efeito dos compostos sobre a peritonite aguda foi indicado pela contagem total e diferencial de células recrutadas à cavidade do peritônio, bem como pela produção das citocinas IL-1β, IL-6 e TNF-α.

Foram formados 4 grupos, cada um contendo 6 animais (todos machos), distribuídos da seguinte maneira: controle negativo, controle positivo, HEP (125

µg/Kg/animal) e HL-GAG (125 µg/Kg/animal). Essas doses foram escolhidas de acordo com estudos prévios em laboratório e literatura (WANG, 2002). Todas as soluções injetadas nos animais foram preparadas em condições estéreis em capela de fluxo laminar, a fim de se evitar contaminação por microorganismos.

Os animais do grupo controle negativo receberam injeção intraperitoneal e tratamento com injeção intravenosa com solução salina (PBS), enquanto o positivo recebeu estímulo intraperitoneal com LPS da cepa 055:B5 (3,3 µg/kg/animal) e após 1h foi realizado o tratamento com PBS. Os grupos da HEP e HL-GAG foram estimulados intraperitonealmente com LPS e tratados com 100µL dos respectivos compostos por injeções intravenosa (veia caudal) após 1h de estímulo. Após 4h, os camundongos foram eutanasiados e a cavidade peritoneal foi lavada com 2mL de PBS contendo 0,5% de soro de albumina bovina e 1mM de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), afim de recuperar as células presentes naquele espaço. O número total de células do lavado foi contado em hemocitômetro e a contagem diferencial dos leucócitos polimorfonucleares foi determinado em preparações de cytospin e fixadas com eosina e hematoxilina.

3.8 – Dosagem de citocinas pró-inflamatórias

O lavado peritoneal coletado de cada grupo após 4h da indução da inflamação com LPS e foram armazenados à -80°C. Os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α foram mensuarados utilizando kit de ensaio imunoenzimático (ELISA) (eBioscience) de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi calculada em triplicata e a densidade ótica de cada poço foi determinada a 450nm.

3.9 - Viabilidade Celular

Para avaliar a citotoxicidade dos compostos foi realizado o ensaio do Alamar Blue. Este ensaio avalia a capacidade metabólica enzimática em RAW 264.7.

As células (1x104_{/poço) foram expostas aos compostos (1, 25, 50 e 100} µg/mL) e incubadas a 37°C por 24h. Após incubação 10μL de Alamar Blue 400 µg/mL foi adicionado em cada poço e incubado a 37°C por 4h. A absorbância foi mensurada usando leitor de microplaca (Epoch da Biotek Instruments Inc) a 570 e 600 nm. Para controle, as células foram incubadas com meio de cultura. A porcentagem de redução foi calculada pela fórmula:

% Redução = [A570 – (A600 x Ro) / A’570 – (A’600 x Ro)] x 100

Onde, A570 e A600 são as absorbâncias das amostras; A’570 e A’600 são as absorbâncias dos poços com célula e meio (controle), Ro é o fator de correção (Ao570/Ao600) e Ao é a absorbância do Alamar na forma oxidada.

3.10 – Quantificação de Óxido Nítrico (NO)

Células RAW 264.7 (4,8 x 105 _{células/poço) foram plaqueadas e tratadas} com HEP ou HL-GAG de camarão nas concentrações 1,0, 10 e 100 μg/mL. Uma hora depois, as células foram induzidas com LPS (2µg/mL). Após 24h, o sobrenadante foi aspirado e submetido à dosagem de NO. Para determinação da concentração total de NO, adicionaram-se 50 μl de reagente de Griess (1% de sulfanilamida em ácido fosfórico a 5% e 0,1% de dicloridrato de naftililetilenodiamina em água) a 50 μl de sobrenadante celular de cada poço. Após uma incubação por 30 min à temperatura ambiente, a densidade óptica foi determinada a 545 nm com um leitor de microplacas.

3.11- Determinação das Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) intracelular

A geração de ERO intracelular foi medida pelo ensaio com 2',7'-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA).

As células foram incubadas com LPS 2 µg/mL por 18h a 37°C. Em seguida, o meio contendo LPS foi aspirado e as amostras (25, 50 e 100 µg/mL) foram adicionadas e mantidas durante 4h a 37°C. Posteriormente, os poços foram lavados com PBS 1X e adicionou o DCFH-DA 100 µM, incubando por 1h a 37°C no escuro. Por fim, foi realizada a leitura em leitor de fluorescência no comprimento de onda azul (485 e 535 nm).

3.12 – Ensaios Antioxidantes

Nos ensaios antioxidantes, foram usadas as mesmas concentrações de HEP, HL-GAG (25, 50 e 100 µg/mL) em todos os testes. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e, com exceção do ensaio do 2,2-difenil-1-picril-hidrazina (DPPH), a fórmula para determinar a inibição foi a mesma:

Inibição (%) = [1-(A1-A2/A0] x100

Onde, A0 é a absorbância do branco, A1 é a absorbância dos compostos sob ensaio e A2 é a absorbância dos compostos.

3.12.1 - Avaliação de Quelação de Metais

Para avaliar o potencial do HL-GAG em quelar o cátion Fe2+_{, foi realizado o} método de detecção da ferrozina como descrito por Thiansilakul et. al., 2007 com algumas modificações.

Em uma microplaca foram adicionados 100 μL dos GAGs nas diversas concentrações, e em seguida, foi adicionado 100 μL do sulfato ferroso 0,1 mM em todos os poços, exceto no poço do branco. Após 5 minutos foi adicionado 100 μL ferrozina 0,25 mM nos poços, exceto no do branco, e incubados por 10 minutos na penumbra. A leitura foi realizada a 562 nm. Foram usados como controle negativo os reagentes (Sulfato ferroso e ferrozina) sem amostras, o controle positivo foi o EDTA na concentração de 20 μg/mL e branco foi a amostra sem os reagentes.

3.12.2 - Sequestro do Radical Superóxido

A atividade de sequestro do radical superóxido pelos compostos foi mensurada pela redução do tetrazólio nitroazul (NBT) como descrito Nishikimi et. al., 1972.

A mistura de reação (200 µL) continha 156 µM de Nicotinamida Adenina Dinucleotideos (NADH), NBT (156 µM), 60 µM de metassulfato de fenazina (PMS) e várias concentrações dos compostos. Após incubação de 5 min à temperatura ambiente, a absorbância da mistura de reação foi mensurada a 560 nm. O ácido ascórbico foi usado como controle positivo.

.

3.12.3 - Sequestro do Radical Hidroxil

A atividade sequestradora do radical hidroxil foi mensurada pelo método de Fenton, como descrito por Mathew et. al., 2006. As amostras foram preparadas em diferentes concentrações. Foi adicionado na placa 50µL de FeSO4 9mM, 50µL das amostras de GAGs e 50µL de H2O2 8,8 mM. A reação ocorreu em banho-maria a 37°C por 10 min. Por fim, 50 µL de ácido salicílico - etanol 9mM foi adicionado. A

absorbância foi mensurada a 510 nm com água destilada como referência e ácido ascórbico como controle positivo.

3.12.4 - Avaliação da Peroxidação Lipídica

O sistema de peroxidação lipídica foi gerado com 250 µL da suspensão de gema de ovo homogeneizado a 10% com tampão PBS (pH 7,4), 25 µL de sulfato ferroso 0,07 M para iniciar a peroxidação. Em seguida, foi adicionado 250 µL das amostras em concentrações variadas e a mistura foi incubada a 37°C por 30 min. Após incubação, foi adicionado 750 µL de ácido tricloroacético 20% e 750 µL de ácido tiobarbitúrico 0,8% (para parar a reação), e a mistura foi aquecida a 100°C por 15 minutos. Decorrido este tempo, a mistura foi submetida à centrifugação a 7000 rpm por 10 minutos e a leitura realizada a 532 nm.

3.12.5 - Atividade de Sequestro do Radical DPPH

A atividade do sequestro do radical DPPH foi realizado de acordo com Braca (2003) com algumas modificações.

Para este ensaio, em uma placa de 96 poços, foram adicionadas diferentes concentrações do HL-GAG ou de heparina, seguido de solução etanólica DPPH 0,03 mM. O controle foi composto apenas pela solução etanólica DPPH; e o branco foi composto pelo etanol. A placa foi incubada por 30 min a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após incubação, a absorbância foi mensurada em leitor de microplaca na faixa de onda de 517 nm.A atividade sequestradora (SR) do radical foi calculada utilizando a seguinte fórmula:

%SR =

3.17 – Análise Estatística

As análises estatísticas e gráficos foram realizadas com o programa GraphPad Prism, versão 5. A Análise de Variância Univariada (ANOVA – two way) foi aplicada para determinar as diferenças estatísticas entre os tratamentos. O teste a posteriori de Bonferroni foi utilizado para examinar as diferenças estatísticas individuais entre tratamentos, quando observadas diferenças estatísticas ao nível de significância de 0,05. Para os ensaios in vivo, foi aplicada a ANOVA (one-way) com

teste a posteriori de Tukey, observando diferenças estatísticas a nível de significância de 0,05.

4 – RESULTADOS

4.1 – Obtenção e Purificação do HL-GAG

O HL-GAG foi obtido a partir de um extrato de GAGs denominado F-3M, extraído do cefalotórax do camarão após proteólise e fracionamento com resina de troca iônica.

O tratamento do extrato com proporções crescentes de acetona produziu três frações: F-0,5A, F-0,7A e F-1,0A, cujo perfil eletroforético é apresentado na Figura 7. Embora tenha sido observado nas 3 frações componentes de migração semelhante a HEP/HS, a F-0,5A foi a única que não apresentou banda com migração semelhante ao condroitim sulfato (CS).

Figura 7. Perfil eletroforético das frações obtidas após fracionamento com acetona. OR: origem; P: padrão, Condroitim sulfado (CS), Dermatam sulfato (DS), Heparan sulfato (HS) e Heparina (HEP).

Para obter o HL-GAG, a fração F-0,5A foi submetida a cromatografia de troca-iônica em DEAE-sephacel e eluída com NaCl nas molaridades 0,8 e 1,0 M (Figura 8 A). Sendo isolados dois picos: F-0,5A-0,8M e F-0,5A-1,0M. Através da dosagem de ácido urônico foi observado que a fração eluída com NaCl 0,8 M representa 91,5% do total do conteúdo total de urônico. Essa fração foi reunida e após liofilização, submetida à cromatografia de gel filtração para remoção do sal (Figura 8B). O perfil eletroforético da F-0,5-0,8M (dado não mostrado) corresponde ao HL-GAG anteriormente obtido pelo método de obtenção realizado por Brito et.al. (2008) e caracterizado estruturalmente por Chavante et. al. (2014).

Figura 8. Purificação do HL-GAG. (A) Perfil de eluição das frações F-0,5-0,8 M e F-0,5-1,0 M após cromatografia de troca iônica. A linha pontilhada representa os valores de absorbância para a quantidade de urônico presente em cada tubo coletado. (B) Purificação da fração F-0,5-0,8 M após cromatografia de gel filtração.

4.3 –Ensaio de Peritonite Aguda induzida por LPS

Para avaliar o efeito do HL-GAG sobre o recrutamento de leucócitos foi realizado o ensaio de peritonite aguda (Figuras 9 e 10). O controle positivo apresentou um aumento significativo de células na cavidade peritoneal (p<0,001), em relação ao controle negativo, indicando que o LPS induz um aumento de migração leucocitária.

Observou-se que o HL-GAG reduziu em 50% a migração de leucócitos totais para o peritônio quando comparado com o controle positivo (p<0,01), contudo não houve diferença significativa em relação ao controle negativo. A heparina apresentou uma redução de 40%, porém não diferiu significativamente em comparação com o controle positivo. Também não existiu diferença significativa entre a heparina e o HL-GAG.

Contagem Total de Leucócitos

Figura 9. Contagem Total de Leucócitos em modelo de peritonite induzida por LPS. HEP – heparina, HL-GAG – heparinoide de camarão, CN (controle negativo – animais não induzidos com LPS) e CP (controle positivo – animais induzidos com LPS e tratados com PBS). Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 100 µL de LPS, 1h antes da injeção intravenosa de PBS, HEP e HL - GAG (125 µg/Kg/animal). Após 4h, o lavado peritoneal foi avaliado quanto ao número total de células. As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Tukey como pós-teste na comparação entre os compostos. N=6.

Quando avaliou-se a contagem diferencial de leucócitos, observou-se que as células polimorfonucleares apresentaram uma diminuição de migração nos animais tratados com HL-GAG e heparina. O HL-GAG reduziu em torno de 50% a quantidade de células no peritônio, enquanto a heparina diminuiu 40% quando comparados com o controle positivo, diferindo estatisticamente (p<0,001). A heparina e o HL-GAG não apresentaram diferença significativa entre si, apenas a heparina diferiu (p<0,01) do controle negativo.

Contagem Diferencial de Leucócitos

Figura 10. Contagem Diferencial de Leucócitos em modelo de peritonite induzida por LPS. HEP – heparina, HL-GAG – heparinoide de camarão, CN (controle negativo – animais não induzidos com LPS) e CP (controle positivo – animais induzidos com LPS e tratados com PBS). Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 100 µL de LPS, 1h antes da injeção intravenosa de PBS, HEP e HL-GAG (125 µg/Kg/animal). Após 4h, o lavado peritoneal foi avaliado quanto ao número total de células. As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Tukey como pós-teste na comparação entre os compostos. N=6.

4.4 - Dosagem de Citocinas

O resultado da produção de citocinas está apresentado na Figura 11. O controle positivo diferiu (p<0,001) do negativo em todas as citocinas avaliadas, indicando que o LPS estimula a produção dessas moléculas.

Os animais tratados com HL-GAG apresentaram uma redução de 53% dos níveis de IL-1β, enquanto aqueles, no qual a heparina foi usada como tratamento, reduziram 54%. Essa diminuição está relacionada ao controle positivo e apresentou diferença significativa (p<0,01), contudo não houve diferença estatística entre a heparina e o HL-GAG.

Com relação a IL-6, o HL-GAG reduziu os níveis em 50%, enquanto a heparina diminuiu 53%, quando comparados ao controle positivo, diferindo estatisticamente (p<0,001). Entre os compostos não houve diferença significativa.

O TNF- α teve sua produção reduzida quando os animais foram tratados com os compostos. O HL-GAG diminuiu cerca de 57% enquanto a heparina reduziu

60% quando comparados com o controle positivo, ocorrendo diferenças significativas (p<0,001). O HL-GAG e a heparina também apresentaram diferença significativa (p<0,05).

Figura 11. Produção de citocinas estimuladas por LPS em camundongos C57BL/6. HEP – heparina, HL – HL-GAG de camarão, CN (controle negativo – animais não induzidos com LPS) e CP (controle positivo – animais induzidos com LPS e tratados com PBS). Os resultados representam as médias dos níveis de citocinas (pg/mL), bem como os desvios padrões entre os animais de cada grupo. As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Tukey como pós-teste na comparação entre os compostos. N=6.

4.5 – Viabilidade Celular

A fim de verificar a ação citotóxica de diferentes concentrações do HL-GAG sobre as células RAW 264.7, foi empregado o método de análise utilizando Alamar Blue.

Quando comparados ao controle negativo, o tratamento com o HL-GAG diferiu significativamente em todas as concentrações. A heparina seguiu o mesmo perfil. A HEP não apresentou reduções significativas nas duas menores concentrações (1 e 25 µg/mL), mantendo a viabilidade celular próxima a 90%. Contudo, na concentração de 50 e 100 µg/mL, ela reduziu a viabilidade das células a 87 e 75%, respectivamente (p<0,001). O HL-GAG manteve a viabilidade em cerca de 90% em todas as concentrações testadas, indicando que ele não apresentou citotoxicidade às células.

Viabilidade Celular

Figura 12. Viabilidade celular avaliada pelo ensaio de Alamar Blue®. HEP – heparina, HL-GAG - heparinoide de camarão, CN – controle negativo (células + meio de cultura). As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Bonferroni como pós-teste na comparação entre os compostos.

4.6 - Efeito na Produção de Óxido Nítrico (ON)

As células RAW 264.7 foram tratadas com várias concentrações de HL, heparina (1,0, 10 e 100 µg / mL) e LPS (2 µg / mL) por 24 horas. A Figura 13 mostra que a produção de NO induzida por LPS foi significativamente diminuída na presença do HL-GAG e da HEP, alcançando 50% e 40%, respectivamente de inibição na concentração de 100 µg/mL (p<0,01), quando comparada com células sem tratamento, enquanto a heparina mostrou apenas 40% de inibição na mesma concentração (p<0,01).

Produção de Óxido Nítrico

Figura 13. Produção óxido nítrico em RAW 264.7 estimuladas por LPS. CP (controle positivo – células induzidos com LPS e tratados com PBS), CN (controle negativo – células induzidas e tratadas com PBS), HEP – heparina, HL-GAG – heparinoide de camarão, CN (controle negativo – animais não induzidos com LPS). As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Bonferroni como pós-teste na comparação entre as amostras.

4.7 – Ensaio das Espécies Reativas Intracelular

O ensaio de DCFH-DA mensura a quantidade de espécies reativas intracelular. Os compostos avaliados diferiram estatisticamente do controle negativo em todas as concentrações testadas (p<0,001). A heparina reduziu os níveis de EROs em 58% na concentração de 25 μg/mL, enquanto o HL-GAG apresentou essa mesma inibição apenas na concentração de 100 μg/mL, entretanto o efeito dos compostos sobre os EROs não demonstrou dose-dependência.

A heparina apresentou a maior inibição de espécies reativas intracelular em todas as concentrações testadas. A heparina diferiu estatisticamente (p<0,05) do HL-GAG em todas as concentrações.

Espécies Reativas Intracelular

Figura 14. Avaliação das espécies reativas intracelular em modelo de inflamação usando RAW 264.7. HEP – heparina, HL-GAG – heparinoide de camarão, CN (controle negativo – células com meio de cultura). As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Bonferroni como pós-teste na comparação entre as amostras.

4.8 –Potencial de quelação de metais

A figura 15 mostra os resultados do efeito quelante em relação ao ferro. Ao controle positivo foi atribuído 100% de quelação em todas as concentrações. Todos os compostos apresentaram diferença estatística em relação ao controle positivo (p<0,001). O HL-GAG quelou em 23% e 24%, nas concentrações de 25 e 50 μg/mL, respectivamente. Além disso, diferiu estatisticamente (p<0,05) da heparina nestas concentrações.

Na concentração de 100 μg/mL, a heparina apresentou o maior percentual de quelação, reduzindo 58% dos íons ferrosos livres, enquanto o HL-GAG diminuiu 48%. Nesta concentração, houve diferença estatística (p<0,05) entre os compostos.

Quelação de Íon Ferroso

Figura 15. Avaliação do potencial de quelação de ferro pelos compostos. HEP – heparina, HL-GAG – heparinoide de camarão, CP – controle positivo (EDTA - 20 µg/mL). As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Bonferroni como pós-teste na comparação entre as amostras.

4.9 - Sequestro do Radical Superóxido

A figura 16 apresenta o resultado da capacidade das amostras em reduzir a produção de radical superóxido. Os compostos apresentaram diferença significativa em todas as concentrações testadas quando comparados com o controle positivo (p<0,001). O HL-GAG teve a maior inibição em três concentrações 25, 50 e 100 μg/mL, inibindo 30%, 34% e 40%, respectivamente, e nas três concentrações diferiu significativamente (p<0,05) da heparina.

Radical Superóxido

Figura 16. Avaliação do potencial de sequestro do radical superóxido. HEP – heparina, HL-GAG – heparinoide de camarão, CP – controle positivo (ácido ascórbico).As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Bonferroni como pós-teste na comparação entre as amostras.

4.10 – Sequestro do Radical Hidroxil

Na concentração de 25 μg/mL, a heparina sequestrou 21%, enquanto o HL-GAG 13%. Houve diferença significativa entre a heparina e o HL-HL-GAG. Nesta concentração apenas a heparina apresentou diferença estatística em relação ao controle positivo (p<0,05).

Na concentração de 50 μg/mL, a heparina apresentou o maior capacidade de sequestro, reduzindo 28% do radical hidroxil, enquanto o HL-GAG 15% (p<0.001). Na concentração de 100 μg/mL, o HL-GAG sequestrou 40%, enquanto a heparina 35%, mas nesta concentração não houve diferença significativa entre os compostos (Figura 17).

Radical Hidroxil

Figura 17: Avaliação do sequestro do radical hidroxil. HEP – heparina, HL-GAG – heparinoide de camarão, CP – controle positivo (ácido ascórbico). As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Bonferroni como pós-teste na comparação entre as amostras.

4.11 - Ensaio de Peroxidação Lipídica

A figura 18 apresenta a taxa de inibição da peroxidação lipídica. Todos os compostos apresentaram diferença estatística significativa quando comparados ao controle positivo (p<0,001).

Na concentração de 25 μg/mL, o HL-GAG inibiu a peroxidação em 58%, tendo uma elevada redução na menor concentração e na de 50 μg/mL, reduziu 55%. A heparina apresentou uma inibição maior, seguido do HL-GAG. Todos diferiram significativamente entre si (p<0,001). Na maior concentração (100 μg/mL), o HL-GAG reduziu a peroxidação em 54%.

Peroxidação Lipídica

Figura 18. Avaliação da peroxidação lipídica. HEP – heparina, HL-GAG – heparinoide de camarão, CP – controle positivo (ácido ascórbico). As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Bonferroni como pós-teste na comparação entre as amostras.

4.12 - Atividade sequestradora do radical DPPH

O resultado obtido utilizando diferentes concentrações de HL-GAG e heparina está resumido na Figura 19. Observou-se que heparina e HL-GAG apresentaram atividade antioxidante semelhante em todas as concentrações, sequestrando o radical DPPH em aproximadamente 80%. Os compostos não diferiram estatisticamente entre si (p> 0,05). Quando comparados ao controle positivo, todas as amostras apresentaram menor porcentagem de inibição do radical DPPH, apresentando diferença significativa (p <0,001).

Sequestro do Radical DPPH

Figura 19. Potencial de redução do radical DPPH. HEP – heparina, HL-GAG – heparinoide de camarão, CP – controle positivo (ácido ascórbico). As letras indicam diferença estatística (p<0,05) pela ANOVA, com Bonferroni como pós-teste na comparação entre as amostras.

5 – DISCUSSÃO

Várias evidências da literatura revelam o papel anti-inflamatório da heparina devido sua capacidade de modular as etapas do processo de migração dos leucócitos, desde sua adesão inicial ao endotélio vascular até a diapedese (ZYGMUNT et al., 2013). Entretanto, o aproveitamento desse potencial é limitado, principalmente pelas complicações hemorrágicas que geralmente acompanham a utilização clínica da heparina. Diante dessa problemática, a comunidade científica vem explorando as propriedades anti-inflamatórias de heparina e/ou análogos não anticoagulantes obtidos de diferentes fontes. Dentro desse contexto, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo do papel anti-inflamatório de um HL-GAG, de baixo risco hemorrágico, purificado do camarão L. vannamei.

Em estudos prévios, Brito e colaboradores (2008) demonstraram que o HL-GAG reduziu a migração de leucócitos para o local da inflamação quando testado no modelo de peritonite in vivo induzida por tioglicolato e reduziu a atividade de metaloproteinases em todas as dosagens testadas, indicando um possível mecanismo de ação antimigratório. Em outro estudo, o HL-GAG foi capaz de interagir com fatores de crescimento angiogênicos (FGF-2, EGF e VEGF), gerando um efeito anti-angiogênico, o que pode ser um indicativo do papel regulatório do HL-GAG durante a reparação das células endoteliais (DREYFUS et. al., 2010). Em 2013, Coelho demonstrou que o efeito antimigratório do HL-GAG persiste após 6 horas de indução da inflamação, e que o mesmo reduz a atividade da elastase (COELHO, 2013). Diante dessas evidências, avaliamos se o HL-GAG também seria capaz de modular a migração leucocitária, a produção de citocinas pró-inflamatórias e metabólitos reativos de oxigênio e nitrogênio, que participam durante uma resposta inflamatória.

Apesar de existirem evidências sobre o efeito do HL-GAG na migração leucocitária, os estudos realizados por Brito e colaboradores (2008) utilizaram ratos da linhagem Wistar com indução de peritonite por tioglicolato, um indutor químico. Soudi e colaboradores (2012) demonstraram que há diferenças na resposta imunológica entre as diversas linhagens de camundongos, além dos diferentes indutores de peritonite, portanto realizamos outro estudo antimigratório utilizando camundongos C57BL/6 e induzindo a peritonite com LPS, um indutor biológico. O LPS mimetiza uma fração da parede bacteriana induzindo uma resposta imunológica

mediada por patógenos, diferente do tioglicolato que estimula respostas a danos químicos.

O HL-GAG apresentou um redução na migração dos leucócitos de 50%, tanto na contagem total, como nos polimorfonucleares. Isso demonstra a capacidade do composto em atuar frente a ambas respostas imunológicas, por patógenos e por danos químicos. Diante dessas evidências, buscamos avaliar se esse efeito anti-migratória seria mediado pela atuação das citocinas, dessa forma, dosamos os níveis das principais citocinas pró-inflamatórias.

As citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, TNF-α e IL-6) são a responsáveis pela sinalização de células de defesa, ativando diversas vias relacionadas a inflamação. Estas citocinas são liberadas pelas células que migraram ao sítio de injúria, principalmente os macrófagos (SOUDI et al., 2012). A IL-1β, TNF-α e IL-6 estimula a migração leucocitária, uma vez que ativa a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1, VCAM-1, E-selectinas e CD11b) nas células endoteliais, libera espécies reativas, como o óxido nítrico e ativa fatores de transcrição de metabólitos da resposta inflamatória (SALAS, et.al., 2000; DE FILIPPO et. al., 2013; FISCHER et. al., 2015). As metaloproteinases e elastase são capazes de ativar citocinas pró-inflamatórias, como TNF- e IL-1 (LEE et al., 2015; DHARWAL et. al., 2018). CNOSiderando que o HL-GAG reduz a atividade dessas enzimas, propõe-se que este seria um dos mecanismos de ação do seu papel antimigratório, contudo surgiu o interesse em avaliar se esse GAG conseguiria atuar em outras vias de sinalização, como aquelas ativadas pelas citocinas. Portanto, foram dosados os níveis das principais citocinas relacionadas a resposta inflamatória aguda. Essa dosagem foi realizada a partir do líquido peritoneal de animais em modelo de inflamação aguda. O HL-GAG diminuiu os níveis de todas as citocinas avaliadas, tendo o TNF-α a maior redução (57%). Há evidências na literatura indicando que a heparina e heparina de baixo peso molecular são capazes de inativar o fator NF-kB, responsável pela regulação de alguns genes envolvidos na resposta inflamatória (HOCHART et. al., 2006; SHAKER et. al., 2018). Tem sido proposto que essa inibição é resultante de uma interação entre a proteína e uma região da heparina rica em resíduos dissulfatados (THOURANI et. al., 2000; HEGAZY et. al., 2010; ETTELAIE et. al., 2011). CNOSiderando essa evidência e a predominância de dissacarídeos dissulfatados nas cadeias do HL-GAG (CHAVANTE et. al., 2014), não