MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Efeito protetor do extrato de Arrabidaea chica contra o
câncer de mama quimicamente induzido em modelo animal
Keyla Borges Ferreira Rocha
NATAL/RN 2019
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AUTOR
Keyla Borges Ferreira Rocha
Efeito protetor do extrato de Arrabidaea chica contra o
câncer de mama quimicamente induzido em modelo animal
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Dr. Aldo da Cunha Medeiros
NATAL/RN 2019
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Ficha catalográfica
Rocha, Keyla Borges Ferreira.
Efeito protetor do extrato de Arrabidaea chica contra o câncer de mama quimicamente induzido em modelo animal / Keyla Borges Ferreira Rocha. - 2019.
63f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2019.
Orientador: Aldo da Cunha Medeiros.
1. Neoplasias da mama - Tese. 2. Câncer de mama - Tese. 3. 12-Dimetil-1,2-benzantraceno - Tese. 4. Arrabidaea chica - Tese. 5. Vincristina - Tese. I. Medeiros, Aldo da Cunha. II. Título. RN/UF/BS-CCS CDU 618.19-006
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde Prof. Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
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AUTOR
Keyla Borges Ferreira Rocha
Efeito protetor do extrato de Arrabidaea chica contra o
câncer de mama quimicamente induzido em modelo animal
Aprovada em 20 / 11 / 2019
Banca examinadora:
Presidente da Banca: Dr. Prof. Aldo da Cunha Medeiros
Membros da Banca: Dra. Prof. Lidiane Maria de Brito Macedo Ferreira Dr. Prof. Geraldo Barroso Cavalcante Júnior Dra. Amália Cínthia Meneses do Rêgo Dr. Eduardo Pereira de Azevedo
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DEDICATÓRIA
Ao meu esposo, meus filhos, minha mãe, irmãos, amigos, colegas de trabalho, alunos e todos aqueles que contribuíram direta e indiretamente para a realização deste trabalho.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao professor Aldo Medeiros orientador e idealizador deste trabalho, pela paciência e dedicação e por ter me conduzido de forma a chegar ao final deste projeto.
Agradeço a professora Cláudia Nunes Oliveira por todo incentivo, paciência e companherismo na jornada da vida e na pós graduação
Agradeço a Dr. Ítalo Medeiros de Azevedo pela contribuição na avaliação estatística, indispensável para conclusão do projeto.
Agradeço a Dr. Robson de Macedo Filho, Doutor em Ciências da Saúde, Especialista em Medicina Nuclear, que contribuiu para a realização dos exames do Petscan.
Agradeço aos funcionários do departamento de Patologia e em particular Rondineli de Oliveira Santos e Ana Rogéria Pereira da Silva.
Agradeço a minha família que pacientemente suportou as ausências e o cansaço, me incentivando e apoiando em todos os momentos.
Agradeço aos demais professores do Departamento de Patologia e
funcionários do Departamento de Patologia e Cirurgia Experimental da UFRN que permitiram realizar esta pós-graduação mesmo com tantas dificuldades de
professores no Departamento.
Agradeço a todos que contribuíram, e estiveram junto ou distante, motivaram e desejaram boa sorte nesta jornada.
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A vida somos nós que a construímos diariamente por isso lute e nunca desista de criar o que sempre sonhou.
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RESUMO
Objetivo: O objetivo do estudo foi examinar os efeitos de extrato de Arrabidaea chica
(crajiru), planta nativa da Amazônia, em modelo de carcinoma mamário induzido por 7,12-dimetil-benzantraceno (DMBA) em ratas Wistar. Método: Foi comparada a resposta do carcinoma mamário ao estrato de A. chica (EAC) administrado v.o. durante 16 semanas, associado ou não à vincristina. Grupos do desenho experimental: controle normal; grupo DMBA sem tratamento; DMBA tratado com EAC (300 mg/kg); grupo DMBA+Vincristina injetada i.p. 500µg/kg; DMBA+EAC+Vincristina 250µg/kg. Exames de imagem utilizando microPET e fluorescência, bioquímica, estresse oxidativo, hematologia e histopatologia foram utilizados para a validação dos tratamentos. Resultados: Todos os animais sobreviveram. Houve aumento gradual de peso em todos os grupos por 16 semanas, sem diferença significante entre eles (p>0,05). A administração v.o. de EAC e EAC+vincristina 50% reduziu significativamente (p<0,001) a incidência de tumores mamários examinados com PET-18FDG e fluorescência. Reduziu significativamente as transaminases séricas, o estresse oxidativo e a toxicidade hematológica. Os níveis de enzima antioxidante no tecido mamário foram significativamente maiores, comparando com os grupos DMBA e DMBA+vincristina. Conclusão: Estes resultados demonstram claramente que o extrato de A. chica exerce eficácia fitoterápica em modelo de câncer de mama induzido por DMBA, suprimindo a proliferação celular anormal e induzindo a redução da toxicidade do quimioterápico e do estresse oxidativo. O extrato de A. chica pode ter implicação clínica e ser desenvolvido como uma droga para reduzir a mortalidade e atenuar a toxicidade da quimioterapia para o câncer de mama.
Palavras chave: Câncer; mama; 7,12-dimetil-benzantraceno; Arrabidaea chica; vincristina; modelo animal.
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ABSTRACT
Objective: The aim of this study was to examine the effects of Arrabidaea chica
(crajiru) extract, native plant of the Amazon, on a 7,12-dimethyl-benzanthracene (DMBA)-induced breast carcinoma model in Wistar rats. Methods: We compared the response of mammary carcinoma to the oral injected A. chica extract (ACE) for 16 weeks, associated or not with vincristine. Experimental design: normal control; DMBA group without treatment; DMBA+ACE (300 mg/kg) treatment; DMBA+vincristine. 500µg/kg injected i.p; DMBA+ACE+Vincristine 250µg/kg. Imaging using microPET and fluorescence, biochemistry, oxidative stress, hematology and histopathology were used to validate the treatments. Results: All animals survived. There was a gradual weight gain in all groups for 16 weeks, with no significant difference between them (p>0.05). The oral injection of ACE and ACE+vincristine 50% significantly reduced the incidence of breast tumors examined with PET-18FDG and fluorescence (p<0.001). Significant reduction of serum transaminases, oxidative stress and hematological toxicity were observed in these groups. Antioxidant enzyme levels in breast tissue were significantly higher compared to the DMBA and DMBA+vincristine groups.
Conclusion: These results demonstrate that ACE positively influences the treatment
of DMBA-induced breast cancer in animal model, suppressing abnormal cell proliferation and inducing a reduction in oxidative stress and chemotherapy toxicity. ACE may have clinical implication and be developed as a drug to reduce mortality and mitigate the toxicity of chemotherapy for breast cancer.
Keywords: Cancer; breast; 7,12-dimethyl-benzanthracene; Arrabidaea chica;
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DMBA: 7,12-Dimetilbenzantraceno VIN: Vincristina
EAC: Extrato de Arrabidaea chica CRA: Crajiru
IP: Intraperitoneal IV: Intravenoso
ROI: Região de interesse VO: Via oral
18-FDG: 2-[18F]fluoro-2-deoxi-D-glicose. PET: Positron Emission Tomography AST: Aspartato aminotransferase ALT: Alanina aminotransferase GGT: Gama-glutamil transferase CAT: Catalase
SOD: Superóxido dismutase GPx: Glutationa peroxidase MDA: Malondialdeído oxidativo
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Procedimento cirúrgico: Tricotomia. Figura 2 - Macroscopia das mamas.
xii SUMÁRIO Introdução ... 13 Justificativa ... 16 Objetivos ... 17 Método ... 18 Artigo publicado ... 22 Conclusões ... 42
Comentários, críticas e sugestões ... 43
Figuras ... 45
Referências ... 46
Apêndice ... 49
1. INTRODUÇÃO
O câncer de mama é uma das principais causas de morbidade e mortalidade entre as mulheres. Em todo o mundo, é o segundo tipo mais comum de câncer. Há uma tendência de aumento da mortalidade por câncer de mama em mulheres brasileiras1. É estimado para 2020, um aumento de 26% do câncer de mama, principalmente nos países em desenvolvimento2. As diferentes taxas de incidência do câncer de mama observadas entre os países desenvolvidos e em desenvolvimento, refletem a qualidade do sistema de saúde e as diferentes características do perfil populacional3,4.
O câncer de mama origina-se do tecido mamário, mais comumente do revestimento interno do epitélio ductular ou lóbulos que suprem os ductos, e a principal via de metástase é o sistema linfático ou a corrente sanguínea5. É uma doença heterogênea com padrões histológicos diversos, mas que podem ser separados em dois grupos: carcinomas com receptores de estrógeno positivo e os com receptores negativos.
Os fatores de risco são diversos e incluem: gênero (apenas 1% de casos acontecem em homens), idade, idade da menacme, idade do nascimento do primeiro filho, idade da menopausa, hereditariedade e ocorrência de hiperplasia atípica. Além disso, outros fatores são importantes, como raça/etnia, exposição ao estrógeno, densidade da mama, exposição à radiação, fatores geográficos, fatores dietéticos, obesidade, atividade física, amamentação, fumantes, e toxinas ambientais como pesticidas e outros6.
O câncer de mama pode ser induzido pelo 7,12-dimetil-benzantraceno (DMBA). O DMBA é um hidrocarbono aromático policíclico utilizado amplamente como modelo de carcinogênese em pesquisa de câncer. Representa um procarcinogênio com seletividade para câncer de mama em ratas. Ele sofre ativação metabólica ao diidrodiolepóxido, que se liga aos resíduos de adenina do ácido desoxirribonucleico, resultando em mutagênese e carcinogênese7. Estudos têm focado na imunotoxicidade do DMBA em animais experimentais induzindo câncer de pele e glândula mamária. DMBA causa imunotoxicidade no baço, timo e medula óssea. Mostra suprimir tanto a imunidade humoral e a resposta mediada por células em baço e culturas esplênicas8,9. Sua ação em parte é através de um efeito direto em enzimas microssomais, embora a natureza desta interação hipoteticamente não seja ainda conhecida9. A participação das P450 também é considerada na susceptibilidade a carcinógenos químicos, através de sua capacidade de ativar metabolicamente os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e que vem a validar a busca da expressão deste como fator de risco de câncer em humanos10.
A atividade citotóxica da vincristina (Alcalóide da vinca) está relacionada à inibição dos microtúbulos e à alteração do equilíbrio da polimerização da tubulina, o que causa a parada da divisão celular nos tumores, através da ligação a proteínas microtubulares, interrompendo o fuso mitótico na fase de metáfase (fase M e S)11,12. Faz parte de protocolos de quimioterapia para câncer de mama13. No entanto, tem sido relatado que a vincristina é altamente tóxica para outros tecidos não neoplásicos e causa insuficiência respiratória, toxicidades neuromusculares,
cardíacas e gastrointestinais14-17. Sinais de hepatotoxicidade, incluindo níveis significativamente altos de transaminase hepática, necrose hemorrágica centrilobular e alterações histológicas e ultraestruturais têm sido observados em pacientes ou em modelos animais tratados com vincristina18.
Arrabidaea chica é uma videira pertencente à família Bignoniaceae, nativa da região Amazônica (conhecida como crajiru) e atualmente ocorre nas regiões tropicais da América do Sul e África19. Vários flavonóides e antocianidinas têm sido isolados de suas folhas20, bem como as principais classes de metabólitos secundários como antocianinas, antraquinona, catequinas, ácidos orgânicos, açúcares redutores, esteroides, xantonas, taninos, flavanonóis e flavanona21. O teor de compostos fenólicos e flavonóides nas folhas foram determinados em alguns estudos22,23.
As folhas de A. chica têm sido tradicionalmente usadas pelos índios brasileiros como um corante vermelho nos rituais de pintura corporal, como agente antiinflamatório e adstringente, antianêmico, analgésico, cicatrizante e para várias doenças como cólicas intestinais, diarréias e enfermidades de pele24,25. Ribeiro et al (2012) estudaram em camundongos o efeito extrato de A. chica (EAC) na evolução de tumores de Ehrlich, e demonstraram significativa redução das lesões sem efeitos adversos26. Na medicina popular tem mostrado uma ação antineoplásica, que foi identificada através de atividade anti-proliferativa in vitro, utilizando 9 linhagens de células tumorais humanas: mama, ovário com resistência a múltiplas drogas, melanoma, pulmão, próstata, cólon, ovário, rim e leucemia27,28. Esta atividade foi expressa em valores de inibição total de crescimento, capacidade de sequestrar radicais livres, atividade citotóxica e pró-apoptótica29-31. A espécie A. chica recebe várias denominações nas diversas regiões brasileiras tais como cipó-pau, cipó-cruz, carajuru, carapiranga, carajiru, crajiru, carajeru, crejer, entre outras32.
Imagens por fluorescência tem se mostrado uma técnica promissora para avaliar a extensão e presença de tumores, em avaliação intraoperatória. Ishizawa e colaboradores mostraram tumores hepatocelulares e metástases hepáticas de tumores intestinais identificados usando imagem de fluorescência33. A profundidade máxima de penetração da fluorescência no nível próximo do infravermelho nos tecidos é de até 1 cm, portanto a identificação de tumores profundos com imagem de fluorescência é difícil34,35. No presente estudo, como se trata de tumores superficiais de mama, foi decidido utilizar a técnica de fluorescência para estudar a evolução dos tumores.
A tomografia por emissão de pósitrons (PET) é um exame de imagem de alta resolução, que tem sido muito útil para o diagnóstico de câncer e o acompanhamento de seu tratamento36,37. A PET é uma técnica de imagem molecular que utiliza emissores de pósitrons traçadores de radionuclídeos, como o 18F-fluorodeoxiglicose (18FDG), que permitem uma avaliação não invasiva das atividades metabólicas e fisiológicas em estados saudáveis e doentes nos níveis molecular e celular37,38. Este traçador consegue detectar a atividade glicolítica que é alta no câncer, na inflamação e na infecção37-39. No presente estudo utilizamos equipamento microPET in-vivo para a avaliação da resposta do carcinoma mamário ao EAC, comparando à quimioterapia convencional com vincristina. Imagens de fluorescência in-vivo, estresse oxidativo e histopatologia contribuíram para a avaliação das neoplasias.
Com base nos dados acima descritos, o presente estudo busca investigar se o EAC pode atenuar o desenvolvimento do carcinoma mamário e avaliar o seu efeito antitumoral associando EAC à dose plena e à metade da dose de vincristina contra o carcinoma mamário induzido por DMBA em ratas.
2. JUSTIFICATIVA
O EAC (crajiru) exemplifica um promissor agente anticancerígeno natural, oriundo da Amazônia, para prevenção e tratamento do câncer de vários órgãos. O efeito anticancerígeno do EAC é mediado pela modulação da carcinogênese por seu impacto sobre diversos sinalizadores. Tem sido demonstrado que o EAC inibe a proliferação de células neoplásicas, promove a apoptose e suprime diversos mediadores do câncer25.
O presente projeto justifica-se e demonstra ser relevante na medida em que procura, em estudo experimental pré-clínico, examinar a viabilidade e efetividade do EAC no tratamento de carcinoma mamário em modelo experimental de câncer induzido por DMBA, comparando-o com a vincristina como droga isolada e crajiru + metade da dose de vincristina. São estratégias para melhorar os resultados e tentar reduzir os efeitos adversos de quimioterápico citotóxico convencional.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral:
Estudar os efeitos do extrato alcoólico de A. chica em um modelo de carcinoma de mama induzido por DMBA em ratas Wistar.
3.2 Objetivos Específicos:
Avaliar a eficácia do EAC no tratamento do carcinoma de mama em modelo experimental;
Comparar a resposta do carcinoma de mama ao EAC com o tratamento quimioterápico convencional com vincristina isolada e crajiru + vincristina 50% da dose, visando reduzir a toxicidade do quimioterápico;
Correlacionar os tratamentos com as dosagens laboratoriais e as imagens obtidas por microPET e fluorescência.
Estabelecer correlação anátomo-radiológica dos achados macroscópicos de focos tumorais nos animais, com as imagens diagnósticas.
4. MÉTODO
Animais
Foram utilizadas ratas jovens da linhagem Wistar (Rattus norvegicus), provenientes do Biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Brasil. O projeto foi aprovado pela Comissão institucional de Ética no Uso de Animais (protocolo 04/2018). Todos os procedimentos experimentais foram realizados com base nas diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, bem como na Lei Brasileira Nº 11.794/08.Foram usadas ratas Wistar com 60 dias de vida, que são mais sensíveis ao DMBA para a indução dos tumores mamários11. As ratas foram aclimatadas por 1 semana antes do início do experimento em condições de alojamento padrão, incluindo temperatura ambiente de 22-24 °C, umidade relativa a 40% e ciclo claro-escuro de 12 horas, em gaiolas de polipropileno (máximo 3 animais / gaiola). Os animais tiveram acesso ad libitum a dieta para roedores (Prevence ®, Campinas-São Paulo) e água.
Preparação do extrato de A. chica
A preparação do extrato alcoólico foi previamente descrita40. Em resumo, foi preparado por maceração de folhas secas (200 g) de A. chica. Foi adicionado etanol na proporção de 1:3 para o processo de percolação à temperatura ambiente. O material foi filtrado e concentrado em evaporador rotativo RV3 (IKA-Brasil, Campinas, SP) à temperatura de 60°C. O extrato foi pesado e diluído, e um extrato hidroalcoólico na concentração de 10% foi obtido. Este extrato final foi seco e liofilizado.
Indução do carcinoma mamário
A indução do carcinoma de mama foi feita pela administração de 7,12-dimetil-benzantraceno - DMBA (Sigma, St. Louis, MO, US) dissolvido em óleo de milho. Todas as ratas submetidas à indução de câncer de mama receberam dose única de 50 mg/kg de DMBA dissolvido em óleo de milho (1 mL) por via oral (v.o.).sendo observadas por 16 semanas. Com exceção do grupo controle normal, todos os animais foram tratados com uma dose única de DMBA de acordo com Bishayee et al41. A palpação dos tumores mamários (duas vezes por semana) começou 4 semanas após o início do tratamento com DMBA. O experimento foi terminado 16 semanas após a administração do DMBA.
Delineamento Experimental
Foram utilizadas 30 ratas Wistar (Rattus norvegicus) divididas em 5 grupos com 6 animais cada. Todas as ratas submetidas à indução de câncer de mama receberam dose única de 50 mg/kg de DMBA dissolvido em óleo de milho (1 mL) por via oral (v.o.).Extrato de A. Chica, 300mg/Kg, via oral por gavagem três vezes por
semana, e Vincristina, injetada via intraperitoneal na dose de 500 µg/Kg ou 250 µg/Kg a cada semana, por cinco semanas, sendo observadas por 16 semanas.
Grupo 1: Controle normal. Ratas tratadas com solução salina (1 mL) v.o. durante 16 semanas.
Grupo 2: DMBA. Dose única de 50 mg/kg de DMBA dissolvido em óleo de milho (1 mL) por via oral (v.o.).Observação por 16 semanas.
Grupo 3: DMBA + EAC (DMBA+ EAC). Tratamento com 300 mg/kg de EAC v.o. por gavagem três vezes por semana (segunda, quarta e sexta-feira), até completar 16 semanas.
Grupo 4: DMBA + Vincristina (DMBA+VIN). Vincristina foi injetada via intraperitoneal (i.p.) na dose de 500 µg/kg a cada semana por 5 semanas consecutivas. Foram observados até completar 16 semanas.
Grupo 5: DMBA + EAC + Vincristina 50% (DMBA+ EAC +VIN50%). Vincristina foi injetada 250 µg/kg intraperitoneal (i.p.) a cada semana por 5 semanas consecutivas + EAC 300 mg/kg v.o. por gavagem três vezes por semana (segunda, quarta e sexta-feira), até completar 16 semanas.
Após a coleta de sangue, foi provocada a eutanásia dos animais com superdose de tiopental sódico (100 mg/Kg) através de injeção intracardíaca. Em seguida, os tumores mamários foram dissecados e ressecados.( Figuras 1 e 2)
Pesagem e sobrevida
Os animais foram pesados semanalmente e mantidos em gaiolas de polipropileno (2 por gaiola) durante todo o período do experimento, sendo registrado o tempo de sobrevida dos mesmos em dias.
Imagens por 18-FDG-PETscan
O 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (18F-FDG) foi usado. Concluído o período de observação (16 semanas), os animais foram anestesiados com cetamina 70 mg/kg e xilazina 7 mg/kg i.p. A dose de 1,5 mCi de 18F-FDG foi injetada em cada animal i.v., no volume de 0,5 mL, e a aquisição dinâmica das imagens iniciou 30 minutos após a injeção. As imagens tridimensionais de Positron Emission Tomography (PET) foram captadas no corpo inteiro dos animais, com o Sistema de Imagens Pré-clínico Bruker Albira microPET, New Haven, CT, USA.
A análise da captação do radiotraçador e respectivas imagens foi realizada pelo software do equipamento (PMOD), considerando os tecidos e as regiões de interesse (ROI) das áreas em estudo.
Imagens por fluorescência (in vivo)
Em seguida, com os animais anestesiados, foi feita a injeção i.v. de 0,16 mg de indocianina verde (Ophtalmos, São Paulo, SP, Brasil). Após 24 horas, com os animais novamente anestesiados, imagens de fluorescência in-vivo foram obtidas usando o Image Station Kodak FX in-vivo (New Haven, CT, USA). Os filtros para emissão e excitação foram 700 e 540nm respectivamente. O protocolo de imagens (tempo de exposição 60 segundos, 4x binning, f-stop 2,5, campo de visão 160 mm e plano focal 9 mm) foi mantido para todos os exames. As imagens foram analisadas pelo software Kodak Molecular Imaging (versão 5.0), sendo quantificadas de acordo com escala de cores, conforme descrito anteriormente34. Resumidamente, uma região de interesse (ROI) criada por ferramenta automatizada foi determinada em torno das áreas de abdome e mama dos ratos. Intensidades de sinal da região de interesse média foram expressas como unidades arbitrárias de intensidade de sinal fluorescente. Imagens em escala de cinza foram coloridas para fins de representação de acordo com uma escala de cores definida para os níveis mais altos e mais baixos da intensidade média de fluorescência (vermelho e roxo indicaram intensidade máxima e mínima da luz, respectivamente).
Análise bioquímica
Foi colhido sangue através de punção cardíaca dos animais ainda anestesiados, logo após os exames de imagem, para hemograma e dosagens séricas. Aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), Gama-glutamil transferase (GGT) e albumina foram dosados em autoanalisador (Konelab, Software Version, 60i, Finland).
Exame dos parâmetros enzimáticos antioxidantes e oxidativos
Partes de tecidos mamários foram homogeneizadas em tampões adequados e os sobrenadantes do homogenato foram utilizados para examinar os parâmetros antioxidantes enzimáticos catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e o malondialdeído oxidativo (MDA), usando kits de ensaio colorimétrico de acordo com as instruções do fabricante. (ABCAM, Cambridge, MA, EUA).
Exame histopatológico
Amostras dos tecidos tumorais a fresco foram seccionados em fragmentos com espessura de 5 mm e lavados em água corrente, permitindo a ação rápida e uniforme da solução fixadora. As amostras para histopatologia foram fixadas em formalina tamponada a 10%, por um período máximo de 48 horas, e em seguida processados durante 18 horas em processador automático de tecidos, utilizando-se equipamento Leica TP 1020. Os cortes histológicos foram obtidos com micrótomo Leica RM 2125 RTS, na espessura de 04 micra, em lâminas previamente silanizadas. Seções dos
tecidos foram coradas com hematoxilina-eosina e Tricrômico de Masson para análise morfológica em microscópio ótico (Olympus Microscópio CX41, Tóquio, Japão).
O desenvolvimento do carcinoma mamário foi caracterizado pela presença de células neoplásicas, a resposta inflamatória e a presença de apoptose. A análise histopatológica foi avaliada por patologista independente, cego em relação aos grupos de estudo.
Análise estatística
Inicialmente, avaliou-se o pressuposto de normalidade através do teste de Shapiro Wilk e Kolmogorov-Smirnov. Para testar a hipótese da diferença entre os grupos, utilizaram-se a Análise de Variância (ANOVA) e o teste de Kruskal Wallys, seguido dos testes de comparação múltipla de Tukey e Dunnett, com nível de significância de 5%. Foi utilizado o pacote estatístico SPSS®20 (Chicago, Ill, USA).
5. ARTIGO PUBLICADO
Artigo publicado no periódico Acta Cirúrgica Brasileira, doi:10.1590/s0102-865020190100000001
Effect of Arrabidaea chica extract against chemically induced breast cancer in animal model1
Keyla Borges Ferreira RochaI, Cláudia Nunes OliveiraI, Ítalo Medeiros de AzevedoI,
Robson de Macedo FilhoI, Aldo Cunha MedeirosII
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IFellow PhD degree, Postgraduate Program in Health Sciences, Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal-RN, Brazil. Technical procedures, acquisition of data, statistics
analysis, critical revision. All these authors had the same participation on the study.
IIFull Professor, MD, PhD, Chief, Nucleus of Experimental Surgery, Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal-RN, Brazil. Conception, design, intellectual and scientific content of
the study, critical revision, final approval.
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ABSTRACT
Purpose: This study aimed to examine the effects of Arrabidaea chica (Bignoniacea) extract,
a native plant of the Amazon known as crajiru, on a 7,12-dimethyl-1,2-benzanthracene(DMBA)-induced breast cancer model in Wistar rats. Methods: We compared the response of breast cancer to the oral administradion of A. chica extract (ACE) for 16 weeks, associated or not with vincristine. Groups: normal control; DMBA (50mg/kg v.o,) without treatment; DMBA+ACE (300 mg/kg); DMBA+vincristine. 500µg/kg injected i.p; DMBA+ACE+Vincristine 250µg/kg i.p. Imaging by microPET and fluorescence, biochemistry, oxidative stress, hematology and histopathology were used to validate the treatments.
Results: All animals survived. A gradual weight gain in all groups was observed, with no
significant difference (p>0.05). The oral administration of ACE and ACE+vincristine 50% significantly reduced breast tumors incidence examined with PET-18FDG and fluorescence(p<0.001). Significant reduction of serum transaminases, oxidative stress and hematological toxicity were observed in these groups. Antioxidant enzyme levels in breast tissue were significantly higher compared to the DMBA and DMBA+vincristine groups.
Conclusion: These results demonstrate for the first time that ACE positively influences the
treatment of DMBA-induced breast cancer in animal model, inducing a reduction in oxidative stress and chemotherapy toxicity, meaning that ACE may have clinical implication in furtherstudies.
Keywords:Breast cancer.12-Dimethyl-1,2-benzanthracene. Arrabidaea chica. Vincristine.
INTRODUCTION
Breast cancer is a major cause of morbidity and mortality among women. Worldwide, it is the second most common type of cancer. There is a tendency for increased mortality from breast cancer in Brazilian women1. Breast cancer originates from breast tissue, most commonly from the inner lining of milk ducts or lobes that supply the ducts, and the main metastasis pathway is the lymphatic system or the bloodstream2. Breast cancer may be induced by 7,12-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA), a procarcinogen with selectivity for female breast cancer. It undergoes metabolic activation to carcinogenic dihydrodiolepoxide. Dihydrodiolepoxide binds to adenine residues of deoxyribonucleic acid, resulting in mutagenesis and carcinogenesis3.
Vincristine is a cell cycle specific anticancer drug. The cytotoxic activity of vincristine is related to inhibition of microtubules and changing of tubulin polymerization balance, which causes the cell division to stop in tumors4. It is part of chemotherapy protocols for breast cancer5.
Arrabidaea chica is a plant from the Bignoniaceae family, a native species from the Amazon region (known as crajiru) and currently occurs in the tropical regions of South America and Africa6. Several flavonoids and anthocyanidins have been isolated from its leaves7, as well as the major classes of secondary metabolites such as anthocyanins, anthraquinone, catechins, organic acids, reducing sugars, steroids, xanthones, tannins, flavanonols and flavanones8,9. The content of phenolic and flavonoid compounds in the leaf were determined9.
A. chica leaves have traditionally been used by Brazilian Indians as a red dye in ritual body painting, as well as anti-inflammatory, anti-anemic, analgesic and healing agent. Ribeiro et al (2012) studied in mice the effect of A. chica extract on the evolution of Ehrlich tumors, and demonstrated significant reduction of lesions without adverse effects10.
Positron emission tomography (PET) is a high-resolution imaging exam that has been very useful for cancer diagnosis and treatment follow-up11,12. PET is a molecular imaging technique that uses radionuclide tracer positron emitters such as 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG), which allow for noninvasive assessment of metabolic and physiological activities in healthy and diseased states at molecular and cellular levels13. This tracer can detect glycolytic activity that is high in cancer, inflammation and infection13. In the present study we used in vivo microPET equipment for the
evaluation of mammary carcinoma response to A. chica lyophilized extract, compared to conventional chemotherapy with vincristine. In vivo fluorescence imaging, oxidative stress, biochemical parameters and histopathology contributed to the evaluation of neoplasms.
Based on data described above, the present study aimed to investigate whether A. chica extract (ACE) can attenuate the development of breast carcinoma and evaluate its antitumor effect when associated with half the dose of vincristine against induced-breast carcinoma by DMBA in rats.
METHODS
The project was approved by the institutional Commission of Ethics in the Use of Animals (protocol 04/2018). All experimental procedures were performed based on the guidelines of the Brazilian College of Animal Experimentation, as well as the Brazilian Law No. 11.794/08. Wistar female rats (Rattus norvegicus) weighting 185±23g from the Animal Science Center of the Federal University of Rio Grande do Norte, Brazil were used. Young (six week) rats, more sensitive to DMBA, were used for breast tumor induction14. The rats were acclimatized for 1 week prior to the start of the experiment under standard housing conditions, including room temperature 22-24 °C, relative humidity 40% and 12-hour light-dark cycle in polypropylene cages (maximum 2 animals/cage). The animals had ad libitum access to the rodent diet (Prevence ®) and water.
Extract preparation
The ethanol extraction was previously described15. Briefly, it was prepared by maceration of dry A. chica leaves (200 g). Ethanol in a 1:3 ratio was added for the percolation process at room temperature. The material was filtered and concentrated in rotary evaporator RV3 (IKA-Brazil, Campinas, SP, Brazil) at 60°C temperature. The extract was weighed and a hydroalcoholic extract at a concentration of 10% was obtained. This final extract was dried and lyophilized.
Breast cancer induction
Induction of breast cancer was done by 7,12-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA) injection (Sigma, St. Louis, MO, US) dissolved in corn oil. Except for the
normal control group, all the other animals were treated with an oral single dose (50mg/kg) of DMBA. Palpation of breast tumors (twice a week) began 4 weeks after initiation of DMBA treatment. The experiment was terminated 16 weeks after DMBA administration.
Experimental Design
Thirty Wistar rats were divided into 5 groups with 6 animals each. All rats submitted to breast cancer induction received a single dose of DMBA 50 mg/kg dissolved in corn oil (1 mL) orally (v.o.) by gavage and were observed for 16 weeks. Group 1: Normal Control. Saline-treated rats (1 mL) v.o. for 16 weeks.
Group 2: DMBA treated rats.
Group 3: DMBA + A. chica extract (DMBA + ACE). Treatment with 300 mg/Kg ACE v.o. by gavage three times a week (Monday, Wednesday and Friday), until completing 16 weeks.
Group 4: DMBA + Vincristine (DMBA + VIN). VIN was injected intraperitoneally (i.p.) at a dose of 500 μg / Kg each week for 5 consecutive weeks.
Group 5: DMBA + ACE + VIN50% group. VIN 250 μg/kg was injected i.p. each week for 5 consecutive weeks + ACE 300 mg/kg by gavage three times a week (Monday, Wednesday and Friday), until completing 16 weeks.
Weighing and survival
The animals were weighed weekly throughout the experiment period, and their survival time in days was recorded.
18-FDG-PETscan Imaging
2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (18F-FDG) was used. After the observation period (16 weeks), the animals were anesthetized with ketamine 70 mg/kg and xylazine 7 mg/kg i.p. The 1.5 mCi dose of (0.5 mL) 18F-FDG was injected i.v. in each animal, and dynamic imaging began 30 minutes after injection. PET three-dimensional images were captured from the whole body of the animals with the Albira microPET Preclinical Imaging System, (Bruker BioSpin Co., The Woodlands, TX, USA).
The analysis of the radiotracer uptake and respective images was performed using the equipment software (PMOD), considering the tissues and regions of interest (ROI) of the areas under study.
Fluorescence imaging (in vivo)
Then, the anesthetized animals were injected i.v. with 0.16 mg of green indocyanine (Ophtalmos, São Paulo, SP, Brazil). After 24 hours in vivo fluorescence images were obtained using the in vivo-Kodak FX Image Station, New Haven, CT, USA. The emission and excitation filters were 700 and 540nm respectively. The imaging protocol (60 second exposure time, 4x binning, f-stop 2.5, 160 mm field of view and 9 mm focal plane) was maintained for all examinations. The images were analyzed by Kodak Molecular Imaging software (version 5.0) and quantified according to color scale, as previously described16. Briefly, an automated tool-created region of interest (ROI) was determined around the rat's abdomen and breast areas. Signal intensities of the ROIs were expressed as arbitrary units of fluorescent signal intensity. Grayscale images were colored for representational purposes according to a color scale set for the highest and lowest levels of mean fluorescence intensity (red and purple indicate maximum and minimum light intensity, respectively).
Biochemical analysis
Blood was collected by cardiac puncture (5 mL) of the still anesthetized animals, immediately after the imaging exams, for blood count and serum dosages. Aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), Gamma glutamyl transferase (GGT) and albumin were dosed on a self-analyzer (Konelab, Software Version, 60i, Finland). Hematological analysis was performed using CELL-DYN Analyser (Abbott Park, Illinois, USA).
Examination of antioxidant and oxidative enzymatic parameters
Parts of mammary tissues were homogenized in phosphate buffer solution and homogenate supernatants were used to examine the enzymatic antioxidant catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and oxidative malondialdehyde (MDA) parameters using colorimetric assay kits, according to the manufacturer's instructions. (ABCAM, Cambridge, MA, USA).
Histopathological exam
Euthanasia of the animals was performed with thiopental 100 mg/kg, i.p. Fresh tumor tissue samples were collected, sectioned into 5 mm thick fragments and washed in running water, allowing the fast and uniform action of the fixative solution. The
specimens were fixed in 10% buffered formaldehyde for a maximum of 48 hours and then processed for 18 hours in automated tissue processor using Leica TP 1020 equipment (Leica Biosystems, BuffaloGrove, IL, USA). Histological sections were obtained with Leica microtome. RM 2125 RTS (Leica Biosystems, BuffaloGrove, IL, USA), 04 microns thick, on previously silanized slides. Tissue sections were stained with hematoxylin-eosin for morphological analysis under light microscopy (Olympus Microscope CX41, Tokyo, Japan).). The development of breast carcinoma was characterized by the presence of neoplastic cells and everything was studied by an independent pathologist, blinded to the study groups.
Statistical analysis
The assumption of normality was assessed by the Shapiro Wilk and Kolmogorov-Smirnov test. To test the hypothesis of difference between groups, we used the Analysis of Variance (ANOVA) and the Kruskal Wallys test, followed by Tukey and Dunett multiple comparison tests, with a significance level of 5%. The statistical package SPSS®20, (Chicago, Ill, USA) was used.
RESULTS
All animals survived after the experimental model procedures. The evolution of body weights of the five study groups is shown in figure 1. There was a gradual weight gain in all groups over 16 weeks. The higher weight gain was observed in the control group rats, with no significant difference between groups (p>0.05).
Figure 1 – Mean weight of animals per week, by group. DMBA, dimethyl-benzanthracene; ACE, A. chica extract, VIN, vincristine.
PET scan imaging
Figure 2 shows images of sagittal sections taken from microPET, representative of rats from the study groups. Figure 2-A shows two breast tumor nodules from the DMBA group, and Figure 2-B (DMBA+ACE group) shows no image of 18-FDG uptake in the anterior abdominal wall, indicating no breast tumor. The standardized uptake values (SUV) of these images confirmed the rare presence of breast cancer, as a result of significant reduction in tumor uptake of 18-FDG and respective metabolic activity, as clearly visualized by microPET. These images coincided with the intergroup comparison of ex-vivo fluorescence imaging. Figure 2-C (DMBA+VIN group rat) shows an image of a breast tumor and Figure 2-D (DMBA + ACE + VIN50% group rat) shows no images with metabolic activity, indicative of breast carcinoma. The other images resulting from 18-FDG uptake coincide with the presence of brain, kidneys and bladder (see arrows). 150 170 190 210 230 250 270 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 P eso m éd io (g ) Semana
Fluorescence imaging
Figures 3 to 6 show in vivo representative images of the fluorescence intensity of induced breast tumors submitted to various treatments. In Figure 3, representative of two animals from the DMBA group (untreated), the fluorescence intensity highlighted in red indicates carcinoma, and was significantly higher than in Figures 4, 5 and 6. The fluorescence intensity and respective areas of tumor involvement is higher in figure 5 (from vincristine-treated mammary carcinoma), when compared to figures 4 and 6, from rats treated with ACE and ACE+vincristine 50% respectively. Table 1 summarizes the mean fluorescence intensity values of breasts of rats submitted to induction of DMBA mammary carcinoma and respective treatments. In animals treated with DMBA+ACE the mean fluorescence intensity was significantly lower than in DMBA group and DMBA+VIN group. (p<0.001). Data are presented in logarithm of mean fluorescence intensity.
Figure 2 - PetScan Images. Sagittal sections representative of study group rats.
A - shows two rat mammary tumors of the DMBA group (arrows); B - (DMBA + ACE group rat) no 18-FDG uptake image on the anterior abdominal wall; absence of breast tumor; C - (DMBA + VIN group rat) Shows one breast tumor image (arrow); D - (rat group DMBA + ACE + VIN50%), no image with metabolic activity indicative of breast carcinoma. Other 18-FDG images represent brain, heart, kidneys and bladder (arrows).
Figure 3 - Fluorescence images - DMBA group; fluorescence after green indocyanine injection. A, five breast tumor images. In B, four breast tumor images.
Figure 4 - Fluorescence images - (DMBA + ACE Group). In A and B one breast tumor in each representative image.
Figure 6 - Fluorescence images - DMBA + ACE + VIN 50% group. In A and B, 2 breast tumors in rats treated with ACE + VIM at half dose.
Table 1 - Descriptive and inferential statistics of mean fluorescence intensity Groups
CONTROL DMBA DMBA+ACE DMBA+VIN DMBA+ACE + VIN 50% p-value1 MIF (log)
0.0 4.4 ± 0.55a,b 2.63 ± 0.59a 3.9 ± 0,66a 3.42 ± 0.3b <0.001 Mean ± standard deviation.
1 – p-value Kruskal Wallys.
2 – Values - in the same row - followed by at least one equal letter showed statistically significant differences. (p<0.001). MIF(log), Mean intensity fluorescence (log); DMBA, dimethyl-benzoanthracene; VIN, vincristine; ACE, A. chica extract
Biochemical and hematological analysis
At the end of the observation period, biochemical determinations showed significantly higher serum ALT, AST and GGT levels in animals treated with VIN, compared with rats in the ACE-treated group (p<0.001). The highest levels of ALT, AST and GGT were observed in animals after induction of DMBA mammary carcinoma without other treatments. The lowest albuminemia was observed in the DMBA and DMBA+VIN groups, levels significantly lower than in the DMBA+ECE and DMBA+VIN 50% groups (p<0.001). These data are summarized in Table 2.
Table 2 – Descriptive and inferential statistics of biochemical analysis Groups
Parameters Control DMBA DMBA+ACE DMBA+VIN DMBA+ACE +
VIN 50% p-value1 ALT (UI/L) 54.9 ±
3.5a
132.4 ±
4,2ab 61.0 ± 3.2bc 95.3 ± 4.7ac 60.6 ± 2.0a <0.001 AST (UI/L) 62.3 ± 3.1a 113.4 ± 8.1abc 59.6 ± 2.9bd 87.5 ± 4.9acd 70.2 ± 3.1c <0.001 GGT (UI/L) 8.0 ± 0.5a 36.9 ± 2.5abc 9.3 ± 0.5bd 25.7 ± 2.7acd 8.7 ± 0.6c <0.001 Albumin(g/dL) 4.9 ± 0.2ab 2.5 ± 0.3ac 4.3 ± 0.4cd 2.6 ± 0.3bd 4.0 ± 0.1ab <0.001 Mean ± standard deviation.
1 – p-value ANOVA.
2 – Values - in the same row followed by at least one equal letter showed statistically significant differences. (p<0.001).
DMBA, dimethyl-benzanthracene; VIN, vincristine; ACE, A. chica extract; ALT, alanine-aminotransferase; AST, aspartate-aminotransferase;GGT, Gamma-gluthamyl transferase.
Hematological parameters showed that the rats treated with vincristine (DMBA+VIN) had significantly lower RBC, total leukocyte and neutrophil counts than in the DNBA+ACE and control groups (p<0.001). The difference between DMBA+ACE and DMBA+ACE+VIN 50% group rats was statistically insignificant (p>0.001). These data mean that the treatment with ACE changed the hematologic pattern to approximately the same as the rats in the normal-control group. Data summarized in table 3
Table 3 – Descriptive and inferential statistics of hematological analysis. Groups
Control DMBA DMBA+ACE DMBA+VIN DMBA+ACE +
VIN 50% p-value1 RBC (106/mm3) 5.0±0.2ab 3.4 ± 0.3acd 4.4±0.3ce 3.2±0.38bef 4.6±0.3df <0.001 Leukocytes (103/mm3)
8.6±0.5ab 4.3±0.2ab 5.6±0.4a 3.2±0.27ab 5.72±0.3b <0.001 Neutrophils
(103/mm3)
4.8±0.2a 3.5±0.3abc 4.5±0.2b 2.5±0.13abd 4.7±0.2cd <0.001 Mean ± standard deviation.
1 – p-value ANOVA.
2 – Values - in the same row followed by at least one equal letter showed statistically significant differences. (p<0.001).
DMBA, dimethyl-benzoanthracene; VIN, vincristine; ACE, A. chica extract; RBC, red blood cells.
Oxidative stress
DMBA acted as an oxidizing agent in the DMBA-treated group and resulted in a significant reduction in the intracellular mammary tissue levels of the antioxidant catalase, SOD and GSH-px enzymes when compared to the normal control group
(p<0.001). When ACE was added to animals treated with DMBA and DMBA+ACE+VIN50%, the tissue levels of the antioxidant enzymes catalase, SOD and GSH-px were restored, and these levels were significantly higher than in the DMBA group ( p<0.001). Data summarized in table 4.
Table 4 – Results of antioxidant enzyme dosage and respective inferential statistics. Groups
Control DMBA DMBA+ACE DMBA+VIN DMBA+ACE
+ VIN 50% p-value1 Catalase
(µmol/mg)
127.9±1.6ab 39.5±2.2b 77.5±2.9ab 41.5±2.4a 68.4±2.5ab <0.001 SOD
(µmol/mg)
26.1±2,9abc 8.6±0.6be 19.1±1.3ab 11.1±0.8ad 20.9±1.7cde <0.001 GSH-px
(µmol/mg)
82±2.5ab 29.5±1.9b 59.8±2.1ab 29.1±1.8a 49.3±1.3ab <0.001 Mean ± standard deviation.
1 – p-value ANOVA.
2 – Values - in the same row followed by at least one equal letter showed statistically significant differences. (p<0.001).
DMBA, dimethyl-benzoanthracene; VIN, vincristine; ACE, A. chica extract; RBC, red blood cells.
DMBA group rats had significantly higher levels of maloialdehyde (MDA) when compared to normal control rats. ACE treatment caused a significant decrease of MDA levels, which confirms the antioxidant property of the extract (p<0.001). DMBA+VIN group rats maintained the preventive power against lipid peroxides represented by MDA. When the ACE was added to animals treated with 50% of the vincristine dose (DMBA + ACE + VIN 50% group), the breast tissue MDA dosage was significantly lower than in the DMBA+VIN group (p<0.001). These data are summarized in table 5 Table 5 – Determination of cellular index of lipid peroxidation in breast tissue homogenates.
Groups
CONTROL DMBA DMBA+ACE DMBA+VIN DMBA+ACE + VIN 50%
p-value1 MDA
(nmol/mg) 18.4±1.7ab 85.8±2.6ab 25.7±3.1a 38.3±2.1ab 27.4±1.3b <0.001 Mean ± standard deviation.
1 – p-value ANOVA.
2 – Values - in the same row followed by at least one equal letter showed statistically significant differences. (p<0.001).
Histopathology
Normal structure with well-defined architecture was observed in the mammary tissue of rats of the normal control group. Rats from the DMBA-induced cancer group showed edema, neutrophil inflammation, and epidermal ulceration. Ductal carcinoma with irregular cytoplasm, glandular cell multiplication and focal proliferation were found in all rats of this group. DMBA+ACE group rats showed improvement in the histological characteristics of the breast tissue. Neutrophil inflammation was observed in the vicinity of the tumor. Ductal and epidermoid carcinoma were found in ducts. Extensive apoptotic figures have been identified in the tumors. In the DMBA+full-dose vincristine group adiponecrosis was identified near the tumor areas. Apoptotic figures were present in ductal and epidermoid carcinoma. When breast tumors were treated with DMBA+ACE+VIN50%, chronic inflammation was present in the vicinity of neoplastic lesions. Apoptotic figures were identified in all ductal carcinomas. (Figure 7 A-J).
Figure 7 - Histopathology HE, 400x magnification.
A B
C D
A, B - Control group - Histologically normal breast, with a predominance of adipose tissue. Acinar and ductular structures forming mammary lobes; C, D - DMBA group, proliferation of atypical ducts, associated with peritumoral inflammatory response. E, F - DMBA + ACE group, presence of apoptosis, with mild to moderate inflammatory response. G, H - DMBA + VIN group, shows apoptotic cells and dense peritumor inflammation. I, J - DMBA + ACE + VIN50% group, tumor apoptosis with mild to moderate peritumoral inflammatory response.
DISCUSSION
Breast cancer is the most common cancer among women and the second leading cause of cancer-related deaths worldwide. In 2012, 522,000 women died of breast cancer in developed and developing countries17.
The mechanism by which vincristine induces tumor cell death is the polymerization of mitotic microtubules and the consequent arrest of cell division in metaphase18. Several mechanisms have been reported to mediate vincristine-induced cytotoxicity, including its ability to induce apoptosis via oxidative stress and inflammation19-21. In addition, vincristine is capable of interfering with vascular blood flow and inducing cell necrosis22. However, vincristine has been reported to be highly toxic to other non-neoplastic tissues and cause respiratory failure, neuromuscular, cardiac and gastrointestinal toxicities23. Signs of hepatotoxicity, including significantly high levels of hepatic transaminase, centrilobular hemorrhagic necrosis, and
G
H
histological and ultrastructural changes have been observed in patients or animal models treated with vincristine24. In our study vincristine was associated with oxidative stress, apoptosis and peritumoral inflammation.
The maximum penetration depth of near-infrared fluorescence in tissues is up to 1 cm, so identifying deep tumors with fluorescence imaging is difficult16. As in the present study, we examined superficial breast cancer lesions in rats, fluorescence images were clear and useful for the interpretation of the findings. 18F-FDG micro PET was used to monitor the therapeutic effect of ACE and vincristine in the DMBA-induced breast cancer model. The images confirmed that ACE alone or associated with half the dose of vincristine reduced the presence and volume of breast tumors. Thus, from the 18F-FDG PET results, we found that in the ACE group, and in the ACE+50% of the vincristine dose, 18F-FDG tumor uptake decreased when compared to the DMBA group.
In the present study we found that animals with DMBA-induced cancer treated with vincristine had significantly higher levels of ALT, AST and GGT than in the ACE-treated group. We observed a significant reduction in liver and hematologic toxicity in the group treated with 50% of the vincristine dose associated with ACE, with good results in the control of breast carcinoma. Treatment with ACE raised leukocyte and RBC levels. Relevant data is that in the DNBA + ACE + VIN50% group we were able to reduce the treatment toxicity by using 50% of the vincristine dose without compromising the antineoplastic effect. Low albumin levels were expected in tumor rats, which was evidenced in the DMBA and DMBA + VIN groups. In rats treated with ACE, serum albumin and transaminase levels showed significant improvement, probably due to the effect of its antioxidant components (anthocyanins, anthraquinone, catechins, organic acids, reducing sugars, steroids, xanthones, tannins, flavanonols and flavanones) in reducing oxidative stress. The antioxidant components of A. chica have been studied7-9.
In our study, we evaluated oxidative stress in DMBA-induced breast tumors in rats undergoing antitumor treatments. Our results indicated considerable oxidative stress by determining MDA in breast tumor samples taken from DMBA treated animals. Malondialdehyde (MDA) is the lipid marker of oxidative stress most commonly used to validate ischemia/reperfusion and cancer25. We have demonstrated that DMBA-injected rats developed oxidative stress in breast tissues, as evidenced by increased MDA levels. Oral administration of ACE to rats following DMBA-induced breast cancer
reduced MDA dosage in mammary tumors. CAT, GPx and SOD are vital enzymes and antioxidant parameters26. In our investigation, we observed that ACE increased breast tissue CAT, GPx, and SOD enzymes in DMBA-induced breast cancer. These findings demonstrated that ACE alone or associated with vincristine can attenuate reactive oxygen species and reduce oxidative destruction of mammary tissues. These effects can be attributed to the flavonoid mixture in the plant extract27. Our findings suggest that ACE has a protective effect against DMBA-induced oxidative stress in breast cancer tissues. Michael et al (2015) found that the ethanolic extract of A.chica showed in vitro antiproliferative activity against human cancer cells28.
Studies on the antineoplastic effects of ACE, derived from herbal medicine of Amazonian origin, are scarce. However, for the first time, we proved in this study its positive effect on the control of induced breast cancer in an animal model. It does not mean that ACE can cure breast cancer. However, it was demonstrated in the present study that, if used orally alone or in combination with half the vincristine dose (VIN50%), it can contribute to the reduction of hematological toxicity and disease control, which is very relevant. In conclusion, our study confirmed that ACE acted as a therapeutic agent in a rat breast cancer model. The combination of ACE and chemotherapy positively influenced the treatment of breast tumors, reduced the effective dose of chemotherapy and attenuated some of its adverse effects.
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_______________________________________________________________ Correspondence:
Aldo Cunha Medeiros Avenida Nilo Peçanha, 620 59012-300 Natal – RN Brasil cirurgex.ufrn@gmail.com
Financial source: Grant nº 449084/2014-4 from National Council for the Scientific and Technological Development, CNPq, Brazil.
1Research performed at Nucleus of Experimental Surgery, Department of Surgery, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Brazil. Part of PhD scientific study, Postgraduate Program in Health Sciences. Tutor: Aldo Cunha Medeiros.
6. Conclusões
Em conclusão, nosso estudo confirmou que o EAC atuou como agente terapêutico em um modelo de câncer de mama em ratas. A combinação de EAC e quimioterapia influenciou positivamente o tratamento dos tumores mamários, possibilitou a redução da dose efetiva de quimioterápico e atenuou seus efeitos adversos.
7. Comentários, Críticas e Sugestões
No segundo semestre de 2014, recebi com satisfação, a notícia de que o professor Aldo da Cunha Medeiros me aceitaria como orientanda no Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Dr. Aldo Medeiros é um dos professores mais atuantes e admirados por sua seriedade e dedicação à academia, por seus esforços incansáveis em produzir conhecimento de qualidade em nome da nossa instituição. Para mim é uma honra tê-lo como orientador e poder conviver e aprender com ele, e aproveito este momento para deixar aqui registrado os meus mais sinceros agradecimentos.
O ingresso no Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da UFRN permitiu o contato com diversas disciplinas em caráter multiprofissional contribuindo para ampliar meus conhecimentos antes mais restritos à área da medicina, especialmente a Patologia. Através do contato com alunos e professores de diversas áreas da saúde pude conhecer as diferentes visões e dimensões da pesquisa científica dentro da UFRN, além de identificar os diversos trabalhos que estão sendo desenvolvidos em nossa instituição, possibilitando uma ampliação na minha área de atuação como docente e pesquisadora. Através das disciplinas curriculares e complementares, pude aprofundar meu conhecimento acerca da escrita e metodologia dos trabalhos científicos, minimizando os riscos de erros e criando uma visão mais crítica durante o desenvolvimento de pesquisas e outras atividades relacionadas à vida acadêmica.
Fazer novas amizades, conhecer bases de pesquisa, promover conhecimento e passar conhecimento, foram algumas boas oportunidades proporcionadas durante os anos de pós-graduação.
Em relação ao trabalho desenvolvido, me proporcionou contribuição para o avanço de estudos referentes à linha de pesquisa, avaliação de terapias alternativas para câncer utilizando fitoterápicos bem como estudar modelo de carcinogênese (câncer de mama experimental in vivo induzido por DMBA), colocando em prática alguns conceitos teóricos que ministramos em aulas de graduação.
Contribuiu para fortalecer a pesquisa na área de tratamento de câncer com drogas não convencionais fitoterápicas e de baixo custo, no âmbito do Núcleo de Cirurgia Experimental-UFRN e no Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde da UFRN, incrementando a cooperação com outros Departamentos da instituição.
O estudo do Crajiru mostrou-se eficaz em sua ação antioxidante e modulação da resposta inflamatória, evidenciados em sua aplicação isolada na neoplasia e em associação com o quimioterápico, reduzindo a necrose tecidual e promovendo uma melhor perspectiva de tratamento com menos reações adversas.
As dificuldades pertinentes ao financiamento e custos para as pesquisas, como estudo imunohistoquímico de marcadores específicos de apoptose foram limitadores do projeto. O tempo para conclusão impossibilitou outras análises de órgãos, prováveis alvo de citotoxidade, mas que poderão ser uma continuação em novas pesquisas a serem desenvolvidas.
FIGURAS
Figura 1: Procedimento cirúrgico: Tricotomia.
8. Referências
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