Niterói 2/2017
ESCOLA DE ENGENHARIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA E DE PETRÓLEO
MARCUS VINICIUS OLIVEIRA GOMES
PRODUÇÃO DE QUERCETINA POR FERMENTAÇÃO EM MEIO
SÓLIDO
Niterói 2/2017
PRODUÇÃO DE QUERCETINA POR FERMENTAÇÃO EM MEIO
SÓLIDO
Projeto Final apresentado ao Curso de Graduação em Engenharia Química, oferecido pelo departamento de Engenharia Química e de Petróleo da Escola de Engenharia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Bacharel em Engenharia Química.
ORIENTADORAS
Profa. Dra. Sorele Batista Fiaux
Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca da Escola de Engenharia e Instituto de Computação da UFF
G633 Gomes, Marcus Vinicius Oliveira
Produção de quercetina por fermentação em meio sólido / Marcus Vinicius Oliveira Gomes. – Niterói, RJ : [s.n.], 2017.
57 f.
Projeto Final (Bacharelado em Engenharia Química) – Universidade Federal Fluminense, 2017.
Orientadores: Sorele Batista Fiaux, Gabrielle Alves Ribeiro da Silva.
1. Quercetina. 2. Fermentação. 3. Flavonóide. 4. Aspergillus
niger. 5. Fungo. I. Título.
CDD 547.632
PRODUÇÃO DE QUERCETINA POR FERMENTAÇÃO EM MEIO SÓLIDO
Projeto Final apresentado ao Curso de Graduação em Engenharia Química, oferecido pelo departamento de Engenharia Química e de Petróleo, da Escola de Engenharia, da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Bacharel em Engenharia Química.
Aprovado em 14 de dezembro de 2017.
BANCA EXAMINADORA
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Gabrielle Alves Ribeiro da Silva, M.Sc. OrientadoraNlteról
Agradecimentos
À minha família, principalmente à minha mãe, Cleonice da Cruz, e à minha irmã, Herica da Cruz, que estiveram presentes em todos os momentos dessa árdua jornada, me apoiando e guiando. Vocês foram essenciais para a realização desse sonho.
Às minhas orientadoras, Prof.ª Sorele Batista Fiaux e Gabrielle Alves Ribeiro da Silva, pelos conhecimentos compartilhados e pelo acolhimento no LTM.
Aos amigos da Feira Hippie de Ipanema, principalmente à Luciana e Teóphilo Ottoni, por toda a dedicação em estudar junto comigo durante o ensino fundamental.
Aos amigos Amanda Coutinho, Daniel Oliveira, Michel Pedro e Luis Renato de Almeida, pela presença constante em minha vida desde o ensino médio.
Aos amigos do MagMol, Beatriz Lima, Daniel Martins, Thiago Reitor e Thamyres Araújo, pelo companheirismo nos momentos de alegria e de aperto da vida acadêmica.
À Cecília Cavalcanti, pela paciência e companheirismo durante toda a faculdade. À Dafne Varanda, Izabella Azevedo e Maria Cecília Ribeiro, por estarem ao meu lado sempre, mesmo com todos os “você me cansa, menino”. Vocês foram o melhor presente que a universidade poderia me dar.
À minha namorada, Amanda Dias, pela compreensão, pelo carinho e pelo incentivo.
Aos amigos do LTM, Fernanda Mantuano, Ozéias dos Santos e Sandra Bitencourt, pela ajuda, pelo apoio e pelos conhecimentos compartilhados comigo.
Às agências de fomento, CAPES e FAPERJ, pelo apoio financeiro no desenvolvimento do projeto.
Resumo
A quercetina é um flavonoide de grande importância para as indústrias farmacêutica e alimentícia, pois possui atividades biológicas como antioxidante, anticancerígena, anti-inflamatória e neuroprotetora. Umas das principais matérias-primas utilizada para produção de quercetina é a fava d’anta, uma planta nativa do cerrado brasileiro. Como a planta apresenta pequenas concentrações dessa substância, a produção de quercetina é realizada através da hidrólise ácida da rutina, que é encontrada em concentrações maiores (cerca de 15%). Desta maneira, para produzir o flavonóide, é necessário a extração da rutina da matriz vegetal e sua hidrólise até quercetina, sendo necessária a utilização de ácidos, de grandes volumes de água e solventes orgânicos, o que torna o processo danoso ao meio ambiente. É relatada na literatura a capacidade de diversos microrganismos de agir sobre a rutina, transformando-a em quercetina. Além disso, fungos como o Aspergillus niger também são capazes de sintetizar enzimas que degradam a celulose da parede vegetal, o que pode facilitar a extração da rutina presente no vegetal. Assim sendo, o desenvolvimento de um processo biotecnológico se torna uma alternativa atrativa ao processo industrial aplicado atualmente, visto que a extração e a hidrólise seriam realizadas em uma única etapa através do microrganismo. Os objetivos desse trabalho foram otimizar as condições de tempo e razão de solvente para a extração da quercetina produzida por uma linhagem fúngica isolada em trabalhos anteriores através de um planejamento fatorial completo 22. Foram avaliados três solventes: metanol, etanol e
isopropanol. Buscou-se também realizar o levantamento cinético da produção de quercetina tanto dessa linhagem quanto da linhagem de Aspergillus niger INCQS 40065 obtida da coleção de fungos da Fundação Oswaldo Cruz. Os resultados mostraram que a razão de solvente de 7:1 e o tempo de 60 min foram as melhores condições. O metanol foi o solvente mais eficaz em extrair a quercetina produzida em todos os experimentos realizados, sendo capaz de extrair cerca de 66% (46,1 mg/g de fava) da quercetina na condição ótima, seguido do etanol (aproximadamente 50%). Ambas as linhagens fúngicas foram capazes de produzir quercetina a partir da fava d’anta, sendo encontrada uma substância intermediária, provavelmente isoquercetina.
Abstract
Quercetin is a flavonol of great importance for pharmaceutical and food industry, due to its biological characteristics such as antioxidant, anticancer, anti-inflammatory and neuroprotective activities. One of the major sources used for the fabrication of quercetin is fava d’anta, a native plant from Brazilian savannah (Cerrado brasileiro). The concentration of quercetin in the plant is very low, so it’s production is made from the hydrolysis of rutin, whose concentration is higher (approximately 15%). This means that it is necessary to extract rutin from the vegetal and hydrolyze it to obtain the product. This process needs acids, organic solvents and waste a great amount of water, which makes it not sustainable. It is reported that there are many microorganisms that can transform rutin in quercetin. Some fungi as Aspergillus niger can, additionally, synthetize enzymes capable of degrade cellulose. Therefore, the development of a biotechnological process is a compelling alternative to the existing industrial process, since the extraction and hydrolysis of rutin would be made in only one step by the microorganism. The objectives of this work were to optimize the time and solvent ratio to the extraction of quercetin produced by a fungus strain isolated in a previous work through a full factorial experimental design 22. Three solvents were evaluated: methanol, ethanol and
isopropanol. It was also accomplished a kinect study of the production of quercetin by this strain and by Aspergillus niger INCQS 40065 from the Fungi Collection of Oswaldo Cruz Foundation. The results showed that the best conditions were ratio of solvent 7:1 and time of extraction of 60 min. The most efficient solvent in extract quercetin from the fermented medium was methanol, whom extracted approximatey 66% (46,1 mg/g of fava) in the best condtion, followed by ethanol. Both fungi strains were capable of produce quercetin from fava d’anta and it was observed an intermediate substance, that could be isoquercetin.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura básica do núcleo flavano ... 16
Figura 2: Principais classes de flavonoides ... 17
Figura 3: Estrutura química da quercetina ... 18
Figura 4: Esquema das reações enzimáticas. ... 23
Figura 5: Fava d'anta ... 24
Figura 6: Secagem dos frutos ... 24
Figura 7: Degradação enzimática da quercetina ... 28
Figura 8: Meio ágar Sabouraud ... 31
Figura 9: Aspergillus niger cultivado em fava d'anta ... 32
Figura 10: Obtenção do extrato ... 34
Figura 11: Rampa do gradiente de eluição ... 36
Figura 12: Cromatograma do ponto 4 da curva padrão ... 38
Figura 13: Cromatograma do experimento 1 do metanol ... 38
Figura 14: Massa de quercetina nos extratos ... 39
Figura 15: Gráfico de Pareto para os resultados do metanol ... 40
Figura 16: Gráfico de Pareto para os resultados do etanol ... 42
Figura 17: Gráfico de Pareto para os resultados do etanol excluindo a variável x1 ... 43
Figura 18: Gráfico de Pareto para os resultados do isopropanol ... 44
Figura 19: Rendimento da extração de quercetina ... 47
Figura 20: Placas cromatográficas reveladas com NP/PEG (esquerda) e em UV 365nm (direita) ... 48
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Conteúdo médio de quercetina em alimentos ... 18
Tabela 2: Comparativo entre a fermentação em estado sólido (FES) e a fermentação submersa (FSm) ... 29
Tabela 3: Domínio experimental do planejamento fatorial. ... 33
Tabela 4: Planejamento experimental para a otimização da extração ... 33
Tabela 5: Concentrações de rutina e quercetina da curva padrão do planejamento fatorial. ... 35
Tabela 6: Análise de variância para o metanol ... 41
Tabela 7: Análise de variância para o etanol ... 43
Tabela 8: Análise de variância para o isopropanol ... 45
Tabela 9: Resultados experimentais e modelados para metanol e etanol ... 46
ÍNDICE DE EQUAÇÕES
Equação 1: equação da reta padrão da rutina ... 37
Equação 2: equação da reta padrão de quercetina ... 37
Equação 3: Modelo para massa de quercetina extraída com metanol ... 40
Equação 4: Modelo para massa de quercetina extraída com etanol. ... 42
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ABIQUIFI - Associação Brasileira da Indústria Farmoquímica e de Insumos Farmacêuticos
ANOVA – do inglês, Analysys of variance CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência
ECO-92 – Conferência das Nações Unidas sobre o Meio Ambiente e o Desenvolvimento, realizada no Rio de Janeiro em 1992
FDA – Food and Drug Administration FES – Fermentação em estado sólido FSm – Fermentação líquida ou submersa GRAS – Generally Recognized as Safe
HPLC – do inglês, High Performance Liquid Chromatography INCQS – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde LDL – Lipoproteínas de baixa densidade
NP – solução metanólica de ácido β-etilamino-difenilbórico p/v – Peso por volume
PEG – solução etanólica de polietilenoglicol 4000 UFF – Universidade Federal Fluminense
UV – Ultravioleta
LISTA DE UNIDADES
µL – Microlitro µm – Micrometros cm – Centímetros g – Gramas L – LitroM – Molaridade, dada em mol/L mAU – mili unidades de absorbância mg – Miligramas
mL – Mililitros mm – Milímetros nm - Nanômetros
SUMÁRIO
1. Introdução ... 13 2. Objetivos ... 15 3. Revisão bibliográfica ... 16 3.1. Flavonoides ... 16 3.2. Quercetina ... 18 3.3. Produção da quercetina ... 20 3.3.1. Extração da rutina... 203.3.2. Hidrólise ácida e enzimática da rutina ... 22
3.4. Fava d’anta ... 24
3.5. Fungo ... 27
3.6. Fermentação em estado sólido ... 29
4. Materiais e métodos ... 31
4.1. Fava d’anta ... 31
4.2. Microrganismos ... 31
4.3. Preparação de inóculo ... 31
4.4. Cultivo na fava d’anta ... 32
4.5. Otimização da extração ... 32
4.6. Levantamento da cinética de produção ... 34
4.7. Métodos analíticos ... 34
4.7.1. Análise por cromatografia em camada fina ... 34
4.7.2. Análise por cromatrografia líquida de alta eficiência .. 35
5. Resultados e discussões ... 37 5.1. Otimização da extração ... 37 5.2. Levantamento cinético ... 47 6. Conclusões ... 50 7. Sugestões ... 51 8. Referências bibliográficas... 52
1. INTRODUÇÃO
A quercetina é um composto polifenólico que tem despertado o interesse de pesquisadores devido às suas diversas propriedades biológicas como antioxidante, anticancerígeno, anti-inflamatório e cardioprotetor. É o flavonol mais abundante na dieta humana, sendo encontrado em tomates, maçãs, uvas, cebolas, vinhos e outros vegetais. Entretanto, esse composto é ingerido em maiores quantidades nas suas formas glicosiladas. Geralmente a quercetina se encontra conjugada a um ou dois açúcares, como é o caso da rutina, onde a quercetina está combinada com a rutinose (D’ANDREA, 2015).
Como a rutina é encontrada em maiores concentrações nas plantas, os processos industriais extraem esse composto e o hidrolisam para obter a quercetina. Existem na literatura diversos métodos descritos para a extração da rutina de matrizes sólidas utilizando solventes, muitas vezes tóxicos. Em muitos casos também é necessário realizar a extração sob agitação e fornecer energia ao processo para favorecer a transferência de massa (AZMIR et al, 2013).
Posteriormente à extração é necessário quebrar a ligação glicosídica gerando quercetina e rutinose. Essa reação pode ser feita através da ação de ácidos ou de enzimas. A rota mais utilizada industrialmente é a rota ácida, porém esta representa maiores custos com tratamento de efluentes e perdas de seletividade devido à formação de subprodutos. Já a rota enzimática apresenta condições mais brandas de reações, sendo uma rota alternativa aos processos industriais (WANG et al.,2011).
Merken e Beecher (2000), por exemplo, utilizaram uma solução 50% metanol com uma solução aquosa de ácido clorídrico 1,2 M e 0,4 g/L tert-butilhidroquinona para produzir quercetina a partir de casca de cebola. A extração foi realizada em refluxo por duas horas. Nesse caso ficam evidenciados alguns problemas da metodologia química, como a necessidade de uso de solventes orgânicos tóxicos, de temperatura, de um meio acidificado e da hidroquinona para prevenir a oxidação do produto (DMITRIENKO et al.,2012).
A principal fonte de quercetina utilizada na indústria é uma planta do Cerrado brasileiro: a fava d’anta (NUNES et al., 2012). É nos frutos dessa árvore que as maiores concentrações de flavonoides são encontradas (HUBINGER et al., 2009).
Devido à metodologia empregada, o processo industrial para produção de quercetina vai de encontro à sustentabilidade. Desta maneira, é necessário o desenvolvimento de processos que sejam viáveis economicamente, menos tóxicos e
menos agressivos ao meio ambiente (DA SILVA, 2016). Nesse aspecto um processo biotecnológico se torna bastante atrativo.
Processos biotecnológicos são largamente utilizados na indústria. O etanol, por exemplo, um dos principais biocombustíveis utilizados aqui no Brasil, é produzido a partir da cana-de-açúcar através de um processo fermentativo utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae (CINELLI, 2012). Outras áreas onde processos biotecnológicos possuem um grande potencial de aplicação são as indústrias têxtil, de alimentos e de papel. Dentro dessas áreas podem ser citados a produção de alimentos (queijos, por exemplo), bebidas (cervejas e vinhos, por exemplo) e enzimas (pectinases e amilases, por exemplo) (ARO et al., 2005).
Quanto à produção de quercetina, é relatada na literatura a existência de fungos que possuem a capacidade de hidrolisar a rutina, apresentando, portanto, potencial para aplicação em processos biotecnológico (TRANCHIMAND et al., 2010). Diante disso, este trabalho teve como finalidade avaliar a produção de quercetina em escala de laboratório através de processos fermentativos utilizando fungos de linhagens diferentes, para possível aplicação industrial em processos mais sustentáveis. A intenção é levar os fungos a agir diretamente sobre o material vegetal através das enzimas hidrolíticas, acessar a rutina ali presente e hidrolisá-la, tornando a aplicação mais interessante do ponto de vista da sustentabilidade.
2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a produção de quercetina a partir da fava d’anta por fermentação utilizando fungos filamentosos a fim de desenvolver um processo biotecnológico viável e mais sustentável em relação ao processo tradicional utilizado na indústria. Com relação aos objetivos específicos, estes são:
a) Otimizar as condições de tempo e a razão volume de solvente:massa de fava na extração da quercetina produzida durante o processo de fermentação; b) Realizar o levantamento cinético da produção de quercetina a partir do fungo
isolado em trabalhos anteriores no Laboratório de Tecnologia Microbiana (LTM) da Universidade Federal Fluminense (UFF) e;
c) Realizar o levantamento cinético da produção de quercetina a partir da linhagem do fungo Aspergillus niger INCQS 40065 obtida da coleção de fungos do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. FLAVONOIDES
Os flavonoides são compostos fenólicos sintetizados pelas plantas como metabólitos secundários através da via fenilpropanóides. Sua estrutura base é composta por quinze átomos de carbono, sendo esses dispostos em: dois anéis benzênicos (A e B) e um anel pirano (C), conforme demonstrado na Figura 1 (TRANCHIMAND et al., 2010).
Figura 1: Estrutura básica do núcleo flavano. Adaptado de ERLUND, 2004.
Uma grande variedade de compostos naturais apresenta o núcleo de flavano, sendo classificados de acordo com os substituintes ligados ao anel C e ao estado de oxidação dos átomos contidos neste anel. Os flavonoides são encontrados nas plantas associados ou não à açúcares, apresentando maiores concentrações nas suas formas glicosiladas. São reportados na literatura pelo menos oito açúcares (monossacarídeos ou suas combinações) que se ligam aos radicais hidroxila presentes na estrutura dos flavonoides (ERLUND, 2004). As principais classes dos flavonoides estão representadas na Figura 2.
Alguns fatores externos naturais podem afetar a concentração dos flavonoides nas plantas como a incidência de radiação solar, umidade e nutrientes, além de fatores artificiais como a poluição. Diversos autores indicam que a produção desses compostos está relacionada a diversas funções nos vegetais. Podem ser citadas, por exemplo, a proteção contra raios ultravioleta, ação antioxidante e antibiótica. Alguns também atribuem funções reprodutivas aos derivados de flavonoides, já que estes compostos coloridos (responsáveis pelas cores vermelha e azul presentes em algumas flores) atraem insetos polinizadores. (MACHADO et al., 2008, SIMÕES et al., 1999).
Figura 2: Principais classes de flavonoides. Adaptado de DMITRIENKO et al., 2012
Como os seres humanos não são capazes de sintetizar os flavonoides, estes precisam ser ingeridos através da alimentação (MACHADO et al., 2008). Os compostos podem ser encontrados em diversos vegetais presentes na dieta humana, como a maçã (WACH et al., 2007), uva (GEORGIEV et al., 2014) e couve (KUMAR et al., 2014). A quantidade de flavonoides ingerida diariamente pelos seres humanos varia de acordo com a dieta. Estima-se que nos Estados Unidos seja consumido, em média, 1 grama de flavonoides por dia, com a quercetina correspondendo a aproximadamente 75% desse total (ERLUND, 2004; D’ANDREA, 2015). Na Tabela 1 está listada a quantidade média de quercetina presente em alguns de alimentos e bebidas.
Tabela 1: Conteúdo médio de quercetina em alimentos. Adaptado de ROTHWELL et al., 2013.
Alimentos e bebidas Quantidade média de quercetina
Vinho vermelho 0,83 mg/100 mL
Suco de maçã 0,48 mg/100 mL
Cebola (família Alliaceae) 1,31 mg/ 100 g
Chocolate amargo 25 mg/ 100 g
3.2. QUERCETINA
A quercetina é um flavonoide largamente encontrado em diversos vegetais que estão presentes na dieta humana como: cebola, tomate e alface (Figura 3). É encontrada em maior concentração nos vegetais nas suas formas combinadas com açúcares, como a rutina (glicosídeo formado pela ligação da quercetina com o dissacarídeo rutinose). Neste caso, o substituinte R na estrutura química da quercetina é a rutinose. Quando hidrolisada, a rutina perde esse dissacarídeo e o substituinte R se torna um átomo de hidrogênio (WANG et al., 2016; YANG et al., 2009).
Figura 3: Estrutura química da quercetina. Adaptado de TRANCHIMAND et al., 2010.
A quercetina vem despertando o interesse de pesquisadores e da indústria devido às suas variadas atividades biológicas. A molécula apresenta propriedades antioxidante (RAVICHANDRAN et al., 2014), anti-inflamatória (BOOTS et al., 2011), cardioprotetora (HERTOG et al., 1993), antiviral (BOOTS et al., 2008) e anticancerígena (SEUFI et al. 2009).
Essa substância pode reagir com radicais livres gerados pela respiração e, por possuir diversas ligações π conjugadas, pode formar compostos menos reativos estabilizados por estruturas de ressonância (SOLOMONS e FRYHLE, 2011). O grupo catecol presente no anel B (vide Figura 1) desse composto pode também funcionar como
um agente quelante, reagindo com metais de transição no organismo e impedindo que estes reajam com compostos orgânicos, oxidando-os (D’ANDREA, 2015). Por consequência desses dois fatores, a quercetina apresenta uma alta atividade antioxidante.
Coballase-Urrutia e colaboradores (2013) realizaram um estudo no qual ratos foram submetidos ao tetracloreto de carbono (CCl4). Aqueles alimentados com quercetina
tiveram seu tecido hepático protegidos da oxidação por radicais livres. Com o objetivo de estudar o metabolismo da quercetina em humanos Wiczkowski e colaboradores (2014), alimentaram suínos com casca seca de cebola (rica em quercetina), analisaram a urina dos animais antes e após (entre 2 a 6 horas) o consumo. As análises revelaram a presença de diversos metabólitos da quercetina após a ingestão da casca da cebola, que podem agir protegendo as células do estresse oxidativo.
Os processos oxidativos estão diretamente relacionados às inflamações (D’ANDREA, 2015, ERLUND, 2004). Sabendo disso, Boots e colaboradores (2011) realizaram estudos no University Hospital Maastricht com 18 pacientes diagnosticados com sarcoidose, uma doença inflamatória crônica. Alguns deles tiveram a sua alimentação suplementada com 500 miligramas de quercetina. Os resultados dos testes demonstraram que a suplementação com o flavonoide foi eficiente tanto em aumentar a proteção contra processos oxidativos quanto a defesa contra as inflamações provocadas pela doença.
Existem na literatura diversos estudos que mostram a atividade cardioprotetora da quercetina em seres humanos (D’ANDREA, 2015, MORALES-CANO et al., 2014). A quercetina atua inibindo a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL). Quando oxidadas, essas lipoproteínas se depositam nas paredes dos vasos sanguíneos formando placas que impedem o fluxo de sangue. Flavonóis e flavonas atuam também como inibidores da ciclo-oxigenase, uma enzima relacionada à agregação de plaquetas no sistema circulatório, reduzindo a possibilidade de trombose (HERTOG et al., 1993).
A fim de avaliar o potencial antimicrobiano de alguns extratos de plantas finlandesas e de compostos puros como os flavonoides rutina e a quercetina, Rauha e colaboradores (2000) realizaram testes com diversos microrganismos. A quercetina mostrou-se com capacidade de inibir as bactérias estudadas, enquanto a rutina, sua forma glicosilada não apresentou atividade antimicrobiana.
3.3. PRODUÇÃO DA QUERCETINA
A quercetina é encontrada em concentrações pequenas nas plantas, o que torna a sua obtenção industrial direta inviável. Para contornar esse fato, a opção é extrair a rutina, já que ela está presente em maiores concentrações nos vegetais, e hidrolisá-la, formando quercetina. A hidrólise consiste na quebra da ligação entre a rutinose e a quercetina na sua forma livre (KIM et al., 2011).
3.3.1. Extração da rutina
A extração de compostos orgânicos de matrizes vegetais é uma etapa bastante desafiadora, já que diversos parâmetros podem influenciar tanto no rendimento da extração, quanto na qualidade do produto de interesse. O tipo de solvente, propriedades da matriz vegetal, temperatura, pressão e tempo de extração são alguns exemplos de parâmetros que influenciam na obtenção do extrato (AZMIR et al., 2013).
Compostos naturais em geral são moléculas que apresentam menor polaridade, sendo extraídas com maior facilidade com solventes orgânicos, muitas vezes tóxicos. As técnicas de extração são baseadas na aplicação de calor e/ou agitação, sendo a principal delas a técnica de Soxhlet. Ao longo dos anos foram desenvolvidas diversas técnicas alternativas a fim de reduzir os impactos ambientais e a quantidade utilizada desses solventes. Entre as técnicas não convencionais podem ser citadas as técnicas de ultrassom, digestão enzimática, fluidos supercríticos, entre outras (AZMIR et al., 2013).
A técnica de Soxhlet, também conhecida como extração por refluxo, consiste em expor a matriz vegetal ao solvente repetidas vezes. Para isso, a fonte vegetal é disposta em um recipiente permeável, conectado à um mecanismo sifonado. Ao atingir um determinado nível, o sifão é acionado e o extrato obtido é levado a um refervedor, onde o solvente é evaporado e o extrato fica retido. O solvente é então conduzido a um condensador e retorna ao recipiente permeável. A quantidade de ciclos de extração é determinada pelo tempo de extração. Quanto maior for o tempo do processo, mais eficiente ele será. Entretanto, os longos períodos de tempo requeridos podem reduzir a produtividade do processo (CHUA, 2013). Willians e colaboradores (2006) realizaram estudos comparativos entre as técnicas de Soxhlet, ultrassom e fluido pressurizado e concluíram que a extração por Soxhlet foi a mais eficiente. Contudo, o tempo de extração pode ter sido um fator influenciador nos resultados obtidos.
A técnica de extração assistida com ultrassom, segundo Zhao e colaboradores (1991), foi cerca de 50% mais eficiente em uma extração de rutina a 40 °C por uma hora,
quando comparada a um processo de extração similar utilizando a técnica de refluxo a 80 °C por duas horas. Dessa forma é possível concluir que o método com ultrassom é mais produtivo e pode ser mais seletivo em relação a rutina, pois temperaturas menores diminuem as chances de degradação do composto de interesse (ZHAO et al., 1991). As ondas ultrassônicas atuam aumentando a área de transferência de matéria entre a matriz vegetal e o solvente. Isso ocorre porque as bolhas formadas pelo vapor do solvente absorvem a energia das ondas e se contraem, aumentando a temperatura e a pressão na solução e favorecendo os fenômenos de transferência. Chua e colaboradores (2013) mostraram que a aplicação das ondas de ultrassom é mais eficaz quando não são utilizadas soluções aquosas para a extração. Nesses meios, as ondas podem promover a produção de radicais hidroxil, que degradam a rutina. Já em soluções metanólicas, por exemplo, a formação desses radicais não foi tão favorecida.
As enzimas também podem ser aplicadas em conjunto com solventes visando uma maior eficiência do processo extrativo. O uso de uma mistura enzimática promove um pré-tratamento do material vegetal, degradando a sua parede celular e tornando os compostos de interesse mais acessíveis aos solventes (DA SILVA, 2016). Pinelo e colaboradores (2008) avaliaram a cinética de extração de diferentes compostos fenólicos da casca de maçã através da extração líquido-sólido convencional e da extração assistida por enzimas (pectinases, celulases e proteases). Os resultados obtidos mostraram que, em geral, a ação enzimática promoveu uma maior liberação dos compostos fenólicos avaliados. Individualmente, as pectinases foram as mais eficientes, seguidas pelas proteases e pelas celulases, que não apresentaram quase nenhuma influência. Quando avaliadas em conjunto, o coquetel de enzimas se mostrou o mais eficiente quando comparado aos outros experimentos, tendo o maior número de Fick1.
Nos processos enzimáticos diversos parâmetros podem influenciar na eficiência da extração do composto de interesse, tais como: temperatura, tamanho de partícula da matriz vegetal, razão solvente/matriz vegetal e composição do solvente. Uma vantagem da digestão enzimática consiste no acesso aos compostos fenólicos que estão retidos no interior da parede celular da matriz vegetal. Essa estratégia está bastante consolidada na indústria alimentícia, onde são utilizados coquetéis enzimáticos (contendo celulases, hemicelulases e proteases) para degradar a parede celular de frutas, facilitando a prensa
1 O número de Fick fornece informações sobre a migração de um composto para a fase bulk ao longo de período de extração. Esse número foi obtido através da linearização da segunda Lei de Fick, assumindo partículas esféricas e que houve transferência de massa apenas na direção radial para simplificação da equação original (PINELO et al., 2008).
das mesmas e aumentando o rendimento do processo de fabricação de sucos (PINELO et al., 2008).
A tecnologia de extração através de fluidos supercríticos também é bem consolidada industrialmente, sendo aplicada, por exemplo, na preparação de café descafeinado (WILLIAMS e CLIFFORD, 2010). Nessa técnica, o fluido usado para extrair a substância de interesse tem sua pressão e sua temperatura elevadas acima dos seus valores críticos, atingindo o estado supercrítico. Ao entrar nesse estado o fluido passa a apresentar propriedades de difusão, viscosidade e tensão superficial similares às da sua fase vapor, enquanto sua densidade e poder de solvatação são similares aos da sua fase líquida. Essas características favorecem a difusão do solvente através da matriz vegetal e a transferência do composto natural para o solvente (AZMIR et al., 2013). Usualmente se utiliza o dióxido de carbono como solvente, pois este possui temperatura e pressão críticas baixas (31 °C e 74 bar, respectivamente) o que possibilita o trabalho em condições de temperatura próxima à ambiente e pressão moderada (entre 100 e 450 bar). Podem ser citadas como vantagens da extração através de fluidos supercríticos: menor tempo de extração, extração quase total do composto de interesse e necessidade de baixas temperaturas, que garante maior estabilidade às substâncias termossensíveis (AZMIR et al., 2013).
3.3.2. Hidrólise ácida e enzimática da rutina
A reação de hidrólise da rutina consiste na ruptura dos grupamentos éter presentes no glicosídeo e pode ocorrer de duas maneiras. A primeira consiste na quebra da ligação entre os açúcares, gerando isoquercetina e ramnose. A segunda consiste na quebra da ligação entre o flavonoide e os açúcares, gerando quercetina aglicona e rutinose (TRANCHIMAND et al., 2010; WANG et al., 2011).
A forma clássica de se hidrolisar éteres consiste na utilização de ácidos, como o ácido sulfúrico, o ácido fosfórico e o ácido clorídrico. Esse tipo de reação é capaz de quebrar facilmente as ligações entre glicosídeos e os flavonoides, podendo gerar tanto flavonoides livres, quanto intermediários glicosilados. No entanto, meios ácidos também são capazes de degradar os flavonoides (WANG et al., 2011). Wach e colaboradores (2007) determinaram a quantidade de quercetina presente em amostras de cebolas, casca de maçã e ervas como Hypericum perforatum e Sambucus nigra. Após ser extraída, a rutina foi hidrolisada utilizando uma mistura de ácido clorídrico 2,8 M e metanol (60:40 p/p), sob agitação e aquecimento. Com a hidrólise ácida, uma quantidade considerável de rutina presente nos vegetais estudados foi transformada em quercetina. No caso da casca
de maçã, por exemplo, foi possível obter cerca de 250 miligramas de quercetina por quilograma de material seco, resultado 12 vezes maior do que a quantidade de quercetina livre encontrada nesse material antes da hidrólise.
A alternativa para a hidrólise ácida consiste na utilização de enzimas. Nesse caso, as condições de operação são mais brandas e a reação é mais seletiva em relação à quercetina. Como esta rota não envolve solventes orgânicos, as indústrias alimentícia e farmacêutica podem se tornar mercados consumidores da quercetina produzida desta maneira (WANG et al., 2011). As principais enzimas que podem hidrolisar a rutina para a formação de quercetina são a rutinosidase, a β-glicosidase e a α-L-ramnosidase. A primeira é capaz de gerar quercetina e rutinose (um dissacarídeo formado por uma molécula de glicose e uma de ramnose). A segunda e a terceira enzimas agem em conjunto, sendo a α-L-ramnosidase a responsável por gerar isoquercetina e ramnose. Já a β-glicosidase age sobre a isoquercetina gerando quercetina e glicose (TRANCHIMAND et al., 2010). Na Figura 4 estão representadas as reações descritas.
Para a extração de rutina, três espécies vegetais são comumente utilizadas, Sophora japonica, Uncaria elliptica e Dimorphandra mollis ou Dimorphandra gardneriana. Dentre estas, D. mollis e D. gardneriana, que são conhecidas como fava d’anta e nativas do cerrado brasileiro, são responsáveis por boa parte da produção mundial de rutina (GOMES, 1998). Isso se deve a seus frutos, que contêm elevada concentração desse flavonoide, aproximadamente 15%, e em menor quantidade, a isoquercetina (aproximadamente 3%). Já as folhas de Uncaria elliptica podem apresentar uma concentração de rutina em torno de 10% e de isoquercetina em torno de 0,1% (Food and Drug Administration (FDA) – Generally Recognized as Safe (GRAS) NOTICE QUERCEGEN, 2010).
3.4. FAVA D’ANTA
A fava d’anta é uma árvore nativa do cerrado brasileiro, de médio porte, podendo atingir até 20 metros de altura. Duas espécies são conhecidas popularmente como fava: a Dimorphandra mollis e a Dimorphandra gardneriana. Ela pertence à família das leguminosas e pode ser encontrada desde de São Paulo até o Tocantins (FLILIZOLA, 2013).
Figura 5: Fava d'anta. Fonte: http://www.ppmac.org/sites/default/files/fava_danta.jpg. Acesso em: 16 de outubro de 2017
Essa árvore apresenta casca grossa e caule retorcido. Suas flores apresentam coloração amarelada e possuem a forma de espigas. Seus frutos imaturos apresentam coloração esverdeada e, à medida que vão amadurecendo, sua coloração torna-se amarelada. Ao final do processo de maturação os frutos apresentam coloração marrom-escuro (FLILIZOLA, 2013; FERREIRA et al., 2001).
Figura 6: Secagem dos frutos. Fonte:
http://www.agenciaminas.mg.gov.br/ckeditor_assets/pictures/2666/content_imagem_13.jpg. Acesso em: 16 de outubro de 2017
Os frutos dessas espécies são ricos em rutina, os quais são utilizados como matéria prima pelas indústrias farmacêutica e química para produção de rutina e quercetina (OLIVEIRA et al., 2008). Na Erro! Fonte de referência não encontrada. estão relacionados os dados referentes às exportações de rutina e seus derivados segundo o Sistema de Análise das Informações de Comércio Exterior (Alice Web, 2007). No ano de
2015, a rutina foi o oitavo principal insumo farmacêutico exportado pelo Brasil, segundo a Associação Brasileira da Indústria Farmoquímica e de Insumos Farmacêuticos (ABIQUIFI, 2017). Os principais consumidores de fava d’anta são a Bélgica, a Alemanha, os Estados Unidos e o Japão (OLIVEIRA et al., 2008). A quantidade de rutina presente nos frutos secos pode variar de acordo com as condições de extração da fava como a época e o local da colheita. Estima-se que, para cada 10 quilogramas de fruto, sejam produzidos 0,5 a 1,5 quilogramas de rutina (DA SILVA, 2016; FDA – GRAS NOTICE QUERCEGEN, 2010; MACEDO et al, 2004).
Além da quercetina e da rutina, outros produtos de interesse industrial podem ser produzidos a partir da fava d’anta. É relatado o uso da ramnose como aromatizante e do galactomanano, um polissacarídeo presente na semente da fava, para se obter gomas (PANEGASSI et al., 2010).
Apesar do fruto possuir tamanha importância comercial, não há plantações de faveiras. Os frutos coletados são basicamente extraídos da vegetação nativa, muitas vezes de forma desordenada e predatória. A extração não sustentável da fava pode gerar problemas sociais e ecológicos (perda de diversidade genética e diminuição na disponibilidade de alimento para a fauna associada). Para reverter esse cenário, algumas cooperativas estão implantando sistemas de manejo sustentável (FLILIZOLA, 2013). Um outro problema é a eliminação das faveiras pelos pecuaristas, que alegam perdas na produção devido à efeitos tóxicos dos frutos no gado (NUNES, 2010).
Na região do Cerrado brasileiro, o extrativismo surgiu como uma forma de complementação de renda. Nessa região a população sofre com os prolongados períodos de seca e solo empobrecido, o que dificulta a implantação de sistemas de agricultura. Para colher os frutos são utilizados equipamentos como foice, facão e podão, os quais danificam os galhos das árvores e diminuem a produtividade das colheitas. Os coletores têm consciência do impacto causado por esses equipamentos, já que, na colheita seguinte pode ser necessário mudar o local de coleta devido aos danos sofridos anteriormente pelos arbustos. Desmatamento e queimadas também podem forçar mudanças de local na próxima colheita (NUNES, 2010). Outro problema gerado pelo extrativismo é a falta de incentivo ao plantio de novas mudas de faveira. Essa prática poderia garantir a variabilidade genética, além de introduzir árvores mais jovens na população, favorecendo a produção (NUNES et al., 2012).
No Brasil as empresas responsáveis pela produção de quercetina a partir de fava d’anta são a Quercegen Agronegócios, a Sanrisil, a PVP S/A e a Centroflora. A
Quercegen, por exemplo, faz uso de diversas etapas para produzir o flavonoide. A primeira delas consiste em extrair a rutina da matriz vegetal através da utilização do etanol e sob aquecimento. Em seguida o extrato é resfriado e o material particulado em suspensão é filtrado através de um filtro prensa. A etapa seguinte consiste na hidrólise ácida da rutina obtida, utilizando ácido nítrico, o que gera a quercetina bruta. Esse material passa então por um processo de purificação através do método de recristalização utilizando etanol. Utiliza-se carvão ativado para absorção das impurezas presentes no meio. A solução é filtrada e a solução purificada de quercetina é então concentrada através da técnica de destilação, o que provoca a precipitação dos cristais de quercetina. A suspensão concentrada é submetida à centrifugação para se obter os cristais de quercetina purificados. Esses processos de purificação são realizados até que seja alcançado um teor de pureza de 99,5%. Por fim, esses cristais são secos e armazenados adequadamente (FDA – GRAS NOTICE QUERCEGEN, 2010).
A metodologia apresentada emprega o etanol, cuja produção pode ter impactos ambientais negativos (DE ALMEIDA et al., 2014). Desta forma, a redução no consumo deste insumo através da utilização de um processo biotecnológico vai ao encontro do desenvolvimento sustentável. Desde a década de 1970, com a conferência de Estocolmo, políticas internacionais voltadas para a sustentabilidade estão sendo aplicadas. Um dos grandes marcos da implementação do conceito de sustentabilidade ocorreu na ECO-92 2.
Tendo isso em mente, a pressão sobre a indústria química para tornar seus processos mais verdes aumentou. Conceitos como o de “Economia atômica”, criado por Trost (1991), a busca por processos mais eficientes e mais limpos passaram a fazer parte do cotidiano da indústria (DA SILVA et al., 2005; DA SILVA, 2016).
O estudo de um método alternativo para produção de quercetina de maneira sustentável é extremamente importante. Uma forma de se atingir esse objetivo é utilizando processos biotecnológicos envolvendo fungos filamentosos. É relatado na literatura que esses fungos, através de suas enzimas, são capazes de acessar a rutina presente no material vegetal e transformá-la em quercetina. Em consequência disso a quantidade de solvente empregada no processo de extração seria reduzida expressivamente, os ácidos seriam extintos do processo e o consumo de água reduzido (DA SILVA, 2016).
2 Conferência das Nações Unidas sobre o Meio Ambiente e o Desenvolvimento realizada na cidade
3.5. FUNGO
Os fungos são microrganismos presentes em diversas atividades humanas. Alguns, como a levedura Saccharomyces cerevisiae, são utilizados em processos fermentativos para a produção de cervejas e pães. Outros, como os bolores, são extremamente necessários no meio ambiente, pois realizam a degradação da matéria orgânica (COELHO, 2017). Até 2008 tinham sido descritos na literatura aproximadamente 99 mil espécies de fungos. No entanto, estima-se que o número total de espécies seja da ordem de 5 milhões. Embora as técnicas de caracterização genética tenham facilitado a descrição desses seres, muitos ainda estão inacessíveis aos seres humanos (BLACKWELL, 2011).
Devido à sua capacidade de produzir enzimas capazes de degradar os polissacarídeos presentes na parede celular dos vegetais, os fungos têm grande importância também na indústria. As amilases, por exemplo, são aplicadas na indústria alimentícia para degradar o amido de alguns alimentos. Já as xilanases são amplamente aplicadas como branqueadores na indústria de papel e celulose, o que reduz a quantidade de alvejantes químicos utilizados nessa indústria. Essas enzimas também são aplicadas na obtenção de alguns óleos vegetais, de amido e na clarificação de sucos de frutas (BEG et al, 2001).
Outra área com grande potencial para aplicação de processos biotecnológicos envolvendo fungos é o tratamento de resíduos agrícolas. Esses resíduos são produzidos em grandes quantidades e possuem baixo valor agregado. Buscando reduzir os impactos ambientais dos resíduos e gerar valor a partir deles, Ahmed e colaboradores (2016) realizaram estudos para induzir a produção de pectinase pelo Aspergillus niger a partir de resíduos da casca de laranja. Eles obtiveram enzimas na concentração de 120 mg/mL e com atividade específica de 23,6 U/mg, mostrando que o método possui um grande potencial para produção enzimática através de uma matéria-prima mais barata.
Ainda nesse contexto, a produção de combustível a partir de resíduos agroindustriais também vem chamado a atenção da comunidade científica. Dashtban e colaboradores (2009) mostraram o potencial que esses resíduos têm para produção de etanol, sendo uma alternativa sustentável aos combustíveis fósseis. De acordo com esse estudo, a quantidade média mundial de resíduos lignocelulósicos ente 1997 e 2001 era da ordem de 1,5 milhões de toneladas por ano, o que poderia gerar 442 bilhões de litros de etanol anualmente. Entretanto, o desenvolvimento de tecnologias viáveis esbarra em
diversos obstáculos como, por exemplo, a presença de lignina na superfície da celulose, que impede a ação eficiente das celulases.
Na literatura diversos microrganismos capazes de utilizar a rutina como fonte de carbono e liberar a quercetina, como algumas bactérias pertencentes ao gênero Clostridium. Porém os mais mencionados são fungos filamentosos, principalmente os dos gêneros Penicillium e Aspergillus. De forma geral, esses fungos agem sobre a rutina através de glicosidases, quercetinase e esterases. As glicosidases são enzimas capazes de quebrar os sacarídeos presentes na molécula de rutina. O fungo Aspergillus flavus, por exemplo, utiliza a rutinase para gerar quercetina e rutinose (TRANCHIMAND et al, 2010).
Já o fungo Aspergillus niger apresenta uma rota metabólica diferente. Esta espécie metaboliza a rutina através de duas enzimas: a α-L-ramnosidase e a β-glicosidase. A ramnosidase atua principalmente na clivagem da rutina, gerando isoquercetina e ramnose. Também pode clivar a rutinose, produzindo glicose e ramnose, mas poucos são os relatos desta via metabólica. A glicosidase é empregada para clivar a isoquercetina, gerando quercetina e glicose. As enzimas quercetinase e esterase têm a função de metabolizar a quercetina. A quercetinase catalisa a reação de oxidação do grupamento hidroxila presente no anel central do flavonoide, gerando monóxido de carbono e depsídeo. Por fim, a esterase tem a função de hidrolisar o depsídeo e gerar ácido carboxílico fluoroglucinol e ácido protocatequino (Figura 7) (TRANCHIMAND et al, 2010; YANG et al, 2009).
Figura 7: Degradação enzimática da quercetina. Adaptado de TRANCHIMAND et al., 2010
Na atual produção industrial de quercetina, as etapas de extração e hidrólise da rutina são necessárias. Um processo biotecnológico pode viabilizar essa produção em apenas uma única etapa, através da ação de um microrganismo capaz de liberar a rutina presente na matriz vegetal e hidrolisá-la até quercetina. Isso representa ganhos ambientais e econômicos, tornando a produção de quercetina um processo mais sustentável.
3.6. FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
A tecnologia fermentativa experimentou um grande avanço desde a década de 1940, quando a elevada demanda de produtos como a acetona e a penicilina alavancou a aplicação industrial de fermentação líquida ou submersa (FSm). Esse tipo de processo, no entanto, pode gerar diversos impactos ao meio ambiente devido ao elevado consumo de energia, de água e geração de resíduos (CHEN, 2013). Para reverter esse quadro, pesquisadores tem estudado a chamada fermentação em estado sólido (FES) (HARZVEVILI e CHEN, 2014). Esse tipo de fermentação é definido como aquele no qual o processo fermentativo é realizado sobre matrizes sólidas e na ausência de água livre (BHARGAV et al., 2008).
Na Tabela 2 estão descritas as principais diferenças entre a FSm e a FES, sendo possível notar vantagens e desvantagens de ambas as fermentações.
Tabela 2: Comparativo entre a fermentação em estado sólido (FES) e a fermentação submersa (FSm). Adaptado de HARZVEVILI e CHEN, 2014.
FES FSm
Fase sólida Mais que 70% Menos que 5%
Oxigênio disponível Livre Limitado, com apenas o O2 dissolvido
Substrato Simples e de baixo custo Alta qualidade e elevado custo
Nutrientes
Dissolvidos na água adsorvida no substrato, de
forma desigual
Dissolvido no meio líquido, de maneira uniforme
Estado de crescimento dos microrganismos
Crescem sobre o substrato ou penetram na matriz
sólida
Crescem em suspensão no meio fermentativo Parâmetros tecnológicos do processo fermentativo
Retirada de calor Difícil Fácil
Uniformidade do meio Heterogêneo Homogêneo
Biorreator Aberto, volume pequeno e elevado custo operacional
Fechado, volume grande e elevado custo de investimento Concentração de
produtos Alta Baixa
A principal vantagem da FES comparada a FSm consiste na sua maior disponibilidade de oxigênio para os microrganismos. Isso acontece, pois, o ar está em contato direto com o meio fermentativo, o que favorece a transferência de oxigênio para os microrganismos. Já no processo submerso há a limitação de transferência de massa devido ao meio líquido, que retarda o fenômeno de transporte de oxigênio para o microrganismo e apresenta um limite de solubilidade. Outra importante vantagem é a necessidade de reatores menores. A relação entre o volume de meio fermentativo por massa de substrato de uma FES é bem menor do que a de uma FSm. Com isso, o investimento inicial para uma planta de FES acaba sendo menor do que o investimento necessário para se construir uma planta de FSm (CHEN, 2013; KRISHNA, 2005, HARZVEVILI e CHEN, 2014).
Entre as desvantagens da FES prevalece a dificuldade em se retirar calor do meio fermentativo. Durante a fermentação, os microrganismos produzem energia proporcionalmente às suas atividades metabólicas. No caso das fermentações submersas esse calor pode ser dissipado para o meio líquido através do mecanismo de convecção, já que os biorreatores são equipados com misturadores e chicanas. A injeção de ar nos sistemas FSm também facilita a transferência de energia, pois as bolhas de ar conferem maior turbulência ao meio. Quanto à FES, a transferência de energia é dificultada pela baixa umidade do meio e pela baixa condutividade térmica das matrizes vegetais (BHARGAV et al., 2008). Esse problema pode ser amenizado através do fluxo forçado de ar no biorreator e a utilização de mecanismos de agitação constante do meio fermentativo (FIGUEROA-MONTERO et al., 2011).
4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. FAVA D’ANTA
A fava foi adquirida da empresa Empório do Cerrado – Rede de comercialização solidária de agricultores, familiares extrativistas do cerrado, localizada na cidade de Goiânia – Goiás. A rede centraliza o recebimento da fava colhidos pelos extrativistas de diversas regiões do cerrado, o que torna impossível definir o local de coleta dos frutos.
4.2. MICRORGANISMOS
Neste trabalho duas linhagens fúngicas foram utilizadas nos experimentos. A primeira delas foi a linhagem 5J isolada e identificada morfologicamente como Aspergillus niger em trabalho anterior (DA SILVA, 2016). A segunda linhagem foi Aspergillus niger INCQS 40065, cedida pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Ambos os fungos foram preservados em areia estéril.
Todos os experimentos relacionados à produção de quercetina utilizando microrganismos a partir da fava d’anta foram realizados no Laboratório de Tecnologia Microbiana (LTM) da Universidade Federal Fluminense.
4.3. PREPARAÇÃO DE INÓCULO
O inóculo foi preparado utilizando meio ágar Sabouraud 4% Dextrose (Merck) (Figura 8). O meio foi preparado conforme orientação do fabricante descrita no rótulo da embalagem. Tubos com rosca foram preenchidos com cerca de 10 mililitros de meio e foram esterilizados em autoclave a 1 atm e durante 15 minutos. O meio foi deixado solidificar inclinado no tubo. Em capela de segurança biológica inocularam-se os fungos com o auxílio de alças estéreis. Em seguida os tubos foram incubados em estufa bacteriológica por 5 dias em temperatura de 30°C. Os conídios suspensos em uma solução de Tween 80 (Pró-quimios) (0,1% v/v) foram utilizados como inoculo.
4.4. CULTIVO NA FAVA D’ANTA
Nos experimentos foram utilizados Erlenmeyer de 250 mL, contendo cinco gramas de fava moída (90% abaixo de 0,60 mm de diâmetro) cada. Em seguida a fava foi esterilizada em autoclave a 1 atm e durante 15 minutos.
Para a produção de quercetina pelo fungo a partir da fava, o inóculo foi constituído dos conídios de A. niger 5J suspensos em Tween 80. Para a padronização do inóculo, os conídios foram contados em câmara de Neubauer, e o volume de suspensão necessário para inocular a fava com 5x105 conídios para cada grama de fava foi calculado. O volume
de inóculo calculado foi adicionado em cada Erlenmeyer contendo a fava moída e estéril, seguido de adição de 5 mL de água destilada e esterilizada.
O cultivo foi realizado em estufa bacteriológica por dez dias em uma temperatura de 30°C (Figura 9). Após esse tempo os produtos gerados foram extraídos e quantificados através de técnicas cromatográficas.
Figura 9: Aspergillus niger cultivado em fava d'anta. À esquerda a fava estéril. À direita a fava com o fungo crescido.
4.5. OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO
A partir do cultivo do fungo A. niger 5J sobre a fava, os produtos obtidos foram extraídos em condições de extração diferentes através de planejamento fatorial completo com dois níveis (2k). Nesse tipo de planejamento são analisadas as variáveis
experimentais que podem influenciar no processo e suas interações, a partir de ferramentas estatísticas. Dois parâmetros foram escolhidos para serem estudados: a razão volume de solvente: massa de fava e o tempo de extração. O domínio e o planejamento experimental estão apresentados nas Tabelas Tabela 3 e Tabela 4. Estes foram aplicados a três solventes: metanol (Vetec), etanol (Quimex) e isopropanol (Vetec). Desta forma, para cada solvente avaliado foram realizados sete experimentos: um para cada combinação de nível (22) e uma triplicata para o ponto central, totalizando vinte e um
experimentos. Como variável de resposta foi considerada a produção de quercetina (mg/g de fava). A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa Statistica® versão
13.2.1 da Statsoft.
Tabela 3: Domínio experimental do planejamento fatorial.
Parâmetros -1 0 +1
Tempo de extração (minutos) – x1 10 35 60
Razão volume de solvente:massa de fava (mL:g) – x2
3:1 5:1 7:1
Tabela 4: Planejamento experimental para a otimização da extração
Experimento Tempo de extração (minutos) Razão volume de solvente:massa de fava 1 +1 +1 2 +1 -1 3 -1 +1 4 -1 -1 5 0 0 6 0 0 7 0 0
As extrações foram realizadas em uma câmara de incubação com agitação (shaker) a uma velocidade de rotação de 250 rpm e temperatura ambiente. Para cada amostra foram realizadas duas extrações para maximizar a extração dos produtos.
Os extratos obtidos foram submetidos à centrifugação (Centrífuga Eppendorf 5804R) por 15 minutos com uma força centrífuga relativa de 2933 gravidades, para retirada de material particulado em suspensão (Figura 10). Por fim, os extratos foram secos em rotaevaporador e armazenados para análise quantitativa através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
Figura 10: Obtenção do extrato
4.6. LEVANTAMENTO DA CINÉTICA DE PRODUÇÃO
Foi realizado o levantamento cinético da produção de quercetina para as linhagens fúngicas A. niger 5J e A. niger INCQS 40065. O cultivo e produção de quercetina foi realizado conforme descrito no item 4.4, com exceção do inóculo que foi padronizado em 1x107 conídios/5 g de fava. A fermentação ocorreu durante dez dias, durante os quais
foram realizadas amostragens, em triplicata, no terceiro, no quinto, no sexto, no sétimo, no nono e no décimo dia. O produto gerado foi extraído de acordo com as melhores condições para a extração, que foram estabelecidas através de planejamento experimental.
As amostras foram analisadas qualitativamente através da técnica de cromatografia em camada fina (CCF).
4.7. MÉTODOS ANALÍTICOS
4.7.1. Análise por cromatografia em camada fina (CCF)
A fase móvel utilizada foi uma solução de acetato de etila (LS Chemicals), ácido acético glacial (Vetec), ácido fórmico (Vetec) e água destilada na proporção 100:11:11:26, conforme descrito em Wagner e Bladt (2009). Para revelar as placas foram preparadas duas soluções distintas. A primeira utilizada na revelação foi uma solução metanólica de ácido β-etilamino-difenilbórico (NP) (Fluka) em uma concentração de 1% p/v, seguida da aplicação de solução etanólica de polietilenoglicol 4000 (PEG) (Neon) em uma concentração de 5% p/v, utilizada para intensificar a cor gerada pelo primeiro revelador (WAGNER e BLADT, 2009).
Foram utilizadas placas de sílica gel (Merck) de 5 cm de altura por 5 cm de largura. Em cada placa foram aplicados os padrões de rutina (Farmos) e de quercetina (Sigma-Aldrich) dissolvidos em metanol, seguido das triplicatas das amostras das duas linhagens fúngicas avaliadas. A análise foi realizada para acompanhar a formação de quercetina durante o levantamento cinético. Por isso, para poder comparar a intensidade das bandas
formadas na CCF, cada amostra dissolvida em metanol foi avolumada para aproximadamente 50 mL, a fim de uniformizar as mesmas. Além disso, com o auxílio de uma seringa de cromatografia, a quantidade de cada amostra aplicada na placa foi igual a 1 µL.
Após cada corrida cromatográfica, as placas foram secas em temperatura ambiente e reveladas com NP e PEG respectivamente. Por fim, as placas foram visualizadas em câmara de luz Ultravioleta (UV) com comprimento de onda de 365 nm.
4.7.2. Análise por cromatrografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Para as análises relativas ao planejamento fatorial da extração dos produtos obtidos pela fermentação foram construídas curvas-padrão utilizando diluições de soluções-mãe de rutina (concentração de 1000 µg/mL) e quercetina (concentração de 500 µg/mL) de modo que fossem obtidas as concentrações apresentadas na Tabela 5. Todas as soluções foram preparadas em metanol grau HPLC (Merck). Cada um dos pontos da curva foi produzido em triplicata.
Tabela 5: Concentrações de rutina e quercetina da curva padrão do planejamento fatorial.
Ponto da curva Rutina (µg/mL) Quercetina (µg/mL)
1 2 2 2 5 3 3 10 5 4 20 10 5 30 15 6 40 20 7 50 25
Após a construção da curva padrão, foram preparadas as amostras para análise. Cada um dos extratos secos obtidos a partir de metanol foi dissolvido em metanol e avolumado para 100 mL. Em seguida eles foram diluídos na proporção 1:125, diluindo 80 µL da ressuspensão em 10 mL de metanol.
No caso dos extratos secos obtidos a partir de etanol, a ressuspensão foi realizada com 50 mL de metanol. Foram realizadas duas diluições: uma para quantificar a rutina presente no extrato e outra para quantificar a quercetina. Para a quantificação da rutina foi feita uma diluição de 1:10. Já para a quantificação da quercetina foi feita uma diluição de 1:200.
Por fim, os extratos secos obtidos a partir de isopropanol também foram ressuspendidos em 50 mL de metanol. Para quantificação de rutina foi feita uma diluição de 1:4. Já para a quantificação da quercetina foi feita uma diluição de 1:200.
Todas as amostras diluídas foram filtradas em filtro de politetrafluoroetileno com diâmetro de abertura de 0,45 μm. Para todas as diluições utilizou-se metanol grau HPLC.
Essa análise foi realizada em HPLC Shimadzu, com bomba LC 20AT, detector SPD-M20A DAD e coluna C-18 Shim-pack VP-ODS 4,6 mm X 25 cm e 5μm de diâmetro da partícula. O equipamento se encontra na Central analítica da Faculdade de farmácia da Universidade Federal Fluminense. Foi utilizada a metodologia utilizada por da Silva (2016), em que são empregadas duas soluções diferentes, A e B, como fase móvel através de bombeamento por gradiente seguindo a rampa de eluição ilustrada na Figura 11. A solução A consiste em uma solução 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético (Vetec) em água destilada. A solução B consiste em uma solução 0,1 (v/v) de ácido trifluoroacético em metanol grau HPLC. O solvente foi bombeado a uma vazão constante de 0,8 mL/min e foram injetados 20 µL de amostra em cada análise. As amostras foram detectadas no comprimento de onda de 350 nm.
Figura 11: Rampa do gradiente de eluição
50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 Fr aç ão v ol um ét ri ca d e m et an ol (% )
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1. OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO
Uma curva de calibração para a rutina e outra para a quercetina foram utilizadas para a determinação da concentração de rutina e quercetina, respectivamente, nas amostras dos extratos. Para as análises relativas ao planejamento fatorial da extração dos produtos obtidos pela fermentação foram construídas curvas-padrão utilizando diluições de soluções-mãe de rutina (concentração de 1000 µg/mL) e quercetina (concentração de 500µg/mL) de modo que fossem obtidas as concentrações apresentadas na Tabela 5. Todas as soluções foram preparadas em metanol grau HPLC (Merck). Cada um dos pontos da curva foi produzido em triplicata.
Os coeficientes angular e linear das retas foram calculados através de regressões lineares, com o auxílio do programa Excel® 2016. Todas as curvas de calibração
apresentaram boa linearidade, tendo um coeficiente de determinação maior que 0,99. As curvas apresentaram equação conforme exemplificado abaixo.
Equação 1: equação da reta padrão da rutina
𝑦 = 46596 ∗ x − 77536
Equação 2: equação da reta padrão de quercetina
y = 77189 ∗ x − 89851 Onde:
y = área sob o pico relativo ao analito; x = concentração do analito em µg/mL.
A análise das amostras dos extratos apresentou cromatogramas nos quais foi possível observar dois picos com tempos de retenção aproximados de 6 e de 11 minutos.
Esses tempos de retenção são correspondentes aos encontrados para rutina e quercetina, respectivamente, na curva padrão, conforme ilustrado nas Figura 12 e Figura 13.
Figura 12: Cromatograma do ponto 4 da curva padrão
Figura 13: Cromatograma do experimento 1 do metanol
Na Figura 14 estão representadas as concentrações de rutina e quercetina nos extratos obtidos com os solventes analisados. É interessante notar que em todos os experimentos o metanol foi o solvente mais eficaz em extrair a quercetina do meio sólido.
Figura 14: Massa de quercetina nos extratos. Legenda: 1: extração por 60 min e com relação solvente:fava 7:1; 2: extração por 60 min e com relação solvente:fava 3:1; 3: extração por 10 min e com relação solvente:fava 7:1; 4: extração por 10 min e com relação solvente:fava 3:1; 5, 6 e 7: extração por
35 min e com relação solvente:fava 5:1.
A melhor extração foi obtida no experimento 1, no qual tanto a razão solvente: fava quanto o tempo de extração foram os máximos. Observou-se que os dois experimentos com a razão solvente:fava máxima resultaram em maior extração. Isso pode ser explicado pela Lei de Fick, pois quanto maior o volume de solvente, mais facilitada a transferência do produto do meio sólido para o meio líquido, ou seja, quanto maior fosse a razão solvente:fava, maior será o gradiente de concentrações dos produtos (WELTY et al., 2008)3. A melhor extração com o aumento da razão solvente:sólido foi observada
também na extração de flavonoides de folhas de oliveiras e de resíduos de vinícolas (LAKFA et al., 2013; LAKFA et al., 2007). Além disso, promover o contato entre o meio fermentado e o solvente por um maior período de tempo também pode favorecer o fenômeno de transporte de massa. De fato, comparando os experimentos 1 e 3, com razão solvente:fava máxima mas com o tempo no máximo e no mínimo, respectivamente e os experimentos 2 e 4 com razão solvente:fava mínima mas com o tempo no máximo e no
3 Lei de Fick: relaciona o fluxo molar difusivo de uma substância (JA) em um sistema com o
gradiente de concentração (∇CA) em um determinado volume de controle. Como a concentração inicial é
uma função inversamente proporcional ao volume, quanto maior for o volume, menor ela será e, consequentemente, maior será o fluxo difusivo.
𝐽 = −𝐷 ∗ ∇𝐶 46 29 39 19 31 30 32 35 14 28 19 22 24 27 27 5 13 6 13 15 19 0 10 20 30 40 50 1 2 3 4 5 6 7 Q U E R C E T IN A ( m g/ g fa va ) EXPERIMENTO
mínimo, respectivamente, pode ser visto que um tempo maior leva a uma melhor extração.
O gráfico de Pareto resultante da análise estatística dos resultados com o metanol está apresentado na Figura 15. As variáveis cujos efeitos aparecem à direita da linha (p=0,05) são significativas. Foram verificadas como variáveis significativas a razão solvente:fava e o tempo de extração. Já a interação entre as duas variáveis não foi significativa.
Figura 15: Gráfico de Pareto para os resultados do metanol. Legenda: x1: tempo de extração; x2:
razão entre volume de solvente:massa de fava; x1x2: interação entre as duas variáveis.
Desta maneira foi possível observar que, no domínio estudado, os efeitos de cada variável foram positivos. Ou seja, à medida que os valores das variáveis aumentam, a massa de quercetina extraída aumenta. A equação gerada por esse modelo está representada abaixo (variáveis normalizadas) e apresentou um coeficiente de determinação de 0,96485.
Equação 3: Modelo para massa de quercetina extraída com metanol
𝑦 = 32,51 + 4,18 ∗ 𝑥 + 9,21 ∗ 𝑥 Onde:
y = produção de quercetina (mg/g de fava); x1 = variável tempo normalizada;
Vale ressaltar que a interação entre x1 e x2 não está presente nesse modelo, pois a
retirada da mesma não levou a uma redução expressiva no coeficiente de correlação e simplificou o modelo.
A análise de variância do modelo (ANOVA) está apresentada na Tabela 6. A partir dos dados foi calculado o F, que se mostrou maior do que o F crítico para um nível de confiança de 95%. Desta forma, pode-se concluir que o modelo se ajusta bem aos dados experimentais.
Tabela 6: Análise de variância para o metanol
SQ GL QM F P
x1 69,8290 1 69,8290 18,7501 0,01234
x2 339,0668 1 339,0668 91,0447 0,00067
Erro 14,8967 4 3,7242
Soma dos quadrados total 423,7925 6
F modelo 54,89
F crítico 6,94
Legenda:
SQ: soma dos quadrados; GL: graus de liberdade; QM: quadrado médio; F: fator de Fisher.
Pela análise estatística as melhores condições de extração são verificadas quando ambas as variáveis estão em seus níveis máximos, ou seja, tempo de extração de 60 minutos e razão solvente:fava igual a 7:1. Nessas condições a massa de quercetina extraída calculada pelo modelo é de 45,9 mg/ g de fava.
O gráfico de Pareto resultante da análise estatística dos resultados com o etanol está apresentado na Figura 16. Foi verificada como variável significativa apenas a razão volume de solvente:massa de fava. Já a interação entre as duas variáveis e o tempo de extração não foram significativos.
Figura 16: Gráfico de Pareto para os resultados do etanol. Legenda: x1: tempo de extração; x2:
razão entre volume de solvente:massa de fava; x1x2: interação entre as duas variáveis.
Deste modo foi possível observar que, no domínio estudado, o efeito da razão volume de solvente:massa de fava foi positivo. Ou seja, a massa de quercetina extraída é uma função diretamente proporcional à razão volume de solvente:massa de fava aplicada. A equação gerada por esse modelo está representada abaixo (variáveis normalizadas) e apresentou um coeficiente de determinação de 0,9494.
Equação 4: Modelo para massa de quercetina extraída com etanol.
𝑦 = 24,05 + 7,42 ∗ 𝑥 + 3,07 ∗ 𝑥 ∗ 𝑥 Onde:
y = produção de quercetina (mg/g de fava); x1 = variável tempo normalizada;
x2 = variável razão solvente:fava normalizada.
Vale ressaltar que a variável x1 não está presente nesse modelo, pois a retirada da
mesma não levou a uma redução expressiva no coeficiente de correlação e simplificou o modelo. Foi observado que ao se retirar essa variável do modelo a interação entre as variáveis se tornou significativa, conforme observado na Figura 17.
Figura 17: Gráfico de Pareto para os resultados do etanol excluindo a variável x1. Legenda: x1:
tempo de extração; x2: razão entre volume de solvente:massa de fava; x1x2: interação entre as duas
variáveis.
A análise de variância do modelo está apresentada na Tabela 7. A partir dos dados foi calculado o F, que se mostrou maior do que o F crítico para um nível de confiança de 95%. Desta forma, pode-se concluir que o modelo se ajusta bem aos dados experimentais.
Tabela 7: Análise de variância para o etanol.
SQ GL QM F P
x2 220,3429 1 220,3429 64,1518 0,00132
x1x2 37,7899 1 37,7899 11,0024 0,02946
Erro 13,7388 4 13,7388
Soma dos quadrados total 271,8716 6
F modelo 37,57
F crítico 6,94
Legenda:
SQ: soma dos quadrados; GL: graus de liberdade; QM: quadrado médio; F: fator de Fisher.
Pela análise estatística as melhores condições de extração são verificadas quando ambas as variáveis estão em seus níveis máximos, ou seja, tempo de extração de 60
