Programa de Pós-Graduacão em Genética
Ronald Rodrigues de Moura
Associação de polimorfismos no gene IFIH1 com a Diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes
Recife, 2014
Ronald Rodrigues de Moura
Associação de polimorfismos no gene IFIH1 com a Diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Genética.
Orientador: Lucas André Cavalcanti Brandão
Recife, 2014
Catalogação na fonte Elaine Barroso
CRB 1728
Moura, Ronald Rodrigues de
Associação de polimorfismos no gene IFIh1 com a diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes/ Recife: O Autor, 2014.
73 folhas : il., fig., tab.
Orientador: Lucas André Cavalcanti Brandão
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Genética, 2014.
Inclui bibliografia e anexos
1. Imunogenética 2. Polimorfismo (genética) 3. Diabetes I. Brandão, Lucas André Cavalcanti (orientador) II. Título
571.9648 CDD (22.ed.) UFPE/CCB- 2014- 168
Ronald Rodrigues de Moura
Associação de polimorfismos no gene IFIH1 com a Diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Genética.
Situação: Aprovado 19/02/2014
Banca Examinadora:
____________________________________________ Prof. Dr. Lucas André Cavalcanti Brandão/ UFPE - Patologia
____________________________________________ Prof. Dr. Paulo Roberto Eleutério de Souza/UFRPE - Biologia
____________________________________________ Prof. Dr. Marcos André Cavalcanti Bezerra/UFPE - Biofísica
____________________________________________ Prof. Dr. Sergio Crovella/ UFPE – Genética
Recife, 2014
AGRADECIMENTOS
Externo meus sinceros agradecimentos aos colegas de trabalho que contribuíram de alguma forma para o desenvolvimento das atividades aqui apresentadas em especial ao meu orientador Professor Lucas Brandão por me dar liberdade nas pesquisas e ao Professor Sergio Crovella, que me deu a oportunidade de interagir com outros grupos de pesquisa no exterior; a Universidade Federal de Pernambuco e aos órgãos de fomento (CAPES, CNPq e FACEPE) por incentivar a minha formação e a pesquisa que venho desenvolvendo; a todos os professores da Pós Graduação em Genética, que estimularam o pensamento crítico sobre os meus trabalhos.
“CAVEIRA!” (Autor desconhecido)
RESUMO
Diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune multifatorial caracterizada por danos e destruição de células-beta, nas Ilhotas de Langerhans no pâncreas, reduzindo ou inviabilizando a produção de insulina. Estudos apontam que infecções virais, principalmente enterovírus, têm sido consideradas um dos principais fatores ambientais associados com a DM1. A proteína codificada pelo gene Helicase C induzida por interferon tipo 1 (IFIH1) participa do reconhecimento de vírus de dsRNA e no desenvolvimento da DM1, o que sugere uma possível etiologia viral da DM1 e outras desordens autoimunes como a doença autoimune da tireóide (DAIT) e doença celíaca (DC). Este estudo teve como objetivo avaliar a associação entre os polimorfismos de base única (SNP) não-sinônimos do IFIH1 rs3747517, rs1990760 e rs10930046, além do tag-SNP rs6432714, com a DM1 e a insurgência de DC e DAIT nesses pacientes. Não foi observada associação desses SNPs com o desenvolvimento da DM1, nem com a insurgência de DC ou DAIT. Entretanto, o tag-SNP rs6432714 indicou uma tendência de associação apenas com o desenvolvimento da DM1 (P=0,0365). A Análise in silico do domínio helicase indicou um aumento na estabilidade da proteína, quando ocorre a mutação H460R, entretanto essa variação estrutural observada não parece ser suficiente para causar uma deficiência na detecção do dsRNA viral. Apesar da evidência de não-associação do rs1990760 na população estudada, uma meta-analise realizada confirma a associação dessa variante com a DM1.
Palavras-chave: Imunogenética; Estudos de associação genética; Autoimunidade;
ABSTRACT
Type 1 diabetes is a multifactorial disease characterized by damages to beta-cells at the Langerhans’ islets in the pancreas, impairing the insulin production. Studies show that viral infections, mostly by enterovirus, are considered one the major environmental factors involved with T1D. The protein codified by the interferon-induced helicase gene (IFIH1) plays a role on the dsRNA virus and on the T1D onset, suggesting a possible viral aetiology of T1D and others autoimmune diseases, such as autoimmune thyroiditis (AITD) and celiac disease (CD). This study aimed to evaluate the association between the non-synonymous single nucleotide polymorphisms of the IFIH1 gene rs3747517, rs1990760 and rs10930046, plus the tag-SNP rs6432714, with T1D and the insurgence of AITD and CD in these patients. We did not find evidences for association between the SNPs with T1D nor the occurrence of AITD or CD. However, the tag-SNP rs6432714 presented a trend for association with the T1D development (P = 0.0365). An in silico analysis of the Helicase domain shown an increase in the stability of the protein when the H460R mutation occur, although this structural variation appears not to be sufficient to cause an impairment in the dsRNA recognizing. Despite, the evidence for not association of the rs1990760 SNP in the studied population, a meta-analysis indicates confirms the association between this variant and T1D.
Key Words: Immunogenetics; Genetic association study; Autoimmunity; Genetic
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Incidência da diabetes mellitus tipo 1 em vários países. 16 Figura 2. Modelos autoimunes para a patogenia da diabetes mellitus tipo 1: modelo
linear (A) e modelo não-linear (B).
18
Figura 3. Evolução histórica das descobertas de fatores genéticos envolvidos na diabetes mellitus tipo 1. Note que o efeito dos polimorfismos descobertos (OR) diminui com o tempo.
20
Figura 4. Gráfico indicando o risco relativo dos principais loci não-HLA envolvidos na diabetes mellitus tipo 1.
22
Figura 5. Distribuição dos polimorfismos de base única (SNPs) no gene IFHI1 mais estudados na diabetes mellitus tipo 1 e outras doenças autoimunes.
28
Figura 6. Esquema funcional da via de detecção de RNA através de receptores RIG-I-like.
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
Item Definição
DM1 Diabetes mellitus tipo 1
CD4+ Cluster of differentiation 4+
CD8+ Cluster of differentiation 8+
AAI anticorpo anti-insulina
GADA anticorpo antidescarboxilase do ácido glutâmico
IA2 anticorpo antitirosina fosfatase
SPAII Síndrome poliglandular autoimune tipo II
SPAIII Síndrome poliglandular autoimune tipo III
TNF-α fator de necrose tumoral
HLA Human leucocitary antigen
SNP polimorfismos de base única
CNV variações no número de cópias
IPEX immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked
APS-I autoimmune polyendocrine syndrome type 1
MHC complexo principal de histocompatibilidade
PTPN22 proteína tirosino-fosfatase não receptora tipo 22 (linfóide) CTLA4 antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico
PGV proteína genômica viral
PCR Polymerase chain reaction
CVB4 Coxackievirus B4
NOD camundongos diabéticos não-obesos
IFIH1 Helicase C domínio 1 indutora de interferon tipo 1
AR Artrite Reumatóide
EM esclerose múltipla
LES Lupus eritematoso sistêmico
CARD domínio de recrutamento de caspase
IFN interferon
dsRNA RNA de fita dupla
PRK proteína quinase R
VSV vírus da estomatite vesicular
ECMCV vírus da encefalomiocardite
siRNA RNA silenciador
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 REVISÃO DA LITERATURA 15
2.1 DIABETES MELLITUS TIPO 1: DEFINIÇÃO E EPIDEMIOLOGIA 15
2.2 PATOLOGIA 17
2.3 DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO 18
2.4 FATORES GENÉTICOS ENVOLVIDOS NO DESENVOLVIMENTO DA DM1 19
2.4.1 Formas monogênicas da Diabetes mellitus tipo 1 20
2.4.2 Locus HLA 21
2.4.3 Outros genes associados com a DM1 21
2.5 FATORES AMBIENTAIS ENVOLVIDOS NO DESENVOLVIMENTO DA DM1 22
2.5.1 Infecções virais 23
2.5.1.1 Infeções por Enterovírus 24
2.5.2 Outros fatores ambientais 25
2.5.2.1 Infecções bacterianas 25
2.5.2.2 Proteínas do leite de vaca 26
2.5.2.3 Proteínas do trigo 26
2.5.2.4 Vitamina D 27
2.6 IFIH1: CARACTERÍSTICAS DO GENE DE SEU PAPEL NA IMUNIDADE INATA 27
2.6.1 Características do gene e da proteína 27
2.6.2 O Papel da IFIH1 na imunidade contra infecções virais 28
2.6.3 IFIH1 e a Diabetes mellitus tipo 1 31
2.6.3.1 Polimorfismos do gene IFIH1 relacionados com a DM1 31
2.6.4 Polimorfismos no gene IFIH1 estudados em outras doenças
autoimunes e infecciosas
32
3.1 OBJETIVO GERAL 34 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 34 4 MÉTODOS 35 5 RESULTADOS 36 6 DISCUSSÃO 37 7 CONCLUSÕES 39 REFERÊNCIAS 40
APÊNDICE A – INTERFERON INDUCED WITH HELICASE C DOMAIN 1 (IFIH1): TRENDS ON HELICASE DOMAIN AND TYPE 1 DIABETES ONSET
48
APÊNDICE B – STAT4 AND IFIH1 POLYMORPHISMS AND META-ANALYSIS IN TYPE 1 DIABETES MELLITUS PATIENTS WITH AUTOIMMUNE POLYGLANDULAR SYNDROME TYPE III
53
ANEXO A – INSTRUÇÕES PARA AUTORES DA REVISTA DIABETES & METABOLISM
1 INTRODUÇÃO
As doenças com causas multifatoriais consistem na maioria das patologias que ocorrem em humanos. Por ter uma etiologia complexa, a descoberta de todos os fatores associados (genéticos e ambientais) aos seus desenvolvimentos se torna uma tarefa bastante extensa ou até mesmo inviável o que reflete na dificuldade de um sistema de diagnóstico antecipado e de um esquema de tratamento buscando a cura.
Variações genéticas desempenham um papel ubíquo na etiologia das doenças multifatoriais, porém com importância variada dentre as diversas doenças multifatoriais. Mesmo com o avanço tecnológico no processamento da informação genética que ocorreu de forma bastante pronunciada nos últimos anos, as bases genéticas das doenças multifatoriais parecem estar longe de serem elucidadas.
Nesse contexto, nosso grupo de pesquisa vem estudando doenças multifatoriais com um objetivo mais voltado à descoberta de variantes genéticas informativas para um diagnóstico prévio e prognóstico, visando desvendar as causas genéticas das patologias. Dentre os diversos estudos já realizados pelo nosso grupo, o presente estudo avalia o papel de variantes genéticas no gene IFIH1 como um possível marcador preditivo para o diagnóstico da diabetes mellitus tipo 1 na população pernambucana.
2 REVISÃO DA LITERATURA
A seguir está apresentada a revisão de literatura pertinente ao tema do presente estudo.
2.1 DIABETES MELLITUS TIPO 1: DEFINIÇÃO E EPIDEMIOLOGIA
Diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma desordem autoimune que ocorre em indivíduos geneticamente susceptíveis sendo possivelmente desencadeada por fatores ambientais (VAN BELLE et al., 2011). O sistema imune do próprio indivíduo ataca as células-β nas ilhotas de Langerhans do pâncreas, destruindo ou danificando as células suficientemente para reduzir, e eventualmente anular, a produção de insulina (VAN BELLE et al., 2011).
Dados emergentes da instituição Diabetes Mondiale indicam que a incidência de DM1 varia largamente entre e dentro dos países (DIAMOND, 2006). África, América Central e do Sul e a Ásia apresentam baixas taxas de DM1, enquanto que países da América do Norte, do Norte Europeu, além da Austrália de da Nova Zelândia apresentam as maiores taxas de incidência (Figura 1). Esse dado é corroborando entre várias organizações multinacionais que avaliam a distribuição epidemiológica da DM1 (EURODIAB, 2000; DIAMOND, 2006; GAN et al., 2012).
A incidência da DM1 varia de 0,1 por 100.000 habitantes, em Países como China e Venezuela, a aproximadamente 41 por 100.000 habitantes por ano, na Finlândia (DIAMOND, 2006). Com base nos dados obtidos na década de 1990, é possível observar uma tendência ao aumento na incidência da doença de 2,4% a 3,2% casos por ano (GAN et al., 2012).
Dados combinados dos Registros de estudo sobre DM1 do Colorado e o projeto “SEARCH for diabetes in youth” indicam que a incidência dessa doença tem aumentado nas últimas três décadas de 14,8 por 100.000 indivíduos/ano, na década de 1980, para 23,9 por 100.000 habitantes/ano, entre os anos de 2002 e 2004 (GAN et al., 2012).
Na Figura 1 é possível observar um gradiente geográfico da incidência da DM1. As razões para a ocorrência desse gradiente ainda não são bem compreendidas, entretanto diferenças climáticas, na alimentação, no estilo de vida, além de uma maior
incidência de determinadas infecções virais e crianças do Hemisfério Norte comparadas às do Hemisfério Sul podem estar envolvidos nessa variação (ZIPRIS, 2009). Esses dados indicam a importância dos fatores ambientais no desenvolvimento da DM1 em diversos países com diversas características socio-econômicas e ambientais.
A DM1 ocorre mais em crianças do que em adultos. Mais que 85% dos casos de DM1 são diagnosticados em indivíduos com idade inferior a 20 anos (GAN et al., 2012). Apesar do pico de incidência da DM1 ser em jovens na faixa etária de 10 a 14 anos, dados recentes apontam o maior aumento na incidência da doença em pacientes com idade entre zero e 4 anos (PATTERSON et al., 2009). Com relação ao gênero, a a distribuição da DM1 é praticamente balanceada em relação à taxa mulher/homem (STIPANCIC et al., 2008).
Figura 1. Incidência da diabetes mellitus tipo 1 em vários países
2.2 PATOLOGIA
Os fatores de iniciação da DM1 ainda não foram completamente elucidados, entretanto sabe-se que múltiplos tipos celulares do sistema imune medeiam o processo de destruição das células-beta (BENDING et al., 2012). Por conta da influência de caráter genético, ambiental e da interação desses fatores nos processos imunológicos, a DM1 pode ser considerada uma doença autoimune complexa, ou seja, multifatorial (PINO et al., 2010; STECK; REWERS, 2011; KNIP; SIMELL, 2012). Essa doença é caracterizada pela progressiva infiltração de, principalmente, macrófagos, células T CD4+ e CD8+ nas ilhotas pancreáticas, resultando em um processo inflamatório (insulite) e consequentemente prejudicando a produção de insulina (BENDING et al., 2012).
Dois modelos principais sugerem uma explicação para o progressivo decréscimo de células-β por conta de processos autoimunes: O modelo linear e o modelo não-linear (Figura 2).
A hipótese de declínio linear de células-beta postulado por Eisenbarth (1986) ressalta que indivíduos geneticamente susceptíveis em algum momento entra em contato com agentes ambientais (vírus, por exemplo) que iniciam a autoimunidade nas ilhotas, levando a um decaimento da massa de células-beta, desenvolvimento de autoanticorpos, hiperglicemia, e, eventualmente, perda de peptídeo C.
O Modelo não-linear (BONIFACIO et al., 1999) estabelece que o decaimento da massa de células-beta nas ilhotas ocorre de forma intercalada entre uma fase de declínio e uma fase de estase que se dá por conta do equilíbrio dinâmico entre a quantidade de populações de células T efetoras e reguladoras. Esse balanço ocorre pela intensidade da resposta das células T aos estímulos das células da imunidade inata (VAN BELLE et al., 2011). Portanto, variações em genes relacionados com a regulação da resposta imune à autoantigenos e infecções tem um papel fundamental nesse sistema.
Figura 2. Modelos autoimunes para a patogenia da diabetes mellitus tipo 1: modelo linear (A) e modelo não-linear (B).
Fonte: Adaptado de Van Belle, et al. (2011).
2.3 DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO
O diagnóstico da DM1 é feito com base nos níveis séricos de glicose, além de ensaios envolvendo auto-anticorpos como o anticorpo anti-insulina (AAI), o anticorpo antidescarboxilase do ácido glutâmico (GADA) e o anticorpo antitirosina fosfatase (IA2) (VERGE et al., 1998; LESLIE et al., 1999). Acredita-se que 90% das crianças com DM1 apresentam positividade para ao menos um desses anticorpos durante o diagnóstico (ATKINSON; EISENBARTH, 2001).
Indivíduos com DM1 apresentam um risco maior ao desenvolvimento de outras doenças autoimunes órgão-específicas, como a tireoidite autoimune (VILLANO, et al., 2009), doença de Addison (KAHALY, 2009), que acomete a glândula adrenal e a doença celíaca (CAMARCA et al., 2012), que está relacionada com o intestino. O diagnóstico para essas doenças é comumente realizado em pacientes com DM1, e quando confirmado, o indivíduo pode ser considerado como portador de síndrome poliglandular autoimune tipo II (SPAII), quando envolve uma combinação da DM1 com tireoidite e doença de Addison, ou tipo III (SPAIII), quando é observado apenas a DM1 em conjunto com a tireoidite autoimune (KAHALY, 2009).
Além da insurgência de outras doenças autoimunes, indivíduos com DM1 também desenvolvem complicações envolvendo outros órgãos e tecidos. De um modo geral, essas complicações são de ordem vascular acometendo a retina, rins, coração, cérebro e nervos periféricos (STEHNO-BITTEL, 2012).
Além do tratamento convencional com injeções de insulina e do transplante de pâncreas, diversas estratégias de tratamento para a DM1 vem sendo desenvolvidas, mas a eficácia desses tratamentos é controversa. Os métodos mais promissores estão relacionados com:
A combinação de terapias com moduladores autoimunes, como o anti-CD3 F(ab’)2 FcR-não ligante, e vacinas antigênicas nas ilhotas (BRESSON et al., 2006, 2010);
Combinação de imuno-moduladores e acentuadores do desenvolvimento e função das células-beta (SUAREZ-PINZON et al., 2008);
Terapias com citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF-α) e as interleucinas 2, 15 e 18 (ROTHE et al., 1999; SUTHERLAND et al., 2009).
2.4 FATORES GENÉTICOS ENVOLVIDOS NO DESENVOLVIMENTO DA DM1
O risco de se desenvolver a DM1 é determinado por complexas interações entre a constituição genética do indivíduo e o ambiente no qual ele se desenvolve. As evidências da influência genética sobre o fenótipo observado em pacientes com DM1 podem ser observadas pelo alto risco de desenvolvimento da doença em parentes (7%), principalmente entre gêmeos idênticos, que é de 50%, em relação ao risco na população de um modo geral (0,4%) (KYVIK et al., 1995; REDONDO et al., 2001, 2008).
Os estudos de associação vem identificando diversos marcadores genéticos associados tanto com a proteção quanto com a susceptibilidade à DM1. Os primeiros marcadores relacionados com a susceptibilidade à diabetes mellitus tipo 1 foram polimorfismos do locus do antígeno leucocitário humano (HLA) nos anos 70 (ESPINO-PAISÁN et al., 2009), e desde então vários outros polimorfismos de base única (SNPs) associados com a DM1 continuam sendo encontrados pelo genoma (Figura 3).
Duas abordagens são utilizadas na busca de SNPs com a DM1: Estudos de genes candidatos e estudos de associação genômica. Estudos de associação de genes candidatos utilizam do conhecimento a priori de genes que indicam alguma relação com a doença, portanto, limitando-se a uma pequena quantidade de SNPs, ou ainda tag-SNPs (SNPs que representam um agrupamento de outros SNPs em desequilíbrio de ligação). Enquanto que os estudos de associação genômica não
necessitam de um conhecimento prévio de SNPs possivelmente relacionados com a DM1, analisando centenas (ou até milhares) de SNPs simultaneamente (LUNETTA, 2008).
Recentemente, dois novos tipos de marcadores vem sendo utilizados nos estudos de associação genética: microRNAs e variações no número de cópias (CNV). Ambos estão relacionados com a regulação da expressão de genes que podem estar associados com a patogenia de doenças como a DM1 (ESPINO-PAISÁN et al., 2009; WTCCC, 2010).
Figura 3. Evolução histórica das descobertas de fatores genéticos envolvidos na diabetes mellitus tipo 1. Note que o efeito dos polimorfismos descobertos (OR) diminui com o tempo
Fonte: STECK; REWERS, 2011.
2.4.1 Formas monogênicas da Diabetes mellitus tipo 1
Apesar da DM1 ser bem caracterizada como uma doença autoimune multifatorial é possível encontrar casos de pacientes com formas monogênicas da doença. Casos como esse são raros e geralmente acompanhados de outras doenças autoimunes (VAN BELLE et al., 2011). Atualmente são conhecidas duas formas monogênicas da DM1: a síndrome IPEX e a APS-I.
A desregulação imune, poliendocrinopatia e enteropatia ligada ao X (do inglês immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked), ou IPEX, é uma síndrome que está relacionada com mutações no gene que codifica para o fator de transcrição Foxp3, que levam a uma disfunção de células T regulatórias (BACCHETTA et al., 2006).
A síndrome poliendócrina autoimune (do inglês autoimmune polyendocrine syndrome type 1), ou APS-I, também consiste em uma síndrome autoimune causada por mutações no fator de transcrição AIRE, que está relacionado com o estímulo da produção de moléculas do timo, que permite a evasão de linfócitos autorreativos durante o processo de autotolerância (VILLASENOR et al., 2005).
2.4.2 Locus HLA
Dentre as regiões do genoma humano que mais contribuem para o desenvolvimento do DM1, destaca-se o locus gênico altamente polimórfico do complexo principal de histocompatibilidade (MHC classe I, II e III; ou Antígeno Leucocitário Humano, HLA) localizado no cromossomo 6p21. Os alelos HLA-DRB1, HLA-DQA1 e HLA-DQB1, do MHC classe II são as principais variações envolvidas com o DM1, sendo assim chamados de locus principal para esta doença (ESPINO-PAISÁN et al., 2009) com uma contribuição genética estimada em até 50% (NOBLE et al., 1996). Esse resultado indica que o somatório da contribuição genética de todos os outros genes e outras regiões genômicas relacionados com o fenótipo da DM1 corresponde aos outros 50% da variação genética da doença.
A causa do alto impacto de polimorfismos do locus HLA se dá pela sua relação com a resposta imunológica observada na DM1. Alelos do MHC classe II presentes nos linfócitos T CD4+ são importantes no reconhecimento de epítopos antigênicos específicos, iniciando a resposta autoimune, enquanto que alelos do MHC classe I desempenham um papel na sinalização das células β que serão destruídas pelas células CD8+ na fase efetora da doença (TAIT et al., 2003).
2.4.3 Outros genes associados com a DM1
Além do HLA, polimorfismos em vários outros genes e regiões cromossômicas relacionados com o sistema imune vem sendo identificados como genes associados com a DM1 (Figura 4). Dentre esses, pode-se citar o gene PTPN22, que codifica a proteína tirosino-fosfatase não receptora tipo 22 (linfóide), importante na sinalização de células T (BURN, et al., 2011) e gene CTLA4 (antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico), que atua como um co-receptor na ativação de células T CD8+ (FIFE;
BLUESTONE, 2008). Polimorfismos nesses genes já foram associados não só com a DM1, mas também com outras doenças autoimunes, como a tireoidite autoimune, artrite reumatóide, doença de Chron e lupus eritematoso sistêmico (ZHERNAKOVA et al., 2009).
Figura 4. Gráfico indicando o risco relativo dos principais loci não-HLA envolvidos na diabetes mellitus tipo 1.
Adaptado de Todd (2010).
Outros genes associados com a sinalização, ativação e regulação de células do sistema imune, como IL2RA, CCR5, SH2B3, PTPN2, IL10 e IFIH1 também vem sendo estudados demonstrando o amplo espectro genético relacionados com a DM1 (LEHNE et al., 2011; STECK; REWERS, 2011).
2.5 FATORES AMBIENTAIS ENVOLVIDOS NO DESENVOLVIMENTO DA DM1
A seguir são relacionados os diversos fatores ambientais relacionados ao desenvolvimento da DM1. 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50
Risco relativo x Gene
Risco relativo2.5.1 Infecções virais
Dentre os fatores ambientais envolvidos no desenvolvimento da DM1, infecções por certos tipos de vírus são consideradas um dos principais fatores associados à doença (HYÖTY; TAYLOR, 2002). Algumas revisões tem ressaltado o papel das infecções virais no desenvolvimento da DM1 (JUN; YOON, 2001; VAN DER WERF et al., 2007). O relato mais antigo data de 1926, e tenta associar variações sazonais de incidência da DM1 com infecções virais (ADAMS, 1926). Dentre os tipos virais estudados, atualmente os Enterovirus são os principais candidatos a uma associação com a DM1, principalmente os Coxsackievirus (Tabela 1) (VAN BELLE et al., 2011).
Tabela 1. Grupos virais associados com a diabetes mellitus tipo 1.
Enterovirus
Coxsakievirus das linhagens A.
Todos os seis tipos de Coxsakievirus das linhagens B, especialmente os B4 associados com a autoimunidade. Isolados virais induziram diabetes em camundongos.
Ecovírus. Muitos tipos podem estar envolvidos.
Rubeola Seguido de infecção intrauterina. A diabetes pode aparecer após um longo intervalo de tempo. Induz anticorpos às células das ilhotas. Vacinação tem atenuado o risco.
Citomegalovirus Pode tem um pequeno papel na patogênese. Reação cruzada com o epítopo GAD
65.
Virus Epistein-Barr Vírus associados com doenças autoimunes, ocasionalmente com a diabetes.
Virus da caxumba Muitos relatos antigos, mas nenhum confirmado. A vacinação tem atenuado os riscos. Retrovirus Evidências controversas para humanos.
Rotavirus Relatos de automunidade às células da ilhota em uma criança depois da infecção. adaptado de Hyöty e Taylor (2002).
Em uma revisão, Van der Werf e colaboradores (2007) relacionam seis diferentes vias pelas quais infecções virais podem levar à DM1:
1 Infecções virais nas células β podem levar à citólise dessas células;
2 As infecções nas células β podem levar à quebra da autotolerância à essas células por conta da expressão de antígenos virais, antígenos das células β alterados e aumento da expressão do MHC, citocinas e quimiocinas.
3 Indução da ativação bystander de linfóctitos T, incluindo linfócitos autorreativos, que agem contra antígenos das células β.
4 Expressão de proteínas virais que agem como super antígenos, levando a proliferação de células T específicas;
5 Epitopos virais podem apresentar mimicidade molecular com auto-antígenos de células β, levando à ativação cruzada de linfócitos B e T autorreativos. 6 Sucessivas infecções podem culminar na autoimunidade das células β.
2.5.1.1 Infeções por enterovírus
Enterovirus são pequenos vírus não-envelopados que possuem um capsídeo icosaédrico e uma molécula de RNA fita simples positiva, linear e não-fragmentada, protegida por uma proteína genômica viral (PGV) na extremidade 5’ (JAÏDANE; HOBER, 2008). Seu genoma corresponde a uma sequência de 7500 bases, e compreende uma única região aberta à leitura (Open Reading Frame) ocupando aproximadamente 80% do RNA viral e produzindo uma poliproteína com 2200 aminoácidos que sofre sucessivas clivagens para produzir 11 proteínas maduras, das quais quatro são estruturais (VP1 até VP4) e sete são funcionais. Essa poliproteína é flanqueada por duas regiões não-codificantes que são essenciais para a tradução e síntese do RNA viral (KITAMURA et al., 1981).
A distribuição do Enterovírus é ubiqua, sendo transmitidos principalmente pela água ou comida contaminada com fezes. Além da DM1, a infecção por Enterovírus tem sido relacionada tanto a manifestações agudas, tais como meningite, encefalite e pericardite, quanto à doenças crônicas como por exemplo, meningocefalite em pacientes agamaglobulinemicos, síndrome pós-poliomelite, esclerose amiotrófica lateral, miocardite crônica e cardiomiopatia dilatada (JAÏDANE; HOBER, 2008).
O primeiro relato sobre a associação de um Enterovirus com a DM1 foi observado por Gamble e colaboradores (1969), que relataram anticorpos neutralizantes para o Coxsackievirus no soro de pacientes recentemente diagnosticados com DM1 em comparação com controles saudáveis. Posteriormente, esses dados foram confirmados a partir de amplificações por PCR (CLEMENTS et al., 1995). Em um estudo na década de 1970, observou-se que a incidência de casos de pacientes que desenvolveram DM1 após serem infectados pelo Coxackievirus B4
(CVB4) em relação àqueles que desenvolveram a doença, porém não foram infectados, foi considerada semelhante, sugerindo nenhuma ligação de infeção pelo CVB4 e a DM1 (DIPPE, et al., 1975). Esses resultados indicam que é necessário mais que a infeção viral para se desenvolver a DM1, ressaltando a importância do estudo de fatores genéticos envolvidos com a doença. Trabalhos mais recentes continuam propondo associação entre a infecção por Enterovírus e a DM1 (LÖNNROT et al., 2000; SALMINEN et al., 2003; SCHULTE et al., 2010).
As causas pelas quais a infecção pelo CVB4 leva à DM1 são comumente estudadas em modelos in vitro. As linhagens diabetogênicas CVB4 E2 e CVB4 VD2921 podem infectar e causar danos às células β, causando a expressão de moléculas do MHC, que facilitam a resposta autoimune ás células infectadas (PARKKONEN et al., 1992). A perturbação da seleção de timócitos pelo sistema de autotolerância no timo devido à infecção pelo CVB4 também pode levar à autoimunidade às células β (BRILOT et al., 2004).
Muitos estudos ainda são necessários para elucidar a associação não só dos Enterovírus, mas também da infecção por outros tipos virais com a precipitação da DM1, auxiliando na elaboração de estratégias preventivas para impedir a patogênese da doença.
2.5.2 Outros fatores ambientais
A seguir, outros fatores, além de infecções virais, que possivelmente estão associados com o desenvolvimento da DM1.
2.5.2.1 Infecções bacterianas
A microbiota intestinal é um dos fatores que podem estar associados ao desenvolvimento da DM1. De um modo geral, a administração de probióticos e antibióticos podem influenciar no desenvolvimento da DM1 por alterar o equilíbrio da microbiota intestinal, tanto em um estado tolerogênico, quanto em um estão não-tolerogênico, dependendo da constituição da microbiota no momento da administração dessas substâncias (BACH, 2002).
Estudos realizados com roedores indicam que há um agravo da DM1 por conta de desequilíbrios na composição da microbiota intestinal, que fazem com que a permeabilidade intestinal aos patógenos seja diminuída em indivíduos diabéticos, aumentando a exposição de antígenos bacterianos ao sistema imune em uma condição chamada de “intestino mal-vedado” (BACH, 2002; VAARALA et al., 2008). O uso de probióticos específicos podem prevenir a autoimunidade sob certas condições (CALCINARO et al., 2005). Entretanto, outros testes ainda são necessários para comprovar essa observação.
2.5.2.2 Proteínas do leite de vaca
A albumina do leite da vaca tem sido proposta com um fator promotor de autoimunidade por conta de sua atividade cruzada entre anticorpos séricos para a albumina e uma proteína de superfície das células β chamada ICA-1 (BRUSKO; BLUESTONE, 2008). Essa associação ainda permanece bastante controversa por conta de divergentes resultados de experimentos envolvendo modelos de ratos e camundongos diabéticos não-obesos (NOD) comentados em algumas revisões (AKERBLOM et al., 2002; VAN BELLE et al., 2011).
A evidência mais forte sobre o efeito do leite de vaca na autoimunidade foi a associação inversa encontrada entre o período de aleitamento materno e as chances de se desenvolver a DM1 na infância (AKERBLOM et al., 2002), ou seja, crianças que tiveram o aleitamento materno substituído pela ingestão do leite de vaca tem maiores chances de desenvolver a doença. Um estudo Finlandês indicou que a autoimunidade desenvolvida por conta da ingestão de leite de vaca se dá apenas quando os indivíduos apresentam um polimorfismo no gene PTPN22 (C858T), sugerindo esse fator genético como uma das causas das controvérsias entre os resultados (LEIMPAINEN et al., 2009).
2.5.2.3 Proteínas do trigo
De forma semelhante à albumina no leite da vaca, proteínas encontradas no trigo também podem desempenhar um papel no desenvolvimento da DM1. A adição de giadina, a proteína extraída do glúten do trigo, ou o glúten à dieta tem mostrado
um aumento na incidência de DM1 em modelos de roedores (Macfarlane, et al., 2003). É provável que esse efeito se dê por conta do aumento da atividade das células T quando expostas ao glúten (AKERBLOM et al., 2002).
2.5.2.4 Vitamina D
A vitamina D inibe a diferenciação de células dendríticas e ativação do sistema imune (VAN BELLE et al., 2011). Níveis de metabólitos de vitamina D foram menores no plasma de indivíduos com DM1 na fase inicial da doença (LITTORIN et al., 2006). Estudos de associação genética concluíram sobre a não-associação de polimorfismos no receptor da vitamina D e a DM1, porém polimorfismos em enzimas que participam da via de metabolização da vitamina D podem estar envolvidos com a doença (GUO et al., 2006; BAILEY et al., 2007).
2.6 IFIH1: CARACTERÍSTICAS DO GENE DE SEU PAPEL NA IMUNIDADE INATA
Nas próximas seções será descrita a estrutura gênica e protéica o IFIH1 e seu papel na imunidade inata.
2.6.1 Características do gene e da proteína
O gene IFIH1 (Helicase C domínio 1 indutora de interferon tipo 1) – também conhecido como Melanoma Differenciation associated protein number 5 (MDA5) – tem tamanho de aproximadamente 51,5 Kb e está localizado no braço longo do cromossomo 2 na região 24 (2q24). Outros genes que estão presentes nessa região cromossômica estão altamente ligados ao IFIH1: FAP, GCA e KCNH7 (MARTÍNEZ et al., 2008). O IFIH1 possui 16 éxons e não possui variantes devido à recomposição alternativa. Um cDNA completo do IFIH1 foi obtido pela primeira vez de uma biblioteca de cDNA placentário humano (KANG et al., 2002). A região codificante do IFIH1 possui 3365 pb de comprimento, e codifica para 1025 aminoácidos, produzindo uma molécula com peso aproximado de 116,7 KDa (CHISTIAKOV, 2010) (Figura 5).
Várias mutações de base única (SNPs) no IFIH1 tem sido associadas à etiologia de doenças autoimunes, como a Artrite Reumatóide (AR) (MARINOU et al.,
2007), Esclerose múltipla (EM) (ENEVOLD et al., 2009), Lupus eritematoso sistêmico (LES) (GRAHAM et al., 2011), Psoríase (LI et al., 2010) e DM1 (SMYTH et al., 2006; TODD et al., 2008; NEJENTSEV et al., 2009). No capítulo seguinte, será dada ênfase aos SNPs associados ao DM1 bem como alguns estudos funcionais relacionados.
A proteína homônima codificada pelo gene IFIH1 (também conhecida com MDA-5 e Helicard) contém dois domínios altamente conservados: Um domínio N-terminal de recrutamento de caspase (CARD), e um domínio C-N-terminal contendo uma RNA helicase DExH=D (KANG et al., 2002). O domínio DExH=D é responsável pelo reconhecimento RNA fita dupla dos vírus, enquanto que o domínio CARD é responsável por ativar a cascata de reações que levam à produção de interferon tipo 1 (IFN-α e IFN-β) (TAKEUCHI; AKIRA, 2008).
Figura 5. Distribuição dos polimorfismos de base única (SNPs) no gene IFHI1 mais estudados na diabetes mellitus tipo 1 e outras doenças autoimunes.
Fonte: CHISTIAKOV, 2010.
2.6.2 O Papel da IFIH1 na imunidade contra infecções virais
O RNA de fita dupla (dsRNA) representa um intermediário molecular de muitas infecções virais, e portanto, foi necessário que fosse desenvolvido no hospedeiro mecanismos para detectar sua presença (CHISTIAKOV, 2010).
Atualmente, sabe-se que existem duas vias de reconhecimento e sinalização do dsRNA viral: a via dependente da proteína quinase R (PKR) e a via da 20-50-oligoadenilato sintetase. A PKR é uma quinase induzida por interferon (IFN), que é ativada a partir de sua ligação ao dsRNA citoplamático, resultando na fosforilação do Fator de iniciação de tradução tipo A (MEURS et al., 1990), inibindo a tradução e replicação viral na célula infectada (WILLIAMS, 2001).
A 20-50-oligoadenilato sintetase é uma enzima que ativa a endoribonuclease RNase L pela síntese de curtos oligoadenilatos, promovendo a clivagem de RNAs viral e celular (CHISTIAKOV, 2010).
Vale frisar que como ambas as vias são principalmente induzidas por INF e não são necessitadas para a produção desta citocina, outro mecanismo celular é necessário para explicar a relação entre o reconhecimento do dsRNA e a produção de INF do tipo 1 (CHISTIAKOV, 2010). Tais mecanismos são àqueles mediados por receptores toll-like (TLRs), e àqueles de RNA helicases contendo DExD-H Box. O primeiro mecanismo não será abordado nesse estudo, entretanto, descreveremos o segundo, cuja a IFIH1 faz parte.
A família das RNA helicases contendo DExD-H Box é constituída pela IFIH1, RIG-I e LGP2, que são RNA helicases induzidas em nível transcripcional por IFNs tipo 1, ácido retinóico e dsRNA. O motivo CARD da RIG-I e da IFIH1 ativam a cascata de sinalização, utilizando uma proteína adaptadora chamada Estimulador do promotor de IFN-β tipo 1 (IPS-1), que resulta na ativação dos fatores regulatórios de interferon (IRF-3), IRF-7 e do NF-kβ (KAWAI et al., 2005). Os interferons induzem apoptose de células infectadas por vírus, bem como ativação de células NK e T (TAKEUCHI; AKIRA, 2008).
A IFIH1 (ou a RIG-I) reconhece a região 5’ do dsRNA viral, que não é metilada, diferentemente do RNA celular, por meio do domínio DExD-H Box; a seguir ocorre a interação da IFIH1 com o IPS-1 através do domínio CARD. A ubiquitina ligase E3, conhecida como TRAF3 é necessária para a ativação da sinalização do IPS-1. A desubiquitinase DUBA é responsável por inibir a atividade da TRAF3, suprimindo a sinalização. A TRAF3 recruta duas quinases, TBK1/IKK-i, que fosforilam o IRF-3 e o IRF-7, o que induz a formação de homodímeros e/ou heterodímeros dessas moléculas. Esses dímeros se translocam para o núcleo, se ligando aos elementos responsivos estimulados por IFN, resultando na produção de IFN tipo 1 e genes
associados que também são induzidos por IFN tipo 1 (TAKEUCHI; AKIRA, 2008) (Figura 6).
A IFIH1 compartilha alta similaridade com a RIG-1, porém suas funções não são plenamente similares, como se pensava anteriormente (YONEYAMA et al., 2005). A partir de estudos com camundongos knockout, foi observado que cada helicase reconhece grupos virais diferentes, ou ainda, alguns grupos em comum. A RIG-I reconhece tipos virais como o paramixovirus, vírus da estomatite vesicular (VSV) e o vírus influenza (KATO et al., 2006). A IFIH1 reconhece grupos de picornavirus, como o ecovirus, rinovirus e o vírus da encefalomiocardite (ECMCV) (BARRAL et al., 2007). Estudos com RNA silenciador (siRNA) sugerem que ambos RIG-I e IFIH1 compartilham o reconhecimento do vírus da dengue e o vírus do Oeste do Nilo (TAKEUCHI; AKIRA, 2008). Por fim, através de experimentos com o VSV em camundongos knockout, acredita-se que a LGP2 esteja associada com a regulação da atividade da RIG-I, desempenhando um papel antagônico (TAKEUCHI; AKIRA, 2008).
Figura 6. Esquema funcional da via de detecção de RNA através de receptores RIG-I-like.
2.6.3 IFIH1 e a Diabetes mellitus tipo 1
Como observamos anteriormente, alguns vírus, em especial aqueles do grupo dos Enterovírus, infectam vários órgãos causando várias perturbações, tais como danos às células-β do pâncreas (VON HERRATH, 2009). Geralmente, essas infecções per se não causam a DM1, como foi notado em alguns casos tanto em camundongos quanto em humanos (JUN; YOON, 2001). Entretanto, elas podem contribuir para o quadro de autoimunidade contra as células-β possivelmente por conta do aumento da expressão de fatores inflamatórios como a interleucina 2 (IL-2) e IFN-α, além do MHC-I (VAN DER WERF et al., 2007; VON HERRATH, 2009).
Como foi explicado antes, a IFIH1 desempenha um importante papel na estimulação de interferons tipo 1 em resposta a infecções de certos vírus, principalmente os Enterovírus. Portanto, polimorfismos no gene IFIH1 podem indiretamente alterar os níveis de IFN tipo 1 nas células, agravando o estado de autoimunidade, levando a DM 1 (LI et al., 2008).
2.6.3.1 Polimorfismos do gene IFIH1 relacionados com a DM1
O primeiro trabalho que relacionou polimorfismos no gene IFIH1 com a DM1 foi realizado por Smyth e colaboradores (2006) em uma população caucasiana do Reino Unido, que reuniu cerca de 10 mil indivíduos. Nesse estudo de associação genômica, o SNP rs1990760 (A946T), uma substituição não sinônima no éxon 14, onde se encontra o sítio de ligação do fator de transcrição HNF-3b, mostrou-se associada à DM1 com um efeito protetor (OR = 0.86; P = 1.42 x10-10) para o alelo mutante. Em um
estudo funcional (SHIGEMOTO, et al., 2009) não foi observada mudança no fenótipo do alelo mutante para o alelo selvagem. Além disso, outros dois estudos (DOWNES et al., 2010; ZOUK et al., 2010) não encontraram mudanças nos níveis de expressão da IFIH1 relacionadas com a mutação A946T. Portanto, o papel protetor do SNP rs1990760 contra a DM1 ainda permanece inconclusivo.
Posteriormente ao trabalho de Smyth e colaboradores, outro estudo de associação genômica (NEJENTSEV et al., 2009), identificou quatro variantes raras no gene IFIH1 altamente relacionadas com a proteção a DM1: a mutação de perda de função G627X (rs35744605) no éxon 10, as mutações 1641+1 (G/C) (rs35337543) e
2807+1 (G/A) (rs35732034), que alteram o sítio de splicing nos íntrons 8 e 14, respectivamente, e finalmente a mudança não-sinônima I923V (rs35667974) no éxon 14. As odds ratios (OR) variaram entre 0,51 e 0,74. Esse último também foi estudado em pacientes com EM, porém não foi observada associação (BERGAMASCHI et al., 2010).
Downes e colaboradores (2010) estudaram a expressão de indivíduos portadores dessas raras variantes e observou que os níveis de IFIH1 foram menores para os portadores da mutação de perda de função G627X. Para a mudança não-sinônima I923V, observou-se que o nível de expressão não foi reduzido, porém a eficiência da IFIH1 foi reduzida. Acredita-se que essa perca de eficiência se dá por mudanças na interação entre a IFIH1 e o IPS-1 (DOWNES et al., 2010). Com relação às duas variantes nos íntrons 8 e 14, foi observada menor quantidade de mRNA transcrito nos portadores das mutações, indicando a produção de uma proteína aberrante.
Outro SNP associado com a proteção a DM1 é o rs3747517 (H843A) localizado no éxon 13 em um sítio de ligação do regulador de transcrição AP-1 (LIU et al., 2009), e seu efeito pode estar relacionado com a diminuição de transcrição do gene (DOWNES et al., 2010).
Por fim, outros dois SNPs associados com a DM1 é o rs2111485 (A/G) e o rs13422767 (A/G), que estão localizados entre o gene FAP e o IFIH1 (a 13 Kb e 23 Kb do fim do IFIH1, respectivamente), onde foram observadas OR de 1,7 e 1,9 (LIU et al., 2009). Ainda não há estudos quanto a sua funcionalidade desses dois SNPs, uma vez que eles não alteram o sítio de ligação de nenhum fator de transcrição conhecido.
2.6.4 Polimorfismos no gene IFIH1 estudados em outras doenças autoimunes e infecciosas
Além da DM1, alguns SNPs do gene IFIH1 também se mostrou associado a
outras doenças autoimunes. LI e colaboradores (2010) observaram um efeito protetor dos SNPs rs35667974 e rs10930046 contra a psoríase. Outro polimorfismo estudado para a psoríase foi o rs17716942, que não demonstrou associação com a doença (CHEN et al., 2011). Ainda com relação ao SNP rs10930046, ENEVOLD et al. (2009)
realizaram um estudo com esclerose múltipla que não revelou associação deste polimorfismo com a doença. Molineros e colaboradores (2013) observaram associação desse SNP com o LES e de uma variante intrônica (rs13023380).
Outros dois polimorfismos estudados por Enevold e colaboradores em pacientes com EM foram o rs3747517 e o rs1990760, onde foi encontrada uma associação desses polimorfismos com a proteção ao desenvolvimento da doença. Entretanto, um estudo anterior não havia encontrado associação do SNP rs1990760 com essa doença (MARTÍNEZ et al., 2008). Esses mesmos dois SNPs foram estudados por Chen e colaboradores (2011) onde os autores observaram respectivas associações de proteção e susceptibilidade com a periodontite crônica, além de um efeito protetor do SNP rs1990760 ao desenvolvimento da psoríase, indicando que o mesmo polimorfismo pode produzir efeitos opostos em diferentes doenças.
Além das doenças acima citadas, o polimorfismo rs1990760 dentre outros também estão possivelmente associado com a susceptibilidade ao LES (GRAHAM et al., 2011; CEN et al., 2012; MOLINEROS et al., 2013; WANG et al., 2013), doença de Graves (SUTHERLAND et al., 2007, ZURAWEK et al., 2013) e vitiligo (JIN et al., 2012). Entretanto, com relação à Doença de Graves, Penna-Martinez e colaboradores (2009), em outro estudo, não encontraram associação desse polimorfismo com a doença, assim como também não encontraram associação com a tireoidite de Hashimoto nem com a Doença de Addison, sendo essa última já estudada por Sutherland e colaboradores (2007), que encontrou resultados similares. Marinou e colaboradores (2007) e Smyth e colaboradores (2008) estudaram o SNP rs1990760 em pacientes com artrite reumatoide e doença celíaca, respectivamente, e não encontraram associação.
3 OBJETIVOS
Abaixo determinamos os objetivos gerais do trabalho e pontuamos os objetivos específicos.
3.1 OBJETIVOS GERAIS
Este trabalho tem por objetivo geral avaliar a influência de polimorfismos no gene IFIH1 no desenvolvimento de doenças autoimunes, principalmente a diabetes mellitus tipo 1.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar as frequências alélicas e genotípicas de variantes do gene IFIH1 em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 em Pernambuco e de uma população saudável do mesmo local;
Verificar a associação dessas variantes com um possível efeito de risco ou proteção ao desenvolvimento da diabetes mellitus tipo 1;
Avaliar a associação das variantes do IFIH1 com a susceptibilidade ou proteção à outras doenças autoimunes.
4 MÉTODOS
Informações detalhadas sobre os indivíduos selecionados para essa pesquisa, bem como os materiais e os métodos empregados, estão relacionados nos apêndices A e B.
5 RESULTADOS
Todos os resultados obtidos no presente trabalho estão detalhados nos apêndices A e B.
6 DISCUSSÃO
Considerando o papel das infecções virais na etiologia da Diabetes mellitus tipo 1 (DM1), doença autoimune da tireóide (DAIT) e doença celíaca (DC) mecanismos deficientes no reconhecimento viral causados por uma molécula de IFIH1 deficiente podem estar associados com o desenvolvimento destas doenças (KNIP et al., 2005; DESAILLOUD; HOBER, 2009). De fato, Smyth e colaboradores. (2006) encontraram associação do SNP rs1990760 (A946T), mas Penna-Martínez e colaboradores (2009) não encontraram associação deste polimorfismo com a doença de Graves e a tireoidite de Hashimoto. Assim como na DAIT, Smyth e Colaboradores (2008) não encontraram associação envolvendo a DC e o IFIH1.
O primeiro estudo realizado (apêndice A) nesse projeto reporta uma tendência para associação do tag-SNP rs6432714 com a susceptibilidade à DM1, considerando o modelo se semidominância. Esse tag-SNP representa a região entre os íntrons 6 e 7, aprensentando alto desequilíbrio de ligação com os outros SNPs desse fragmento, e dentre eles, o SNP não sinônimo rs10930046. Entretanto, nossos dados não sugerem uma relação da variante rs10930046 com a DM1.
O polimorfismo rs10930046 consiste em uma alteração do aminoácido na posição 460 (histidina) por um resíduo de arginina (H460R), ambos carregados positivamente, em uma região de alfa-hélice do domínio helicase, que é responsável pelo reconhecimento de dsRNA viral (VASSEUR et al., 2011).
De acordo com os nossos dados de modelagem molecular, a variação estrutural observada não parece ser suficiente para causar uma deficiência na detecção do dsRNA do vírus através da proteína que afete a susceptibilidade à DM1 ou a insurgência de DAIT e DC, corroborando com os resultados descritos por Shigemoto e colaboradores (2009).
No trabalho apresentado no apêndice B, relatamos um estudo envolvendo polimorfismos do gene STAT4 (rs7574865 e rs3024839) e do IFIH1 (rs3747517 e rs1990760). Ambos os genes codificam para proteínas que fazem parte de uma das vias de ativação do Interferon tipo I (ZHENG et al., 2013). Nesse estudo, não foi observada associação de ambos os SNPs do IFIH1 com o desenvolvimento da DM1 ou da síndrome autoimune poliglandular tipo III, que é a co-ocorrência da DAIT e DM1 (DITTMAR; KAHALY, 2010).
Entretanto, a meta-analise realizada com grande parte dos estudos envolvendo o SNP rs1990760 e a DM1, incluindo o nosso, foi observada associação desse polimorfismo com a DM1. Essa meta-analise reforça outra meta-analise já realizada anteriormente (JERMENDY et al., 2009), porém agora com o acréscimo de novos trabalhos publicados.
Apesar de vários trabalhos apontarem a associação da variante não sinônima rs1990760 (A946T) com a DM1 e da expressão ser afetada (LIU et al., 2009), estudos funcionais não conseguiram determinar o efeito biológico dessa variação tanto em pacientes saudáveis, quanto em pacientes com DM1 (SHIGEMOTO et al., 2009; DOWNES et al., 2010, ZOUK et al., 2013).
É possível que o SNP rs3747517 (A843H) seja o real fator associado com a susceptibilidade à DM1 (DOWNES et al., 2010), mas apesar de se saber que esse polimorfismo está localizado em uma região da proteína importante no reconhecimento do dsRNA (WU et al., 2012), ainda não foram feitos estudos funcionais suficientes para comprovar essa hipótese.
Em nossos dois estudos os resultados não indicam uma evidência forte do gene IFIH1 como fator relacionado com a DM1. Sendo assim, algumas considerações sobre os estudos devem ser feitas: o tamanho amostral dos estudos é baixo; fatores de confundimento podem estar interferindo nos resultados.
No primeiro estudo, o poder estatístico para excluir a possibilidade de um falso negativo foi alto (maior que 0,80). O mesmo não foi observado no segundo estudo em que o poder estatístico foi inferior a 0,80. Ainda no segundo estudo, a meta-analise envolvendo o SNP rs1990760 detectou certa heterogeneidade entre os estudos. Essa heterogeneidade pode estar relacionada com diferentes graus de estruturação populacional observados nas populações estudadas.
De fato, estudos de genética de população apontam frequências de alguns SNPs do IFIH1 diferentes entre populações com alto grau de miscigenação em relação a populações com baixo grau de miscigenação (FUMAGALLI et al., 2011), o que não foi considerado em nossos trabalhos.
Portanto, outros estudos mais robustos e que levem em consideração a estruturação populacional como fator de confundimento são necessários para determinar o papel do IFIH1 na DM1.
7 CONCLUSÕES
Nossos achados indicam que o tag-SNP rs6432714 do gene IFIH1 apresentou tendência para associação com a diabetes mellitus tipo 1; o SNP rs10930046 (H460R), que é representado por esse tag-SNP não apresentou associação com DM1 ou outras doenças autoimunes, porém uma análise in silico indica que essa variação produz uma alteração na estabilidade da proteína; Os polimorfismos rs3747517 (H843R) e rs1990760 (A946T) também não apresentaram associação com o desenvolvimento da DM1 ou síndrome poliglandular autoimune tipo III; entretanto, a meta-analise envolvendo o rs1990760 confirmou resultados anteriores de que esse SNP está assoiado com a DM1; O poder estatistico reduzido em alguns testes e a estratificação populacional podem ser fatores que contribuiram para que o presente estudo tenha produzido resultados divergentes dos já observados na literatura.
REFERÊNCIAS
ADAMS, S. F. The seasonal variation in the incidence of acute diabetes. Arch Int
Med, v. 37, p. 861, 1926.
AKERBLOM, H. K. et al. Environmental Factors in the Etiology of Type 1 Diabetes.
Am J Med Genet, v. 115, p. 18-29, 2002.
ATKINSON, M. A.; EISENBARTH, G. S. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet, v. 358, p. 221-229, 2001.
BACCHETTA, R. et al. Defective regulatory and effector T cell functions in patients with FOXP3 mutations. J Clin Invest, v. 116, p. 1713–1722, 2006.
BACH, J. The effect of infections on susceptibility to autoimmune and allergic diseases. N Engl J Med, v. 347, n. 12, p. 911-920, 2002.
BAILEY, R. et al. Association of the Vitamin D Metabolism Gene CYP27B1 With Type 1 Diabetes. Diabetes, v. 56, p. 2616-2621, 2007.
BAKER II, P.R.; STECK, A. K. The Past, Present , and Future of Genetic Associations in Type 1. Diabetes.Curr Diab Rep, v. 11, p. 445-453, 2011.
BARRAL, P. M. et al. MDA-5 Is Cleaved in Poliovirus-Infected Cells. J Virol, v. 81, n. 8, p. 3677-3684, 2007.
BENDING, D.; ZACCONE, P.; COOKE, A. Inflammation and type one diabetes. Int
Immunol, v. 24, n. 6, p. 339-346, 2012.
BERGAMASCHI, L. et al.. No evidence of association of the rare nsSNP rs35667974 in IFIH1 with multiple sclerosis. J Neuroimmunol, v. 221, p. 112-114, 2010.
BONIFACIO, E. et al. Early autoantibody responses in prediabetes are IgG1
dominated and suggest antigen-specific regulation. J Immunol, v. 163, p. 525–532, 1999.
BRESSON, D. et al. Genetic-induced Variations in the GAD65 T-cell Repertoire Governs Efficacy of Anti-CD3/GAD65 Combination Therapy in New-onset Type 1 Diabetes. Mol Therap, v. 18, n. 2, p. 307-316, 2010.
BRESSON, D. et al. Anti-CD3 and nasal proinsulin combination therapy enhances remission from recentonset autoimmune diabetes by inducing Tregs. J Clin Invest, v. 116, p. 1371-1381, 2006.
BRILO, T. F. et al. Coxsackievirus B4 Infection of Human Fetal Thymus Cells. J
virol, v. 78, n. 18, p. 9854-9861, 2004.
BRUSKO, T.; BLUESTONE, J. Clinical applications of regulatory T cells transplantation. Eur J Immunol, v. 38, p. 901-937, 2008.
CALCINARO, A. F.; SIMONE, D.; MARIO, D. Oral probiotic administration induces interleukin-10 production and prevents spontaneous autoimmune diabetes in the non-obese diabetic mouse. Diabetologia, v. 48, p. 1565-1575, 2005.
CAMARCA, M. E. et al. Celiac disease in type 1 diabetes mellitus. Ital J Pediatr, v. 38, p. 10-16, 2012.
CEN, H. et al. Association Study of IFIH1 rs1990760 Polymorphism with Systemic Lupus Erythematosus in a Chinese Population. Inflammation, DOI:
10.1007/s10753-012-9564-0, 2012.
CHEN, G. et al. Genetic variants in IFIH1 play opposite roles in the pathogenesis of psoriasis and chronic periodontitis. Int J Immunogent, v. 00, p. 1-7, 2011.
CHISTIAKOV, D. A. Interferon Induced with Helicase C Domain 1 (IFIH1) and Virus-Induced Autoimmunity: A Review. Viral Immunol, v. 23, p. 3-15, 2010.
CLEMENTS, G. B.; GALBRAITH, D. N.; TAYLOR, K.W. Coxsackie B virus infection and onset of childhood diabetes. Lancet, v. 346, p. 221-223, 1995.
DESAILLOUD, R.; HOBER, D. Viruses and thyroiditis: an update. Virol. J, v. 6, 2009. DIAMOND – DIABETES MONDIALE GROUP. Incidence and trends of childhood Type 1 diabetes worldwide 1990-1999. Diabet Med, v. 23, p. 857-866, 2006. DIPPE, S.E. et al Lack of Causal Association Beteween Coxsackie B4 Virus Infection and Diabetes. Lancet, v. 305, n. 7920, p. 1314-1317, 1975.
DITTMAR, M.; KAHALY, G. J. Genetics of the Autoimmune Polyglandular Syndrome Type 3 Variant. Thyroid, v. 20, p. 737-743, 2010.
DOWNES, K. et al. A. Reduced Expression of IFIH1 Is Protective for Type 1 Diabetes. PLoS One, v. 5, n. 9, p. 1-6, 2010.
EISENBARTH, G. S. Type I diabetes mellitus. A chronic autoimmune disease. N
Engl J Med, v. 314, p. 1360-1368, 1986.
ENEVOLD, C. et al. Multiple sclerosis and polymorphisms of innate pattern recognition receptors. J Neuroimmunol, v. 212, p. 125-131, 2009.
ESPINO-PAISÁN, L.; URCELAY, E.; SANTIAGO, J. L. An insight into the genetics of type 1 Diabetes. Immunologia, v. 28, p. 173-181, 2009.
EURODIAB, ACE STUDY GROUP. Variation and trends in incidence of childhood diabetes in Europe. Lancet, v. 355, p. 873-876, 2000.
FIFE, B.T.; BLUESTONE, J. A. Control of peripheral T-cell tolerance and
autoimmunity via the CTLA-4 and PD-1 pathways. Immunol Rev, v. 224, p.166-182, 2008.
FUMAGALLI, M. et al. Population Genetics of IFIH1: Ancient Population Structure, Local Selection, and Implications for Susceptibility to Type 1 Diabetes. Mol. Biol.
Evol, v. 27, n. 11, p. 2555-2566, 2011.
GAMBLE, D. R. et al. Viral Antibodies in Diabetes Mellitus. Brit Med J, v. 3, p. 627-630, 1969.
GAN, M. J.; ALBANESE-O’NEIL, A.; HALLER, M. J. Type 1 Diabetes: Current Concepts in Epidemiology, Pathophysiology, Clinical Care, and Research. Curr
Probl Pediatr Adolesc Health Care, v. 42, p. 269-291, 2012.
GRAHAM, D. S. C. et al. Association of NCF2, IKZF1, IRF8, IFIH1, and TYK2 with systemic lupus erythematosus. PLoS Genet, v. 7, n. 10, 2011.
GUO, S. et al. Meta-Analysis of Vitamin D Receptor Polymorphisms and Type 1 Diabetes: A HuGE Review of Genetic Association Studies. Am J Epidemiol, v. 164, n. 8, p. 711-724, 2006.
HYÖTY, H.; TAYLOR, K. W. The role of viruses in human diabetes. Diabetologia, v. 45, p. 1353-1361, 2002.
JAÏDANE, H.; HOBER, D. Role of coxsackievirus B4 in the pathogenesis of type 1 diabetes. Diabet Metabol, v. 34, p. 537-548, 2008.
JERMENDY, A. et al. The interferon-induced helicase IFIH1 Ala946Thr
polymorphism is associated with type 1 diabetes in both the high-incidence Finnish and the medium-incidence Hungarian populations. Diabetologia, v. 53, p. 98-102, 2009.
JIN, Y. et al. Genome-wide association analyses identify 13 new susceptibility loci for generalized vitiligo. Nat Genet, v. 44, n. 6, p. 676-681, 2012.
JUN, H. S.; YOON, J. W. The role of viruses in Type I diabetes : two distinct cellular and molecular pathogenic mechanisms of virus-induced diabetes in animals.
Diabetologia, v. 44, p. 271-285, 2001.
KAHALY, G. J. Polyglandular autoimmune syndromes. Eur J Endocrinol, v. 161, p. 11-20, 2009
KANG, D. et al. mda-5 : An interferon-inducible putative RNA helicase with double-stranded RNA-dependent ATPase activity and melanoma growth-suppressive properties. PNAS, v. 99, n. 2, p. 637-642, 2005.
KATO, H. et al. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature, v. 441, p. 101-105, 2006.
KAWAI, T. et al. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat Immunol, v. 6, n. 10, p. 981-988, 2005.
KITAMURA, N. et al. Primary structure, gene organization and polypeptide expression of poliovirus RNA. Nature, v. 291, p. 547-553, 1981.
KNIP, M.; SIMELL, O. Environmental Triggers of Type 1 Diabetes. Cold Spring Harb
Perspect Med, DOI: 10.1101/cshperspect.a007690, 2012.
KNIP, M. et al. Environmental Triggers and Determinants of Type 1 Diabetes.
Diabetes, v. 54, p. 125-136, 2005.
KYVIK, K. O.; GREEN, A.; BECK-NIELSEN, H. Concordance Rates of Insulin Dependent Diabetes Mellitus: A Population Based Study Of Young Danish Twins.
BMJ, v. 311, p. 913-917, 1995.
LEHNE, B.; LEWIS, C. M.; SCHLITT, T. From SNPs to Genes: Disease Association at the Gene Level. PLoS One, v. 6, n. 6, DOI: 10.1371/journal.pone.0020133, 2001. LEIMPAINEN, J. et al. Interplay Between PTPN22 C1858T Polymorphism And Cow’s Milk Formula Exposure In Type 1 Diabetes. J Autoimmun, v. 33, p. 155-164, 2009. LESLIE, R. D. G.; ATKINSON, M. A.; NOTKINS, A. L. Autoantigens IA-2 and GAD in Type I (insulin-dependent) diabetes. Diabetologia, v. 42, p. 3-14, 1999.
LI, Q. et al. Interferon-α initiates type 1 diabetes in nonobese diabetic mice. PNAS, v. 105, n. 34, p. 1-6, 2008.
LI, Y. et al. Carriers of rare missense variants in IFIH1 are protected from psoriasis. J
Invest Dermatol, v. 130, n. 12, p. 2768-2772, 2010.
LITTORIN, B. et al. Lower levels of plasma 25-hydroxyvitamin D among young adults at diagnosis of autoimmune type 1 diabetes compared with control subjects : results from the nationwide Diabetes Incidence Study in Sweden (DISS). Diabetologia, v. 49, p. 2847-2852, 2006.
LIU, S. et al. IFIH1 polymorphisms are significantly associated with type 1 diabetes and IFIH1 gene expression in peripheral blood mononuclear cells. Hum Mol Genet, v. 18, n. 2, p. 358-365, 2009.
LÖNNROT, M. et al. Enterovirus Infection as a Risk Factor for β-Cell Autoimmunity in a Prospectively Observed Birth Cohort. Diabetes, p. 492-496, 2000.
LUNETTA, K. L. Genetic Association Studies. J Am Heart Assoc, v. 118, p. 96-101, 2008.
MACFARLANE, A. J. et al. A type 1 diabetes-related protein from wheat (Triticum aestivum). cDNA clone of a wheat storage globulin, Glb1, linked to islet damage. J
Biol Chem, v. 278, p. 54-63, 2003.
MARINOU, I. et al. Research article The interferon induced with helicase domain 1 A946T polymorphism is not associated with rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther, v. 9, n. 2, p. 1-5, 2007.
MATINÍNEZ, A. et al. IFIH1-GCA-KCNH7 locus: influence on multiple sclerosis risk.
Eur J Hum Genet, v. 16, p. 861-864, 2008.
MEURS, E. et al. Molecular cloning and characterization of the human double-stranded RNAactivated protein kinase induced by interferon. Cell, v. 62, p. 379-390, 1990.
MOLINEROS, J. E. et al. Admixture Mapping in Lupus Identifies Multiple Functional Variants within IFIH1 Associated with Apoptosis, Inflammation, and Autoantibody Production. PLoS Genet, v. 9, n. 2,e1003222, 2013.
NEJENTSEV, S. et al. Rare Variants of IFIH1, a Gene Implicated in Antiviral Responses, Protect against Type 1 Diabetes. Science, v. 324, p. 387-389, 2009. NOBLE, J. A. et al. The role of HLA class II genes in insulin-dependent diabetes mellitus: Molecular analysis of 180 Caucasian, multiplex families. Am J Hum Genet, v. 59, p. 1134-1148, 1996.
PARKKONEN, P. et al. Mumps virus infects beta cells in human fetal islet cell
cultures upregulating the expression of HLA class 1 molecules. Diabetologia, v. 35, p. 63-69, 1992.
PATTERSON, C. C. et al. Incidence trends for childhood type 1 diabetes in Europe during 1989–2003 and predicted new cases 2005-2020: a multicentre prospective registration study. Lancet, v. 373, p. 2027-2033, 2009.
PENNA-MARTINEZ, M. et al. The rs1990760 polymorphism within the IFIH1 locus is not associated with Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis and Addison's disease.
BMC Med Genet, v. 10, 2009.
PINO, S. C.; KRUGER, A. J.; BORTELL, R. The Role of Innate Immune Pathways in Type 1 Diabetes Pathogenesis. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes, v.17, n. 2, p. 126-130, 2010.
REDONDO, M. J.; FAIN, P. R.; EISENBARTH, G. S.; Genetics of Type 1A Diabetes.
Recent Prog Horm Res, v. 56, p. 69-89, 2001.
REDONDO, M. J. et al. Concordance for Islet Autoimmunity among Monozygotic Twins. N Engl J Med, v. 359, n. 26, p. 2849-2850, 2008.
ROTHE, H. et al. IL-18 Inhibits Diabetes Development in Nonobese Diabetic Mice by Counterregulation of Th1-Dependent Destructive Insulitis. J Immunol, v. 163, p. 1230-1236, 1999.
SALMINEN, K. et al. Enterovirus Infections Are Associated With The Induction Of B-Cell Autoimmunity In A Prospective Birth Cohort Study. J Med Virol, v. 69, p. 91-98, 2003.
SCHULTE, B. M. et al. Detection of Enterovirus RNA in Peripheral Blood
Mononuclear Cells of Type 1 Diabetic Patients Beyond the Stage of Acute Infection.
Viral Immunol, v. 23, n. 1, p. 99-104, 2010.
SHIGEMOTO, T. et al. Identification of loss of function mutations in human genes encoding RIG-I and MDA5: implications for resistance to type I diabetes. J Biol
Chem, v. 284, n. 20, p. 13348-13354, 2009.
SMYTH, D. J.et al. A genome-wide association study of nonsynonymous SNPs identifies a type 1 diabetes locus in the interferon-induced helicase (IFIH1) region. Nat Genet, v. 38, p. 617-619, 2006.
SMYTH, D. J. et al. Shared and Distinct Genetic Variants in Type 1 Diabetes and Celiac Disease. N Engl J Med, v. 359, p. 2767-2777, 2008.
STECK, A.K.; REWERS, M. J. Genetics of Type 1 Diabetes. Clin Chem, v. 57, n. 2, p. 176-185, 2011.
STEHNO-BITTEL, L. Organ-Based Response to Exercise in Type 1 Diabetes. ISRN
Endocrinol, DOI: 10.5402/2012/318194, 2012.
STIPANIC, G. et al. Incidence and trends of childhood Type 1 diabetes in Croatia from 1995 to 2003. Diab Res Clin Pract, v. 80, p. 122-127, 2008.
SUAREZ-PINZON, W. L. et al. Combination Therapy With Glucagon-Like Peptide-1 and Gastrin Restores Normoglycemia in Diabetic NOD Mice. Diabetes, v. 57, p. 3281-3288, 2008.
SUTHERLAND, A. et al. Genomic Polymorphism at the Interferon-Induced Helicase (IFIH1) Locus Contributes to Graves’. J Clin Endocr Metab, v. 92, n. 8, p. 3338-3341, 2007.
SUTHERLAND, A. P. R. et al. Interleukin-21 Is Required for the Development of Type 1 Diabetes in NOD Mice. Diabetes, v 58, p. 1144-1155, 2009.
TAIT, B. D. et al. HLA genes associated with autoimmunity and progression to disease in type 1 diabetes. Tissue Antigens, v. 61, p. 146-153, 2003.
TAKEUCHI, O.; AKIRA, S. MDA5 / RIG-I and virus recognition. Curr Opin Immunol, v. 20, p. 17-22, 2008.
WTCCC – THE WELLCOME TRUST CASE CONTROL CONSORTIUM. Genome-wide association study of copy number variation in 16,000 cases of eight common diseases and 3,000 shared controls. Nature, v. 464, n. 7289, p. 713-720, 2010. TODD, J. A. Etiology of Type 1 Diabetes. Immunity, v. 32, p. 457-467, 2010 TODD, J. A. et al. Robust associations of four new chromosome regions from
VAARALA, O.; ATKINSON, M. A.; NEU, J. The “Perfect Storm” For Type 1 Diabetes: The Complex Interplay Between Intestinal Microbiota, Gut Permeability, And Mucosal Immunity. Diabetes, v. 57, p. 2555-2562, 2008.
VAN BELLE, T. L.; COPPIETERS, K. T.; VON HERRATH, M. G. Type 1 Diabetes: Etiology, Immunology, and Therapeutic Strategies. Physiol Rev, v. 91, p. 79-118, 2011.
VAN DER WERF, N. et al. Viral infections as potential triggers of type 1 diabetes.
Diabetes Metab Res Rev, v. 23, p. 169-183, 2007.
VASSEUR, E. et al. The selective footprints of viral pressures at the human RIG-I-like receptor family. Hum Mol Genet, v. 20, p. 4462–4474, 2011.
VERGE, C. F. et al. Combined Use of Autoantibodies (IA-2 Autoantibody, GAD Autoantibody, Insulin Autoantibody, Cytoplasmic Islet Cell Antibodies) in Type 1 Diabetes. Diabetes, v. 47, p. 1857-1866, 1998.
VILLANO, M. J. B. et al. Autoimmune Thyroiditis and Diabetes: Dissecting the Joint Genetic Susceptibility in a Large Cohort of Multiplex Families. J Clin Endocrinol
Metab, v. 94, n. 4, p. 1458–1466, 2009.
VILLASEÑOR, J.; BENOIST, C.; MATHIS, D. AIRE and APECED: molecular insights into an autoimmune disease. Immunol Rev, v. 204, p. 156-164, 2005.
VON HERRATH, M. Diabetes: A virus-gene collaboration. Nature, v. 459, p. 518-519, 2009.
WANG, C.; et al. Contribution of IKBKE and IFIH1 gene variants to SLE susceptibility. Genes Immun, DOI: doi:10.1038/gene.2013.9, 2013.
WILLIAMS, B. R. Signal integration via PKR. Sci STKE, v. 2001, n. 89, p. RE2, 2001. WU, B. et al. Structural Basis for dsRNA Recognition, Filament Formation, and
Antiviral Signal Activation by MDA5. Cell, v. 152, p. 1-14, 2012.
YONEYAMA, M. et al. Shared and Unique Functions of the DExD/H-Box Helicases RIG-I, MDA5, and LGP2 in Antiviral Innate Immunity. J Immunol, v. 175, p. 2951-2858, 2005.
ZHENG, J. et al. Meta-analysis reveals an association of STAT4 polymorphisms with systemic autoimmune disorders and anti-dsDNA antibody. Hum Immunol, v. 74, p. 986-992, 2013.
ZHERNAKOVA, A.; VAN DIEMEN, C. C.; WIJMENGA, C. Detecting shared
pathogenesis from the shared genetics of immune-related diseases. Nat Rev Genet, v. 10, p. 43-55, 2009.
