UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
TATYANE BANDEIRA BARROS
QUALIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN SUÍNO CONSERVADO A
BAIXAS TEMPERATURAS EM DILUENTES ALTERNATIVOS
FORTALEZA – CE
2010
TATYANE BANDEIRA BARROS
QUALIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN SUÍNO CONSERVADO A
BAIXAS TEMPERATURAS EM DILUENTES ALTERNATIVOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Toniolli
FORTALEZA 2010
B277q Barros, Tatyane Bandeira
Qualidade espermática do sêmen suíno conservado a baixas temperaturas em diluentes alternativos / Tatyane Bandeira Barros. — Fortaleza, 2010.
66 p.
Orientador: Profº. Drº. Ricardo Toniolli.
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária .
1. Conservação espermática. 2. Água de coco em pó. 3. Gema de ovo. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
TAYANE BANDEIRA BARROS
QUALIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN SUÍNO CONSERVADO A
BAIXAS TEMPERATURAS EM DILUIDORES ALTERNATIVOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Aprovada em: ____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
______________________________ Prof. Dr. Ricardo Toniolli
FAVET / Universidade Estadual do Ceará Orientador
______________________________ Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo
______________________________ Dra. Maria Gorete Flores Salles Universidade Estadual do Ceará
Co-Orientador
Lar Antônio de Pádua Examinadora
______________________________ Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva
Universidade Estadual do Ceará Examinadora
À minha mãe por me permitir sonhar.
1
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me permitir realizar mais um sonho e não me deixar desistir dele. ÀUniversidade Estadual do Ceará pelo conteúdo técnico-científico adquirido ao longo do curso de pós graduação em Ciências Veterinárias.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro.
À minha família, por todo apoio, força e dedicação.
Ao professor Dr. Ricardo Toniolli, pela orientação no mestrado, por todas as conversas e lições de vida, e principalmente pela confiança depositada em mim e na minha forma de trabalhar desde o início, obrigada!
Ao sr. Carlos Braga, pela gentileza de abrir as portas da Granja Regina sempre com um café da manhã e me permitir realizar meu trabalho lá. À Elizete e Nonato pela ajuda e paciência nos dias de coleta.
Ao sr. Tabosa, por facilitar minhas e por me atender sempre com um sorriso no rosto. À técnica Rocilda pelo auxílio no projeto.
Ao Núcleo Integrado de Biotecnologia, dirigido pelo professor José Ferreira Nunes da UECE, por me permitir utilizar o Sistema de Análise Computadorizado e a Dra Cristiane Clemente de Mello Salgueiro da ACP Biotecnologia pelo fornecimento da ACP-103®.
Ao grupo maravilhoso formado no laboratório. Luciana Toniolli, Daianny Barbosa, Thalles Gotardo, Eduardo Nunes, e os recém chegados Inti Salles, vocês são pessoas maravilhosas e com muita competência, só me tiraram um pouco a paciência, mas vocês tornaram tudo mais divertido.
À minha turma de mestrado por todos os momentos de alegria compartilhados. Aos pra sempre amigos Lívia Mendes, Leonardo Peres e Darlete Matos, por todos os momentos mágicos que vivemos, por todas as conversas que tivemos e me fizeram uma pessoa melhor, pelos projetos realizados juntos, sonhos e angústias divididos. Vocês são meu apoio!
À todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
2
RESUMO
A estocagem de sêmen por um longo período permitindo o seu posterior uso representa uma importante ferramenta para criadores que desejam resguardar o potencial genético de seus reprodutores. Com o intuito de melhorar a conservação do sêmen do varrão durante o resfriamento, diversos componentes de meios diluidores têm sido testados, incluindo a gema de ovo, sendo a sua maior função a minimização de danos à célula espermática durante processos de resfriamento Assim esse trabalho objetivou testar diferentes concentrações de gema de ovo adicionada ao diluente água de coco em pó (ACP-103®) na mantido em três diferentes temperaturas (17, 10 e 5 °C) na conservação do sêmen suíno e verificar qual concentração e temperatura mantém a viabilidade espermática por um maior período de tempo. Para tanto, 36 ejaculados foram obtidos a partir da técnica da mão enluvada, levados ao laboratório, onde foram analisados quanto as características de vigor, motilidade total e morfologia. Após as análises foi realizada a diluição do sêmen à 30 °C, com a formação dos seguintes tratamentos: T0 (ACP + 0% de gema de ovo), T1 (ACP + 1% de gema de ovo), T2 (ACP + 3% de gema de ovo), T3 (ACP + 5% de gema de ovo) e T4 (ACP + 7% de gema de ovo). Cada tratamento foi mantido nas três temperaturas e analisado quanto às características de vigor, motilidade total, morfologia e integridade de membrana, por até cinco dias (D0, D1, D2, D3 e D4). Quando comparado os resultados de vigor e motilidade do sêmen diluído para cada temperatura, pode-se verificar que os tratamentos T2, T3 e T4 foram os que apresentaram melhores resultados, não diferindo estatisticamente entre si. As análises de vitalidade, morfologia e hiposmótico não apresentaram diferença significativa. Já quando o diluente ACP-103® acrescido de 7% de gema de ovo foi testado nas três temperaturas (17, 10 e 5 °C), a melhor curva de temperatura foi a de 10 °C com sêmen diluído, previamente mantido a 17 °C, por manter por um período maior a viabilidade da célula espermática em suínos. Assim pode-se concluir que o diluente ACP-103® acrescido de 7% de gema de ovo pode ser utilizado para a conservação do sêmen suíno, sendo uma alternativa de baixo custo e por principalmente poder ser utilizado em temperatura inferior a de conservação já padronizada para esta espécie.
3
ABSTRACT
The storage of semen for a longer period allowing for its subsequent use is an important tool for breeders who wish to preserve the genetic potential of its breedrs. Aiming to improve the conservation of boar semen during cooling, several components of extenders have been tested, including egg yolk, and its main role is to minimize the damage to sperm cells during cooling processes. So this work aimed testing different concentrations of egg yolk added to the coconut milk powder extender (ACP-103®) at three different temperatures (17, 10 and 5 °C) in the conservation of boar semen and to verify what concentration and temperature maintains the viability sperm for a longer period of time. For this purpose, 36 ejaculates were obtained from the gloved hand technique, brought to the laboratory where they were analyzed for the characteristics of vigor, total motility and morphology. The analysis was performed by diluting semen to 30 ° C, with the formation of the following treatments: T0 (ACP + 0% egg yolk), T1 (ACP + 1% egg yolk), T2 (ACP + 3 % egg yolk), T3 (ACP + 5% egg yolk) and T4 (ACP + 7% egg yolk). Each treatment was maintained at three temperatures and analyzed the characteristics of vigor, total motility, morphology and membrane integrity for up to five days (D0, D1, D2, D3 and D4). When comparing the results of vigor and motility of diluted semen for each temperature, one can verify that the treatments T2, T3 and T4 showed the best results were not statistically different from each other. Analyses of vitality, morphology, and hypoosmotic showed no significant difference. But when the ACP-103® extender added of 7% egg yolk was tested at three temperatures (17, 10 and 5 °C), the best temperature curve was 10 °C with diluted semen, previously kept at 17 °C, keeping for a longer period, the viability of sperm cells in boars. Thus we can conclude that the ACP-103® extender added of 7% of egg yolk can be used for boar semen preservation, become a low cost alternative and can be used at a temperature below conservation already standardized for this species.
4
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 2
Figura 1 Células espermáticas de suíno, corados em Azul de Bromofenol,
visualizados em microscópio óptico com aumento de 100x. (M espermatozóide morto e V espermatozóide vivo... 39
5
LISTA DE TABELAS
Capítulo 2
Tabela 1 Vigor espermático do sêmen suíno após diluição em ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo e conservado a 17°C durante cinco dias.
38
Tabela 2 Porcentagem de células móveis do sêmen suíno após diluição em ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo e conservado a 17°C durante cinco dias.
39
Tabela 3 Análise da porcentagem de espermatozóides vivos (vitalidade) do sêmen suíno conservado a 17 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
40
Tabela 4 Análise de porcentagem de células morfologicamente normais do sêmen suíno conservado a 17 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo
40
Tabela 5 Análise de resistência osmótica do sêmen suíno conservado a 17 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
40
Capítulo 3
Tabela 1 Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado em três diferentes temperaturas (17, 10 e 5 °C) no diluente ACP-103® adicionado de 7% de gema de ovo.
48
Tabela 2 Análise de motilidade espermática do sêmen suíno conservado em três diferentes temperaturas (17, 10 e 5 °C) no diluente ACP-103® adicionado de 7% de gema de ovo.
49
Tabela 3 Análise de vitalidade espermática do sêmen suíno conservado em três diferentes temperaturas (17, 10 e 5 °C) no diluente ACP-103® adicionado de 7% de gema de ovo.
49
Tabela 4 Análise de porcentagem de células normais do sêmen suíno conservado em três diferentes temperaturas (17, 10 e 5 °C) no diluente ACP-103® adicionado de 7% de gema de ovo.
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Tabela 5 Análise de resistência osmótica do sêmen suíno conservado em três diferentes temperaturas (17, 10 e 5 °C) no diluente ACP-103® adicionado de 7% de gema de ovo.
50
Capítulo 4
Tabela 1 Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado a 10 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
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Tabela 2 Análise da porcentagem de espermatozóides móveis no sêmen suíno conservado a 10 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
58
Tabela 3 Análise de vitalidade do sêmen suíno conservado a 10 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
58 Tabela 4 Análise de porcentagem de células normais do sêmen suíno conservado a
10 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
6 Tabela 5 Análise de resistência osmótica do sêmen suíno conservado a 10 °C no
diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
60
Capítulo 5
Tabela 1 Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado a 5 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
66
Tabela 2 Análise de motilidade do sêmen suíno conservado a 5 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
66 Tabela 3 Análise de vitalidade do sêmen suíno conservado a 5 °C no diluente
ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
67 Tabela 4 Análise de porcentagem de células normais do sêmen suíno conservado a
5 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
68
Tabela 5 Análise de resistência osmótica do sêmen suíno conservado a 5 °C no diluente ACP-103® adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACE Água de coco estabilizada ACG Água de coco em gel ACL Água de coco liofilizada ACN Água de coco in natura
ACP - 103® Água de coco em pó para suínos ACP - 106 Água de coco em pó para cães
BTS Betesville
CFMV Conselho Federal de Medicina Veterinária
mL Mililitros
IAA Ácido 3- indol acético FAVET Faculdade de veterinária
8
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 9
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 11
2.1. CARACTERÍSTICAS DO EJACULADO SUÍNO 11
2.2. AVALIAÇÃO SEMINAL 11 2.3. PROBLEMAS ESPERMÁTICOS 13 2.4. CONSERVAÇÃO DO SÊMEN 13 2.5. DILUENTES 15 2.6. ÁGUA DE COCO 15 3 JUSTIFICATIVA 18 4 HIPOTESE CIENTÍFICA 20 5 OBJETIVOS 21 5.1. Objetivo Geral 21 5.2. Objetivos Específicos 21
6 CAPITULO 1 - Uso potencial da água de coco em processos biológicos. 22 7 CAPITULO 2 - Diferentes concentrações de gema de ovo adicionada ao
diluente ACP-103® na conservação do sêmen suíno.
33
8 CAPITULO 3 - Diferentes curvas de resfriamento do sêmen do varrão
diluído em ACP-103® adicionado de gema de ovo em concentração fixa.
43
9 CAPITULO 4 - Qualidade espermática do ejaculado suíno conservado a 10 o
C no diluente ACP-103® adicionado de gema de ovo.
52
10 CAPITULO 5 - Qualidade espermática do ejaculado suíno conservado a
5oC no diluente ACP-103® adicionado de gema de ovo.
61
11 CONCLUSÕES 70
12 PERSPECTIVAS 71
9
1 INTRODUÇÃO
Os primeiros suínos chegados ao Brasil vieram com Martim Afonso de Souza em 1532, entretanto, somente a partir do início deste século começaram a aparecer os efeitos melhoradores de animais zootecnicamente mais avançados, com a importação de diferentes exemplares (CAVALCANTI, 1998). O suíno como fonte protéica, responde por cerca de 50% do consumo global de carnes (CFMV, 2007). No Brasil esse mercado representa um importante setor entre as atividades pecuárias, situando-se entre um dos maiores criadores do mundo, ficando atrás apenas da China, Rússia e Estados Unidos (CAVALCANTI, 1998).
O processamento do sêmen, utilizando diluentes adequados, é um dos pontos importantes para o sucesso de um programa de inseminação (CORRÊA et al., 2001). Eles são meios formados por uma ampla variedade de substâncias quimicamente diferentes. Sua utilização no preparo das doses inseminantes tem como finalidade aumentar o volume do sêmen, estabilizar seu pH, inibir o crescimento bacteriano e manter a célula espermática viável até o momento de ser introduzida no genital da fêmea. Atualmente no mercado existem duas categorias de diluentes: os de longa duração, que prolongam a vida do espermatozóide por cinco ou mais dias; e os de curta duração, que preservam a viabilidade espermática por até três dias (BORTOLOZZO et al., 2005).
A escolha do diluente deve considerar as condições específicas em que a inseminação artificial ocorre, particularmente o tempo que decorre entre o processamento e a utilização das doses, ou seja, se o sêmen se destina ao uso imediato ou armazenamento durante alguns dias (BORTOLOZZO et al., 2005).
Vários estudos têm sido realizados com a finalidade de se conhecer a capacidade de conservação da célula espermática na água de coco para o sêmen de diversas espécies. Segundo LAGUNA (1996) ela é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais, açúcares, vitaminas, fatores de crescimento (fitohormônios) e muito pouco fosfolipídios. Pode ser utilizada em diferentes formas, ou seja, in natura, estabilizada, gel e liofilizada, onde após a correção da osmolaridade e do pH, pode se apresentar como um diluente eficiente para o sêmen de diferentes espécies, com uma relação custo/benefício favorável aos programas de inseminação artificial, quando comparada aos diluentes importados (NUNES & COMBARNOUS, 1995, SALGUEIRO, et al., 2002, BARBOSA et
al.,2007).
Na busca por novos componentes para os meios diluentes, que possibilitem uma maior estabilização da membrana espermática, diferentes trabalhos têm testado o potencial
10 da gema de ovo (WATSON, 1990; FERNÁNDES-SANTOS et al., 2006; BARBOSA et al., 2007). Suas propriedades crioprotetoras para o sêmen foram descobertas em 1939 (PHILIPS, 1939) mas ainda sem resultados consistentes no processo de conservação/congelação do sêmen para o suíno, além disso, não se sabe como a gema de ovo age quando esta é adicionada ao diluente água de coco. Desta forma, o estabelecimento de novos protocolos de refrigeração e congelação para o sêmen suíno utilizando o meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-103®), bem como da concentração ideal de gema de ovo a ser acrescida ao mesmo, são de fundamental importância.
11
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Características do ejaculado suíno
Dentre as diversas espécies domésticas, o suíno é o que produz maior volume de sêmen por ejaculado, com valores médios em animais adultos que oscilam entre 150 a 500 ml. Esta característica pode ser influenciada pela idade do animal, estação do ano, intervalo entre coletas, estado nutricional e raça (CAVALCANTI, 1998).
O ejaculado do suíno é constituído de três porções: a primeira é a chamada fase pobre de espermatozóides, a fase intermediária é a mais rica em células espermáticas e a última porção forma o tampão vaginal e é constituída de material gelatinoso, que para a inseminação se separa do restante da amostra por filtrado, com gaze ou algodão (CAVALCANTI, 1998).
Através da análise visual do ejaculado é possível estimar subjetivamente a concentração de células espermáticas. Sua coloração pode variar entre aquoso, seroso, sero-leitoso, leitoso e leitoso denso. Quanto mais leitoso e denso for um ejaculado, maior será a sua concentração (CORRÊA et al., 2001).
Os varrões utilizados como doadores de sêmen para inseminação artificial devem cumprir as exigências mínimas de volume superior a 100 ml, motilidade espermática total mínima de 70%, morfologia espermática com menos de 20% de formas anormais e número total de espermatozóides do ejaculado superior a 10 bilhões (FERREIRA, 1995).
2.2 Avaliação Seminal
O processamento de sêmen é um dos pontos que requer maior cuidado para a obtenção de bons resultados em um programa de inseminação artificial, tendo por finalidade principal produzir doses inseminantes de alta qualidade (CORRÊA et al.,2001), desta forma, o controle e a avaliação seminal tem grande importância.
As características do ejaculado (sêmen in natura) constituem o passo inicial no controle de qualidade da matéria prima, garantindo o nível das características espermáticas que irão definir a adequação do ejaculado visando a produção de doses inseminantes com sêmen de alta qualidade (SILVEIRA & SCHEID, 2003).
A avaliação do ejaculado é dividida nas etapas macroscópicas (análise de volume, aspecto, cor e odor) e microscópicas (concentração, vigor, motilidade e morfologia). A análise do ejaculado também pode ser dividida em exame quantitativo e qualitativo. O exame quantitativo é realizado com o objetivo de determinar o número de doses inseminantes a serem produzidas. Já a segunda etapa é realizada com objetivo de predizer a
12 capacidade fecundante de uma amostra de sêmen ou o potencial reprodutivo de um animal, não informando de maneira definitiva se um determinado macho é fértil ou não. (BORTOLOZZO et al., 2005).
A análise da concentração é definida como sendo o número de células espermáticas presentes em um ejaculado, por sua unidade de volume. Esta medida pode ser determinada de três maneiras: espectofotômetro, espermiodensímetro e câmara de Neubauer. O espectofotômetro é um aparelho que mede a concentração através da densidade ótica, permitindo uma análise prática, rápida e precisa. O espermiodensímetro determina a concentração através da observação do grau de turvação de uma suspensão de espermatozóides. Esta avaliação pode ser laboriosa quando há necessidade de fazer uma pré-diluição em caso de sêmen muito denso. Já a câmara de Newbauer é o método de contagem mais demorado, não sendo indicado para ejaculados com grande volume (CORRÊA et al., 2001).
Vigor e motilidade são análises subjetivas. O primeiro, representa a força do movimento do espermatozóide, podendo ser classificado com uma nota de 0 a 5, onde 0 representa a ausência de movimento progressivo com deslocamento de cauda lateral fraco e inexpressivo, e 5 representa um movimento vigoroso e veloz dos espermatozóides. Apesar desta análise subjetiva, seguindo-se as características pré-determinadas pela tabela de análise de vigor espermático (TONIOLLI, 1996), os resultados obtidos para esta característica, por pessoas bem treinadas, são bastante homogêneos. Já a motilidade consiste em estimar o percentual de células vivas com movimentos progressivos (BORTOLOZZO et
al., 2005).
A análise morfológica permite a determinação da freqüência de cada uma das anormalidades espermáticas e do percentual total de alterações na amostra de sêmen. Um alto percentual de defeitos pode representar alterações durante a espermatogênese ou no trânsito e maturação no epidídimo, ou mesmo, manipulação inadequada do ejaculado (UFRS, 2007).
A avaliação do sêmen deve ser conduzida de forma disciplinada, respeitando alguns conceitos básicos de higiene e controle de temperatura. Os métodos empregados para avaliação, na medida do possível, devem ser eficientes, econômicos e práticos, de modo a se preservar a qualidade inicial do ejaculado. Apesar de não ser possível predizer com absoluta exatidão a fertilidade de um ejaculado, os resultados obtidos através dessas análises permitem selecionar um ejaculado quanto a sua provável capacidade fertilizante (CORRÊA et al., 2001).
13
2.3 Problemas espermáticos
A qualidade espermática dos ejaculados (concentração, motilidade, vigor e anomalias morfológicas) é um dos principais itens considerados para a seleção de reprodutores dentro de uma criação, podendo ser influenciada por vários fatores: idade, luminosidade, temperatura, nutrição, e diluente utilizado (BONET et al., 1993)
Além disso, condições inadequadas durante o transporte e o armazenamento afetam negativamente a qualidade do sêmen, e podem ter impacto significativo nos resultados reprodutivos das matrizes inseminadas (SCHEID, 2003).
Os principais problemas encontrados no sêmen do cachaço são:
a) Degradação espermática devido à contaminação do sêmen, que pode levar a uma possível infecção das porcas. A fração inicial do ejaculado e a coleta são grandes fontes de contaminação. A primeira por carrear um grande número de bactérias que estão presentes na porção final da uretra e a segunda pode ocorrer por falhas de higienização do local onde o procedimento é realizado, do animal e do próprio coletador (SILVEIRA & SCHEID, 2003).
b) Motilidade espermática. Entre as causas de anomalia na motilidade estão a temperatura muito baixa ou muito elevada quando do exame microscópico, e a falta de oxigenação dos espermatozóides na gota de sêmen entre a lâmina e a lamínula (SILVEIRA & SCHEID, 2003).
c) A aglutinação representa o aglomerado de células espermáticas no ejaculado. Ela pode ser ocasionada por falhas no processo de coleta, choque térmico, alterações de pH, alterações do equilíbrio osmótico e contaminação por bactérias (CORRÊA et al., 2001).
d) Formas anormais de espermatozóides. Estas alterações podem ter origem na fase de gênese dos espermatozóides no testículo, durante seu trânsito, maturação e armazenamento no epidídimo ou resultar da ação de fatores deletérios à célula após a ejaculação, relacionados com a manipulação do ejaculado (SILVEIRA & SCHEID, 2003).
2.4 Conservação do sêmen
A estocagem de sêmen por um longo período permitindo o seu posterior uso representa uma importante ferramenta para criadores que desejam resguardar o potencial genético de seus reprodutores (CARDOSO et al., 2002). Além disso, a conservação do
14 sêmen permite o transporte de material genético e a preservação de genes de alto valor comercial mesmo após a morte do animal.
Para conservar os espermatozóides durante períodos prolongados é necessário manter a integridade celular, reduzir a atividade metabólica e manter sob controle o desenvolvimento de microorganismos, para tanto é realizada a diluição em meio adequado além do abaixamento da temperatura (SÁNCHEZ, 2003).
Há duas formas de conservação seminal já amplamente utilizadas: o resfriamento e a congelação. A redução da temperatura tem sido um método utilizado para prolongar a viabilidade dos espermatozóides ejaculados, devido a seu efeito de desaceleração dos processos metabólicos celulares (ALMOND et al., 1994). Isso ocorre em virtude da característica da membrana dos espermatozóides, que quanto menor for a temperatura do meio, menor será a mobilidade de seus lipídios na dupla membrana, os quais se solidificam, impedindo seu movimento e também o movimento das proteínas, mantendo desta forma a estrutura da membrana celular (SÁNCHEZ, 2003).
Apesar dos benefícios do processo de conservação citados acima, este pode provocar danos irreversíveis à célula espermática em virtude do choque térmico, que podem levar a uma redução da sua motilidade, resultando em inchaço na membrana acrossomal, aumento da permeabilidade da membrana plasmática (FERNÁNDEZ-SANTOS et al., 2006), rompimento da integridade de suas membranas, interferindo assim na sua sobrevivência e capacidade fecundante (MAXWELL & WATSON, 1996).
O sêmen suíno, dentre outras espécies de mamíferos é o mais sensível a flutuações de temperatura (CORRÊA et al., 2001). A temperatura ideal para a manutenção das doses inseminantes situa-se entre 15 e 18 °C. Queda de temperatura abaixo de 15 °C é causa de choque térmico, que resulta em perda irreversível da motilidade espermática e lesões na estrutura das células. Temperatura acima dos 18 °C, por outro lado, são negativas por não reduzirem de forma eficiente o metabolismo dos espermatozóides e facilitam a multiplicação de bactérias, que agem negativamente sobre a qualidade do sêmen (SCHEID, 2003).
A adição de crioprotetores, como a gema de ovo, tem como finalidade proteger as células espermáticas dos choques térmicos e osmóticos que podem ocorrer durante o processo de resfriamento e congelação (ALBERTI, 2006). Mas pouco se sabe sobre o efeito deste crioprotetor, em específico, na conservação da célula espermática em temperaturas acima de 0 °C, principalmente para a espécie suína, fazendo-se necessário pesquisas que demonstrem sua ação.
15
2.5 Diluentes
A inseminação artificial na espécie suína obteve êxito em virtude da inovação na técnica e melhoria dos materiais utilizados, entre esses, desempenhou papel fundamental o desenvolvimento de diluentes para a conservação do sêmen por refrigeração (SÁNCHEZ, 2003).
O diluente utilizado na inseminação é uma composição bioquímica para dar equilíbrio fisiológico, bioquímico e biofísico aos espermatozóides e ao ambiente que o rodeia, assim ele é composto por uma ampla variedade de substâncias quimicamente diferentes entre si como glicose, antibiótico, sais, dentre outras, que tem como finalidade aumentar o volume do sêmen, proteger o espermatozóide contra choque térmico, fornecer substratos necessários ao metabolismo espermático, manter o pH e inibir o crescimento bacteriano, mantendo assim a viabilidade dos espermatozóides até o momento de serem introduzidos no trato reprodutivo da fêmea (CORRÊA et al., 2001).
De acordo com VISHWANATH & SHANNON (2000), além de todas essas substâncias citadas acima, para um meio diluente ser eficiente é necessário a presença de lipoproteínas ou material de alto peso molecular, com a finalidade de prevenir o choque térmico, como por exemplo, a gema de ovo ou o leite.
Os diluentes podem ser classificados quanto ao seu tempo de armazenamento como de longa duração, que prolongam a vida dos espermatozóides por cinco dias ou mais e podem ser usados quando o sêmen é armazenado por períodos maiores ou transportado por longas distâncias, tendo como exemplos para a espécie suína os diluentes Androhep e Reading. Já os de curta duração preservam a viabilidade da célula espermática por até três dias, como os diluentes BTS e KIEV. Assim, a escolha do meio diluente deve considerar as condições em que a inseminação artificial irá ocorrer, o tempo que normalmente decorre entre o processamento das doses e a inseminação artificial, ou seja, se o sêmen se destina ao uso imediato ou armazenamento durante alguns dias (BORTOLOZZO et al.,2005).
Os atuais meios de conservação representam a soma de conhecimentos de diferentes grupos de pesquisa, que se aprofundaram nas necessidades das células espermáticas e nas suas condições de conservação por refrigeração (SÁNCHEZ, 2003). Apesar disso, ainda é desconhecido o diluente e a temperatura ideal capaz de oferecer maior longevidade aos espermatozóides suínos (VYT et al., 2004).
2.6 Água de coco
A água de coco é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais, açúcares, vitaminas, fatores de crescimento (fitohormônios) e muito pouco fosfolipídeo (LAGUNA, 1996). Em virtude da presença dessas características, a água de coco passou a
16 ser testada como meio diluente de sêmen para diversas espécies animais, como suínos (AIRES & TONIOLLI, 2005), caprinos (AZEVEDO et al., 1999), ovinos (BRAZ et al., 2003), caninos (SILVA et al., 2000) e felinos (SILVA et al., 2007).
Após correção da sua osmolaridade e pH, ela vem apresentando, através de experimentos in vitro e in vivo,resultados positivos na manutenção da viabilidade e poder fecundante dos espermatozóides, sendo possível sua utilização em processos biotecnológicos como a inseminação artificial, sem os custos elevados com diluentes importados (NUNES, 1998).
Em virtude dessa potencialidade a água de coco foi testada como diluente em diferentes formas: in natura (ACN) constituída por 50% de água de coco filtrada + 25% de água destilada + 25% de uma solução de citrato de sódio a 5% (SALLES, 1989); estabilizada (ACE) esterilizada, envazada, e passada por um processo de ultrafiltração através de uma membrana microporosa e mantida (SALLES, 1989)ob refrigeração; liofilizada (ACL), processo de desidratação, onde o produto é congelado e a água é retirada por sublimação; em gel (ACG) e em pó (ACP), obtida através da técnica de spray dry, método de produzir um pó seco a partir de um líquido através da rápida secagem, com um gás quente.
Para a espécie suína a água de coco como diluente de sêmen tem sido utilizada com freqüência na região Nordeste do Brasil e os resultados mostram efeitos benéficos, evidenciados in vitro sobre as características de motilidade espermática, e in vivo sobre os parâmetros de fertilidade (TONIOLLI et al., 1997 e 1998).
A água de coco sob as formas, in natura e estabilizada, foi utilizada como diluentes para o sêmen suíno e avaliadas quanto sua ação sobre a viabilidade espermática e comparadas ao diluente tradicional BTS. A ACN e ACE não apresentaram diferença estatística para a característica motilidade progressiva durante todo o período de conservação, contudo ela foi superior ao diluente BTS aos 30, 60, 90 e 120 minutos de incubação, podendo ser esta uma alternativa tecnológica para o seu emprego na conservação do sêmen da referida espécie (TONIOLLI et al., 1998).
Entretanto, o uso da água de coco in natura apresenta limitações como a inabilidade de estocar a água de coco por longos períodos, a utilização dos frutos que é limitada as regiões onde ele é encontrado (CARDOSO et al., 2005), além da dificuldade de encontrar frutos com características ideais, ou seja, com seis meses de maturação (BRAZ et al., 2003). Assim estudos foram conduzidos para desenvolver uma água de coco em pó (ACP-®) que permitisse sua estocagem e utilização por longos períodos (CARDOSO et al., 2005).
17 A ACP foi desenvolvida com o intuito de simplificar a utilização da água de coco como diluente (SALGUEIRO et al., 2002), apresentando após reidratação características bioquímicas muito similares aquelas da água de coco in natura. Além disso, a ACP pode ser facilmente armazenada e enviada para regiões onde o fruto não é encontrado (CARDOSO et
al., 2005).
As formas em pó e in natura foram comparadas no processo de congelação do sêmen canino (CARDOSO et al., 2005) e para a verificação das taxas de prenhez em ovelhas da raça Santa Inês (FIGUEIRÊDO et al., 2007). Em ambos os trabalhos a ACP e ACN apresentaram resultados satisfatórios favoráveis similares nos estágios analisados (Vigor e motilidade durante as fases de diluição, resfriamento, congelação-descongelação, no primeiro trabalho e taxa de prenhez no segundo trabalho).
Sua ação como diluente de sêmen foi avaliada para a espécie de capote Numida meleagris submetido a diferentes temperaturas (4 e 15 °C) e comparada a um diluente comercial já utilizado para esta espécie. Para todos os parâmetros avaliados, o diluente ACP a 4 °C apresentou melhor desempenho em todos os tempos de conservação. No entanto, na temperatura de 15 °C os resultados permaneceram acima dos valores mínimos recomendados para a inseminação artificial, resultado também observado para o diluente controle, o que indicou que a ACP pode ser utilizado para a conservação do sêmen de capotes (RONDON et al., 2008).
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3 JUSTIFICATIVA
Pela crescente utilização da inseminação artificial em suínos, cada vez mais se fazem necessários o aprimoramento e o desenvolvimento de tecnologias que visem incrementar a produtividade e a rentabilidade nas unidades de produção. Desta forma, biotécnicas reprodutivas podem ser utilizadas como ferramentas para a otimização desse processo (CORRÊA et al., 2001).
A expansão da inseminação artificial suína está alicerçada na utilização do sêmen resfriado, que possui tempo de armazenamento limitado. Este fator, aliado às dificuldades existentes no transporte e comunicação, muitas vezes tem limitado o seu uso. Além disso, os diluentes de longa duração, que permitem a viabilidade espermática por cinco dias, são de preparação complexa e de custo elevado, enquanto que os de curta duração só prolongam a vida dos espermatozóides por três dias (CORRÊA et al., 2001), o que justifica a busca por novos diluentes que preservem a viabilidade das células espermáticas por mais tempo e que sejam de fácil preparo e de baixo custo.
Diluentes como o TRIS e o BTS (CORRÊA et al., 2001), além do líquido prostático autólogo (UCHOA et al., 2003), já foram utilizados para a conservação de sêmen em diferentes espécies domésticas. No entanto, nem todos possuem os pré-requisitos para serem considerados como bom diluente (FOOTE, 1964), tais como, nutrientes para as células espermáticas, antibióticos, tampões para prevenir alterações de pH (CORRÊA et al., 2001).
Recentemente foram desenvolvidos trabalhos relacionados ao uso de diluente a base de água de coco. Os resultados apresentados, em ovinos (CRUZ, 1994), suínos (TONIOLLI
et al., 1998), caninos (UCHOA et al., 2003), primatas (ARAÚJO et al., 2007), inclusive
humanos (NUNES, 1998), demonstraram avanços positivos na utilização deste meio à base de água de coco na diluição e refrigeração do sêmen. Devido aos bons resultados com o sêmen de diferentes espécies, traduzida pelo estímulo da sobrevivência dos espermatozóides e da sua fertilidade, este diluente pode se tornar uma alternativa para a difusão dos programas de inseminação artificial nas espécies de interesse econômico com uma relação custo benefício positiva, quando comparado aos outros diluentes disponíveis no mercado (NUNES & COMBARNOUS, 1995).
Para permitir a sobrevivência in vitro prolongada da célula espermática é necessário reduzir sua atividade metabólica através da adição de elementos químicos (CORRÊA et al., 2001). A gema de ovo é um importante componente de meios de resfriamento e congelação
19 do sêmen de várias espécies. Suas propriedades protetoras dos espermatozóides foram descobertas em 1939 (PHILLIPS, 1939).
Concentrações de 10 e 20% de gema de ovo adicionada aos diluentes à base de água de coco são eficientes para a conservação da qualidade espermática do sêmen canino (SILVA et al., 2000), mas há ainda poucos trabalhos que relatem essa mesma eficiência para outras espécies de importância econômica, como os suínos. Em uma comparação entre três concentrações de gema de ovo adicionadas ao diluente ACP-106 observou-se que as avaliações da motilidade e vigor foram facilitadas à medida que se diminuiu a concentração da gema de ovo, em virtude dos grumos produzidos por este crioprotetor (BARBOSA et al., 2007).
A água de coco em pó é uma alternativa de fácil preparo de baixo custo e padronizada, oriunda de frutos tipicamente tropicais (CARDOSO et al., 2005). Aliado a isso há necessidade de desenvolvimento de técnicas e soluções que permitam a utilização do sêmen suíno resfriado com melhores resultados de fertilidade. Assim, fazem-se necessários estudos adicionais que demonstrem o efeito do diluente ACP-103® acrescido de diferentes concentrações de gema de ovo na manutenção da viabilidade espermática.
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4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
A conservação do sêmen suíno em meio à base de água de coco em pó (ACP-103®), acrescido de diferentes concentrações de gema de ovo em temperaturas abaixo de 17 °C mantém a viabilidade da célula espermática por um período de tempo maior.
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5 OBJETIVOS
Geral
- Avaliar in vitro o comportamento do sêmen suíno em temperaturas abaixo de 17 °C.
Específicos
- Verificar os efeitos da desidratação/reidratação da água de coco, sobre a qualidade espermática;
- Fornecer melhores condições de sobrevivência ao espermatozóide suíno quando conservado em temperaturas abaixo de 17 oC;
- Testar a adição de diferentes concentrações da gema de ovo adicionada ao diluente água de coco em pó (ACP-103®);
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CAPÍTULO 1
Uso potencial da água de coco em processos biológicos
(Potential use of coconut water in biological processes)
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6 CAPÍTULO 1
Uso potencial da água de coco em processos biológicos
(Potential use of coconut water in biological processes)
Tatyane Bandeira Barros¹, Ricardo Toniolli2
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias – FAVET/UECE
2
Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen – FAVET/UECE, Av. Paranjana, 1700
Campus Itaperi, Fortaleza-Ce, CEP: 60.740-000. e-mail: toniolli@roadnet.com.br
Resumo
O presente estudo objetiva apresentar o potencial da água de coco em diversos processos biológicos, enfatizando sua atuação como diluente seminal de várias espécies de animais. Diversos são os trabalhos que demonstram a eficácia da água de coco preservando a célula espermática. Sua utilização como diluente é uma importante alternativa para o transporte de sêmen a curta distância e extensão do volume seminal para a realização da inseminação artificial. Assim, conclui-se que a água de coco poderá tornar-se um diluente alternativo para a difusão dos programas de inseminação artificial em espécies animais de interesse econômico.
Palavras-chave: água de coco; diluente; sêmen.
Abstract
This study aims to present the potential of coconut water in various areas of science, emphasizing his role as a semen extender of various species of animals. There are several studies that demonstrate the efficacy of coconut water preserving the sperm cell. Its use as a extender is an important alternative for the transport of semen within walking distance and extension of seminal volume to perform artificial insemination. Thus, it is concluded that coconut water could become an alternative solvent for the diffusion of artificial insemination programs in animal species of economic interest.
Keywords: cocconut water; extender; semen.
INTRODUÇÃO
A água de coco é o líquido do endosperma encontrado dentro da cavidade do fruto, que começa a se formar em torno de dois meses após a abertura natural da inflorescência. De acordo com pesquisas ela corresponde a 25% do peso do fruto, e sua composição básica é de 95,5% de água, 4% de carboidratos, 0,1% de gordura, 0,02% de cálcio, 0,01% de fósforo, 0,5% de ferro, além de aminoácidos, vitamina C, vitaminas do complexo B e sais minerais (Aragão, 2000) e possui diversas propriedades funcionais como: solução de hidratação oral, suplemento protéico onde o déficit nutricional é alto, e em casos graves, pode ser utilizada como solução de hidratação intravenosa (Campbell-Falck et al., 2000).
Durante a segunda guerra mundial, a água de coco foi utilizada inclusive como soro fisiológico durante cirurgias de emergência (Aragão, 2000). Ela ainda se destaca por sua capacidade diurética, seu poder antioxidante e ainda tem apresentado ação protetora em relação ao aparecimento de tumores malignos (Lim-Sylianco et al., 1992).
Na área da biotecnologia ela apresenta características que a classifica como um bom diluente seminal, já tendo sido utilizada com sucesso em várias espécies como suínos (Aires
24 & Toniolli, 2005), humanos (Nunes, 1998), caprinos (Azevedo & Toniolli,1999; Nunes & Salgueiro, 1999), ovinos (Braz et al., 2003), bovino (Alberti, 2004), caninos(Cardoso et al., 2005), felinos (Silva et al., 2007) e primatas (Araújo et al., 2007).
O processamento do sêmen utilizando diluentes adequados é um dos pontos críticos para o sucesso de um programa de inseminação artificial (Corrêa et al., 2001). Sua utilização tem como objetivos evitar a acidificação do meio e o choque térmico da célula, ocasionados pela ação de resfriamento e congelação (Cavalcanti, 1998). Para tanto os diluentes são compostos por substâncias quimicamente diferentes entre si, que tem por objetivo aumentar o volume do sêmen, manter seu pH, inibir o crescimento bacteriano e manter a viabilidade da célula espermática até o momento da inseminação artificial (Bortolozzo et al., 2005).
Processos como refrigeração e congelação são essenciais para os programas de inseminação artificial, mas provocam sérios danos aos espermatozóides como a ruptura das membranas plasmáticas, principalmente do acrossoma (Pickett et al., 1987). Esses danos levam a uma diminuição da motilidade e do tempo de sobrevivência do espermatozóide no trato reprodutivo da fêmea, afetando seu potencial fecundante. Assim, o desenvolvimento de um diluente que mantenha a viabilidade da célula espermática por um período maior de tempo é uma alternativa importante para a tecnologia da conservação do sêmen de diversas espécies. Esse trabalho teve por objetivo realizar um breve relato sobre a água de coco, avaliar seu potencial em diferentes processos biológicos e sua atuação como diluente sobre a qualidade seminal em diferentes espécies domésticas.
REVISÃO
Coco: cultura, classificação e perecibilidade
Por seu potencial de dispersão, o coqueiro apresenta divergências quanto a sua origem, dentre as quais, a África e a América, são as mais prováveis. Sua introdução no Brasil ocorreu na Bahia em 1553 pelos portugueses (Gomes, 1992).
A cultura do coqueiro constitui-se uma importante fonte geradora de divisas e também uma farta fonte de proteínas e calorias para a população. No contexto mundial, a produção brasileira de coco, mesmo sendo pequena, pelo fato do Brasil não produzir óleos, sempre foi de fundamental importância na vida e economia das populações do Nordeste do país (Ferreira & Filho, 2002). É esta região que concentra as maiores plantações de coco, contribuindo com 96% da produção nacional. A produção brasileira está concentrada em uma área de 300 mil hectares, sendo os estados de Sergipe, Bahia e Alagoas os maiores produtores, respondendo por 75% do total do país (Laguna, 1996).
O coqueiro é constituído de uma só espécie (Cocos nucífera L.) e duas variedades principais: a gigante e a anã (Siqueira et al., 1991). O coco é classificado como uma drupa, sendo dividido, de fora para dentro, nas porções do epicarpo, região constituída por uma fina película, lisa e que envolve todo o exterior do fruto; do mesocarpo, camada mais grossa, caracterizada por ser fibrosa, de coloração castanha quando seca; do endocarpo, estrutura mais lenhosa e dura, de coloração escura; e do endosperma, também chamado de albúmen, porção branca, carnosa e comestível. Na camada oca do fruto é encontrado um líquido denominado de água de coco (Laguna, 1996).
A água de coco é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais, açúcares, vitaminas, fatores de crescimento (fitohormônios) e muito pouco fosfolipídeo. Os frutos imaturos contêm substâncias que induzem a diferenciação celular em estado de dormência (Laguna, 1996). A água de coco é extremamente perecível e esta característica está diretamente relacionada às condições as quais os frutos ficam expostos durante a
25 colheita, pós-colheita e comercialização. Temperaturas elevadas, danos mecânicos, manuseio e condições inadequadas de armazenamento aceleram o processo de deterioração da água diminuindo sua vida útil (Resende et al., 2008).
Diferentes utilizações da água de coco
Além da sua utilização na própria alimentação da população, a água de coco tem apresentado importância significativa com uma ampla utilização em diferentes áreas do conhecimento. Na área médica as propriedades desse líquido destacam-se por sua capacidade diurética e vem sendo testada no tratamento de cálculos renais (Magat & Agustin 1997), além do poder antioxidante, podendo estar associada à presença da vitamina C, mas também se estuda a interação com outros possíveis compostos ativos. Infelizmente, esta propriedade ocorre principalmente na água do coco in natura e se reduz representativamente com o tratamento visando o envase do líquido (Carvalho et al., 2006).
Na área biomédica, a água de coco há anos vem sendo utilizada pela cultura popular como bebida capaz de combater a desidratação. Estudos recentes comprovaram este conceito considerando a bebida um importante repositor de eletrólitos. Assim, tem-se levantado a possibilidade do seu uso para a reidratação, em casos de diarréia crônica, pois além da grande quantidade de potássio possui também glicose (Kuberski et al., 1979). Em virtude disso, ela tem sido recomendada para substituir a perda de fluido do trato gastrointestinal (Khan et al., 2003). Sua utilização como solução no tratamento da desidratação grave ou desnutrição protéica de crianças e idosos, ocorre em virtude da sua composição semelhante ao soro glicosado isotônico (Laguna, 1996).
A água de coco por apresentar uma grande quantidade de sais minerais como o sódio, potássio, cálcio, magnésio manganês, ferro, zinco e cobre e por conter vitaminas do complexo B e C, vem sendo utilizada em produtos cosméticos como hidratantes para o corpo e cabelos (Carvalho et al., 2006).
Em virtude da presença de açúcares na água de coco, ela foi testada na área biotecnológica como meio de cultivo in vitro para embriões de pinhão-manso. Sua presença proporcionou um melhor crescimento das plântulas (Nunes et al., 2008). Ainda nesta área, uma solução a base de água de coco foi comparada à solução salina quanto a sua eficiência na preservação de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano. Ambas soluções apresentaram igual eficiência na conservação dos folículos a 4° C. No entanto, para conservar folículos pré-antrais caprinos em altas temperaturas, somente a solução a base de água de coco é recomendada (Costa et al., 2002).
Em processos tecnológicos de inseminação artificial o desenvolvimento de um diluente que mantenha a viabilidade da célula espermática por um período maior de tempo é uma alternativa importante para a tecnologia da conservação do sêmen de diversas espécies. Em virtude das características da água de coco ditas acima, ela vem demonstrando um grande potencial na conservação da célula espermática em diversas espécies de animais domésticos.
O ácido-3 Indol Acético (IAA)
O princípio ativo dos fatores de crescimento presentes na água de coco é uma substância com propriedades semelhantes às auxinas e citocininas, que agem regulando o crescimento e provocando divisão celular nos vegetais, fungos e alguns protozoários (Nunes & Salgueiro, 1999). O isolamento da citocinina na água de coco foi realizado por Letham (1974). Após isso, observou-se a presença do ácido 3-indol-acético (IAA), uma auxina de origem vegetal inicialmente chamada de JYP (iniciais dos nomes dos pesquisadores) e atualmente chamada de IAA.
Essa auxina já foi vista ser responsável por estimular a motilidade e manter uma maior porcentagem de espermatozóides móveis de caprinos e ovinos (Nunes & Salgueiro, 1999) e quando adicionada a diluentes tradicionais, como o BTS para a espécie suína, o
26 IAA é responsável pelo aumento na proporção de espermatozóides vivos com acrossoma intacto (Toniolli et al., 1996). Pesquisas têm demonstrado que o IAA apresenta uma ação protetora sobre a célula espermática, proporcionando a viabilidade de um maior número de espermatozóides com morfologia normal. A melhoria dessa característica favorece seu deslocamento e a conseqüente penetração da zona pelúcida dos ovócitos (Toniolli et al., 1999).
Diferentes formas e seu uso como diluente de sêmen
Dentre os diversos diluentes alternativos de sêmen já testados, a água de coco, após correção da osmolaridade e do pH, vem demonstrando através de experimentos in vitro e in
vivo, resultados positivos na manutenção da viabilidade e poder fecundante dos
espermatozóides, sendo possível sua utilização em processos biotecnológicos como a inseminação artificial, sem os custos elevados com diluentes importados (Nunes, 1998).
Em virtude dessa potencialidade a água de coco foi testada como diluente em diferentes formas: A in natura (ACN) constituída por 50% de água de coco filtrada + 25% de água destilada + 25% de uma solução de citrato de sódio a 5%; A estabilizada (ACE), que é a ACN esterilizada, envazada, e passada por um processo de esterilização por ultrafiltração, através de membranas com microporos (Aragão, 2002) e mantida sob refrigeração; A liofilizada (ACL), onde o produto é congelado e a água é retirada por sublimação; A em gel (ACG); E a em pó (ACP), obtida através da técnica de spray dry, método de produzir um pó seco a partir de um líquido através da rápida secagem, com um gás quente. Neste estudo serão abordadas as formas in natura, estabilizada e em pó.
Água de coco in natura (ACN) e estabilizada (ACE)
A ACN foi testada como diluente alternativo e comparada ao leite desnatado na avaliação da porcentagem de espermatozóides móveis e motilidade progressiva do sêmen ovino em diferentes períodos de incubação. Embora ambos os diluentes tenham demonstrado resultados satisfatórios na conservação da célula espermática, a ACN se apresentou mais eficiente na manutenção dessas características avaliadas (Nunes, 1997). Trabalho semelhante foi realizado anteriormente para o sêmen caprino (Nunes e Combarnous, 1995), e mais uma vez os testes in vitro realizados demonstraram resultados favoráveis na conservação da motilidade progressiva e da porcentagem de espermatozóides móveis quando o sêmen estava diluído em ACN comparado ao leite.
A água de coco estabilizada (ACE), suplementada com antibióticos, foi comparada ao leite, diluente alternativo já amplamente utilizado para a espécie caprina, nas condições: desnatado adicionado de 100ng/ml de IAA e leite desnatado puro (controle). O diluente ACE e leite desnatado não apresentaram diferença estatística nos parâmetros de vigor e motilidade espermática no período de 48 horas, mas ambos foram inferiores ao diluente leite desnatado suplementado com IAA, no mesmo período, colocando assim em evidência o papel desta auxina na conservação da célula espermática por mais tempo (Azevedo & Toniolli, 1999).
A ACN também foi testada como meio de conservação para o sêmen canino, com a manutenção de taxas de motilidade e vigor espermático, em níveis favoráveis a sua utilização em inseminação artificial com o sêmen conservado por até 180 minutos (Uchoa et
al., 2002). Um estudo sobre o índice de prenhez na inseminação de cadelas com sêmen
diluído em ACN e leite desnatado foi realizado, obtendo taxas de prenhez de 90% quando em meio à base de água de coco, contra 50% quando em meio à base de leite em pó desnatado (Betini et al., 2001).
Com o objetivo de elaborar um método de expansão do ejaculado da espécie Cebus apella (macaco-prego), uma solução a base de água de coco foi testada e os resultados obtidos demonstram que a ACN também foi capaz de manter a viabilidade espermática nesta espécie por até 7 horas após a coleta (Araújo et al., 2007), sendo então seu uso
27 interessante para a inserção de protocolos de inseminação artificial para esta espécie animal, em virtude da sua ameaça de extinção (Barnabé et al., 2002).
As águas de coco, in natura e estabilizada, foram utilizadas como diluente para o sêmen suíno e avaliadas quanto sua ação sobre a viabilidade espermática, sendo comparadas ao diluente tradicional BTS (controle). A ACN e a ACE não apresentaram diferença estatística para a característica motilidade progressiva durante todo o período de incubação, contudo ela foi superior ao diluente BTS aos 30, 60, 90 e 120 minutos de incubação, podendo ser esta uma alternativa tecnológica para o seu emprego na conservação do sêmen da referida espécie (Toniolli et al., 1998).
Entretanto, o uso da água de coco in natura apresenta limitações como a inabilidade de estocar o fruto por longos períodos, sendo sua utilização limitada as regiões onde esse fruto é encontrado (Cardoso et al., 2005), além da dificuldade de encontrar frutos com características ideais, ou seja, com cerca de seis meses de maturação (Braz et al., 2003). Assim estudos foram conduzidos para desenvolver uma água de coco em pó (ACP)® (Cardoso et al., 2005).
Água de coco em pó (ACP)
A ACP foi desenvolvida com o intuito de simplificar a utilização da água de coco como diluente (Salgueiro et al., 2002) e após sua ressuspenção ela apresenta características bioquímicas muito similares aquelas da água de coco in natura. Além disso, a ACP pode ser facilmente armazenada e enviada para regiões onde o fruto não é encontrado (Cardoso et
al., 2005).
Sua ação como diluente de sêmen foi avaliada para a espécie de capote Numida
meleagris submetido a diferentes temperaturas (4 e 15 °C) e comparada a um diluente
comercial já utilizado para esta espécie. Para todos os parâmetros avaliados, o diluente à base de água de coco em pó a 4 ºC apresentou melhor desempenho em todos os tempos de conservação. No entanto a temperatura de 15 °C, os resultados permaneceram acima dos valores mínimos recomendados para a inseminação artificial, resultado também observado para o diluente controle, o que indica que a ACP pode ser utilizada para a conservação do sêmen de capotes (Rondon et al., 2008).
Seu efeito como diluente também foi testado para a espécie ovina (Braz et al., 2003). Os resultados de motilidade espermática após duas horas de conservação a temperaturas de 4 e 15 °C não demonstraram haver diferença significativa, 48,3 e 60%, respectivamente, mantendo índices satisfatórios para a sua utilização em processos de inseminação artificial.
Altas taxas de prenhez (88,46%) foram observadas quando ovelhas foram inseminadas com sêmen diluído em meio à base de ACP (Salgueiro et al., 2007), resfriado a 4 °C, o que demonstra avanços positivos na utilização do meio de conservação à base de ACP na diluição do sêmen ovino.
ACP como meio criopreservação
A tecnologia de criopreservação de sêmen foi desenvolvida com o intuito de possibilitar a constituição de uma barreira adicional contra a introdução de doenças infecciosas, além de representar uma alternativa para maximizar o melhoramento de características maternas, acelerando a obtenção de benefícios econômicos (Corrêa et
al.,2001).
A eficiência do ACP como diluente na criopreservação do sêmen de cães foi comprovada ao compará-lo com o diluente padrão TRIS por meio da avaliação clássica e do teste de termoresistência após descongelação. Ambos os diluentes mostraram-se eficazes para uso na criopreservação, não apresentando diferença estatística quanto à conservação da qualidade seminal após a descongelação (Silva et al., 2005).
28 Sua utilização como diluente de sêmen no processo de criopreservação também foi testada para o gato doméstico nas etapas de diluição, resfriamento e glicerolização, e em todas estas etapas testadas o ACP® mostrou-se eficiente na manutenção da boa qualidade espermática, com as médias de motilidade e vigor superiores a 70% e 3,5, respectivamente, sendo esses dados compatíveis com a utilização de processos como a inseminação artificial. (Silva et al., 2007).
O diluente ACP adicionado de gema de ovo
A criopreservação de sêmen está sendo cada vez mais utilizada, já que permite o transporte de material genético, tanto dentro do país como entre países. Tal processo requer a participação de crioprotetores. Estes devem ser adicionados ao meio diluente para que haja uma proteção do espermatozóide durante os processos de congelação/descongelação (Squires et al., 1999). Estas substâncias devem possuir como propriedades uma baixa toxicidade para as células e alta solubilidade em água. Elas são classificadas como intra-celular ou permeáveis, como o glicerol e extra-intra-celular ou impermeáveis como a gema de ovo (Maria, 2005).
O crioprotetor intracelular age retirando a água da célula e diminuindo a sua temperatura de congelação, interferindo também na formação de cristais de gelo, como exemplo pode-se citar o glicerol e o dimetilsufóxido. Os crioprotetores extracelulares funcionam de forma diferente, atuando sobre a superfície da célula, estabilizando sua membrana, minimizando e reparando os possíveis danos causados pelo processo de congelação, como por exemplo a gema de ovo e o leite (Carolsfeld & Harvey, 1999). Os crioprotetores internos combinados aos externos promovem uma proteção mais completa ao espermatozóide, atuando ao nível da membrana celular (Leung & Jamieson, 1991).
A gema de ovo é um importante componente de meios de resfriamento e congelação para a proteção do sêmen de várias espécies, tendo sido suas propriedades descobertas em 1939 (Phillips, 1939 In: Bathgate et al., 2006). Ela parece agir na superfície da membrana plasmática, aparentemente induzindo uma alteração não permanente na composição da membrana, prevenindo desta forma uma ruptura da mesma (Watson, 1990).
A ACP teve sua ação testada como diluente do sêmen canino, no processo de criopreservação adicionado de 20% de gema de ovo e 6% de glicerol e comparado à água de coco in natura com as mesmas concentrações de crioprotetores. Os diluentes mostraram resultados similares de motilidade e vigor durante os estágios analisados, o que demonstra que a ACP® pode ser utilizada com sucesso na criopreservação do sêmen canino (Cardoso
et al., 2005).
A qualidade do sêmen canino foi avaliada quando este foi congelado em um meio diluente a base de água de coco utilizando diferentes concentrações de gema de ovo (0, 5, 10 e 20%). Os tratamentos com 5% (18,1 ± 3,2), 10% (18,5 ± 2,9) e 20% (18,8 ± 2,5) de gema de ovo apresentaram um menor percentual de alterações de acrossoma que o tratamento com 0% (20,1 ± 2,8). Estes resultados demonstraram o efeito protetor da gema de ovo (Barbosa et al., 2007).
A eficiência da ACP foi avaliada na criopreservação do sêmen do gato doméstico quando este foi adicionado de 20% de gema de ovo e 6% de glicerol. Após descongelação foi obtido um resultado de 69,5% ± 21,4 de motilidade e 3,8 ± 0,7 de vigor, sendo estes dados compatíveis com a sua utilização em processos de inseminação artificial (Silva et al., 2007).
Apesar de seus resultados favoráveis a ACP não permitiu a completa diluição da gema de ovo, quando esta estava na concentração de 20% na solução, o que levou a uma alteração na viscosidade do diluente, dificultando a avaliação da motilidade (Cardoso et al., 2005).
29 Com esse trabalho foi possível observar o grande potencial da água de coco em diferentes áreas científicas e comprovar sua eficiência na conservação e criopreservação do sêmen em diferentes espécies, como diluente alternativo para programas de inseminação artificial.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A água de coco apresenta um grande potencial biológico, e sua utilização abrange diversas áreas, como a indústria cosmética, de alimentos, médica e biotecnológica. Nesta área a água de coco ou suas frações ativas vem apresentando resultados que demonstram sua eficiência como meio para a preservação de folículos pré-antrais, como diluente seminal tanto em processos de conservação, quanto os de criopreservação nas diversas espécies estudadas, o que a torna um diluente alternativo importante para a difusão de programas de inseminação artificial, já que ela apresenta uma relação custo-benefício favorável quando comparado aos demais diluentes disponíveis no mercado.
Referências Bibliográficas
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