ESTUDO DA AVALIAÇÃO DO PLASMA ELÉTRICO NA ADERÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI EM SUPERFÍCIES DE AÇO INOX

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ESTUDO DA AVALIAÇÃO DO PLASMA ELÉTRICO NA ADERÊNCIA DE

ESCHERICHIA COLI

EM SUPERFÍCIES DE AÇO INOX

Santos GP

_{, Figueira FR}

_{, Doria ACOC}

_{, Lima JSB}

_{, Pessoa RS}

_{, Khouri S}

Shishima Hifumi, 12244-000, São José dos Campos, SP, gaby.prado_@hotmail.com

2 _{Universidade do Vale do Paraíba, Núcleo de Estudos Farmacêuticos e Biomédicos da Faculdade de}

Ciências da Saúde, Av. Shishima Hifumi, 2911, São José dos Campos, SP, soniak@univap.com

Resumo – Doenças transmitidas por alimentos são um problema de saúde pública mundial, uma vez

que a contaminação dos alimentos por micro-organismos, pode ocorrer durante o preparo do alimento, seja por meio do manipulador ou da superfície onde está sendo processado. Por esse motivo, é recomendado pela ANVISA que os materiais usados na cozinha sejam livres de porosidades e fissuras, por isso, muitas vezes as bancadas, superfícies e equipamentos são feitas de aço inoxidável (aço inox). Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a aderência da cepa de Escherichia coli (ATCC 10799) e o efeito do plasma elétrico de Argônio, Argônio e Vapor d’agua e Ozônio Portátil, na esterilização deste micro-organismo na superfície. As placas de aço inox AISI 304 foram contaminadas com inóculo de cepa de E. coli e o tratamento com os plasmas elétricos foi realizado em diferentes tempos para avaliação de imagens no MEV e contagem de UFC/mL. Todos os tratamentos realizados com os plasmas elétricos apresentaram ótimos resultados, principalmente em argônio e vapor d’água, que obteve uma redução de 100% da E. coli aderidas no aço inox.

Palavras-chave:Descontaminação, Cozinha, Bactéria e Plasma Elétrico

Área do Conhecimento: Biomedicina Introdução

A intoxicação alimentar, também conhecida como doença transmitida pelos alimentos (DTA), é um problema mundial de saúde pública, causada pela ingestão de alimentos contaminados por fungos e/ou bactérias. Os sintomas mais comuns da doença são: náuseas, vômitos, dores abdominais, diarreia, febre, desidratação, entre outros. Em idosos, crianças, pessoas imunossuprimidas e mulheres grávidas, os sintomas podem ser mais graves, e, em alguns casos, levar o indivíduo a morte (ANVISA, 2005).

De acordo com a Cartilha sobre Boas Práticas para Serviços de Alimentação (Resolução RDC n° 216/2004), da ANVISA, as superfícies de uma cozinha que entram em contato com o alimento, sejam pias, mesas, bancadas, tábuas de corte, equipamentos, entre outros, devem ser mantidos em bom estado de conservação, sem fissuras e/ou rachaduras, e outros possíveis defeitos.

Por isso muitas vezes as bancadas, superfícies, equipamentos e pias são feitas de aço inoxidável (aço inox), pois quando esse material entra em contato com o alimento não transfere gosto ou odor, bem como é mais resistente a corrosão causada por produtos de limpeza utilizados com o propósito de descontaminação. E, principalmente, pelo fato que a superfície lisa do aço inox, dificulta a penetração de micro-organismos e o acúmulo de sujidade, dificultando a proliferação de bactérias e outros micro-organismos (MONTEIRO et al., 2004).

Os agentes químicos são formados principalmente pelos desinfetantes, que devem ter um efeito rápido, ação prolongada, amplo aspecto antimicrobiano, não produzir manchas, ser inodoro ou de odor agradável. Porém, não existe no mercado um produto que obedeça a todas essas especificações (TORTORA et al., 2010).

Caso o controle microbiano não seja realizado de forma eficaz, as bactérias vão se multiplicar, sendo que os agentes etiológicos bacterianos mais comuns em doenças alimentares são: Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella spp, Bacillus cereus e Clostridium perfringens. Com a ressalva de que os três primeiros são mais predominantes (BRASIL, 2010).

A Escherichia coli, micro-organismo de interesse nesse trabalho, é uma enterobactéria. A contaminação pode ocorrer principalmente pela lavagem incorreta das mãos, a qual pode contaminar os alimentos (MITTELSTAEDT, 2006). Esta bactéria é o principal micro-organismo de interesse em

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alimentos, dentro do grupo dos coliformes fecais ou também chamados de termotolerantes (micro-organismos que suportam temperaturas superiores a 45ºC).

O acúmulo de bactérias nas superfícies e equipamentos na cozinha pode dar origem ao biofilme, que é um agregado de bactérias aderidas por uma matriz de polissacarídeos, produzidos pela própria bactéria, essa “película” lhes confere proteção contra possíveis agressões como o uso de algum tipo de desinfetante. A maioria dos biofilmes formados são heterogêneos. (TORTORA et al.; KASNOWSKI et al., 2010).

Quando o material ou superfície passa por um processo de esterilização, o resultado que se espera é a inativação dos micro-organismos presentes. Novas tecnologias têm se mostrado eficazes na descontaminação e uma delas é a esterilização por plasma, a qual já oferece algumas vantagens em relação as outras técnicas, pois são efetivas em reduzir a carga microbiana e não utiliza gases tóxicos. (ROCHA, 2009).

O plasma, comumente conhecido como o quarto estado da matéria, é também definido como um gás com alto grau de ionização, isso por que contém uma mistura de elétrons livres. Um gás se transforma em plasma quando é adicionado calor ou outra fonte de energia, isso faz com que os átomos presentes liberem alguns ou todos os seus elétrons, tornando-se ionizados (com carga positiva), e os elétrons liberados tornam-se livres para se mover pelo gás, interagindo com outros átomos e elétrons. (GALVAO, 2006). O plasma elétrico é uma nova tecnologia, eficiente, limpa, que não prejudica o meio ambiente, não utiliza reagentes tóxicos, não produzindo então resíduos poluentes, sendo assim um processo de descontaminação de superfícies ecologicamente correto, dessa forma, pode vir a substituir processos de limpeza já existentes, como os agentes químicos e físicos (GARCIA et al., 2010).

Os micro-organismos que aderem à superfície ficam mais resistentes a ação de sanificantes e desinfetantes, por isso, novas pesquisas vem sendo realizadas para se encontrar uma nova forma de remover esse biofilme de forma a eliminar uma possível contaminação, a qual acarreta diversos problemas de saúde. Outro problema encontrado é a corrosão, visto que com o tempo os materiais usados em superfície, equipamentos, entre outros, ficam danificados pelo uso constante de produtos químicos para a limpeza (OLIVEIRA, 2010; CASALINI, 2008).

Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi padronizar e avaliar a aderência da cepa de Escherichia coli (ATCC 10799) em superfícies de aço inox e seu controle utilizando uma tecnologia limpa e com potencial antimicrobiano, o plasma elétrico de Argônio e Vapor d’agua, Argônio e Ozônio.

Metodologia

Numa primeira etapa da metodologia, foi recortada uma lâmina de aço inox AISI 304 nas seguintes dimensões 1cm X 1cm. Para preparo das amostras biológicas com a cepa padrão de Escherichia coli (ATCC 10799). As lâminas de aço inox foram lavadas com detergente enzimático e depois de secas foram esterilizadas em autoclave. O inóculo bacteriano foi preparado, de acordo com a escala de 0,5 de Mac Farland.

Nas lâminas de aço inox foi colocado 100 microlitros do inóculo, estas ficaram dentro do fluxo laminar durante um período de 2 horas para que secassem.

Em uma segunda etapa, após a preparação das amostras, essas foram levadas para obtenção de imagem no MEV (microscópio eletrônico de varredura).

O equipamento usado foi o Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) modelo EVO-MA10 da marca Zeiss. Antes de serem analisadas as amostras receberam um fino filme de ouro na metalizadora modelo KV550 da marca EmiTech, isso por que as amostras analisadas no MEV precisam ser condutoras de corrente elétrica.

Após obtenção das imagens controle no MEV, a etapa seguinte foi o preparo do inóculo na escala de 0,5 de Mac Farland para se avaliar a presença de células bacterianas em ágar Mac Conkey. Dessa forma, novamente 100 microlitros no inóculo foram depositados sobre a lâmina de aço inox, e esta deixada para secar dentro do fluxo laminar, porém, dessa vez, por um período menor de 1h30min. Após esse tempo, com auxilio de uma pipeta e 100 microlitros de salina, a amostra foi desprendida, com intenção de retirar as células bacterianas da placa de aço inox e ressuspender na salina, depois esses 100 microlitros foram semeados numa placa de ágar Mac Conkey com auxilio de uma alça de Drigalski descartável.

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Para o primeiro tratamento das amostras, o plasma elétrico utilizado foi de argônio e vapor d’água com um fluxo de 5 L/min, tensão aproximada de 660 Volts e altura de 1,5 cm; o segundo tratamento foi realizado com o plasma elétrico de argônio, com um fluxo de 5 L/min, tensão aproximada de 500 Volts e altura de 1,5 cm; e o terceiro tratamento das amostras foi realizado com o plasma de ozônio portátil da empresa IBRAMED, o equipamento é a caneta HF IBRAMED, regularmente registrado na ANVISA com o número 10360310020, por ser um aparelho que pode ser usado em diversas situações clínicas como: tratamentos faciais, podologia, estimulação da circulação sanguínea entre outros, o equipamento gera uma tensão alternada de alguns milhares de volts de baixa corrente, também foi aplicado numa altura de 1,5 cm em relação a amostra. Esses plasmas elétricos foram aplicados nas placas de aço inox contendo o inóculo em diferentes tempos (1, 3 e 5 minutos). Após o tratamento, as amostras foram levadas novamente para o MEV, com intenção de observar o efeito dos plasmas elétricos nas placas de aço inox contaminados com células bacterianas. Placas de aço inox tratados com os plasmas elétricos nesses diferentes tempos, também foram preparadas para fazer a contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/ml), onde foram desprendidas com 100 microlitros de salina e semeadas em ágar Mac Conkey, para avaliar se os efeitos dos plasmas elétricos, utilizados, influenciariam na quantidade de células viáveis.

Resultados

Os resultados, demonstrados por meio das imagens obtidas pelo MEV (Microscópio Eletrônico de Varredura) com um aumento de 10.000X, demonstram a adesão da cepa padrão de Escherichia coli (ATCC 10799) na superfície de aço inox. Foi realizado o controle positivo antes do tratamento com os plasmas elétricos (argônio e vapor d’água / argônio / ozônio portátil) e também imagens das placas após o tratamento em diferentes tempos (1, 3 e 5 minutos).

As imagens obtidas no MEV, com um aumento de 10.000X, demonstraram que, após à aplicação do plasma, as células bacterianas apresentaram alteração em sua estrutura celular.

Na determinação de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/ml), também foi feito o controle positivo, obtendo o número de colônias antes do tratamento das amostras, para realizar a porcentagem de redução após o tratamento em relação a contagem inicial. O plasma elétrico de argônio de vapor d’água se mostrou eficaz logo em 1 minuto de tratamento, ou seja, quando tratadas com o mínimo de tempo aplicado já não houve mais crescimento bacteriano quando desprendido na placa de ágar Mac Conkey. Entretanto, quando submetemos ao tratamento do plasma elétrico de argônio e ao plasma elétrico portátil de ozônio houve crescimento de E. coli com uma taxa de redução crescente, onde no tempo de tratamento de 5 minutos a taxa de redução foi de 100%, indicando descontaminação do material (Figura 1).

Figura 1 – A: Imagem obtida no MEV e placa de ágar Mac Conkey do controle positivo de E. coli ATCC 10799; B: Imagens obtidas no MEV com as amostras tratadas com plasma elétrico de argônio e vapor d’água, nos tempos de 1, 3 e 5 minutos, e placas de ágar Mac Conkey, onde não houve crescimento bacteriano após o tratamento; C: Imagens obtidas no MEV com as amostras tratadas com plasma elétrico de argônio, nos tempos de 1, 3 e 5 minutos, e placas de ágar Mac Conkey para avaliação de UFC/ml após tratamento; D: Imagens obtidas do MEV com amostras tratadas com plasma portátil de ozônio, nos tempos de 1, 3 e 5 minutos, e placas de ágar Mac Conkey para avaliação de UFC/ml após tratamento.

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Após o tratamento das amostras com os plasmas elétricos, foi realizada a porcentagem de redução para cada tempo de tratamento das células bacterianas em relação a contagem inicial obtida pelo controle positivo (Tabela 1).

Tabela 1 - Correlação dos resultados de UFC/mL com a porcentagem de redução para cada tratamento, nos diferentes tempos:

Discussão

Muitos são os motivos que estão levando ao desenvolvimento de novas pesquisas na área de microbiologia de alimentos, diversos produtos e novas tecnologias vêm trabalhando neste aspecto, cujo plasma elétrico é uma dessas novas tecnologias.

Para início do trabalho foi realizada a padronização do mesmo, buscando os melhores parâmetros para obtenção de bons resultados, tanto na contagem de UFC/ml para avaliação da porcentagem de redução após tratamento com os plasmas elétricos, bem como para obtenção de imagens de qualidade do MEV, nas quais se buscava avaliar como os tratamentos influenciavam as células bacterianas.

Segundo Araújo et al. (2010) a adesão de micro-organismo em superfícies ocorre naturalmente em meios aquosos, porém isso depende da tensão superficial, composição da superfície, membranas dos micro-organismos, disponibilidade de nutrientes, entre outros. A partir dos resultados obtidos, principalmente pelas imagens do MEV, pode-se dizer que a Escherichia coli tem poder de adesão em superfícies de aço inoxidável, dessa forma entende-se que mesmo o aço inox sendo o material mais indicado em superfícies de cozinha, por ser livre de fissuras e porosidades (MONTEIRO et al., 2004), ainda assim está sujeito a adesão de micro-organismos potencialmente patogênicos para a saúde. Isso leva a crer que se esse material estiver contaminado e não ocorrer a devida descontaminação o acúmulo de bactérias pode levar a formação de um biofilme, que se trata de um agregado bacteriano, dificultando cada vez mais o controle de descontaminação da superfície (TORTORA et al.; KASNOWSKI et al., 2010). Segundo Araújo et al. (2010), para um biofilme ser formado inclui várias etapas, porém a primeira delas, sendo assim um pré-requisito, é a capacidade de adesão bacteriana.

O propósito da aplicação do plasma elétrico na superfície de aço inox é que se ocorra uma desinfecção, que é a destruição ou redução dos micro-organismos presentes no material, isso faz com que a potencialidade infecciosa da superfície ou do local seja eliminada ou reduzida. A partir dos resultados obtidos com os plasmas elétricos aplicados na superfície, todos mostraram uma significativa taxa de redução, e, no caso do plasma elétrico de argônio e vapor d’água, a redução foi de 100%, porquanto todas as colônias foram eliminadas, visto que após o tratamento foi desprendida em ágar Mac Conkey. As células bacterianas perderam sua viabilidade em 1 minuto de tratamento, já nos outros plasmas aplicados a potencialidade bacteriana foi reduzida de forma bem eficaz (ROCHA, 2009).

O gás argônio possui um relativo baixo custo (COLOMBO et al., 2014), porém o tratamento de superfícies com plasma ainda não proporcionou muitas pesquisas no meio cientifico (OLIVEIRA et al., 2006), no estudo de Drake; Paul; Keller (1999) a pesquisa avaliou a colonização bacteriana de

Plasma Argônio Ozônio Portátil Argônio + Vapor _d’água

Controle + UFC/mL

E. coli ATCC 10799

817 817 817

Tempo de

Tratamento 1 min 3 min 5 min 1 min 3 min 5 min 1 min 3 min 5 min

E. coli ATCC 10799

UFC/mL Tratada 423 15 0 19 10 1 0 0 0

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Streptococcus sanguis em superfície de titânio puro, antes e após tratamento, com plasma de argônio por 5 minutos, ultravioleta por 15 minutos, óxido de etileno por 3 horas e autoclavagem por 20 minutos à 121ºC, onde notaram que houve diminuição do número de colônias quando a superficie foi submetida à luz utravioleta, óxido de etileno e ao plasma de argônio. Como no caso deste estudo, o plasma de argônio também se mostrou eficaz na porcentagem de redução do número de colônias de E. coli, pois em 5 minutos de tratamento houve uma redução total de 100% em relação a contagem inicial, indicando que talvez esse plasma posssa ser usado como agente descontaminante de muitas outras superficies.

No caso do tratamento de argônio e vapor d'água não há nenhum estudo realizado com esses gases em conjunto, dessa forma os resultados nos levam a crer que a eficácia do gás puro de argônio, como descrito acima, em conjunto com o vapor d'água, que é um agente físico de controle de micro-organismos, eficiente na esterilização e/ou desinfecção, comumente usado principalmente na autoclavagem (TORTORA et al., 2010), tenha amplificado o efeito do plasma na superfície. O vapor d'água age através de difusão para dentro da membrana celular, isso faz com que alterações químicas ocorram por hidrólise, danficando as células dos micro-organimos (MORIYA et al., 2008). Nesse tratamento as células bacterianas se tornaram inviáveis logo em 1 minuto de tratamento, havendo ausência total de micro-organismos na placa de ágar Mac Conkey.

O gás de ozônio já é muito usado em diversas áreas médicas por apresentar caracteristicas bacteriológicas bem significativa, como agente bactericida, bacteriostático, fungicida, entre outros. O ozônio apresenta caracteristicas variáveis dependendo do meio/superfície que é aplicado, isso por que a oxigenação, umidade, e temperatura influenciam no efeito da sua eficácia. Esse gás tem efeito de esterelização em muitos tipos de bactérias, inclusive em E. coli, por esse motivo existem muitas teorias que tentam explicar como o ozônio atua contra as bactérias, porém a mais aceita é pelo grande poder de oxidação que ele apresenta, atuando nas cadeias ácido-lipídicas da parede celular e fazendo com que as bactérias morram rapidamente (OLIVEIRA et al., 2009). O plasma portátil de ozônio apresentou resultados muito bons, indicando a eficiência do poder bactericida que o gás apresenta, pois reduziu uma grande quantidade de bactérias em relação a contagem inicial logo em 1 minuto de tratamento, sendo também um possivel agente promissor na descontaminação e/ou esterilização de superficies.

Conclusão

Após analises dos resultados, podemos concluir que a bactéria Escherichia coli apresenta capacidade de adesão ao aço inox, podendo dessa forma ser um passo inicial para a formação de biofilmes em superfícies utilizadas em cozinhas.

Os tratamentos realizados com os plasmas elétricos foram bastante eficazes, sendo o de melhor resultado o plasma composto de argônio e vapor d’água, o qual mostrou uma taxa de redução de 100%, agindo como bactericida e danificando os micro-organismos na superfície, como mostram as imagens obtidas no MEV. Isso indica que mesmo o aço inox sendo o material mais indicado em cozinhas, ainda assim, se não houver uma descontaminação eficaz, os micro-organismos podem se aderir e proliferar na superfície, sendo uma fonte de contaminação direta para os alimentos ali processados e podendo causar danos à saúde daqueles que consomem o alimento.

O plasma, por ser uma tecnologia limpa e não agredir o meio ambiente, pode ser um meio de descontaminação de superfícies muito útil, pois apresenta aspectos positivos em relação aos métodos convencionais, como ter amplo aspecto antimicrobiano, não produzir manchas, ser inodoro e ter efeito rápido.

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