Trabalho académico de investigação Dissertação: Artigo de Investigação Médica
ESTUDO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS
DO RECETOR DA VITAMINA D
EM DOENTES COM PATOLOGIA AUTOIMUNE
Gustavo Miguel França Santos
Orientador
Prof. Doutor Carlos Vasconcelos, (HSA/CHP) e (ICBAS/UP)
Coorientador
Prof. Doutora Berta Martins, (ICBAS/UP)
Mestrado Integrado em Medicina Porto, 2012
Estudo de polimorfismos genéticos do recetor da Vitamina D em
doentes com patologia autoimune
INTERVENIENTES NO PROJETO Instituições, Departamentos e Serviços Centro Hospitalar do Porto (CHP)
Hospital de Santo António (HSA/CHP) Departamento de Medicina (DM)
Unidade de Imunologia Clínica (UIC)
Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto (ICBAS/UP) Departamento de Patologia e Imunologia Molecular (DPIM)
Laboratório de Imunogenética (DI) Unidades e Grupos de investigação
Unidade Multidisciplinar de Investigação Biomédica da Universidade do Porto (UMIB/ICBAS/UP) Grupo de investigação “Imunogenética, Inflamação e Autoimunidade” (IGIA)
Equipa de Investigação do CHP: Imunologia Clínica Equipa de investigação
Constituição
Aluno
Gustavo Miguel Cabral Machado França Santos, aluno do MIM do ICBAS/UP
Orientadores
Prof. Doutor Carlos Vasconcelos, HSA/CHP e ICBAS/UP Prof. Doutora Berta Martins, ICBAS/UP
Su
pervisores
Prof. Doutora Margarida Lima, HSA/CHP e ICBAS/UP – (Regente da DIIC)
Outros investigadores
Dra. Cláudia Carvalho, ICBAS/UP Drª Andreia Bettencourt, ICBAS/UP Dr. António Marinho, HSA/CHP Drª Isabel Almeida, HSA/CHP
Abstract
Introduction : Genetic and environmental factors are generally acknowledged as playing
a role in the onset of autoimmune diseases, such as Systemic Lupus Erythematous and Systemic Sclerosis. Additionally, Vitamin D has been shown to participate in immune regulation, through the Vitamin D receptor (VDR). The VDR is a candidate gene for susceptibility to autoimmune disorders. The relationship between autoimmune diseases and polymorphisms in the VDR gene has been already subjected to evaluation, but there are conflicting results in different ethnic backgrounds. Studies in Portuguese population have not been published yet.
Aim: To determine whether VDR gene polymorphisms are related to the susceptibility to
SLE and Systemic Sclerosis, severity and activity of the disease across the Portuguese population.
Patients and Methods: A case-control study with 186 SLE patients (diagnosed
according to the American College of Rheumatology (ACR) criteria) and 54 Systemic Sclerosis patients (diagnosed according to the American College of Rheumatology criteria) and 192 age matched controls. The VDR gene polymorphisms: FokI T>C (rs10735810), BsmI A>G (rs1544410), TaqI C>T (rs731236) were genotyped by TaqMan allelic discrimination assay.
Differences in frequencies were evaluated using the Chi-Square test and Fisher’s exact test. Analyses were done using the statistical software program SPSS. Significant levels were set at p<0.05, corresponding to confidence intervals (CI) that were given at 95%, consistent with other studies.
Results : No statistically significant differences, between patients with Lupus and
controls, for VDR genotype frequencies were found. However, there were differences between Systemic Sclerosis patients and controls for genotype frequencies of FokI VDR polymorphism. The genotype TT was significantly more present in these patients (28.3%) than in control subjects (9.4%) [p= 0.023].
Moreover, we could identify an association with disease activity. The genotype TT of the FokI polymorphism was significantly less frequent in patients with SLEDAI 4 (n=76) than in patients with SLEDAI <4 (n=57) (6.2% vs. 20.8%, corrected p [p(c)] = 0.0021). Conversely, the presence of the genotype CC of the TaqI polymorphism and the genotype AA of the BsmI polymorphism were associated with a lower score of Medsger Scale (1.86 vs 4.15) in Systemic Sclerosis patients.
Conclusion : To the best of our knowledge, this study provides data and results,
suggesting that the TT VDR FokI genotype is associated with less disease activity in Lupus patients, and with less susceptibility to the development of Systemic Sclerosis. Our findings are
in agreement with previously published results that associated a more active immune system with the CC VDR FokI genotype. Additional studies exist with conflicting results and that may be explained by the fact that VDR signalling, although contributing to the outcome of immune response, can be overruled by more potent immune pathways. In Systemic Sclerosis patients, we suggest that the CC genotype of TaqI and the genotype AA of the BsmI polymorphism are associated with mitigated disease activity. The absence of studies don’t allow us to compare our results with other populations.
Palavras-Chave:
Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) Esclerodermia
Vitamin D Receptor (VDR) Vitamina D (VD)
Doença autoimune
1. Introdução e Estado de Arte
A patologia autoimune corresponde a um conjunto de entidades clínicas, mais ou menos bem definidas e que vão desde o envolvimento específico de um órgão até quadros sistémicos. Nos últimos anos, tem-se vindo a assistir a um aumento da prevalência deste conjunto de patologias, que afetam aproximadamente 5% da população nos países ocidentais e que se associam a altas taxas de morbilidade e de incapacidade [1].
A vitamina D (VD) é um dos fatores que pode contribuir ou exacerbar manifestações de autoimunidade. Níveis baixos de VD têm sido reportados em várias patologias autoimunes, incluindo as doenças inflamatórias do intestino, o Lúpus Eritematoso Sistémico (LES), a Esclerodermia (ES), a Esclerose Múltipla, a Diabetes Mellitus tipo 1 e Artrite Reumatóide (AR), entre outras [2].
Tendo como modelo o LES e a esclerodermia, este estudo pretendeu caracterizar, através dos polimorfismos do gene do VDR, qual o papel da VD nas doenças autoimunes.
O Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) é uma doença autoimune, na qual órgãos e células sofrem dano mediado por auto-anticorpos e imunocomplexos circulantes. Pela diversidade de sintomatologia que apresenta, e pelos mecanismos biológicos subjacentes, ainda hoje não totalmente esclarecidos, constitui um paradigma da patologia autoimune [3].
No LES, a incapacidade do indivíduo manter a autotolerância, reflete uma desregulação imune traduzida na presença de células T e células B hiperativas.
A prevalência do LES em Portugal é estimada em 19 a 26 casos por 100.000 habitantes
[4]. As mulheres apresentam uma prevalência mais elevada em praticamente todas as doenças
autoimunes, e no LES em particular o rácio é de 12:1 (mulher-homem) entre as idades de 15 e 45 anos, mas quando a doença se desenvolve na infância ou depois dos 45 anos, esse ratio é apenas 2:1 [5]. Na prática clínica, o diagnóstico de LES baseia-se num conjunto de características
clínicas e imunológicas sugestivas da doença. O LES pode envolver qualquer órgão ou sistema, quer isoladamente, quer em simultâneo. O curso clínico é variável, sendo, contudo, mais frequente uma evolução por surtos intercalados com períodos de remissão.
1.1.2 Critérios para o diagnóstico de LES
Na prática clínica, o diagnóstico de LES estabelece-se de acordo com os 11 critérios definidos pela ACR (American College of Rheumatology). A presença de 4 destes critérios permite classificar o LES.
A atividade da doença é avaliada com base em diversos sistemas, que foram desenvolvidos ao longo dos últimos anos. Destes, só alguns foram validados, como, por exemplo, o SLEDAI (SLE Disease Activity Index), o BILAG (the British Isles Lupus
Assessment Group), o SLAM (SLE Activity Measure) e o ECLAM (European Consensus Lupus Activity Measurement). Estes índices são fundamentais na avaliação da actividade
da doença, tendo em conta o curso heterogéneo da mesma [6] [7].
Tabela I: Critérios para o diagnóstico de LES *
Critério Definição
1. Eritema malar Eritema fixo, em forma de asa de borboleta, sobre as eminências malares, que tende a poupar as pregas nasolabiais.
2. Eritema Discóide Placas eritematosas, salientes, com descamação e cicatrização atrófica.
3. Fotossensibilidade Eritema na pele, como resultado de uma reação de exposição à luz solar (pela história do paciente ou observação médica).
4. Úlceras orais Ulceração oral ou nasofaríngea, usualmente indolor, observada pelo médico.
5. Artrite não erosiva Envolvendo duas ou mais articulações periféricas, caracterizadas pela sensibilidade à dor, edema ou sinovite.
6. Serosite Pleurite – história de dor pleurítica, atrito pleural ouvido por um médico ou evidência de derrame pleural
Pericardite – Documentada por um eletrocardiograma ou evidência de derrame pericárdico.
7. Doença renal 1. Proteinúria persistente > 0.5 gramas por dia. Ou
2. Cilindros celulares – podendo ser eritrocitários, granulares, tubulares ou mistos. 8. Doença neurológica 1. Convulsões – na ausência de fármacos predisponentes ou alterações metabólicas como
uremia, cetoacidose ou distúrbios eletrolíticos.
2. Psicose – na ausência de fármacos ou de outras explicações médicas. 9.Doença Hematológica 1. Anemia hemolítica com reticulocitose
Ou
2. Leucopenia < 4.000 / mm3 em pelo menos duas ocasiões Ou
3. Linfopenia < 1.500 / mm3 em pelo menos duas ocasiões Ou
4. Trombocitopenia < 100.000/ mm3 na ausência de fármacos predisponentes. 10.Doença Imunológica 1. Anti-ADN: anticorpo para o ADN nativo em título normal
2.Anti-Sm: presença de anticorpo para o antigénio nuclear Sm
3. Falso teste serológico para a sífilis (VDRL) positivo, conhecido pelo menos há 6 meses e confirmado pelo teste de imobilização do Treponema pallidum ou teste de absorção do anticorpo fluorescente para o T. pallidum
11.Anticorpos
antinucleares positivos Uma titulação anormal de anticorpo antinuclear por imunofluorescência ou um ensaioequivalente, na ausência de fármacos indutores de lúpus. * 1997 Update of the 1982 American college of Rheumatology Revised Criteria for Classification of Systemic Lupus Erythematous.
1.1.3 Fisiopatologia
Apesar de a etiopatogenia do LES ser ainda desconhecida, fatores genéticos e ambientais são considerados importantes para o desenvolvimento da doença.
Thomas Dorner (2012) resumiu recentemente a patogénese do LES, realçando não só a importância da predisposição genética, da modulação epigenética, da imunidade adquirida, mas também uma ativação anormal da imunidade inata. A ativação crónica das células dendríticas leva a um excesso de produção de IFN-α, o que leva à estimulação das populações de linfócitos B [3].
O perfil imunológico dos doentes com LES traduz uma ativação da imunidade humoral, responsável pela produção excessiva de auto-anticorpos e, por outro lado, uma diminuição da imunidade mediada por células (imunidade celular). Os auto-anticorpos podem ser diretamente citotóxicos ou participar na formação de imunocomplexos e desencadear uma resposta inflamatória.
A suscetibilidade genética representa um aspeto relevante na patogénese do LES e tem sido reconhecida pelos mais diversos estudos epidemiológicos genéticos.
Deficiências da via clássica do complemento (C1q, C1r, C1s, C4 e C2) podem implicar um alto risco de desenvolver Lúpus [8].
A importância dos fatores hormonais tem sido demonstrada pelo LES atingir preferencialmente as mulheres em idade reprodutiva. Fatores como a gravidez e a administração de estrogénios podem agravar a doença [9].
Fatores ambientais intervêm também na patogénese, como por exemplo a radiação ultravioleta e algumas infeções virais (Vírus Epstein-Barr) [10].
Estes doentes têm um risco aumentado, em relação à população geral, de desenvolver outras patologias, desde a doença cardiovascular, à osteoporose [11], e a
neoplasias [12].
1.2 Esclerodermia
A Esclerodermia também conhecida como Esclerose Sistémica, é uma doença autoimune, rara, complexa, de origem e causa desconhecidas.
Não existindo nenhum estudo sobre a prevalência na população portuguesa, estudos apontam uma prevalência de cerca de 10 doentes em 100.000 pessoas [13]. Esta prevalência está
sujeita a uma variação geográfica significativa [13][14]. Tal como em outras doenças do tecido
conjuntivo, a esclerodermia é predominante em indivíduos do sexo feminino, sendo a proporção de cerca de quatro mulheres por cada homem afetado. A população de ascendência afro-americana apresenta uma incidência maior que a população de ascendência europeia, e a doença ocorre mais precocemente [15].
Esta doença é caracterizada por vasculite, disfunção imune, deposição excessiva de matriz extracelular e fibrose do tecido conjuntivo da pele, pulmões, trato gastrointestinal, coração e rins [16]. É uma patologia, que se associa a um quadro inflamatório generalizado, por
vezes exuberante, caracterizado pela disfunção visceral progressiva devido a fenómenos fibróticos. A presença do espessamento da pele distingue a esclerose sistémica de outras doenças do tecido conjuntivo.
Os doentes com esclerodermia podem ser classificados em dois subgrupos definidos pela distribuição do padrão e extensão da pele envolvida, assim como outras manifestações clínicas e laboratoriais:
1. Esclerodermia localizada : Caracterizada por um envolvimento focal da pele, e por
vezes, dos músculos. Geralmente, não é acompanhada pelas alterações sistémicas de envolvimento de órgão ou de alterações imunológicas significativas.
2. Esclerodermia Sistémica ou Esclerose Sistémica
a) Forma cutânea limitada (inclui o Síndrome CREST)
Na forma limitada da esclerodermia, os doentes geralmente apresentam o fenómeno de Raynaud, anos antes de outras manifestações da doença aparecerem. O fenómeno de Raynaud afeta 70% dos doentes na fase inicial da esclerodermia [17]. Nesta forma da doença, o
endurecimento da pele é limitado aos dedos (esclerodactilia), extremidades distais e face, e o tronco não é afetado. Uma percentagem de doentes com envolvimento limitado, apresentam fenómenos de calcinose, nomeadamente nos dedos e nas extremidades, fenómeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia e telangiectasias, uma constelação denominada de Síndrome de CREST. A hipertensão pulmonar é uma das responsáveis pela elevada morbilidade destes doentes.
b) Forma cutânea difusa
Na forma difusa de esclerodermia, clinicamente mais severa e com prognóstico desfavorável, os doentes apresentam-se com endurecimento progressivo da pele, que se inicia nos dedos e ascende das extremidades distais às proximais, à face e ao tronco. Estes doentes estão em maior risco de desenvolver fibrose pulmonar e doença renal.
1.2.2 Critérios de Diagnóstico para a Esclerodermia
O diagnóstico clínico muitas vezes é difícil. A presença de endurecimento cutâneo com um padrão de substituição caracteristicamente simétrico associado a manifestações típicas de órgãos viscerais estabelece o diagnóstico. Ocasionalmente, a biópsia da pele pode ser indicada para estabelecer o diagnóstico de esclerodermia. Os critérios de classificação da Esclerodermia, propostos pelo American College of Rheumatology (ACR) exigem pelo menos um critério major ou dois critérios minor.
Tabela II: Critérios para o diagnóstico de Esclerodermia *
Critério Major
Esclerose Cutânea proximal (Acroesclerose). As alterações podem acometer toda a extremidade, face, pescoço e tronco.
Critérios Minor
1. Esclerodactilia
2. Cicatrizes punctiformes ou perda de substância das polpas digitais – áreas atróficas cicatriciais nas polpas digitais ou perda de polpa digital por isquemia.
3. Fibrose pulmonar bilateral
*De acordo com o American College of Rheumatology (ACR) 1982
O diagnóstico de esclerodermia também pode ser estabelecido se o doente tiver pelo menos três das cinco características da síndrome de CREST (calcinose, fenómeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia e telangiectasias) [18].
1.2.3 Fisiopatologia
A causa da esclerodermia é desconhecida, no entanto, sabe-se que existem três fatores principais que participam nos mecanismos da doença, os quais são:
1. Vasculopatia
O envolvimento vascular na esclerodermia é extenso e tem consequências clínicas importantes. Um dos sintomas iniciais é o fenómeno de Raynaud. Se o fenómeno de Raynaud
isolado é relativamente benigno e não progressivo, em doentes com esclerodermia está associado a mudanças irreversíveis morfológicas e funcionais. A lesão endotelial resulta de um dano mediado por radicais livres, e fatores citotóxicos como proteases do soro e fatores do complemento. Este processo afeta capilares, arteríolas e mesmo vasos maiores em vários órgãos, resultando num fluxo sanguíneo reduzido e oxigenação tecidual comprometida. O dano endotelial promove a agregação plaquetária com libertação de agentes vasoconstritores. O comprometimento vascular é agravado depois pela fibrinólise.
2. Sistema Imune desregulado e hiperactivo
Numa fase precoce da patologia, as células T ativadas e os monócitos acumulam-se na pele lesionada, nos pulmões e em outros órgãos afetados. As células endoteliais expressam ICAM-1 e outras moléculas de adesão que facilitam a diapedese dos leucócitos. Os macrófagos ativados e as células T são responsáveis por uma resposta imune polarizada para o fenótipo TH2. As citocinas produzidas pelos leucócitos TH2 induzem a produção de TGF-β e promovem a síntese de colagénio e outros agentes pro-fibróticos, enquanto a secreção de Interferão gama IFN-Y pelos linfócitos TH1 inibe e bloqueia a ativação dos fibroblastos [16].
3. Aumento da produção e deposição de colagénio nos tecidos
O colagénio é uma proteína constituinte do tecido conjuntivo, presente na pele e em todos os órgãos do corpo humano. A fibrose parece ser causada por citocinas pro-fibróticas, incluindo o fator-beta transformador de crescimento (TGF-β), interleucina-4 (IL-4) e fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), que favorece a deposição do colagénio nos vasos e nos tecidos
[16].
Existem vários fatores envolvidos na etiologia da esclerodermia. Uma contribuição genética para a doença é indicada pelo facto de 1,6% dos doentes com esclerodermia terem um familiar em primeiro grau com esclerodermia [19]. O risco de ocorrerem outras doenças
autoimunes, incluindo LES e AR está também aumentado.
Existem também fatores ambientais envolvidos na etiologia desta patologia. Os doentes com esclerodermia têm demonstrado possuir níveis superiores de anticorpos contra o
vírus foram propostos como possíveis fatores participativos na patogénese, nomeadamente: o parvovírus B19. Contudo, o papel etiológico das infeções virais permanece incerto.
1.3 Tratamento nas Doenças AutoImunes.
O tratamento das doenças autoimunes é um desafio, porque nenhuma intervenção terapêutica atualmente leva à cura, as exacerbações da doença podem ocorrer após anos de tratamento de manutenção, e os efeitos adversos dos fármacos podem ser tão ou mais nefastos do que a própria doença [21].
As opções de tratamento corrente incluem o uso de corticosteróides, Hidroxicloroquina e outros medicamentos imunosupressivos (Azatioprina, Micofenolato de mofetil e Ciclofosfamida). Recentemente, o Belimumab foi aprovado pela FDA para tratamento do LES
[22].
A hipertensão pulmonar primária é uma complicação relativamente comum da esclerodermia, que afeta entre 5 a 12% destes doentes [23]. O seu aparecimento correlaciona-se
com morbilidade significativa e um pior prognóstico. Têm sido observados níveis elevados de endotelina-1, que tem propriedades vasoconstritoras, na circulação e nos pulmões destes doentes. Os antagonistas da endotelina (Bosentan, Sitaxsentan e Ambrisentan) têm sido empregues por melhorarem os sintomas e a sobrevida destes doentes [24].
O desenvolvimento de tratamentos biológicos obteve excelentes resultados na AR, mas não tanto no LES [22]. A terapêutica biológica centra-se no bloqueio de células co-estimuladoras
ou acessórias, no uso de anticorpos monoclonais (anti CD-20, anti TNF-a, entre outros), na modulação do complemento e na inibição de citocinas (IL-1, IL-6, IL-10, IL-18, entre outras)[21].
Nos últimos 15 anos, mais de 1500 doentes com patologias autoimunes, a nível mundial, realizaram transplante de células estaminais, a maioria dos quais autólogos [25]. Deste grupo
fizeram parte, quer doentes com LES, quer doentes com Esclerodermia. No global, registaram-se taxas de sobrevida aos 5 anos na ordem de 85% [25].
1.4 – Vitamina D e Doenças AutoImunes
A Vitamina D (VD) é a denominação comum de um grupo de esteróides implicador, não só no metabolismo fosfocálcico, como também na proliferação celular e na diferenciação, quer de células normais, quer de células neoplásicas.
A VD funciona como uma hormona, e à semelhança das hormonas esteróides e tiroideias entra nas células e atua através de recetores nucleares.
A principal fonte da VD é a conversão de 7-dehidrocolesterol na percursora da vitamina D3 (VD3) ou cholecalciferol, que ocorre na pele através da estimulação da radiação UV. Uma quantidade inferior de vitamina D é obtida através da alimentação. A VD3 sofre uma 25-hidroxilação no fígado, formando 25-OH-vitamin D [25(OH)D] ou calcidiol. A forma ativa, 1,25(OH)2D, ou calcitriol, é sintetizada no rim pela 25(OH) VD hidroxilase, uma enzima que é induzida pela paratormona (PTH).
A VD é um imunossupressor efetivo, inibe a ativação de linfócitos B e a produção de citocinas e em modelos animais foi demonstrado que previne ou suprime o desenvolvimento de doenças autoimunes [26].
A carência da VD, além da deficiente mineralização e consolidação ósseas, tem sido associada a maior risco cardiovascular, ao desenvolvimento de hipertensão e ao aparecimento de dislipidemia [27]. Alguns estudos têm sugerido que a suplementação com
vitamina D em crianças reduz o risco de diabetes tipo 1 [28]. A deficiência de vitamina D
também tem sido ligada a um aumento de incidência de esquizofrenia, depressão e risco de suicídio [29] [30].
Vários estudos têm correlacionado deficiência de vitamina D e suscetibilidade a infeções respiratórias, nomeadamente infeção por Mycobacterium tuberculosis e bactérias Gram-negativo [31][32].
Embora não haja um consenso acerca dos níveis ótimos de VD medidos no soro, a deficiência de vitamina D é definida pela maioria dos autores como um nível de 25-hidroxivitamina D menor que 50 nmol/L [33].Assim, tem sido estimado que cerca de um
bilião de pessoas em todo o mundo têm algum grau de insuficiência de vitamina D [34] [35].
A VD tem sido implicada como um dos fatores ambientais que pode contribuir ou exacerbar manifestações de autoimunidade [36]. Tem-se constatado níveis baixos de VD
no soro em várias patologias autoimunes, incluindo as doenças inflamatórias intestinais, o LES, a Esclerodermia, a Esclerose Múltipla, a Diabetes Mellitus tipo 1 e AR. [37-40].
Uma das características clínicas do Lúpus é a fotossensibilidade, o que faz com que estes doentes sejam uma população em risco para desenvolver deficiência de VD. O uso crónico de corticoterapia, e de Hidroxicloroquina, a existência de anticorpos anti-vitamina D e mesmo algum compromisso renal são outros fatores que podem contribuir para explicar os baixos níveis de VD.
Os níveis de Vitamina D foram associados inclusive à atividade da doença, através do índice SLEDAI, demonstrando-se quantidades menores de vitamina D no soro
dos doentes com pontuações mais altas no SLEDAI em vários estudos, de diversas populações [39] [41-43]. Alguns trabalhos apontam um aumento do risco de fraturas nos
doentes com LES, também associado ao défice de vitamina D [44] [45].
Na Esclerodermia, vários estudos documentaram níveis mais baixos de Vitamina D no soro destes doentes, quando comparados com uma população controlo [46-48], o que se
pode dever a vários fatores. O espessamento fibroso dérmico com dano capilar pode levar a uma síntese reduzida da VD a partir do 7-dehidrocolesterol. Uma outra causa pode ser a hiperpigmentação cutânea destes doentes. Além disso, o envolvimento gastrointestinal nesta patologia pode levar a comprometimento da absorção da vitamina D proveniente da dieta. Os doentes com esclerodermia têm igualmente tendência, em virtude da doença, a uma vida sedentária com uma diminuição correspondente de exposição solar [46]. Alguns
estudos demonstraram diminuição de massa óssea em doentes com esclerodermia, associado a hipovitaminose D [49]. Porém, existem também estudos que não encontraram
uma relação da esclerodermia com os níveis da vitamina D [50] [51].
As populações do hemisfério norte, cuja exposição a radiação UV é menor, têm mais propensão a ser vitamina D deficientes, e esta deficiência pode, pelo menos em parte, justificar uma maior prevalência de doenças autoimunes.
1.5 Receptor da Vitamina D
Nas últimas décadas, o conhecimento acerca do metabolismo e da fisiologia da VD, assim como a descoberta dos recetores da VD, permitiu demonstrar que a sua importância ultrapassa a conhecida homeostasia fosfocálcica.
O recetor da VD (VDR, Vitamin D Receptor), também conhecido como recetor do calcitriol, é um membro dos recetores nucleares (NR1|1) da família dos fatores de transcrição e mostra similaridades estruturais com as hormonas tiróideas e esteróides [26].
Após a ligação da VD ao seu recetor, este (VDR) forma um heterodímero com o recetor retinóide-X e liga-se a elementos que respondem a este estímulo no ácido desoxirribonucléico (ADN), resultando na expressão ou repressão de produtos genéticos específicos [26].
Os recetores da VD além de estarem presentes em diferentes tecidos como: osso, pele, intestino e rim, foram também identificados em várias células do sistema imune, tais como os linfócitos ativados, macrófagos e células dendríticas [26] [52].
O gene que codifica para o VDR, localiza-se no cromossoma 12q13.1 e contém aproximadamente 100kb divididas em 8 intrões e 9 exões. Os polimorfismos do gene do
VDR mais estudados são o ApaI (rs7975232), o BsmI (rs1544410), o FokI (rs10735810) e o TaqI (rs731236). O polimorfismo FokI encontra-se no codão de iniciação, e o polimorfismo TaqI no exão 9. O BsmI e ApaI ambos se localizam no intrão 8.
Fig.1 Vitamin D Receptor (Uitterlinden et al. 2004)
Os polimorfismos BsmI, TaqI e ApaI demonstraram-se estar em desequilíbrio de ligação [26].
Os polimorfismos do VDR têm sido associados à suscetibilidade para neoplasias [53],
para infeções bacterianas e virais, para doenças autoimunes e para alergias. Relativamente às neoplasias, os polimorfismos têm sido associados sobretudo ao cancro da mama [54], cancro da pele [55], da próstata [56] e coloretal [57]. O gene VDR por si já foi
associado como tendo um papel no envelhecimento e longevidade [58]. Foram observadas
relações entre os polimorfismos VDR com a densidade mineral óssea e com a ocorrência de fraturas [59] [60],assim como a osteoporose [61].
A VD parece interagir com o sistema imune através da sua ação sobre a regulação e diferenciação de células como linfócitos, macrófagos e células natural killer, além de interferir na produção de citocinas in vivo e in vitro [62]. Entre os efeitos
imunomodeladores destacam-se: a diminuição da produção de Interleucina-2 (IL-2), do Interferão-gama (IFN-y) (tendo já sido demonstrado, que o inibe de uma forma dose dependente [63] e do Fator de Necrose Tumoral (TNF, Tumor Necrosis Factor); inibição
da expressão da IL-6 e da secreção e produção de auto-anticorpos pelos linfócitos B. O efeito imune da VD é exercido principalmente nas células apresentadoras de antigénio, nomeadamente as células dendríticas. A VD inibe a maturação e diferenciação de células dendríticas e reduz a expressão das moléculas do Complexo Major de Histocompatibilidade (MHC, Major Histocompatibility Complex) da classe II e de moléculas co-estimulatórias (CD40, CD80 e CD86), necessárias à apresentação antigénica.
A VD tem também um papel fundamental na secreção de citocinas pelas células dendríticas. A IL-12 é uma citocina imunoestimuladora secretada pelas células dendríticas, crucial na polarização do sistema imune para o fenótipo T helper 1 (Th1). A 1,25(OH)2D3 inibe a IL-12 e, assim, muda o fenótipo de resposta imune para T helper 2 (Th2). Além disso, aumenta a produção de IL-10, uma citocina com amplas atividades inflamatórias e da quimiocina MIP-3a, envolvida no recrutamento de células T reguladoras[64] [65].
A VD estimula também as funções de quimiotaxia e fagocitose, potencializando as atividades antimicrobianas das células mielóides[66]. Tem sido também descrito um papel
imunomodelador da vitamina D na infeção por Mycobacterium tuberculosis [32].
A VD demonstrou desempenhar efeitos importantes nas linhas celulares: Th1, Th17 e T reguladoras. In vitro, a 1,25(OH)2D3 inibe a proliferação de células T e a secreção das citocinas pelas Th1, primariamente IFN-y e IL-2, assim como a secreção das citocinas pelas Th17: a Il-17 e IL-21 [67]. Para além disso, a 1,25(OH)2D3 aumenta a secreção de
citocinas Th2 (Il-4, IL-5 e IL-10).
A capacidade de agonistas-VDR de potenciarem a indução de células T reguladoras tem sido demonstrada in vitro[65]. Além disso, agonistas-VDR revelaram aumentar as
capacidades supressoras das células T reguladoras. [68]
A VD tem vários efeitos inibitórios a nível dos linfócitos B, nomeadamente: inibe a proliferação dos linfócitos B, a diferenciação para plasmócitos e a secreção de imunoglobulinas assim como a indução de células B de memória e a indução de apoptose das células B [49].
Considerando que a VD tem uma semivida curta (4-6 horas) e a necessidade de concentrações elevadas (superiores às fisiológicas) para induzir a modulação das células do sistema imune, é improvável que as ações imunomodeladoras dependam apenas dos níveis sistémicos da VD. Neste contexto, a descoberta da expressão de enzimas metabolizadoras da vitamina D em várias células alvo da VD, nomeadamente as células do sistema imune, representou um importante avanço científico. Várias células imunes,
incluindo os macrófagos, células dendríticas e até os linfócitos T e B expressam as enzimas 1-alfa-hydroxylase (CYP27B1), enquanto que as células dendríticas expressam 25-hydroxylase (CYP2R1). Além disso, foi demonstrado que estas células são capazes de
converter percursores da VD em VD ativa [64].
A presença destas enzimas metabolizadoras da vitamina D e a sua regulação por vias de sinalização celular evidenciam o papel autócrino e parácrino da vitamina D na fisiologia do sistema imune.
Fig.2 Funções Imunomodeladoras da VD (Femke Baeke et al. Current Opinion in Pharmacology 2010)
Estudos demonstraram que a vitamina D também possui um efeito anti-fibrótico. A TGF-β1 é uma citocina chave na esclerodermia e despoleta vários eventos fibróticos [70].
Culturas de células multipotentes mesenquimais com vitamina D permitiram observar a diminuição da expressão de TGF-β1 e concomitantemente a diminuição de expressão de colagénio I e III. Além disso, a vitamina D aumenta a expressão de alguns fatores anti-fibróticos[71].Tem sido demonstrado que a Vitamina D tem um papel nos fibroblastos
pulmonares, que expressam o recetor da vitamina D. Além disso, a vitamina D diminui a expressão do colagénio e fibronectina nos miofibroblastos induzida pelo TGFβ. A vitamina D também atua na diferenciação das células epiteliais pulmonares em miofibroblastos, um mecanismo potencialmente importante na fibrose pulmonar, que ocorre na esclerodermia [72].
Com este trabalho pretendeu-se investigar se os polimorfismos BsmI, FokI e TaqI do gene do VDR contribuem para a suscetibilidade do LES e da Esclerodermia. Os resultados obtidos foram comparados com os de uma população controlo do Norte de Portugal.
2.Materiais e Métodos
2.1 População em estudo
O grupo de estudo consistiu em 186 doentes portugueses com LES (172 mulheres e 14 homens) e 54 doentes portugueses com esclerodermia (53 mulheres e 1 homem). Estes doentes frequentam regularmente a consulta de Imunologia Clínica do Centro Hospitalar do Porto. O diagnóstico de LES e de Esclerodermia foi efetuado acordo com os critérios da ACR (American
College of Rheumatology) [73]. Os dados, idade do doente, sexo, data de instalação da doença, primeiro sintoma antes do diagnóstico, sintomatologia relacionada com o espectro da patologia, necessidade de realização de diálise e comorbilidades associadas foram obtidos através da consulta dos processos clínicos (tarefa supervisionada por um médico responsável).
A atividade do lúpus foi estimada utilizando o índice SLEDAI (Disease Activity Index for
Lupus Patients) (Ver: Anexos), tendo-se estratificado os doentes em dois grupos SLEDAI ≥ 4
(doença moderada a grave), e SLEDAI < 4 (doença ligeira).
A atividade da esclerodermia foi estimada utilizando o índice Medsger (Ver: Anexos), um índice que avalia o envolvimento da doença em nove sistemas de órgãos. O grupo foi constituído por 49 doentes (dos 54, sobre o qual o estudo incidia), em que o valor máximo obtido foi de 14, a média era de 3.86 e o desvio padrão de 2.432
O grupo controlo consistiu de 192 voluntários não relacionados, originários da mesma região, dadores de sangue e indivíduos do hospital e da faculdade, sem história de doença autoimune ou de outras doenças crónicas.
Foi obtido consentimento informado, quer dos doentes, quer dos controlos.
O estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsínquia e foi aprovado pela comissão de ética do HGSA.
2.2 Genotipagem
Foi colhida uma amostra de sangue periférico a todos os intervenientes, destinada à extração de ADN. As amostras foram obtidas no HGSA e no ICBAS em tubos EDTA. A genotipagem do gene VDR foi realizada pela técnica do PCR (Polimerase Chain Reaction) em tempo real, com a utilização de sondas Taqman, em ADN extraído das células de sangue periférico, a plataforma ROTOR-Gene 6000 e utilizando kits comerciais ®Applied Biosystem.
Estas análises foram efetuadas no Laboratório de Imunogenética do ICBAS/UP.
2.3 Análise Estatística
Na tentativa de associar determinado alelo ou genótipo com um maior ou menor risco de desenvolver doença e com algumas características clínicas, genotiparam-se três polimorfismos VDR em três populações, com LES, com Esclerodermia e população de controlo. Calculou-se, então, a frequência de cada alelo e de cada genótipo para verificar se existia uma diferença estatisticamente significativa entre as diferentes populações. Para tal recorreu-se ao t de χ2 ou ao
Teste Exato de Fisher, quando apropriado.
Os valores de Odds Ratios (OR) quantificam a probabilidade de um indivíduo que possua determinado alelo desenvolver a doença, comparativamente aos que não possuem o alelo, tendo sido utilizados como uma aproximação ao risco relativo.
Utilizou-se o teste t student para estimar a relação entre o índice de Medsger, o SLEDAI e os diferentes genótipos dos polimorfismos do VDR. As análises realizaram-se com o software SPSS (Statistics Package for the Social Sciences) v.18. Um valor de p < 0.05 foi considerado ser significativo.
3.1 Distribuição dos genótipos VDR e frequências alélicas nos doentes com lúpus e nos doentes com esclerodermia
A distribuição da frequência dos genótipos VDR e das frequências alélicas dos polimorfismos analisados não diferiram significativamente entre os doentes com lúpus, e a população controlo (tabela III).
Por outro lado, a frequência do genótipo TT do FokI estava significativamente superior nos doentes com Esclerodermia (20.8%), quando comparada com os doentes com LES (11.6%) e com os controlos (9.4%) (Tabela IV e Fig.4).
De notar ainda que a frequência do genótipo TT do polimorfismo TaqI estava superior, quer em doentes com LES (36.6%), quer em doentes com esclerodermia (37%), quando comparada com a determinada para a população controlo, mas sem significado estatístico. (Tabela III e IV).
Na análise dos genótipos dos polimorfismos do gene do VDR e as manifestações clínicas e dados laboratoriais do lúpus não foram observadas diferenças estatisticamente significativas. As variáveis clínicas analisadas foram as seguintes: presença de artrite, de eritema malar, de fotossensibilidade, de lúpus discóide, de nefrite ou de serosite, de alterações no sistema nervoso central e periférico, alterações hematológicas e número de órgãos envolvidos.
Não se encontrou igualmente nenhuma relação estatisticamente significativa entre os genótipos dos polimorfismos do gene VDR e as características clínicas dos doentes com esclerodermia, que foram analisadas: envolvimento vascular periférico, envolvimento mucocutâneo, muscular, do trato gastrointestinal, pulmonar, cardíaco e renal.
Tabela III: Frequências dos Genótipos VDR e frequências alélicas nos doentes com lúpus e controlos
Polimorfismo Controlos, n(%) Doentes, n(%) Odds ratio(95% IC) Valorp
BsmI genótipo n= 186 n= 177 GG 55 (29.6) 61 (34.5) 1.25 (0.81-1.95) 0.318 GA 93 (50.0) 86 (48.6) 0.95 (0.63-1.43) 0.788 AA 38 (20.4) 30 (16.9) 0.79 (0.47-1.35) 0.396 BsmI alelo n= 372 n=354 G 203 (54.6) 208 (58.8) 1.19 (0.88-1.59) 0.255 A 169 (45.4) 146 (41.2) 0.84 (0.63-1.13) 0.255 FokI genótipo n= 192 n=181 CC 90 (47.0) 83 (45.9) 0.96 (0.64-1.44) 0.844 CT 84 (43.8) 77 (42.5) 0.95 (0.63-1.43) 0.814 TT 18 (9.4) 21 (11.6) 1.27 (0.65-2.47) 0.482
FokI alelo n= 384 n= 362 C 264 (68.8) 243 (67.1) 0.93 (0.68-1.26) 0.635 T 120 (31.3) 119 (32.9) 1.08 (0.79-1.47) 0.635 TaqI genótipo n= 179 n= 186 CC 34 (19.0) 29 (15.6) 0.79 (0.46-1.36) 0.390 CT 93 (52.0) 89 (47.8) 0.85 (0.56-1.28) 0.433 TT 52 (29.1) 68 (36.6) 1.41 (0.91-2.18) 0.127 TaqI alelo n= 358 n = 372 C 161 (45.0) 147 (39.5) 0.80 (0.60-1.07) 0.136 T 197 (55.0) 225 (60.5) 1.25 (0.93-1.68) 0.136
Tabela IV: Frequências dos Genótipos VDR e frequências alélicas nos doentes com esclerodermia e controlos
Polimorfismo Controlos, n(%) Doentes, n(%) Odds ratio(95% IC) Valorp
BsmI genótipo n= 186 n= 54 GG 55 (29.6) 21 (38.9) 1.52 (0.81-2.85) 0.195 GA 93 (50.0) 24 (44.4) 0.80 (0.44-1.47) 0.472 AA 38 (20.4) 9 (16.7) 0.78 (0.35-1.73) 0.540 BsmI alelo n= 372 n=108 G 203 (54.6) 66 (61.1) 1.31 (0.84-2.03) 0.228 A 169 (45.4) 42 (38.9) 0.76 (0.49-1.18) 0.228 FokI genótipo n= 192 n=53 CC 90 (47.0) 27 (50.9) 1.18 (0.64-2.16) 0.600 CT 84 (43.8) 15 (28.3) 0.51 (0.26-0.98) 0.042 TT 18 (9.4) 11 (20.8) 2.53 (1.11-5.76) 0.023 FokI alelo n= 384 n= 106 C 264 (68.8) 69 (65.1) 0.85 (0.54-1.33) 0.475 T 120 (31.3) 37 (34.9) 1.18 (0.75-1.86) 0.475 TaqI genótipo n= 179 n= 54 CC 34 (19.0) 8 (14.8) 0.74 (0.32-1.72) 0.484 CT 93 (52.0) 26 (48.1) 0.86 (0.47-1.58) 0.624 TT 52 (29.1) 20 (37.0) 1.44 (0.76-2.72) 0.266
TaqI alelo n= 358 n = 108
C 161 (45.0) 42 (38.9) 0.78 (0.50-1.21) 0.264 T 197 (55.0) 66 (61.1) 1.28 (0.83-1.99) 0.264
n = número; IC = intervalo de confiança.
Fig. 3: Frequências do polimorfismo BsmI
Fig. 5: Frequências do polimorfismo TaqI
3.2 Genótipos VDR e a actividade do lúpus e da esclerodermia
Para comparar a distribuição dos genótipos dos polimorfismos VDR com a atividade do lúpus e da esclerodermia utilizaram-se, respetivamente, duas escalas: o Índice SLEDAI e o Índice
Medsger, como uma medida de atividade da doença.
Relativamente aos doentes com lúpus, observaram-se diferenças estatisticamente significativas no genótipo TT do polimorfismo FokI (Tabela V
)
(Fig.8). Comparando as médias do SLEDAI e a presença ou ausência do genótipo, através do teste t student, observámos que o genótipo TT estava presente em 20 doentes com uma média de SLEDAI de 2.20, e ausente em 133 doentes com uma média de SLEDAI de 4.60 (valor p = 0.021) (Tabela V).Os doentes com LES foram estratificados em dois grupos de acordo com o Índice de SLEDAI. No grupo com SLEDAI ≥ 4, a frequência obtida do genótipo TT do FokI foi de 6,2% dos doentes, enquanto no grupo com SLEDAI < 4, esta frequência foi de 20,8% dos doentes (valor p = 0.007) (Tabela VI) (Fig.6).
Não houve diferenças estatisticamente significativas relativamente aos outros polimorfismos e genótipos.
Fig. 6: Frequências genotípicas e alélicas do FokI VDR em doentes com lúpus com SLEDAI < 4 e SLEDAI ≥4 FokI (doentes)N Média de pontuaçã o SLEDAI Desvio Padrão Valor p Genótipo TT 20 22.000 323.793 0.021 Outros genótipos 133 46.090 442.074
Tabela V: Genótipo TT do polimorfismo FokI e atividade da doença (SLEDAI) em doentes com lúpus
Genótipo do FokI SLEDAI < 4 (n=72) SLEDAI ≥ 4 (n=81) Valor P CC / CT 79.2% 93.8% N.S TT 20.8% 6.2% 0.007
Tabela VI: Genótipos do polimorfismo FokI e atividade da doença (SLEDAI) em doentes com Lúpus
Relativamente aos doentes com esclerodermia, observaram-se diferenças estatisticamente significativas, na relação de o índice de Medsger com alguns dos genótipos dos polimorfismos VDR. Encontraram-se diferenças nas frequências dos genótipos CC do polimorfismo TaqI e nos genótipos AA e GG do polimorfismo BsmI, sendo que a associação encontrada para ambos os genótipos foi com a pontuação de Medsger mais baixa.
Polimorfismo Genótipo N Média do Índice de Medsger Desvio padrão Valorp Do VDR BsmI GG 20 4.65 2.996 0.043 28 3.21 1.771
GA 21 3.67 1.742 0.716 27 3.93 2.895 AA 7 1.86 1.069 0,02 41 4.15 2.455 FokI CC 24 4.25 2.770 0.263 23 3.39 2.061 CT 14 3.79 2.190 0.794 33 3.85 2.600 TT 9 2.78 1.787 0.156 38 4.08 2.551 TaqI CC 7 1.86 1.069 0.020 41 4.15 2.455 CT 23 4.17 2.725 0.330 25 3.48 2.143 TT 18 4.11 2.139 0.517 30 3.63 2.619
Tabela VII: Relação dos polimorfismos do VDR com o índice de Medsger, aplicado aos doentes com esclerodermia.
4.Discussão
O LES e a Esclerodermia são patologias autoimunes com uma etiologia complexa e multifatorial, na qual intervêm vários fatores imunogenéticos.
Nos doentes com LES e Esclerodermia, avaliou-se a atividade da doença, de forma a caracterizar melhor estas populações. Nos doentes com lúpus foi utilizado o índice SLEDAI, que avalia a atividade da doença. O SLEDAI tem 24 variáveis, 16 das quais são variáveis clínicas, e oito variáveis imunológicas, cada uma com um peso diferente. Estes itens são atribuídos consoante as manifestações estão presentes ou ausentes nos dez dias anteriores. A máxima pontuação possível é de 105, sendo que pontuações acima de 20 são extremamente raros [74].
Nos doentes com esclerodermia, utilizou-se o índice Medsger [75]. Este índice avalia nove
sistemas, de acordo com a gravidade, atribuindo, a cada um, um valor de 0 a 4, dependendo se existe ou não envolvimento ligeiro, moderado, severo ou terminal: sintomas gerais, vascular
periférico, pele, articulações, muscular, tracto digestivo, pulmões, coração e rins (máxima pontuação = 36).
A deficiência de vitamina D tem sido reconhecida como um problema de saúde pública na população em geral, e naqueles com doenças inflamatórias crónicas [76]. A VD tem vindo a ser usada terapeuticamente em algumas doenças autoimunes, ainda que a sua eficácia e contributo efetivo no tratamento não estejam ainda totalmente esclarecidos.
Vários estudos demonstraram que a ação biológica da vitamina D se estende além do metabolismo fosfocálcico, e inclui vários efeitos no sistema imune, no crescimento e diferenciação de várias linhagens celulares [2] [62]. Alguns estudos têm demonstrado estados de hipovitaminose D, quer nos doentes com lúpus [77-81], quer nos doentes com esclerodermia [82] [83].
A maioria das atividades biológicas da vitamina D é mediada pelo seu recetor (VDR). A variação genética no VDR pode levar a disfunção significativa do recetor, o que afeta o metabolismo cálcico, a proliferação celular e a resposta imune. Um bom exemplo da importância do VDR são as mutações deletérias no mesmo, que causam raquitismo resistente à vitamina D, uma doença monogénica bastante rara [84].
As variações nas sequências de ADN que ocorrem, em pelo menos 1% da população, são chamadas de “polimorfismos”. Diferentes polimorfismos do VDR têm sido descritos e associados a patologias, como neoplasias, patologias autoimunes, infeções, doenças cardiovasculares, mas o papel destes polimorfismos na expressão e função da proteína VDR necessita ainda de maior clarificação. [85]. A associação de um determinado polimorfismo com
um fenótipo clínico não significa necessariamente que esse polimorfismo seja responsável por esse fenótipo. A frequência de determinados polimorfismos pode ser diferente da esperada, devido à formação de haplótipos, transmitidos em bloco. Este fenómeno designa-se por desequilíbrio de ligação [85]. Tem-se encontrado um grau forte de desequilíbrio de ligação entre o
TaqI, BsmI e ApaI [85].
Vários polimorfismos do VDR têm sido estudados em diferentes populações em estudos de associação com a suscetibilidade para algumas doenças que envolvem o sistema imune, mas com resultados inconclusivos [86]. Para esclarecer a contribuição dos polimorfismos VDR na
suscetibilidade genética dos doentes portugueses com LES e Esclerodermia conduzimos um estudo retrospetivo caso-controlo, através da análise de três polimorfismos VDR
Estudámos os polimorfismos TaqI, BsmI e FokI. Ao contrário do FokI, os polimorfismos BsmI, ApaI e TaqI estão localizados perto da região 3´, na região reguladora, com forte desequilíbrio de ligação, como já foi referido. Estão envolvidos sobretudo na regulação da estabilidade do mRNA [87]. Estão descritos dois haplótipos mais frequentes nestes
polimorfismos: o “baT” (haplótipo 1) e o “BAt” (haplótipo 2). Parece haver uma tendência para o haplótipo BAt demonstrar melhores respostas a tratamento com vitamina D, do que o haplótipo baT, em estudos in vitro [87]. Especula-se que tal resposta se deva a uma melhor estabilidade a
nível do mRNA e da sua semivida. Isto resultaria teoricamente num aumento de expressão dos recetores VDR presentes nas células alvo, possibilitando assim as mesmas de responderem melhor à vitamina D [87].
Por outro lado, o FokI está localizado no exão 2, e consiste de uma mutação de uma base T para uma base C. Esta mutação está dentro de um codão de iniciação. Assim quando a variante C está presente, um sítio alternativo é usado, levando a uma proteína com um tamanho diferente. A maioria dos estudos conduzidos até agora mostra que a versão mais curta da proteína (Alelo C ou “F”, dependendo da terminologia usada) e que possui 424 aminoácidos é mais ativa que a forma longa (Alelo T ou “f”), que possui 427 aminoácidos, em termos de atividade como fator transcricional [88].
Jurutka et al. (2000) demonstraram que a proteína VDR com 424 aminoácidos interage mais eficientemente com o fator de transcrição TFIIB, originando uma proteína VDR mais potente [89]. Estes resultados foram confirmados por Colin et al. (2000), que constataram que as
células mononucleares periféricas que tinham o alelo C (correspondendo à variante curta 424 aa) possuíam um VDR mais ativo [90].
No nosso estudo, não encontrámos nenhuma evidência de associação genotípica ou alélica dos polimorfismos FokI T>C, do BsmI A>G e do TaqI C>T do gene VDR com o LES.
Por outro lado, obtivemos uma frequência do genótipo TT do FokI significativamente maior nos doentes com Esclerodermia (20.8%), quando comparados com os doentes com LES (11.6%) e com os controlos (9.4%) (Tabela IV), sugerindo que o genótipo TT confere alguma suscetibilidade ao desenvolvimento de Esclerodermia.
Não encontrámos nenhuma evidência de associação genotípica ou alélica dos mesmos polimorfismos com as diferentes características clínicas, quer do LES, quer da Esclerodermia
.Relativamente à gravidade das doenças autoimunes, ao analisar a distribuição dos genótipos VDR de acordo com o SLEDAI, obtivemos resultados que sugerem que o genótipo TT do FokI está associado a uma atividade reduzida da doença no Lúpus. No grupo SLEDAI menor que 4, registou-se a presença deste genótipo em 20,8% dos doentes, por outro lado, no grupo com SLEDAI igual ou superior que quatro, o mesmo estava presente em apenas 6.2% dos doentes (valor p= 0.007). Como já foi referido, estudos demonstram que um polimorfismo no FokI, localizado no codão start, cria uma proteína com um diferente comprimento. A proteína mais curta (Alelo C) parece ser mais ativa que a variante mais longa (alelo T). Comparando com
o alelo T, o alelo C exerce mais atividade transcricional a nível do sistema imune, assim como tem um importante papel a nível da proliferação e síntese de citocinas pelo sistema imune. Orton SM et al (2011) encontrou concentrações de vitamina D estatisticamente menores nos genótipos FokI CC, relativamente aos genótipos FokI TT [91]. De igual forma, Smolders et al (2009)
denotaram concentrações de vitamina D estatisticamente inferiores no genótipo CC quando comparado ao genótipo TT [92]. Ambos os estudos foram realizados em doentes com Esclerose
Múltipla.
Os nossos resultados que apontam para uma menor atividade do Lúpus nos doentes que expressam o genótipo TT do FokI estão também de acordo com o estudo realizado em 2011 numa população chinesa por Luo XY et al que concluiu que, além do genótipo CC e TC serem mais prevalentes nos doentes com LES quando comparados com os controlos, os doentes que expressam o alelo C têm maior probabilidade de desenvolver algumas manifestações clínicas e laboratoriais, características do LES, nomeadamente: serosite, anticorpos anti-dsDNA, anticorpos anti-Sm e anticorpos anti-histonas [93].
Lee YH et al publicaram em 2011 uma meta-análise sobre os polimorfismos do VDR e a suscetibilidade à AR e ao LES, concluindo que o genótipo CC o alelo C do polimorfismo FokI conferiam suscetibilidade ao desenvolvimento de AR nos indivíduos de ascendência europeia
[94].
A maioria dos estudos conduzidos neste âmbito em doentes com LES focaram-se unicamente no polimorfismo BsmI. Ozaki Y et al (2000) num estudo com 58 doentes japoneses apontou o genótipo GG como capaz de despoletar o desenvolvimento de lúpus e reportou que o genótipo AA estava associado à nefrite lúpica [95]. Por outro lado, Sakulpipatsin W et al (2006),
numa população tailandesa, não conseguiu demonstrar uma relação estatisticamente significativa entre os polimorfismos BsmI nos doentes com Lúpus, e as características clínicas dos mesmos, apresentando por isso conclusões sobreponíveis ao nosso estudo [96]. C-M Huang et al (2002)
demonstrou um aumento da frequência do genótipo GG e diminuição do genótipo AA nos doentes com lúpus, assim como um aumento da frequência do alelo G, embora sem se verificarem associações entre as variações alélicas do genótipo do VDR e as diferentes manifestações clínicas [97]. De igual forma, X-Y Luo et al (2012) mostrou que a frequência do
alelo G estava aumentada no Lúpus relativamente ao grupo de controlo, apesar de a distribuição dos polimorfismos BsmI em termos de frequências genotípicas não diferir significativamente entre doentes e controlos [98]. Neste estudo, o alelo G foi associado à nefrite lúpica assim como à
produção de anticorpos anti-nucleossómicos. Monticielo AO (2012) não conseguiu encontrar uma associação positiva entre os polimorfismos do BsmI e FokI e os doentes brasileiros com
LES. Por outro lado, demonstrou que o genótipo TT do FokI estava correlacionado com concentrações séricas mais altas de vitamina D, relativamente ao genótipo CC [99].
Ao utilizar o Índice de Medsger como medida para estratificar a gravidade e atingimento da doença, os nossos resultados parecem indiciar os polimorfismos BsmI AA e TaqI CC como fatores protetores da atividade da doença (Tabela VII), embora não diminuam a suscetibilidade ao desenvolvimento da mesma (Tabela IV). Estes dois resultados significativos são muito frequentes de aparecer juntos, dado encontrarem-se em desequilíbrio de ligação, como também já referido. Não existem estudos realizados no âmbito da esclerodermia para compararmos os nossos resultados.
No grupo de doentes com esclerodermia, registámos a mesma tendência que se verificou nos doentes com LES, relativamente ao FokI TT, sem que, contudo, se tenha conseguido uma diferença estatisticamente significativa. Os doentes com esclerodermia que expressam o FokI TT apresentam um índice de Medsger mais baixo (2.78) que os doentes que não expressam o FokI TT (4.08), sugerindo que o mesmo protege contra a gravidade da doença (p=0.156) (tabela V).
Este estudo, ao caracterizar os polimorfismos genéticos do VDR na população do Norte de Portugal, permite relacionar a frequência de polimorfismos específicos do VDR com doenças autoimunes, e fundamentar a utilização cada vez mais frequente de vitamina D no tratamento das doenças autoimunes.
A descoberta de variantes genéticas associadas à suscetibilidade de doenças pode ser a chave do futuro na medicina preventiva. No geral, usam-se estudos de associação para testar se determinado polimorfismo ocorre mais frequentemente nos doentes estudados, do que nos controlos. Se tal acontecer, esse achado suporta a ideia que o gene candidato está de alguma forma envolvido no desenvolvimento da doença. Devemos, contudo, relembrar que a interpretação destes estudos de associação deve ser cuidadosa já que a maioria dos polimorfismos usados têm um efeito funcional incerto, e é preciso também tentar perceber como é que o polimorfismo se relaciona com os outros, quer a nível genético, quer a nível funcional.
O presente trabalho apresenta algumas limitações. Devido a razões operacionais, não foi ainda possível estudar o polimorfismo ApaI (descrito anteriormente). Era também premente avaliar, não só o genótipo do VDR e os seus polimorfismos, mas também a sua atividade funcional e correlacioná-la com a concentração sérica da vitamina D dos doentes.
Existem ainda poucos estudos acerca dos polimorfismos VDR em Portugal. Um estudo de um grupo de investigadores do Porto, através da genotipagem dos polimorfismos TaqI do VDR , demonstrou uma contribuição dos genótipos VDR na suscetibilidade ao cancro da próstata, e realçou a importância dos genótipos VDR na definição de perfil de risco na população
em estudo [100]. Por outro lado, Manuel C Lemos et al (2007) num estudo com uma população
portuguesa, não conseguiu encontrar uma relação significativa entre a distribuição dos polimorfismos BsmI, TaqI, FokI e ApaI e a suscetibilidade à diabetes mellitus tipo 1 [86].
A razão para alguma disparidade de resultados em vários estudos pode dever-se ao pequeno número de amostras, baixo poder estatístico e heterogeneidade clínica nos grupos de doentes. Têm sido descritas variações importantes e significativas nas frequências dos genótipos dos polimorfismos do VDR em diferentes grupos étnicos. Essa diferença pode dever-se a processos evolutivos e comportamentos genéticos diferentes nas populações. Em geral, todos os polimorfismos começam como mutações que se podem “expandir” e aumentar a sua frequência numa população e tornarem-se assim verdadeiros polimorfismos.
Este trabalho reforça a existência mecanismos genéticos e fisiopatológicos comuns entre duas doenças autoimunes com bastante variabilidade clínica, não só entre elas, mas também entre os doentes que a manifestam. É admissível que as doenças autoimunes possam ter uma patogénese comum, tendo em conta fatores genéticos e epigenéticos por vezes sobreponíveis. A diferenciação numa ou noutra patologia poderá ser influenciada por vários fatores, como os polimorfismos do gene do VDR.
Em conclusão:
- Não foi observada evidência de associação genotípica ou alélica dos polimorfismos do gene
VDR estudados nos doentes com LES.
- Nos doentes com esclerodermia, a frequência observada do genótipo TT do FokI foi significativamente superior, quando comparada com os doentes com LES e com os controlos. A possibilidade do genótipo TT poder conferir suscetibilidade ao desenvolvimento da esclerodermia necessita de estudos mais alargados.
- Não foi observada nenhuma relação estatisticamente significativa entre os polimorfismos do VDR estudados e as características clínicas analisadas das duas patologias autoimunes.
- Relativamente à gravidade da doença, os resultados obtidos sugerem que o genótipo TT do FokI cursa com um atividade reduzida não só do LES, como também da esclerodermia, ainda que a associação seja estatisticamente significativa apenas no LES. Os genótipos AA do BsmI e CC do TaqI parecem ser protetores da gravidade da doença na Esclerodermia.
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