ANDERSON VIEIRA CHAVES
FILOGEOGRAFIA, GENÉTICA DA PAISAGEM E IDENTIFICAÇÃO DE ZONAS DE CONTATO ENTRE LINHAGENS GENÉTICAS DIVERGENTES DE
THAMNOPHILUS CAERULESCENS (PASSERIFORMES: THAMNOPHILIDAE).
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética, do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Genética, área de concentração, Genética Evolutiva e de Populações.
Orientador: Prof. Dr. Fabrício Rodrigues dos Santos Co-orientadora: Dra. Daniela Rodrigues Lacerda
Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Geral
Belo Horizonte, MG Fevereiro/2010
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a muitas pessoas que fizeram parte dessa caminhada:
- ao meu orientador Fabrício, primeiramente pela amizade adquirida desde que entrei para o LBEM em 2005 e, pelo incentivo e confiança depositada em mim na participação e gestão de vários projetos do laboratório;
- a minha co-orientadora Daniela, pela ideia desse projeto de mestrado e pela ajuda, ensinamentos e parceria em projetos;
- ao ornitólogo Leonardo Esteves Lopes, pessoa fundamental na execução desse projeto. Esteve presente em todas as coletas, me orientou nos pontos mais relevantes da problemática em torno do T. caerulescens, forneceu artigos e comentários nas análises finais. Além de ter empalhado um bocado de bichos... Muito obrigado pela amizade e parceria nesse trabalho!
- a todo o pessoal do Laboratório de Ornitologia da UFMG, especialmente a Lílian Mariana Costa e Guilherme Freitas, pelo material biológico fornecido da captura de aves em vários trabalhos de campo; ao coordenador do Laboratório, Professor Marcos Rodrigues por toda ajuda e acesso aos exemplares da Coleção Ornitológica da UFMG e ao material bibliográfico; também ao Marcelo Ferreira de Vasconcelos que por ter coletado grande parte do material presente na coleção mesmo antes do início desse projeto e que são de extrema importância para esse estudo;
- a todos as pessoas que me ajudaram nos trabalhos de campo e aos que facilitaram as coletas, especialmente o Gustavo Malaco e Eduardo “Bambam” que foram muito receptivos nas coletas no Triângulo Mineiro;
- a Paloma, Augusto e Priscila, os estagiários que passaram por esse projeto e que muito me ajudaram nesse ou até mesmo em outros projetos, na realização dos trabalhos práticos (“bancada”);
- ao meu amigo Guilherme Freitas que muito me ajudou na taxidermia dos exemplares coletados e nos trabalhos de campo;
- a todos os membros e ex-membros do LBEM: Camila, Bárbara, Letícia, Marilza, Claudia, Sibelle, Leandro, Rodrigo(s), Augusto, Daniela, Débora, Eloisa, Érica, Fabiano, Josimar, Karina, Romeu, Paula, José Raul, Sarah, Ricardo, Juliana, Priscila, Luciana, José Eustáquio, Cayo, Igor, Gisele, ..., (nossa! é muita gente! rsrs). Todos vocês me ajudaram
muito! Aprendi muito com vocês, mas, o que mais vale para mim é a amizade e confiança que fizemos durante todos esses anos;
- os meus colegas da Genética: Renan, Junia, Helena, Renata, Jaqueline, Luciana(s), Carol, Rennan, Wagner, Giordano, Moara, Flávia, Latife, Flaviane, Gustavo, Leonardo, Claudia, Juliana, Anderson (calouro), Rafael Roque, Michele, Sausicha, Siomar, Daniel, Roxana, Marlene, Marina, Magui, Laélia, Isabela, Gutemberg, Décio, Ana, Ana Eloisa, Marcelle, Tessália, Marcela, Guilherme. Obrigado pelos bons momentos juntos!
- ao Rodrigo Redondo e Gisele Dantas pela ajuda e ensinamentos na realização de análises, interpretação de resultados e comentários no manuscrito;
- a Marilza, Camila, Claudia Hollatz e Sarah por me ensinar técnicas e protocolos dos experimentos e/ou programas de análises;
- aos professores: Eduardo Tarazona, Maria Bernadete Lovato, Romeu Cardoso, Cleusa Graça da Fonseca, Marta Svartman, Marisa, Andrea, Rogério Parentoni, Flávio, Paulina, Marcos Rodrigues, pelos ensinamentos, aulas, conselhos e pela amizade demonstrada;
- aos meus amados pais Elio e Isaura e minha irmã Grazielle, pela confiança e paciência, sem o apoio deles nada do que fiz seria possível;
- a minha namorada Patrízzia, pelo companheirismo e por ter me aguentado nessa fase final de estresse, correria e muito trabalho!
- a todos os meus colegas do curso de C. Biológicas (2003-02) pelos inesquecíveis momentos juntos, período no qual nasceram grandes amizades;
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ...2
AGRADECIMENTOS ...4
LISTA DE FIGURAS: ...7
LISTA DE TABELAS:...9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS: ...10
RESUMO...11
ABSTRACT...12
1.INTRODUÇÃO ...13
1.1 O GÊNERO THAMNOPHILUS (THAMNOPHILIDAE SWAINSON, 1824) ...13
1.2 ZONAS DE CONTATO...16 1.3 A GENÉTICA DA PAISAGEM ...17 1.4 MARCADORES MOLECULARES ...19 2.OBJETIVOS...20 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ...20 3.MATERIAL E MÉTODOS...20 3.1 AMOSTRAGEM POPULACIONAL...20 3.2 AMPLIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO...24 3.3. GENOTIPAGEM...25
3.4. ANÁLISE DOS DADOS...26
4.RESULTADOS...28 4.1 ND2...28 4.2 MICROSSATÉLITES...40 5.DISCUSSÃO ...44 6.CONCLUSÕES ...53 7. PERSPECTIVAS...54 8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS...55 9. ANEXOS...62
LISTA DE FIGURAS:
Figura 1. Subespécies de Thamnophilus caerulescens (machos acima e fêmeas abaixo). Ilustrações de Hilary Burn no Handbook of the Birds of the World (Zimmer e Isler, 2003)...15
Figura 2. Mapa com as localidades georreferenciadas amostradas no Brasil...24 Figura 3. Representação da rede haplotípica e seus principais agrupamentos. As cores representam a divisão por subespécies...29 Figura 4. Rede de haplótipos mostrando uma provável delimitação populacional tendo como base clusters (Figura 3) mais divergentes entre si e/ou a proximidade geográfica das amostras. As cores representam a divisão proposta...31
Figura 5. Divisão das localidades amostradas em quatro populações pelo modelo ENCFH. As Figuras à direita mostram a probabilidade dos indivíduos em cada um dos agrupamentos pertencerem a uma mesma população. A maior probabilidade inicia com a cor branca passando até o vermelho que indica a menor probabilidade. O gráfico representa o número de populações mais prováveis depois da simulação MCMC...31 Figura 6. Divisão das localidades amostradas em oito populações pelo modelo ECFH. As Figuras à direita e abaixo mostram a probabilidade dos indivíduos em cada um dos agrupamentos pertencerem a uma mesma população. O gráfico representa o número de populações mais prováveis depois da simulação MCMC. Setas indicam localidades com uma frequência de haplótipos igualmente provável para ambos os agrupamentos adjacentes...32
Figura 7. Rede de haplótipos representando a relação entre os haplótipos das oito populações propostas pelo modelo espacial correlacionado à frequência haplotípica com o programa Geneland...33 Figura 8. Divisão das localidades amostradas em duas populações pelo modelo NENCFH. O gráfico representa o número de populações mais prováveis depois da simulação MCMC. A figura à direita mostra a probabilidade dos indivíduos em um agrupamento pertencerem a uma mesma população. A maior probabilidade inicia com a cor branca passando até o cinza escuro que indica a menor probabilidade...34
Figura 9. Rede de haplótipos destacando os haplótipos altamente divergentes ocorrendo em uma mesma localidade geográfica...37
Figura 10. Zonas de contato identificadas entre linhagens genéticas divergentes. A) Sul de Minas, B) Triângulo Mineiro. Números correspondentes aos municípios da Tabela 2...37
Figura 11. Árvore de Máxima Parcimônia (MP) gerada no programa PAUP mostrando a relação entre os haplótipos...39 Figura 12. Estrutura genética inferida pelo programa Structure a partir de 5 marcadores microssatélites em três agrupamentos propostos. A) subespécies. B) 4 populações a partir da network com haplótipos mitocondriais. C) Oito populações propostas pelo modelo espacial correlacionado à frequência dos haplótipos do software Geneland...42
Figura 13. Divisão das localidades amostradas em oito populações pelo modelo espacial correlacionado à frequência haplotípica, Foi simulado uma maior incerteza nas coordenadas geográficas de cada indivíduo amostrado. As Figuras à direita mostram a probabilidade dos indivíduos em alguns dos agrupamentos pertencerem a uma mesma população. Setas indicam localidades com uma frequência de haplótipos igualmente provável para ambos os agrupamentos adjacentes ou indivíduos migrantes de outra população...45 Figura 14. Rotas de dispersão de T. caerulescens no Brasil traçadas pelas linhagens mitocôndrias nos últimos 500 mil anos...48
Figura 15. Variação no tamanho do chapéu negro no píleo de T. caerulescens...52 Anexo F1. Frequência de homozigotos e diferença no tamanho dos alelos para cada locus analisado pelo Microchecker...68
LISTA DE TABELAS:
Tabela 1. Instituições onde estão tombados os espécimes e amostras utilizados nesse
estudo...21
Tabela 2. Localidades amostradas no Brasil e número referente à localização geográfica no mapa da Figura 2...22
Tabela 3. Sequencia dos iniciadores usados na PCR e no sequenciamento do gene ND2...25
Tabela 4. Índices de diversidade e estatística-F. N: número de indivíduos; H: Número de haplótipos; h: diversidade haplotípica; k: número médio de diferenças nucleotídicas; π: diversidade nucleotídica; S: número de sítios polimórficos...35
Tabela 5. Teste de neutralidade seletiva: D de tajima e Fs de Fu. ts: número de transições; tv: número de transversões; subst: número de substituições. Em destaque os valores estatisticamente significativos...36
Tabela 6. Disposição dos haplótipos por municípios. d: diversidade nucleotídica dentro dos municípios; h: diversidade haplotípica...38
Tabela 7. Testes de frequência de alelos nulos para as amostras como um todo em cada locus...39
Tabela 8. Características dos loci microssatélites. Ta: temperatura ótima de anelamento; n: número de indivíduos genotipados...41
Tabela 9. Estatísticas do Equilíbrio de Hardy-Weinberg mensuradas para cada locus. Ho: Heterozigozidade observada; He: Heterozigozidade esperada; p: Valor p do teste de EHW...43
Anexo T1. Amostras de tecido córneo do tarso de espécimes de coleções ornitológicas...62
Anexo T2. Amostras de sangue...64
Anexo T3. Amostras de tecido coletas para esse estudo...65
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS:
AICc: corrected Akaike Information Criterion AMOVA: Analysis of molecular variance DBG: Departamento de Biologia Geral
CGEN: Conselho de Gestão do Patrimônio Genético COMB: Coleção Ornitológica Marcelo Bagno (UnB) BD-LBEM: Banco de DNA do LBEM
DZUFMG: Coleção Ornitológica da Universidade Federal de Minas Gerais EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético
ECFH: modelo espacial correlacionado à frequência dos haplótipos ENCFH: modelo espacial não correlacionado à frequência dos haplótipos EPDA - Peti: Estação de Pesquisa e Desenvolvimento Ambiental de Peti EPDAG: Estação de Pesquisa e Desenvolvimento Ambiental Galheiro, MG FAL: Fazenda Água Limpa
FMNH: Field Museum Natural History
IBAMA: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis ICB: Instituto de Ciências Biológicas da UFMG
K2p: Kimura 2-parâmetros
LBEM: Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular MCMC: Cadeia de Markov Monte Carlo
MJ: algoritmo median-joining MMA: Ministério do Meio Ambiente ML: máxima verossimilhança MP: máxima parcimônia mtDNA: DNA mitocondrial
MZUFV: Museu de Zoologia João Moojen (UFV)
NENCFH: modelo não espacial não correlacionado à frequência dos haplótipos ND2: NADH desidrogenase, subunidade 2
ND6: NADH desidrogenase, subunidade 6 pb: pares de bases nucleotídicas
PCA: análise de componentes principais PE: PARQUE ESTADUAL
PCR: reação em cadeia da polimerase TrN+I+G: modelo Tamura-Nei plus Gamma UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais UnB: Universidade de Brasília, DF.
UFV: Universidade Federal de Viçosa, MG. USP: Universidade de São Paulo
Estados brasileiros: DF: Distrito Federal; ES: Espírito Santo; GO: Goiás; MG: Minas Gerais; PR: Paraná; RS: Rio Grande do Sul; SP: São Paulo.
RESUMO
A espécie Thamnophilus caerulescens apresenta uma extensa distribuição geográfica que margeia as mais distintas fisionomias, desde as encostas de florestas dos Andes orientais, passando por fragmentos de floresta tropical e matas de galeria em transição com o Chaco, Cerrado e Caatinga. Ao longo de sua extensa distribuição apresenta uma complexa variação de plumagem e algumas de suas oito subespécies descritas parecem indistinguíveis ou têm diferenças na plumagem que parecem ser clinais. Vários estudos relatam zonas de intergradação entre elas e tipos intermediários. Esse estudo tem a intenção de avaliar em detalhes possíveis zonas de contato na espécie e padrões filogeográficos investigando áreas próximas aos limites de distribuição de três das suas subespécies. Nenhuma das três subespécies de T. caerulescens estudadas apresentou linhagens mitocondriais monofiléticas. A rede de haplótipos apresentou três agrupamentos principais bem divergentes entre si. Através de análises de genética de paisagem foram identificadas oito populações estruturadas geograficamente. Registramos também a ocorrência de haplótipos altamente divergentes ocorrendo em simpatria em algumas localidades amostradas no sul de MG, no Triângulo Mineiro, em Planaltina no DF e no norte do PR, resultantes do encontro de linhagens divergentes após eventos de expansão populacional recentes. Essas devem ser áreas de hibridização e introgressão de linhagens que divergiram há muito tempo em alopatria, que agora se encontram nas zonas simpátricas de contato secundário. Encontramos baixos valores não significativos de RST nas análises com microssatélites. As análises com o programa
Structure revelaram alguns padrões de estruturação genética nos agrupamentos traçados, mostrando uma diferenciação para T. c. ochraceiventer, e para populações ao norte de GO e no leste de MG e ES. A bifurcação mais basal das árvores de máxima parcimônia e verossimilhança indica que as primeiras populações de T. caerulescens têm origem na região que compreende o estado de GO e DF e extremo oeste de MG e, as linhagens que colonizaram o sul e sudeste do Brasil são oriundas dessa região. Encontramos um padrão de variação clinal no tamanho do chapéu negro no píleo, concordante com o padrão de variação mitocondrial dos haplótipos no sentido sul-norte, do Triângulo Mineiro até o norte de GO. Constatamos a ocorrência comum de zonas de intergradação e contato de subespécies, onde indivíduos “intermediários” são relatados para a espécie T. caerulescens, o que significa que um grande estudo filogeográfico ao longo de toda a sua distribuição deve ser feito para elucidar a sua história evolutiva.
ABSTRACT
The species Thamnophilus caerulescens has an extensive geographic distribution, which borders the most distinguished faces from the slopes of forests of the eastern Andes, passing fragments of tropical forest and gallery forests in transition to the Chaco, Cerrado and Caatinga. Throughout its extensive distribution has a complex variation of plumage and some of its eight subspecies described seem indistinguishable or have differences in plumage that appear to be clinal. Several studies have reported areas contact between them and intermediate forms. This study intends to evaluate in detail potential areas of contact in species and phylogeographic patterns investigating areas near the limits of distribution of three subspecies. None of the three subspecies of T. caerulescens studied had monophyletic mitochondrial lineages. The network of haplotypes showed three main groupings and divergent. Through genetic analysis of landscape were identified eight geographically structured populations. We also note the occurrence of highly divergent haplotypes occurring in sympatry in some sampling sites in southern Minas Gerais state, in Triângulo Mineiro, in Planaltina, state of the DF and north of PR state as a result of the meeting of different strains after events of recent population expansion. These should be areas of hybridization and introgression of lineages that diverged long ago in allopatry, but are now in areas sympatric secondary contact. We found no significant low values of FST in the analysis with
microsatellites. The analysis with the program Structure revealed some patterns of genetic structure in the clusters plotted, showing a differentiation of T. c. ochraceiventer, and populations north of GO and east of MG and ES. The most basal bifurcation trees of maximum parsimony and likelihood indicates that the first populations of T. caerulescens have originated in the region that comprises the state of GO and DF and the western end of MG and the strains that colonized the southern and southeastern Brazil are from this region. We found a pattern of clinal variation in size of the black hat in the pileus, consistent with the pattern of variation of mitochondrial haplotypes from south to north, the Triângulo Mineiro to the north of GO. We note the common occurrence of zones of contact for subspecies, where individuals "intermediaries" are reported for T. caerulescens, which means that a large phylogeographic studies throughout their distribution must be done to elucidate their evolutionary history.
