UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO

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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO

RELATÓRIO DE PÓS

-

DOUTORADO

P

ÓS

-D

OUTORADO

J

ÚNIOR

(PDJ)/CNP

Q

P

ROJETO

:

FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS EM POVOAMENTOS

FLORESTAIS EXÓTICOS E FRAGMENTOS DE MATAS NATIVAS

DO BIOMA PAMPA

Dr. Ricardo Bemfica Steffen

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SUMÁRIO

1 DADOS DO PROJETO ... 3 2 DADOS DO ESTÁGIO... 3 3 RESUMO... 5 4 INTRODUÇÃO... 6 5 OBJETIVOS... 10 6 ATIVIDADES REALIZADAS... 11

7 ATIVIDADES PREVISTAS x ATIVIDADES DESENVOLVIDAS... 20

8 PUBLICAÇÕES... 21

9 REFERÊNCIAS... 22

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1 DADOS DO PROJETO

Projeto: Fungos ectomicorrízicos em povoamentos florestais exóticos e fragmentos de matas nativas do bioma Pampa

Submetido ao: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), na modalidade de bolsa de Pós-doutorado Júnior (PDJ)

Processo: 155132/2010-5 Coordenadora do Projeto:

Prof. Dra. Zaida Inês Antoniolli – Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo/UFSM Instituição de Execução do Projeto:

Universidade Federal de Santa Maria - Centro de Ciências Rurais – Departamento de Solos Av. Roraima, 1000 – Bairro Camobi – Santa Maria/RS

(55) 3220-8108 CEP 97.105-900 Vigência inicial: Outubro de 2010 a setembro de 2011. Prorrogação concedida: Outubro de 2010 a setembro de 2011. 2. DADOS DO ESTÁGIO Período de realização De dezembro de 2010 asetembro de 2012.

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Dados do pós-doutorando Nome

Ricardo Bemfica Steffen Formação profissional

Engenheiro Agrônomo Solo (Universidade Federal de Santa Maria, 2004), Mestre em Ciência do Solo (Universidade Federal de Santa Maria, 2007) e Doutor em Ciência do Solo (Universidade Federal de Santa Maria, 2010).

E-mail: bemfica_steffen@yahoo.com.br Dados da orientadora

Nome

Zaida Inês Antoniolli Formação profissional

Bióloga (Ciências Biológicas, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, 1984), Especialista em Biotecnologia (Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1988), Mestre em Fitotecnia (Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1988), Doutora em Ecology of Mycorrhizal Molecular Aspects (University of Adelaide, 1999).

Atuação profissional atual

Professora Associada do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria. Endereço profissional

Laboratório de Microbiologia e Biologia do Solo e Ambiente, Sala 3310, Departamento de Solos, Centro de Ciências Rurais, Prédio 42. Avenida Roraima, número 1000, Cep: 97.105-900. Telefone: (55) 3220 8108.

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3 RESUMO

O Bioma Pampa é o mais desconhecido dos biomas brasileiros. Sua fisionomia e biodiversidade foram fortemente alteradas por pressões antrópicas e, frente à implantação de grandes áreas de monoculturas florestais, o bioma permanece suscetível. As ectomicorrízas encontram-se associadas às raízes de essências florestais e desempenham papel fundamental na absorção de água e nutrientes por estas plantas. Contudo, dados referentes à diversidade destes organismos no Pampa são extremamente escassos. Face ao exposto, torna-se urgente a necessidade de pesquisas ligadas ao conhecimento da biodiversidade e prospecção destes importantes recursos genéticos, os quais podem auxiliar na sua conservação e para o desenvolvimento sustentável do país, além de servirem como indicadores da qualidade ambiental. Este projeto de pós-doutoramento teve como objetivos: realizar uma revisão sobre o atual estado do conhecimento de fungos ectomicorrizicos, com especial ênfase aos de hábito hipógeo; avaliar a biodiversidade de fungos ectomicorrízicos ocorrentes em povoamentos de monoculturas florestais e fragmentos de matas nativas do Bioma Pampa, utilizando-se métodos morfológicos e moleculares; obter isolados que viabilizem a produção de inoculantes; e avaliar a compatibilidade de ectomicorrizas em espécies silviculturais exóticas e nativas por meio de técnicas de cultura de tecidos. Expedições foram realizadas em povoamentos homogêneos de espécies exóticas e em fragmentos de matas nativas do Bioma Pampa, onde foram coletados fungos (juntamente com o solo) os quais foram – e alguns estão sendo - identificados morfologicamente. Além disso, realizou-se a extração do DNA genômico destes fungos e a amplificação via reação em cadeia da polimerase da região do Espaço Interno Transcrito (ITS) do rDNA destes fungos. Estes produtos de PCR foram purificados e estão em fase de sequenciamento para a posterior comparação com dados do GenBank e construção de análises filogenéticas. Da mesma forma, procurou-se isolar os fungos coletados para posterior obtenção de inóculos. Os dados de pesquisa obtidos até o presente momento estão em fase final de análise, visando posteriores publicações em periódicos nacionais e internacionais.

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4 INTRODUÇÃO

O Bioma Pampa, compartilhado pelo Brasil, Argentina e Uruguai, distribui-se de forma predominante na maior parte do Rio Grande do Sul (64%), sendo sua ocorrência restrita a este único Estado. O Pampa tem sido submetido à forte ação antrópica, tendo como consequência a alteração significativa de sua fisionomia e biodiversidade. Poucas pesquisas contemplam a avaliação dos organismos existentes neste ambiente, o qual pode ser considerado como o menos conhecido dos biomas nacionais. Estudos nesse sentido podem contribuir com novas descobertas científicas, que auxiliariam em estratégias de conservação e na utilização de seres vivos de interesse no desenvolvimento científico e tecnológico.

Em diversos ambientes, observa-se a importância da presença de micorrizas no desenvolvimento das plantas e na manutenção da dinâmica de ecossistemas. Dos vários tipos de micorrizas existentes, as ectomicorrizas destacam-se em locais onde há presença de espécies lenhosas. Contudo, a presença destes fungos nos fragmentos de mata nativa e em povoamentos florestais exóticos ocorrentes no Bioma Pampa não é conhecida até o presente momento. Dados dessa natureza podem representar informações fundamentais para a sustentabilidade, para o conhecimento de organismos presentes e de novas espécies, como indicadores da qualidade ambiental e, adicionalmente, no isolamento e utilização biotecnológica destes fungos na indústria e na produção vegetal. No entanto, no tocante aos campos sulinos, as áreas de florestas nativas, não frequentemente características destes ecossistemas, encontram-se apenas como fragmentos esparsos, os quais necessitam de medidas urgentes de conservação. Em contrapartida, o uso de monoculturas florestais tem sido intensivo na região, como a descoberta de uma nova vocação econômica, porém, com estudos ainda em discussão sobre os possíveis impactos desta atividade sobre a região.

Frente a esta realidade, destaca-se a necessidade de catalogação e conhecimento da biodiversidade de fungos ectomicorrízicos do Pampa, o que pode ser realizado por meio de técnicas clássicas – como estudos morfológicos baseados em microscopia estereoscópica e ótica - e análises moleculares, as quais são, atualmente, essenciais frente ao grande desenvolvimento nesta área, contribuindo de forma significativa para a sistemática. Desta forma, pode-se também caracterizar espécies que estejam sobre forte pressão ambiental e em risco de extinção. Adicionalmente, é possível a aquisição de informações de grande relevância sobre a associação destes organismos com espécies florestais, exóticas ou nativas, que ocorrem de forma natural ou cultivada no Pampa. Esta caracterização também permitirá traçar comparativos entre a diversidade de ectomicorrizas em povoamentos florestais de

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monoculturas (Eucalyptus spp., Pinus spp., e Acacia spp.) em relação a diversidade de ectomicorrizas em fragmentos florestais nativos.

Outro fator de fundamental importância é a possibilidade de conhecimento destes novos recursos genéticos, possibilitando a prospecção de ectomicorrizas para uso em plantios florestais, por meio da produção de inóculos, contribuindo-se assim uma produção mais sustentável. Sabendo-se que estes organismos são específicos quanto a sua atuação mutualística, isolar e avaliar a sua especificidade e ação no desenvolvimento de mudas nativas e exóticas por meio do cultivo de tecidos pode contribuir para a descoberta de novos isolados e/ou espécies realmente compatíveis, que contribuirão para o desenvolvimento econômico de base florestal no país, sabendo-se da importância desta atividade. Conforme a Sociedade Brasileira de Silvicultura (SBS, 2007), o setor florestal possui participação em 3,5% do Produto Interno Bruto do país, o que equivale a US$ 37,3 bilhões, gerando 4,33 milhões de empregos em florestas plantadas e 2,58 milhões de empregos em florestas nativas.

4.1 O Bioma Pampa

De acordo com dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2004), o Bioma Pampa, também conhecido como campos sulinos, abrange aproximadamente 176 km2, o que equivale a 64% do território gaúcho e a 2,07% do território do País. Este bioma caracteriza-se por seu relevo ondulado contendo suaves elevações (SUERTEGARAY, 1998), onde predomina a vegetação formada por campos - compostos principalmente por gramíneas e plantas herbáceas – e, ocasionalmente, a presença de fragmentos florestais, arbustos e árvores (CARVALHO; BATELLO, 2009). Atualmente, são criadas na região em torno de 13 milhões de cabeças de gado e cinco milhões de ovelhas, as quais utilizam a pastagem da região (95%) como fonte de forragem.

Embora bastante antropizado, os poucos estudos realizados no Pampa mostram a existência de uma biodiversidade bastante significativa. BOLDRINI (1997) estimou a existência de aproximadamente três mil espécies de gramíneas, dados que, segundo OVERBECH et al. (2007) devem estar subestimados. Ademais, o Bioma Pampa serve de habitat para 385 espécies de pássaros e cerca de 90 espécies de mamíferos terrestres (BILENCA; MIÑARRO, 2004). Apesar de haver preocupação com relação ao tema da biodiversidade, o foco das atenções tem se voltado predominantemente para os recursos animais e vegetais, sendo menor atenção dispensada à porção menos evidente, porém não menos importante, que são os microrganismos do solo. Ao nosso conhecimento, são escassos

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os trabalhos sobre a biodiversidade de fungos micorrízicos no Bioma Pampa. Estes dados remetem a necessidade de urgentes discussões e pesquisas, buscando auxiliar na sua conservação e no seu desenvolvimento econômico.

Face ao exposto, o estudo de ectomicorrizas associadas aos ambientes florestais exóticos e nativos do Bioma Pampa, auxiliará significativamente para o melhor conhecimento da biodiversidade destes organismos, corroborando com as necessidades de conservação ambiental. Outrossim, conhecimentos importantes também podem ser gerados em termos de avaliação da variabilidade genética destes fungos e da utilização destes recursos na bioprospecção, tendo em vista seu importante papel na utilização biotecnológica.

4.2 Fungos ectomicorrízicos (fECM)

As micorrizas são associações mutualísticas entre fungos e as raízes das plantas (BRUNDRETT et al., 1996), sendo que estas associações simbióticas são abundantes, ocorrendo em 75 a 80% das plantas (SMITH; READ, 1997). Embora as micorrizas arbusculares e as ectomicorrizas sejam de maior importância econômica e também as mais conhecidas, Brundrett et al. (1996) relataram sete tipos de associações micorrízicas conhecidas: a) micorrizas arbúsculo-vesiculares (MAV) – também chamadas de micorrizas arbusculares (MA); b) ectomicorrizas (ECM); c) ectendomicorrizas; d) orquidóides; e) ericóides; f) monotropóides; e g) arbutóides.

Os fungos ectomicorrízicos são muito importantes nos ecossistemas, pois sua associação mutualística com plantas de diferentes espécies auxilia na absorção de nutrientes, água e na proteção da planta hospedeira em relação aos patógenos e estresses abióticos (SMITH; READ, 1997). Nos ecossistemas florestais, o papel das ectomicorrízas é ainda mais pronunciado, atuando fortemente nos ciclos biogeoquímicos, na dinâmica das comunidades vegetais e na manutenção da estrutura do solo (RILLIG; MUMMEY, 2006; MORRIS et al., 2009).

Com aproximadamente 5000 espécies envolvidas em associações simbióticas com plantas superiores, as ectomicorrizas, além de proporcionarem benefícios ao desenvolvimento vegetal, atuam na estabilização de florestas naturais e cultivadas, servindo como fonte de alimento e participando da ciclagem de nutrientes em florestas temperadas e tropicais (TAYLOR, 1991; HOBBIE, 2006).

Os fungos ectomicorrízicos (fECM), embora se associem com um grupo restrito de plantas (aproximadamente 5% das espécies conhecidas), são encontrados formando simbiose

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com 90% das espécies arbóreas de clima temperado, principalmente com as pertencentes às famílias Pinaceae (95%), Fagaceae (94%), Betulaceae (70%) e Salicaceae (83%) (OLIVEIRA; GIACHINI, 1999; MOLINA et al., 2005).

Há indícios de que estes microrganismos contribuíram para a extensão de florestas para áreas ambientalmente degradadas. Segundo Brunner (2001), o estabelecimento de mudas florestais em solos deficientes em nutrientes ou contaminados pela deposição de certos poluentes se torna possível devido à simbiose destas plantas com fECM.

Em solos que apresentam limitações quanto a sua fertilidade, a inoculação de fECM promove aumento na sobrevivência das plantas após o transplante (SILVA et al., 2003; MELLO et al., 2006).

A maioria, os fungos ectomicorrízicos pertencem à classe Basidiomycota, como os gêneros: Amanita, Hebeloma, Hysterangium, Laccaria, Lactarius, Rhizopogon, Russula, Scleroderma, Suillus, Tricholoma entre outros (VELLINGA et al., 2009). Têm sido considerada extremamente favorável a associação destes fungos às espécies florestais cultivadas como o Pinus spp., Eucalyptus spp. e a Acacia spp. Porém, não há relato no que se refere às espécies ocorrentes no Bioma Pampa, o qual está inserido em um contexto de produção silvícola, além da escassez de conhecimento sobre associações entre ectomicorrizas e espécies florestais nativas, onde não são conhecidos, a priori, dados para o bioma em questão. Conforme citam NARA e HOGETSU (2004), o papel das ectomicorrizas é fundamental na recuperação de áreas impactadas ambientalmente, como é o caso do Pampa, que possui a predominância de solos arenosos, de grande susceptibilidade à ação humana. Ademais, sabendo-se da alta especificidade apresentada por ectomicorrizas, pode-se obter isolados de interesse para a produção florestal brasileira por meio de testes neste sentido.

Nos campos sulinos, estudos morfológicos de ectomicorrizas caracterizam resultados muito importantes no conhecimento da biodiversidade de espécies. Porém, nos dias atuais, o uso da biologia molecular é indispensável, como pode ser observado nos trabalhos de Gomes et al. (2002); Tedersoo et al. (2007); Morris et al. (2009), entre outros. Dentre as diversas ferramentas moleculares disponíveis, tem sido consenso o uso daquelas baseadas no sequenciamento do espaço interno transcrito (internal transcribed spacer – ITS) do rDNA de fungos, auxiliando na caracterização da espécie e na construção de estudos filogenéticos.

A região ITS é composta por regiões não codificantes localizadas entre regiões altamente conservadas do rDNA responsáveis pela codificação da subunidade menor e maior dos ribossomos (BRIDGE; ARORA, 1998). São de fácil amplificação, possuem natureza

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multicópia e permitem a diferenciação entre espécies. Além disso, em estudos de código de barras (barcode) de fungos, a região ITS tem sido escolhida como prioritária.

5 OBJETIVOS 5.1 Objetivo geral

Caracterizar a biodiversidade de fungos ectomicorrízicos ocorrentes em povoamentos de monoculturas florestais e fragmentos de matas nativas do Bioma Pampa por meio de métodos morfológicos e moleculares, bem como obter isolados que viabilizem a produção de inoculante e estudar a compatibilidade de ectomicorrizas em espécies silviculturais exóticas e nativas por meio da cultura de tecidos, contribuindo para o conhecimento da biodiversidade e utilização dos fungos micorrízicos do Bioma Pampa.

5.2 Objetivos específicos

• coletar fungos ectomicorrízicos associados a monoculturas florestais cultivadas e à matas nativas do Bioma Pampa;

• identificar as espécies de fungos ectomicorrízicos coletadas;

• comparar a diversidade de ectomicorrizas presentes em solos com florestas nativas e solos onde há presença de monocultivos florestais;

• determinar a compatibilidade entre isolados de fungos ectomicorrízicos e espécies florestais exóticas e nativas, por meio do cultivo “in vitro”;

• capacitar recursos humanos para o desenvolvimento de pesquisas na área, abrangendo o estudo de ectomicorrizas, biologia molecular e cultura de tecidos; treinando estudantes de graduação, pós-graduação e um profissional em pós-doutoramento.

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6 ATIVIDADES REALIZADAS

6.1 Coletas realizadas no Bioma Pampa e entorno

Com base na abrangência do bioma Pampa, realizaram-se incursões para os municípios gaúchos de Alegrete, Barra do Quarai, Bororé, Rosário do Sul, Dilermano de Aguiar, São Pedro do Sul, São Borja, Bororé, Cacequi, São Gabriel, Santiago, São Sepé, Caçapava do Sul, Lavras do Sul, São Vicente do Sul, Itaqui, Maçambará, Unistalda, Santa Margarida do Sul, Bagé, Pelotas, Santana da Boa Vista, Santana do Livramento, Dom Pedrito, Candiota, Hulha Negra, Cerrito, Uruguaiana, Jaguari e Nova Esperança do Sul (Figura 1). Estes dois últimos municípios estão em área de transição e, por esta razão, foram incluídos, levando-se em consideração a importância e a grande biodiversidade, característica de regiões ecotonais. Registros das coletas podem ser observados na Figura 2.

1- Santa Maria 2- Alegrete 3- Barra do Quaraí 4- Bororé 5- Rosário do Sul 6- Dilermando de Aguiar 7- São Pedro do Sul 8- São Borja 9- Cacequi 10- São Gabriel 11- Santiago 12- São Sepé 13- Caçapava do Sul 14- Lavras do Sul 15- São Vicente do Sul 16- Itaqui

17- Maçambará 18- Unistalda

19- Santa Margarida do Sul 20- Bagé

21- Pelotas

22- Santana da Boa Vista 23- Candiota

24- Hulha Negra 25- Uruguaiana 26- Cerrito 27- Jaguarí

28- Nova Esperança do Sul 29- Santana do Livramento 30- Dom Pedrito

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Figura 2. Viagens prospectivas realizadas pelo grupo de pesquisas onde foram realizadas coletas nas áreas do Bioma Pampa (A), em diferentes ecossistemas (B), coletando-se diversos gêneros de fungos ectomicorrízicos (C e D).

6.2 Análises morfológicas

Para coletar os fECMs, realizaram-se incursões tanto em áreas de fragmentos florestais nativos (de forma geral compostos por capões) como em áreas com povoamentos de monoculturas florestais. Antecedendo a retirada dos basidiomas de seu local de origem, os espécimes foram fotografados e realizou-se o registro de dados como: data, local de coleta, coordenadas geográficas, coletor e característica das estruruturas reprodutivas (coloração, consistência, inserção no solo, forma e mensurações). Os fungos foram removidos cuidadosamente, sendo preservadas uma porção do solo onde estavam inseridos e a vegetação circundante. O material foi numerado e acondicionado em sacos de papel para o transporte até o Laboratório de Biologia do Solo e do Ambiente, do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria, onde, posteriormente, foi identificado (Tabela 1, Figura 3).

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Figura 3. Fungos ectomicorrízicos Lactarius deliciosus (A), Russula sp. (B), Suillus luteus (C),

Russula sp. (D), Suillus sp. (E), Scleroderma sp. (F) e gêneros de fungos não identificados (G e H)

coletados em fragmentos de Pinus elliotti em municípios do Rio Grande do Sul localizados no Bioma Pampa.

Na maior parte das coletas realizadas em matas nativas não foram encontrados exemplares de fungos ectomicorrízicos. Assim, optou-se por incluir a coleta de amostras de solo contendo raízes de espécies arbóreas dos fragmentos florestais visitados. O objetivo destas coletas foi observar a presença de associações micorrízicas nas raízes das árvores, a qual se evidencia pela presença de morfotipos característicos.

Amostras do solo de aproximadamente 50 cm3 foram retiradas e armazenadas em sacos plásticos com acréscimo de água destilada, objetivando-se manter a umidade por 24 h. Posteriormente, o material foi peneirado deixando-se apenas as raízes presentes. Com o auxílio de microscópio estereoscópico, procurou-se evidenciar a presença de morfotipos, bem como de manto fúngico nas raízes.

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No laboratório, as raízes presentes no solo coletado juntamente com os fungos foram peneiradas e passaram por uma sequência de lavagens. Em seguida, receberam um número de identificação e foram mantidas em solução de etanol a 70%. Posteriormente, procuraram-se evidências da ocorrência de associações das raízes com hifas dos fungos coletados, utilizando-se, para esta finalidade, microscópios estereoscópico e óptico (Figura 4).

Já para os basidiomas coletados, parte do material foi desidratada em estufa, mantendo-se os mesmos a 50° C até atingirem massa constante (entre dois e sete dias, dependendo do tamanho do fungo). Posteriormente, foram mantidos em sacos de papel e caixas de papelão cuidadosamente armazenadas para manter o acervo herborizado. A descrição dos basidiomas seguiu as metodologias usuais em micologia como, por exemplo, as chaves de classificação e guias específicos para grupos de fungos.

As análises macroscópicas foram efetuadas a olho desarmado, bem como com o auxílio de microscópio estereoscópico e equipamentos de mensuração como réguas e paquímetros. Também foi utilizada a visualização de estruturas menores, como esporos e hifas, em microscópio óptico, dispondo-se os cortes entre lâmina e lamínula, contendo solução de azul de metileno a 1%.

Para o isolamento, seguiu-se a metodologia proposta por Brundrett et al. (1996) onde, após desinfestação superficial dos basidiomas em etanol a 70%, estes foram partidos ao meio retirando-se, com o auxílio de pinças e alça de platina, parte do interior do contexto, a qual foi inoculada em meio de cultura MNM modificado (MARX, 1969). Todo este procedimento ocorreu em câmara de fluxo laminar asséptico. Após, este material foi mantido para crescimento em estufas com temperatura controlada de 25° C e com repicagens periódicas de acordo com o crescimento micelial (Figura 5).

Durante as diversas incursões realizadas em povoamentos florestais do bioma Pampa foi possível coletar 86 espécimes de fungos ectomicorrízicos. Apesar da dificuldade inicial de encontrar as estruturas reprodutivas desses fungos devido à escassez hídrica na região do Pampa entre novembro de 2010 e março de 2012, durante os meses de abril e julho de 2012 vários basidiomas foram coletados. Nas viagens realizadas nos meses mais secos foi encontrado pouco ou nenhum material.

Dos 85 fungos coletados, 65 foram identificados ao menos em nível de gênero baseado em características morfológicas macroscópicas, e dentre estes 15 já foram identificados em nível de espécie com métodos de biologia molecular. No entanto ainda não foi possível identificar 20 fungos, nem em nível de gênero, e estes aguardam para ser identificados por métodos moleculares (Tabela1).

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A maioria do material foi encontrada em povoamentos florestais exóticos (93%), como eucalipto, pinus e acácia (Tabela 1). Somente 7% do material foi coletado em mata nativa. O fato de não ter sido encontrados fungos ectomicorrízicos nestes locais não significa que estes organismos não estão presentes neste local. Eles podem produzir seus corpos de frutificação em outros períodos do ano, ou ainda, a cada 2, 3,.. 7 anos, por exemplo.

De todo material coletado somente 17 espécimes foram isolados e capazes de se desenvolver em meio de cultura. Esse resultado já era esperado, pois segundo a literatura muitos desses gêneros não são capazes de serem cultivados em condições artificiais.

Figura 4. Morfotipos coletados em fragmentos de mata nativa em diversos municípios do Bioma Pampa do Rio Grande do Sul.

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PM 01 Barra do Quaraí 30º 08’ 27,3”S 57º 22’ 42,3” W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex

PM 02 Barra do Quaraí 30º 08’27,3” S 57º 22’ 42,3” W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex

PM 04 São Borja 28º 41’ 31” S 55º 54’ 09,3” W Pisolithus arhizus Mata de eucalipto Ex

PM 05 Bororé 28º 55’ 22,2” S 56º 06’ 42,0” W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex

PM 07 Bororé 28º 55’ 22,2” S 56º 06’ 42,0” W Descomyces sp Mata de eucalipto Ex

PM 08 Bororé 28º 55’ 22,2” S 56º 06’ 42,0” W Descomyces sp Mata de eucalipto Ex

PM 10 Bororé 28º 55’ 22,2” S 56º 06’ 42,0” W Setchelliogaster ef. tenuipes Mata de eucalipto Ex

PM 11 Bororé 28º 55’ 22,2” S 56º 06’ 42,0” W Laccaria fraterna Mata de eucalipto Ex

PM 14 Jaguari 29º 22’ 44,7’’ S 54º 44’ 49,4’’W Scleroderma citrinun Camboim Nt

PM 15 Caçapava do Sul 30º 54’ 37,96’’ S 53º 25’ 22,7’’W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM 18 Dilermando de Aguiar 29º 46’ 23,1’’ S 54º 05’ 43,1’’ W Cortinarius sp Mata nativa mista Nt

PM 19 Rosário do Sul 30° 08’ 34’’ S 54° 50’ 5,3’’W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex

PM 20 Santiago 29° 10’ 17,8’’ S 54° 53’ 58,8’’ W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM 21 Nova Esperança do Sul 29° 15’ 47,1” S 54° 49’ 50” W Gyrodon rompelli Mata nativa mista Nt

PM 22 Nova Esperança do Sul 29° 15’ 47,1” S 54° 49’ 50” W Telephoraceae Mata nativa mista Nt

PM 23 Jaguari 29° 28’ 13” S 54° 42’ 13,6”W Scleroderma citrinun Camboim Nt

PM 24 Jaguari 29° 28’ 13” S 54° 42’ 13,6”W Geastrum sp Camboim Nt

PM 25 Santiago 29° 08’ 45,7” S 54° 53’ 10,9”W Lactarius deliciosus Mata de eucalipto Ex

PM 26 Caçapava do Sul 30° 30’ 12,8” S 53° 25,5’ 95”W Russula sp. Mata de pinus Ex

PM 27 Caçapava do Sul 30° 15’ 51,6” S 53° 31’ 19,5”W Suillus luteus Mata de pinus Ex

PM 28 São Sepé 30° 12’ 43” S 53° 30’ 52,1”W Suillus cf luteus Mata de pinus Ex

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CI1 Município Coordenadas Material coletado Local da coleta EF3

PM 30 São Sepé 30° 05’ 41,7” S 53° 37’ 30,1”W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex

PM 31 São Gabriel 30° 25’ 57,8” S 54° 22’ 05,3”W Suillus sp Mata de pinus Ex

PM 32 São Gabriel 30° 25’ 57,8” S 54° 22’ 05,3”W Lactarius deliciosus Mata de pinus Ex

PM 33 São Gabriel 30° 25’ 57,8” S 54° 22’ 05,3”W NI2 Mata de pinus Ex

PM 34 São Gabriel 30° 25’ 57,8” S 54° 22’ 05,3”W ordem Boletales (NI2) Mata de pinus Ex

PM 35 São Gabriel 30° 25’ 57,8” S 54° 22’ 05,3”W NI2 Mata de pinus Ex

PM 36 Dilermando de Aguiar 30° 12’ 10,2” S 54° 43’ 31,8”W Vascelum hyalinum Mata de acácia negra Ex

PM37 Rio Grande 32° 32’ 0,5” S 52° 31’ 43,4”W Rhizopogum sp. Pinus taeda Ex

PM38 Rio Grande 32° 36’ 23,5” S 52° 29’ 29,8”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM39 Caçapava do Sul 30° 45’ 50,9” S 53° 32’ 42,9”W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex

PM41 Caçapava do Sul 30° 45’ 50,9” S 53° 32’ 42,9”W Ramaria sp. Mata de eucalipto Ex

PM42 Caçapava do Sul 30° 45’ 50,9” S 53° 32’ 42,9”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM44 Caçapava do Sul 30° 45’ 50,9” S 53° 32’ 42,9”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM45 Bagé 31° 12’ 34,1” S 53° 51’ 46,9”W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex

PM46 Bagé 31° 15’ 42,4” S 54° 08’ 29,9”W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex

PM47 Bagé 31° 15’ 54,7” S 54° 08’ 15,9”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM48 Hulha Negra 31° 25’ 22,7” S 53° 53’ 04,0”W Ramaria sp. Mata de eucalipto Ex

PM49 Hulha Negra 31° 25’ 22,7” S 53° 53’ 04,0”W Ramaria sp. Mata de eucalipto Ex

PM50 Hulha Negra 31° 25’ 22,7” S 53° 53’ 04,0”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM51 Hulha Negra 31° 25’ 22,7” S 53° 53’ 04,0”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM52 Bagé 31° 16’ 48,7” S 53° 54’ 39,4”W Pisolithus sp. Mata de acácia negra Ex

PM53 Bagé 31° 16’ 48,7” S 53° 54’ 39,4”W NI2 Mata de acácia negra Ex

PM55 Rosário do Sul 30° 19’ 52,7” S 55° 00’ 14,5”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM56 Rosário do Sul 30° 19’ 52,7” S 55° 00’ 14,5”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM57 Rosário do Sul 30° 19’ 52,7” S 55° 00’ 14,5”W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex

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1_{Código de identificação;}2_{NI (não identificado);}3_{EF (espécie florestal), Ex (Exótica), Nt (nativa);}4_{Plantação sobre rejeito de mineração de}

carvão.

CI1 Município Coordenadas Material coletado Local da coleta EF3

PM60 Santana do Livramento 30° 51’ 04,6” S 54° 58’ 58,5”W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex

PM61 Santana do Livramento 30° 51’ 04,6” S 54° 58’ 58,5”W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex

PM62 Santana do Livramento 30° 51’ 04,6” S 54° 58’ 58,5”W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex

PM63 Santana do Livramento 30° 50’ 44,6” S 55° 27’ 29,1”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM64 Santana do Livramento 30° 50’ 44,6” S 55° 27’ 29,1”W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex

PM67 Santana do Livramento 30° 50’ 44,6” S 55° 27’ 29,1”W Ramaria flavo – brunessis (cf) Mata de eucalipto Ex

PM70 Santana do Livramento 30° 50’ 44,6” S 55° 27’ 29,1”W Pisolithus arhizus Mata de eucalipto Ex

PM71 Santana do Livramento 30° 50’ 44,6” S 55° 27’ 29,1”W Amanita “pruiti”i Mata de eucalipto Ex

PM72 Candiota 31° 34’ 36,1” S 53° 43’ 54,3”W Pisolithus sp. Mata de Acácia negra Ex

PM73 Candiota 31° 34’ 36,1” S 53° 43’ 54,3”W Scleroderma sp. Mata de Acácia negra Ex

PM74 Candiota 31° 34’ 36,1” S 53° 43’ 54,3”W Scleroderma sp. Eucalipto e Acácia negra Ex

PM75 Candiota 31° 34’ 36,1” S 53° 43’ 54,3”W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex

PM76 Candiota 31° 33’ 50,1” S 54° 40’ 30,9”W Hysterangium Mata de eucalipto Ex

PM77 Candiota 31° 33’ 50,1” S 54° 40’ 30,9”W NI2 Mata de eucalipto Ex

PM78 Hulha negra 31° 25’ 0,7” S 53° 43’ 47,6”W Ramaria sp. Mata de eucalipto Ex

PM79 Hulha negra 31° 25’ 0,7” S 53° 43’ 47,6”W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex

PM80 Hulha negra 31° 25’ 0,7” S 53° 43’ 47,6”W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex

PM82 Candiota 31° 33’ 50,1” S 54° 40” 30,9”W Descomyces sp. Mato de eucalipto Ex

PM83 Candiota 31° 33’ 50,1” S 54° 40” 30,9”W Scleroderma sp. Mato de eucalipto Ex

PM84 Cerrito 31° 48’ 25,9” S 52° 49’ 58,5”W Scleroderma sp. Mato de eucalipto Ex

(19)

Figura 5. Diferentes isolados do fungo ectomicorrízico Pisolithus spp., coletados em diversos municípios do Bioma Pampa do Rio Grande do Sul.

6.3 Análises moleculares

Durante as viagens prospectivas, parte das estruturas reprodutivas (basidiomas) coletadas foi mantida em tubos de precipitação para microcentrífuga contendo 1 mL do detergente catiônico CTAB (cloreto de cetiltrimetilamônio) a 2%. Posteriormente, este material foi congelado, sendo mantido a – 20°C. Parte do material também foi armazenada em tubos de precipitação para microcentrífuga contendo sílica gel, o que confere uma forma alternativa de armazenagem. O material em sílica gel permaneceu em temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC). Todo o material foi armazenado em, no mínimo, duas replicatas. Já para os morfotipos coletados (após análise das raízes presentes no solo), utilizou-se o armazenamento em tubos de precipitação para microcentrífuga contendo água ultrapura. Este material foi congelado e mantido em freezer a – 20°C. As extrações de DNA dos basidiomas, bem como a amplificação via PCR da região ITS do rDNA já foram efetuadas. As extrações dos morfotipos estão em andamento, procurando-se fazer adequações aos protocolos.

Para a extração de DNA genômico utilizou-se o kit de extração DNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen), seguindo-se as instruções de uso do fabricante. O tecido fúngico foi retirado do CTAB e seccionado em porções de aproximadamente 20 mg. A reação em cadeia da polimerase (PCR) seguiu o protocolo descrito por Lupatini et al. (2008) com modificações. A reação foi realizada em um volume total de 25 µL, tendo como componentes: 10 ng de DNA template, 25 pmoles de cada oligonucleotídeo iniciador (ITS 1 e ITS 4), 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM do tampão de reação, 2 mM de MgCl2, 2,5 µM de cada um dos dNTPs (dGTP, dCTP, dATP, dTTP) e 1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen®). Para a amplificação da região do espaço interno transcrito (ITS) do rDNA foram empregados os oligonucleotídeos iniciadores ITS 1 (5’ TTC CGT AGG TGA ACC TGC GG 3’) e ITS 4 (5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’) descritos por WHITE et al. (1990). As reações de

(20)

amplificação foram efetuadas por meio de uma desnaturação inicial a 94° C por 2 minutos, seguida por 35 ciclos que consistiram de: desnaturação a 94° C por 1 minuto, anelamento a 55° C por 1 minuto, e extensão a 72° C por 1 minuto e 30 segundos. Por fim, realizou-se uma extensão final a 72° C por 10 minutos.

Posteriormente à amplificação, realizou-se a eletroforese dos produtos de PCR em gel de agarose a 1,5%. A eletroforese foi conduzida em cuba horizontal contendo o gel submerso em tampão TBE 1X (90 mM Tris-borato, 2 mM EDTA, pH 8,0). Para corar as bandas de DNA e visualizá-las em transluminador, foi realizada a adição de 10 mg mL-1 de brometo de etídeo, sendo o registro fotográfico efetuado com o uso do aparato Cânon Snot S2IS.

Para purificação dos produtos de PCR utilizou-se protocolo baseado no uso de PEG 8000 a 13% descrito por DUNN e BLATTNER (1987). Adicionou-se um volume de solução de PEG 8000 (PEG a 13%, NaCl a 1,6M) homogeneizando-se cuidadosamente com o auxílio de micropipeta. Este material permaneceu nesta condição overnight. Posteriormente, o material foi centrifugado por 15 minutos a 13.000 rpm. Descartou-se a solução de PEG e o material passou por uma etapa de limpeza com a adição de 200 µL de etanol a 70%, seguido de uma centrifugação por 10 minutos a 13.000 rpm. O procedimento de limpeza foi repetido por três vezes. Por fim, os pellets foram secos à temperatura ambiente com posterior eluição em 8 µL de água ultrapura, conforme propõe SAMBROOK et al. (1989).

O material foi enviado para sequenciamento onde foram utlizados os oligonucleotídeos iniciadores ITS 1 e ITS 4. O sequenciamento foi realizado no sequenciador Mega BACE 5000 (Amersham Bioscience), seguindo-se o protocolo fornecido pelo fabricante. Com as sequências analisadas obteve-se a sequência concenso, com auxílio do programa STADEN (STADEN et al. 1992-2000), assim como o alinhamento de sequências por meio do algoritmo ClustalW. As sequências do GenBank foram escolhidas utilizando-se o Algoritmo Megablast, disponível na plataforma BLAST do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e as análises filogenéticas foram realizadas com auxílio do programa MEGA (TAMURA et al., 2006). O andamento das análises moleculares dos isolados está apresentado no quadro 1.

Na figura 6 é apresentado o gel obtido após a eletrofores do produto da PCR realizada com os primers da região ITS. Durante a realização das análises foi decidido incluir também um par de primers para amplificar a região 18S e posteriormente sequenciá-la, uma vez que esse dado auxilia na identificação dos fungos.

(21)

Figura 6. Eletrofores dos produtos de PCR obtidos a partir do uso de primers que flanqueiam a região ITS do rDNA. A primeira coluna evidencia o padrão 100 pb, onde foram destacados os fragmentos de 850 e 650 pb. Observam-se as bandas formadas a partir da amplificação dos fungos onde as letras “PM”, seguida de diferentes números, representa o registro de coleta e “C-“ o controle negativo.

De maneira geral foi possível amplificar a região ITS da maioria dos fungos coletados. Parte das sequencias já foi analisada e os resultados estão apresentados na tabela 2. É importante salientar que apenas uma fração dos resultados estão apresentados neste relalatório, já que muitas sequencias ainda estão sendo analisadas.

Tabela 2. Espécies de fungos ectomicorrízicos com a identificação baseada na sequencia ITS.

Amostra Espécie mais próxima N° acesso* Similaridade

PM01 Scleroderma bovista HM237175 99%

PM10 Setchelliogaster tenuipes AF325624 99%

PM12 Scleroderma bovista HM237175 99% PM13 Scleroderma aurantium HM237174 99% PM14 Scleroderma bovista HM237175 99% PM42 Scleroderma aurantium HM237174 99% PM46 Scleroderma bovista HM237175 99% PM55 Scleroderma bovista HM237175 99% PM71 Amanita sp “prutitii” HQ625011 99%

PM72 Pisolithus tinctorius AF374700 99%

PM73 Scleroderma polyrhizum EU718123 100%

PM74 Scleroderma polyrhizum EU718123 100%

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Quadro 1. Andamento das análises moleculares realizadas nos isolados ectomicorrízicos coletados.

PCR Purificação Sequenciamento

CI1 Extração

DNA MF2 _{DNA MC}Extração 2 _18S _ITS _18S _ITS _18S _ITS

PM 01 PM 02 PM 03 PM 04 PM 05 PM 06 PM 07 PM 08 PM 09 PM 10 PM 11 PM 12 PM 13 PM 14 PM 15 PM 16 PM 17 PM 18 PM 19 PM 20 PM 21 PM 22 PM 23 PM 24 PM 25 PM 26 PM 27 PM 28 PM 29 PM 30 PM 31 PM 32 PM 33 PM 34 PM 35 PM 36 PM 37

Lacunas sombreadas indicam tarefas já realizadas; 1_{Código de identificação;}

2_{Micélio fresco;} 3_{Meio de cultura.}

(23)

Quadro 1. Continuação ... PM 38 PM 39 239 PM 40 30 PM 41 PM 42 PM 43 PM 44 PM 45 PM 46 PM 47 PM 48 PM 49 239 PM 50 30 PM 51 PM 52 PM 53 PM 54 PM 55 PM 56 PM 57 PM 58 PM 59 239 PM 60 30 PM 61 PM 62 PM 63 PM 64 PM 65 PM 66 PM 67 PM 68 PM 69 239 PM 70 30 PM 71 PM 72 PM 73 PM 74 PM 75 PM 76 PM 77 PM 78 PM 79 239

(24)

Quadro 1. Continuação ... PM 80 30 PM 81 PM 82 PM 83 PM 84 PM 85 PM 86

6.5 Análises de compatibilidade in vitro

As espécies nativas que estão sendo estudadas são: angico-vermelho (Parapiptadenia rígida (Benth) Brenan), canafístula (Peltophorum dubium (Spreng.) Taub.), grápia (Apuleia Ieiocarpa (Vogel) J.F. Macbr.), timbaúva (Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong) e sibipiruna (Caesalpinia peltophoroides (Benth)). As sementes foram doadas pelo Centro de Pesquisa de Recursos Florestais (FEPAGRO – FLORESTA), Santa Maria-RS.

Os isolados fúngicos obtidos neste trabalho foram cultivados em placa de Petri, em incubadora microbiológica a 28 ºC, em meio de cultura sólido MNM - Merlin Norkrans Modificado (MARX, 1969) durante 20 dias, sendo posteriormente repicados para erlenmeyer de 250 mL, contendo 60 mL do meio de cultura MNM sólido.

As sementes utilizadas foram esterilizadas pela imersão em hipoclorito de sódio 10% por 30 minutos e lavadas em água esterilizada, por três vezes consecutivas. Posteriormente, as sementes foram novamente esterilizadas, em álcool a 70 % por mais 30 minutos. As sementes de canafístula foram esterilizadas com hipoclorito de sódio 10% por 20 minutos e lavadas em água esterilizada, por três vezes consecutivas. Posteriormente, as sementes foram desinfetadas, em álcool 70% por 20 minutos. Após a esterilização em álcool 70%, as sementes foram lavadas novamente, em água esterilizada, por três vezes.

Para a germinação, as sementes previamente esterilizadas foram colocadas em placa de Petri em meio de germinação esterilizado em autoclave. O meio de germinação continha 500 M de CaSO4.2H2O, 3M de H3BO3, 7,5g de ágar e 2g de glicose por litro de água, com o pH ajustado para 5,7. Em seguida, as placas de Petri foram incubadas a 25 °C por 7 dias. Quando as sementes germinaram e atingiram a fase de plântula, foram transferidas para os erlenmeyers com capacidade de 250 mL, com 60 mL de meio MNM sólido. Após a

(25)

solidificação do meio, o frasco foi fechado com papel alumínio e plástico de PVC transparente, para esterilização em autoclave a 1 atm., durante 20 minutos. Após a autoclavagem, os erlenmeyers estavam prontos para a inoculação das plântulas com os fungos ectomicorrízicos.

Três discos de 10 mm de diâmetro foram transferidos para os erlenmeyer de 250mL contendo o meio MNM sólido. Esses erlenmeyer foram incubados em estufa a 28 ºC, durante 30 dias para o crescimento do micélio fúngico. Após a preparação das sementes, duas sementes pré-germinadas foram adicionadas em cada erlenmeyer. Os erlenmeyers foram mantidos em incubadora com fotoperíodo de 12 horas a 24±1 ºC, por período de 35 dias.

Durante a condução do experimento, realizou-se rodízio dos erlenmeyers, duas vezes por semana, atendendo às exigências do delineamento experimental, cujo objetivo foi eliminar possíveis diferenças quanto à incidência de luz, temperatura e sombreamento. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado.

Ao término do experimento, as plântulas das cinco espécies foram avaliadas quanto à formação de associação micorrízica com os isolados avaliados.

Nesta fase do trabalho, houve contratempos devido à constante adaptação de metodologias para condução dos ensaios, em função de contaminações oriundas da incubação das sementes florestais. De todas as espécies florestais avaliadas neste trabalho, observou-se apenas associação ectomicorrízica “in vitro” da grápia (Apuleia Ieiocarpa) e da canafístula (Peltophorum dubium) com o fungo Suillus luteus, e da espécie sibipiruna (Caesalpinia peltophoroides) com o fungo Pisolithus sp. Nestas espécies, após o período de incubação, observou-se a presença de rede de Hartig, o que evidencia a associação ectomicorrízica (Figura 7).

Figura 7. Cortes transversais de raízes de mudas de sibipiruna (Caesalpinia peltophoroides) inoculadas com o fECM Pisolithus sp. Aumento de 200x.

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marcadas em azul. 2010 2011 2012 ATIVIDADES N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O Revisão de literatura X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Coletas X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Identificação e acondicionamento do material X

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Caracterização morfológica X X X X X X X X X X X X X Extração de DNA X X X X X X X X X X X Amplificação via PCR X X X X X X X Sequenciamento X X X X X X X Isolamento de inóculos X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Análise de resultados parciais X X

X X X X X X X X X X X X X X X X

Análises de compatibilidade in vitro X X X X X X X X

X X X X X X X X X

Elaboração de artigos científicos X X X X X X X X X X

X X X

X X

Elaboração do relatório final X X X X

X X X

X X

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Artigos publicados

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Artigos aceitos para publicação

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STEFFEN, R. B.; STEFFEN, G. P. K.; ANTONIOLLI, Z. I.; JACQUES, R. J. S.; SANTOS, M. L.; BOGUSZ JUNIOR, S.; GODOY, H. T. Óleo essencial de eucalipto como bioestimulador do crescimento de fungos ectomicorrízicos in vitro. Ciência Florestal, 2012.

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