CRISTINA MARIA DO NASCIMENTO
EFICÁCIA DA FOTOSSENSIBILIZAÇÃO LETAL DO
LASER 660nm ASSOCIADO A UM COMPOSTO
FENOTIAZÍNICO FRENTE AO Enterococcus faecalis
PRESENTE NOS CONDUTOS RADICULARES: estudo in
vitro
SALVADOR,: 12/2008
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________________ Profª. Dr. Aparecida Maria Cordeiro Marques – Orientadora – UFBA
__________________________________________________ Profª. Dr. Maria Cristina T. Cangussu - UFBA
__________________________________________________ Prof. Dr. Manoel Damião Souza Neto - USP
_____________________________________________________ Prof. Dr. Aldo Brugnera Junior – UNIVAP
_____________________________________________________ Profª. Dr. Mª Amélia G. Ribeiro - UNIT
CRISTINA MARIA DO NASCIMENTO
EFICÁCIA DA FOTOSSENSIBILIZAÇÃO LETAL COM
LASER 660nm ASSOCIADO A UM COMPOSTO
FENOTIAZÍNICO FRENTE AO MICRORGANISMO
Enterococcus faecalis PRESENTE NOS CONDUTOS
RADICULARES: estudo in vitro
.
Tese apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal da Paraíba e Universidade Federal da Bahia em cumprimento às exigências para obtenção do título de Doutor em Odontologia. Área de concentração: Laser em Odontológica.
Orientadores: Profª Dr. Aparecida Maria Cordeiro Marques Prof. Dr. Paulo Fernando Almeida
Salvador 2008
CRISTINA MARIA DO NASCIMENTO
EFICÁCIA DA FOTOSSENSIBILIZAÇÃO LETAL DO
LASER 660nm ASSOCIADO A UM COMPOSTO
FENOTIAZÍNICO FRENTE AO Enterococcus faecalis
PRESENTE NOS CONDUTOS RADICULARES:
estudo in vitro
SALVADOR: 16/12/2008
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________________ Profª. Dr. Aparecida Maria Cordeiro Marques – Orientadora – UFBA/UFPB
__________________________________________________ Profª. Dr. Maria Cristina Cangussu - UFBA
__________________________________________________ Prof. Dr. Manoel Damião Souza Neto - USP
__________________________________________________ Prof. Dr. Aldo Brugnera Junior - UNIVAP
__________________________________________________ Profª. Drª. Maria Amália G Ribeiro - UNIT
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Seu Nascimento e Dona Áurea, pelo exemplo de retidão,
dignidade e bondade. Vocês construíram o exemplo que procuro seguir em minha vida;
Ao meu amor, Eduardo, pelo incentivo e tolerância. Obrigado por trabalhar em
dobro, sacrificando seus sonhos em favor dos meus.
Ao meu filho Gabriel, por seu amor e presença nos momentos mais difíceis. Eu
te amo incondicionalmente. Você é a luz da minha vida.
Ao meu filho Joãozinho, que partiu antes de nós. Você faz parte disto. Aos meus amigos baianos e fluminenses.
Aos meus mestres, que me guiaram por todo o caminho. À VOCÊS DEDICO ESTE TRABALHO
AGRADECIMENTOS
À DEUS, por estar sempre comigo e por ter aberto meus caminhos.
À minha orientadora, Profª. Dr. Cidinha Marques, pela atenção, carinho, gentileza e conhecimentos transmitidos. Agradeço a oportunidade de tê-la como orientadora. “Se todos fossem iguais a você, que maravilha viver”
Você é uma ovozinha pesquisadora muito especial. E viva Luna!
Ao Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Prof. Antônio Pinheiro da Universidade da Bahia Grande que foi também orientador, incentivador e amigo. Sua intervenção foi imprescindível.
Ao orientador dos estudos em Microbiologia, Prof. Dr. Paulo Fernando Almeida, pela orientação na pesquisa microbiológica e por ter permitido que eu realizasse minha pesquisa no Laboratório de Biotecnologia e Ecologia de Microrganismos – LABEM. À Profª Dr. Cristina Cangussu, pelo acolhimento, pela rapidez e praticidade na resolução das análises estatísticas
Ao meu amigo Alberto Valença, pelo convívio e colaboração na confecção deste trabalho, por sua gentileza desde a primeira vez que nos conhecemos. Agradeço, ainda, pela tradução dos meus trabalhos.
Agradeço aos Professores do Curso de Doutorado em Laser em Odontologia da Universidade Federal da Bahia, por todos os ensinamentos durante minha formação de Doutora.
Aos colegas de turma de Curso de Doutorado em Laser pela amizade, auxílio e troca de informações preciosas para o meu crescimento profissional e pessoal. E aos colegas que ainda estão passando pela pós-graduação agradeço pelo convívio amistoso.
Aos alunos bolsistas de Iniciação Científica do Centro de Laser. Admiro vocês.
Aos alunos bolsistas do Laboratório de Imunologia e Microbiologia da Faculdade de Biociências, pelas suas explicações, disponibilidade, boa vontade e boas idéias. Não vou esquecer nunca o apoio de vocês.
Agradeço ainda a Jackeline Dayane dos Santos pela confecção da curva de crescimento do microrganismo estudado.
Em especial ao bolsista Adailson Feitoza Santos, que pela atenção que sempre dispensou durante minha passagem pelo Laboratório de Microbiologia.
Aos meus amigos da Casa do Rio Vermelho meu carinho eterno, pois vocês são maravilhosos. Sua amizade faz de mim uma privilegiada.
Aos funcionários da FOUFBA, pelo auxílio na labuta do dia-a-dia.
Às minhas amigas Edméa Fernandes e Rosy Nardy pela amizade e por sempre desejarem meu sucesso.
A Edilza Pinheiro e Cleide pelo abrigo nos dias de tempestade. A família Binda pelo apoio irrestrito.
A todos os meus familiares e demais amigos, que sempre torceram pelo meu sucesso e de uma forma ou de outra colaboraram na elaboração desta tese.
Aos Professores e Suplentes da Banca Examinadora de qualificação e de defesa, por sempre estarem dispostos a contribuir com o engrandecimento científico deste trabalho.
À Capes, pelo apoio financeiro concedido por meio da bolsa de formação de pesquisador.
À secretária do Doutorado da FOUFBA, Sueli Paixão.
À MMOptics pelo apoio tecnológico e científico para o desenvolvimento desta pesquisa.
Ao LACEN, Laboratório Central de Saúde Pública Professor Gonçalo Moniz na pessoa da coordenadora do Laboratório de Vigilância Epidemiológica, Dra. Geruza Maria Morais, ao setor de Laboratório de Bacteriologia e a Dra. Ayda Maria Silva Costa. À Sete Central de Esterilização Ltda, pela colaboração na pesquisa com a esterilização com óxido de etileno.
Muito obrigado a vocês pacientes que enriqueceram meu coração, que me encheram de amor e ternura, que sorriram pra mim.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS... 08
LISTA DE FIGURAS... 10 LISTA DE TABELAS... 11 RESUMO... 12 ABSTRACT... 13 1 INTRODUÇÃO... 14 2 REVISTA DA LITERATURA... 16 2. 1 Enterococcus faecalis... 16 2.2 FOTOSSENSIBILIZAÇÃO LETAL... 18 2.3 FONTES DE LUZ... 24 2.5 FOTOSSENSIBILIZADORES... 28 2.5 FENOTIAZÍNICOS... 30
2.6 TÉCNICA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL... 36
3 PROPOSIÇÃO... 38
4 METODOLOGIA... 39
41 PREPARO DAS AMOSTRAS... 39
4.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS... 40
4.3 CONTAMINAÇÃO DO SISTEMA ENDODÔNTICO... 41
4.4 COLETA... 43
4.5 TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL... 43
4.7 IRRADIAÇÃO DAS AMOSTRAS COM EQUIPAMENTO LASER E FIBRA
ÓTICA – GRUPO 2 e 3... 45
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 47
5 RESULTADOS... 49
5.1 ESTATÍSTICA DESCRITIVA... 49
5.2 TESTAGEM ENTRE OS CONES... 50
5.3 TESTAGENS ENTRE GRUPOS E SEUS RESPECTIVOS CONTROLES.... 51
5.4 TESTAGEM ENTRE GRUPOS... 52
5.5 ANÁLISE DA EFICÁCIA... 54
6 DISCUSSÃO... 55
7 CONCLUSÃO... 63
REFERÊNCIAS... 64
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS % ... Por cento λ ... Comprimento de onda + ... Mais ® ... Marca registrada φ ... Diâmetro AM ... Azul de Metileno AT ... Azul de Toluidina ATO ... Azul de Orto-Toluidina
ANVISA ... Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BHI ... Brain Heart Infusion (Infusão de cérebro coração)
CW ... Emissão contínua
μL ... Microlitro cm ... Centímetro
cm2 ... Centímetro quadrado CO2 ... Dióxido de carbono DE ... Densidade de Energia DP ... Densidade de Potência DNA ... Ácido desoxirribonucléico e6 ... chlorin
EROs ... Espécies reativas de oxigênio F ... Freqüência Fig ... Figura FL ... Fotossensibilização Letal G ... Grama Ga ... Gálio H ... Hora
He-Ne ………... Hélio Neônio
GaAlAs ... Arseneto de Gálio e Alumínio ICS ... Instituto de Ciências da Saúde
IEC ... International Electrotechnical Commission GaAs ... Arseneto de Gálio
H2O2 ... Peróxido de Hidrogênio
InGaAlP ... Fosfeto de Índio Gálio Alumínio J ... Joule
J/cm2 ……… Joule por centímetro quadrado Kg ... Kilograma
L ... Laser
LABEM ... Laboratório de Biotecnologia e Ecologia de Microrganismos
Laser ... Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação LPS ... Lipopolissacarídeo
mg ... Miligrama min ... Minutos ml ... Mililitros mm ... Milímetro
mm2 ... milímetro quadrado m/s ... Minutos por segundo mW ... Miliwatts μm ... Micrômetro nm ... Nanômetro nº ... Número OH- ... Íons Hidroxila O2- ... Superóxido O2 ... Oxigênio O ... Orto P ... Potência PEI ... Polyethyleneimine pH: ... Potencial hidrogeniônico RNA ... Ácido ribonucléico
s ... Segundo
SIDA ... Síndrome da Imunodeficiência Adquirida S1 ... 1º Estado excitado singleto
T1 ... 1º Estado excitado tripleto TPI ... Tempo Pré-Irradiação
UFBA ... Universidade Federal da Bahia UFPB ... Universidade Federal da Paraíba UFC ... Unidade formadora de colônia v/v ... Volume por volume
YAG ... Ítrio Alumínio de Granada W ... Watt
°C ... Graus Celsius 1O2 ... Oxigênio Singleto 3O2 ... Oxigênio Molecular 1:1 ... Um para um
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama modificado de Jablonski... 23
Figura 2 Câmara de fluxo laminar com materiais para contaminação...
40
Figura 3 Curva de crescimento do Enterococcus faecalis... 42
Figura 4 Distribuição dos tubos contendo o meio de cultura BHI.. 44
Figura 5 Irradiação das amostras com fibra ótica acoplada à peça de mão... 46 Figura 6 Tubos contendo meio de cultura BHI para aplicação da
técnica NMP... 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Delimitação da Amostra... 41
Tabela 2: Testagem entre grupos... 50
Tabela 3: Comparação dos grupos de tratamento com seus respectivos controles... 51 Tabela 4: Comparação entre grupos -Teste Kuskal-Wallis... 52
RESUMO
A permanência de microrganismos no interior do sistema de canais radiculares é a principal causa do fracasso na terapia endodôntica. Dentre as bactérias isoladas, o microrganismo Enterococcus faecalis tem sido responsável pelo grande número de insucessos na endodontia. Na tentativa de compreender melhor este fato têm-se estudado a ação antimicrobiana por meio da Fotosensibilização Letal (FL). A proposta deste estudo foi avaliar, in vitro, a redução da microbiota intracanal utilizando a FL, fazendo-se uso do laser diodo InGaAlP, 660nm, 40mW, 3,6J/cm2, 90s, fibra ótica com φ300μm, associado à solução aquosa do composto fenotiazínico (azul de metileno e azul de toluidina 100μg/ml - 1:1, v/v). Vinte e quatro dentes humanos unirradiculares foram contaminados com a cepa de E. faecalis (ATCC19433), que foram divididos aleatoreamente em quatro grupos: Grupo 1: Composto Fenotiazínico; Grupo 2: Laser; Grupo 3: Fotossensibilização Letal (FL); Grupo 4: sem tratamento. O efeito de descontaminação dos diferentes tratamentos foi avaliado com a técnica do Número Mais Provável (NMP) e os resultados foram tratados estatisticamente pelo teste Kruskal-Wallis, mostrando uma eficácia de 97,02% para o Grupo 3 (FL); no grupo 1 (Composto Fenotiazínico) foi observada uma redução de microrganismos de 95,51% com significância estatística quando comparado aos seus respectivos Grupos Controle (p<0,05). Através das observações deste estudo, pode-se concluir que a Fotossensibilização Letal mostrou-se eficaz como agente bactericida no modelo de dente contaminado com Enterococcus faecalis (ATCC 19433).
PALAVRAS- CHAVE: Fotossensibilização Letal, Enterococcus faecalis, Laser em Odontologia
ABSTRACT
The maintainance of microrganisms within the root canal system is the main cause of failures in the endodontic therapy. Amongst the isolated microorganisms, Enterococcus
faecalis has been responsible for the great failure rates in endodontics. Attempting at a
better understanding of this fact, the antimicrobial action of the Lethal Photosensitization (LP) has been studied. The aim of this study was to assess, in vitro, the reduction of the intrachannel microbiota with the LP, with a InGaAlP diode laser, 660nm, 40mW, 3,6J/cm2, 90s, optical fiber with ∅300μm, associated with an aqueous solution of a phenotiazinic composite (Methylene Blue and Toluidine Blue 100μg/ml - 1:1, v/v). Twenty-four uniradicular teeth were contaminated with E. faecalis (ATCC19433), which were randomly divided into four Groups: Group 1: Phenothiazinic Composite; Group 2: Laser; Group 3: Lethal photosensitization (FL); Group 4: no treatment. The effect of the decontamination of the different treatments was assessed with the Most Probable Number (MPN) technique and the results were statistically treated with the Kruskal-Wallis test, showing an efficacy of 97,02% in Group 3 (LP); In Group 1 (Phenothiazinic Composite) a reduction of 95,51% was observed, with com statistical significance when compared with the respective Control Groups (p<0,05). Throughout the observations of this study, it can be concluded that Lethal photosensitization showed efficacy as a bactericidal agent in the infected teeth model with Enterococcus faecalis ATCC 19433.
1 INTRODUÇÃO
O papel exercido pelos microrganismos e seus subprodutos na patogenicidade das alterações pulpares e periapicais é inquestionável. Os dentes portadores de polpa necrótica e área radiolúcida periapical apresentam aspectos microbiológicos particulares, pois a infecção sedia-se não somente na luz do canal radicular principal, mas também no sistema de canais radiculares e tecidos periapicais (SIQUEIRA Jr et al, 2004).
A radiação laser apresenta características antimicrobianas que podem auxiliar no tratamento endodôntico. Estudos buscam encontrar uma terapia alternativa antimicrobiana no qual o microrganismo E. faecalis, comumente encontrado no sistema de canais radiculares infectados, não desenvolva resistência a determinados medicamentos como normalmente é observado em infecções refratárias.
A ação antimicrobiana dos laseres terapêuticos tem sido estudada pela terapia fotodinâmica (TFD). Esta foi utilizada inicialmente no tratamento do câncer, apresentando uma ação fotoquímica citotóxica. Para ação da mesma é necessária a presença de oxigênio, de uma droga fotossensibilizadora e de uma fonte de luz intensa, a qual é produzida também por um laser (BRUGNERA Jr & PINHEIRO, 1998).
O emprego da luz, uma energia pura, vem desde os primórdios, sendo conhecida em algumas de suas propriedades terapêuticas, principalmente para o combate de processos dolorosos e da inflamação. Nesse particular, destacam-se os estudos sobre uma fonte de luz, o laser de baixa potência (GENOVESE, 2000).
Os dez últimos anos do século passado foram decisivos na evolução dos equipamentos laser, graças às pesquisas que permitiram o desenvolvimento de novos
sistemas, na melhoria dos equipamentos e com isso na utilização crescente desta luz em vários procedimentos clínicos.
Um grande número de fotossensibilizadores tem sido empregado na Fotossensibilização Letal (FL). De acordo com suas características os fotossensibilizantes são selecionados visando sua eficiência para o microrganismo alvo. O azul de toluidina e o azul de metileno estão incluídos no grupo dos corantes fenotiazínicos e estudados com a finalidade de mediar a morte microbiana (WAINWRIGHT et al., 1998).
Baseada na necessidade de se utilizar métodos mais eficazes de ação antimicrobiana durante a terapia endodôntica, constitui proposta do presente estudo, avaliar in vitro, a redução da microbiota intracanal, composta por E. faecalis, utilizando a Fotossensibilização Letal.
2 REVISTA DA LITERATURA
2.1 Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis, da família Streptococaceae, gênero Streptococcus,
possui parede celular formada por um complexo mucopeptídico, que dá forma à bactéria. São cocos gram positivos, imóveis e anaeróbios aerotolerantes. As bactérias patogênicas possuem cápsula, que é formada por polissacarídeos, conferindo-lhes resistência contra o ataque e englobamento por leucócitos e outros fagócitos, protegendo de prováveis rupturas enzimáticas ou osmóticas.
A parede celular das bactérias gram positivas é composta por ácidos teicóicos unindo-se ao peptideoglicano e aos ácidos lipoteicóicos que se ligam intimamente à porção lipídica da membrana citoplasmática. São estes componentes os responsáveis por possibilitar a formação de colônias e a regularização da entrada e saída de cátions da bactéria (TRABULSI et al., 1999).
Os Enterococcus, são isolados como flora normal do trato gastrointestinal. As espécies clinicamente importantes e mais frequentemente isoladas são a E. faecalis e a E. faecium. Microscopicamente, apresentam-se como diplococos, ou agrupados em cadeia, dependendo do meio ambiente. Macroscopicamente formam colônias pequenas e translúcidas.
Os enterococos, como os estreptococos, não tem enzimas citocromiais e são catalase negativos, embora, algumas cepas possam produzir pseudocatalase. A identificação destas espécies, através dos testes bioquímicos convencionais foi atualizada por Facklam, Sham e Teixeira (1999). Não são muito exigentes em termos
culturais: crescem em meio de cultura suplementado com sangue ou soro (SIMONSEN
et al., 2003).
A pressão seletiva provocada pelo uso ostensivo de cefalosporinas de amplo espectro, aminoglicosídeos e outros antimicrobianos com atividade limitada contra enterococos, tem permitido que esse patógeno sobreviva e prevaleça entre bactérias que colonizam o trato gastrintestinal de pacientes graves, imunossuprimidos e neutropênicos (MUTO et al., 2003). Teme-se atualmente que estes microrganismos transfiram esta resistência a outras bactérias (especialmente aos estafilococos), uma vez que ela é mediada por plasmídeos, produzem betalactamases, causando infecções endodônticas de difícil tratamento (SIMONSEN et al., 2003).
E. faecalis é a bactéria mais predominante nos canais radiculares
tratados e tem a capacidade de sobreviver em condições severas de pós-tratamento endodôntico (GEORGE, KISHEN e SONG, 2005). A habilidade do E. faecalis para formar biofilme calcificado na dentina do canal radicular pode ser um dos fatores que contribuem para a sua persistência depois do tratamento endodôntico. É a bactéria que está associada a periodontite apical persistente, devido a sua resistência a vários agentes antimicrobianos. (KISHEN et al., 2006).
As bactérias facultativas são responsáveis pelo desenvolvimento de um meio com baixo potencial de oxirredução e extremamente propício para anaeróbios estritos no canal radicular. Têm a capacidade de penetrar nos túbulos dentinários (GEORGE, KISHEN e SONG, 2005) enquanto os microrganismos anaeróbios estritos não penetram tão profundamente (SIQUEIRA Jr, et al., 1996; BERKITEN et al., 2000). Os microrganismos que se alojam mais profundamente nos túbulos dentinários podem
sobreviver e perpetuar uma alteração patológica perirraducular (LOPES & SIQUEIRA Jr, 2004).
Nenhuma técnica de instrumentação, solução irrigadora, medicação intracanal ou material obturador é capaz de promover a desinfecção total do sistema de canais radiculares. Uma redução máxima da população bacteriana é obtida até níveis compatíveis com a resistência do hospedeiro, sendo que as características clínicas comprovam que esta meta foi alcançada (SIQUEIRA Jr et al., 2004; JHA et al., 2006; KRAUSE, LIEWEHR e HAHN, 2007).
Devido ao número limitado de antimicrobianos efetivos contra enterococos, as preocupações relativas ao tratamento relacionadas a este microrganismo aumentaram após descrição, nos EUA e França, de amostras resistentes também a vancomicina. (SIQUEIRA Jr et al., 2004; LOPES & SIQUEIRA Jr, 2004).
2.2 FOTOSSENSIBILIZAÇÃO LETAL (FL)
A ação antimicrobiana dos laseres terapêuticos tem sido estudada pela terapia fotodinâmica (TFD), como uma modalidade promissora de tratamento antimicrobiano. A TFD foi utilizada inicialmente no tratamento do câncer, apresentando uma ação fotoquímica citotóxica. É também conhecida por Fotossensibilização Letal (FL), Quimioterapia Fotodinâmica Antimicrobiana (PACT, Photodynamic Antimicrobial
Chemotherapy) ou Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (WAINWRIGHT &
Há 4000 anos já existiam relatos de uso da combinação de plantas ou seus extratos associados a luz do sol para tratar doenças de pele como vitiligo e psoríase. Oscar Raab, estudante de medicina alemão, trabalhando com o professor Herman von Tappeiner, em Munique, no início do século XX, acidentalmente, verificou a primeira demonstração de FL de células, onde baixas concentrações do fossensibilizante acridina sobre Paramecium (protozoário causador da malária) levou esse microrganismo unicelular à morte, quando em exposição a luz intensa (no caso, os raios de uma tempestade). Seus resultados induziram os pesquisadores a postular que algum produto da fluorescência, e não a luz por si só, seria responsável pela elevada toxicidade observada (KUBLER, 2005).
Von Tappeiner e Jodlbauer (1907) utilizaram primeiramente o termo
Photodynamische Wirkung (efeito fotodinâmico) para todas as reações fotobiológicas
relacionados a um fotossensibilizador que podem ocorrer na presença de oxigênio molecular (3O2) e provocam a destruição de tecidos (TRIESSCHEIJN, BAAS e SCHELLENS, 2006).
Depois desta época muitos exemplos do efeito de FL foram estudados com diversos tipos de fotossensibilizadores, tanto in vivo, quanto in vitro. Posteriormente empregou-se luz não-coerente e policromática, com o inconveniente do componente térmico e da dificuldade em se calcular a dose de luz. Mais tarde, os laseres passaram a ser empregados devido a sua monocromaticidade, com comprimento de onda definido, e, por conseqüência, (alta seletividade para o fotossensibilizante), pela facilidade de cálculo da dosimetria, área de radiação controlada e da unidirecionalidade (BRUGNERA JÚNIOR et al, 2003; GUTKNECHT & EDUARDO, 2004).
A FL emprega a combinação de um fotossensibilizante na presença de oxigênio molecular (3O2) e luz visível, normalmente produzida por um sistema laser, baseada em uma reação fotodinâmica citotóxica, que ativa um cromóforo, absorvido pelas células. A irradiação induz a uma série de reações metabólicas, com o objetivo de provocar inativação celular (GARCEZ et al., 2003).
Os produtos das reações fotoquímicas, as espécies reativas de oxigênio (EROs), danificam os componentes essenciais das células, como: as membranas celulares, mitocôndrias, lisossomos, os núcleos, ácidos nucléicos, proteínas estruturais, enzimas. Podem ainda causar a ruptura ou alterar as atividades metabólicas de maneira irreversível, resultando na morte celular (FERGUSON, 2002; KONAN; GURNY; ALLÉMANN, 2002).
A radiação laser quando associada ao fotossensibilizador apresenta características antimicrobianas que podem auxiliar no tratamento endodôntico. Estudos buscam encontrar uma terapia alternativa antimicrobiana em que microrganismos não possam desenvolver resistência, chamando-se nestes casos de FL (GUTKNECHT & EDUARDO, 2004).
A FL envolve a administração de um agente fotossensibilizante, seguida da ativação pela luz, que deverá ter um pico de absorção compatível com o comprimento de onda do corante. A terapia resulta em uma seqüência de processos fotoquímicos e fotobiológicos que produzem efeitos fototóxicos danosos à célula-alvo e sem causar dano ao tecido circunvizinho (GUTKNECHT & EDUARDO, 2004).
De acordo com Ribeiro & Zezell (2004), a eficiência deste tipo de tratamento depende de três fatores: Biológicos: seletividade e retenção do fotossensibilizador; Físicos: intensidade da radiação eletromagnética que chega à
região a ser tratada (propriedades ópticas do tecido), eficiência da absorção dos fótons ativadores, eficiência da transferência de energia de excitação da molécula fotossensibilizadora; e Químicos: efeito oxidante na molécula.
Durante a FL, o fotossensibilizador no estado tripleto é ativado na presença do oxigênio molecular (3O2), quando expostos a uma irradiação laser, que é caracterizado pela passagem dos elétrons para níveis de energia superiores e podem ocorrer dois tipos de processos competidores: reação do tipo I e reação do tipo II (SIBATA et al., 2000)
Primeiramente, na reação do tipo I, o fotossensibilizador tripleto pode interagir com um substrato, como membranas celulares ou moléculas, transferindo um próton ou um elétron para formar um radical aniônico ou catiônico, respectivamente, e resultar na formação de radicais livres. Nesta reação, o fotossensibilizante sofre degradação por ação direta da luz, levando a uma reação química e promovendo a formação de EROs, como peróxido de hidrogênio (H2O2), íons hidroxila (OH-), radicais hidrogênio e ânion superóxido (O2-)(RIBEIRO et al, 2007). Ocorre a transferência de elétrons entre o fotossensibilizador no estado tripleto excitado e componentes do sistema formando radicais livres extremamente reativos (WAINWRIGHT, 1998).
O peróxido de hidrogênio (H2O2) é essencial no sistema biológico, pois atravessa a membrana celular e no interior da célula não pode ser eliminado. O superóxido (O2-) é importante para a produção de radicais hidroxila, altamente reativos. O superóxido age como redutor, e não como agente oxidante (WAINWRIGHT, 1998).
Alternativamente, na reação do tipo II ocorre a transferência de energia do fotossensibilizador no estado tripleto excitado para o estado tripleto fundamental do oxigênio, originando a forma excitada do oxigênio, dita singleto (1O2), o principal agente
citotóxico da FL, (FERGUSON, 2002; KONAN, GURNY, ALLÉMAN, 2002). Nesta reação o fotossensibilizante é preservado e participa do processo como um elemento capaz de transferir energia da fonte de luz ao oxigênio molecular (3O2), que é tripleto em seu estado puro, passando para o estado singleto excitado (1O2) (CASTANHO, DEMIDOVA, HABLIN, 2005; RIBEIRO, et al, 2007). O papel do estado singleto do fotossensibilizador no processo da FL é agir como precursor do estado tripleto, que possui vida mais longa e gera espécies citotóxicas (FERGUSON, 2002; KONAN, GURNY, ALLÉMAN, 2002).
O fotossensibilizante excitado no estado dito singleto pode passar pelo processo conhecido como cruzamento de intersistemas, tendo como conseqüência a formação do fotossensibilizador no estado excitado tripleto, que possui uma meia-vida relativamente longa (CASTANO, DEMINOVA e HAMBLIN, 2005).
Tanto a reação do tipo I, quanto a do tipo II podem ocorrer simultaneamente e dependem do fotossensibilizador utilizado, da sua concentração e da presença do oxigênio (CASTANHO, DEMIDOVA, HABLIN, 2005; RIBEIRO, et al, 2005).
As espécies reativas do oxigênio junto com oxigênio singleto (1O2) são agentes oxidantes que podem reagir diretamente com inúmeras biomoléculas, em que são importantes alvos: os resíduos de aminoácidos das proteínas (GRUNE et al., 2001) e os ácidos nucléicos (OLEINICK, MORRIS & BELICHENKO, 2002).
Estes processos dependem dos rendimentos quânticos para a ocorrência de cada um deles. A probabilidade depende da velocidade dos processos de cruzamento intersistemas de S1 (primeiro estado excitado singleto) para T1 (primeiro
estado excitado tripleto), de fluorescência e de conversão interna, sendo características de cada molécula e do meio em que se encontram (Figura 1)(GROSSWEINER, 1995)
FIGURA 1: Diagrama modificado de Jablonski. Esquema da transferência de elétrons mostrando os vários fotoprocessos envolvidos na excitação de uma molécula fotossensibilizadora. Fonte: Gutknecht & Eduardo, 2004, p.232.
Quanto maior a geração de oxigênio singleto (1O2), menor será a quantidade de fotossensibilizante necessária para a técnica escolhida (WU et al., 2000). Pelo fato do oxigênio singleto (1O2) ter vida curta, o fotossensibilizador não ligado à célula não é considerado fototóxico (NYMAN; HYNNINEN, 2004).
O oxigênio singleto (1O2) e os radicais hidroxila (OH) apresentam alta reatividade e vida curta, resultando na sua instabilidade e alta reatividade do oxigênio singleto. Devido a esse fato, só as moléculas e estruturas próximas à área de sua produção, nas áreas de localização do fotossensibilizador, são afetadas pela FL (CASTANO, DEMIDOVA e HAMBLIN, 2005). Na reação do tipo II mais rápida, envolvendo o AM, ocorre a formação de oxigênio singleto (1O2) e o estado puro do fotossensibilizante. Ocorre, ainda, a formação de superóxido (O2-), porém mais lentamente (FLOYD, SCHNEIDER Jr e DITTMER, 2004).
2.3 FONTES DE LUZ
Com o desenvolvimento tecnológico, as lâmpadas incandescentes convencionais, especialmente as de Tungstênio, Xenônio e Mercúrio, foram substituídas por fontes de luz mais potentes, a luz laser. Diversos tipos de laseres foram utilizados na TFD, como por exemplo, o laser de Argônio, Hélio-Neônio, de corantes, de vapores de metais e o diodo. Hoje, normalmente são utilizados os laseres de comprimentos de onda próximos ao vermelho visível (GUTKNECHT & EDUARDO, 2004; MACEDO, 2004).
A luz laser pode levar grande densidade de energia aos tecidos por meio de fibras óticas e com comprimentos de onda específicos. O desenvolvimento de novos sensibilizadores de espectro de absorção maior motivou a melhora dos sistemas de laser utilizados como fonte luminosa. Sabe-se que a produção de oxigênio nascente está diretamente relacionada ao produto de fluência luminosa e coeficiente de absorção do fotossensibilizador (BRUGNERA Jr & PINHEIRO, 1998).
A habilidade do laser diodo 660nm associado ao fotossensibilizante AT e AM em produzir efeito antimicrobiano sobre bactérias foi comprovado em microrganismos crescidos em meio de cultura in vitro e em bactérias crescidas em biofilme (GARCEZ et al., 2003; SOUKOS et al., 2006; FOSCHI et al., 2007; FONSECA
et al., 2008; BERGMANS et al., 2008).
A eficiência da FL depende da transmissão adequada da luz através da fibra ótica, até que esta chegue a célula alvo, da concentração do fotossensibilizador e da área irradiada, fazendo com que o processo fotoquímico seja iniciado sem a indução
de efeitos colaterais e para causar morte celular, o efeito deve exceder certo limiar de sensibilização (NYMAN & HYNNINEN, 2004; WAINWRIGHT & CROSSLEY, 2004).
Alguns parâmetros deverão ser observados para se calcular a dosimetria, incluindo o comprimento de onda, as dimensões e propriedades ópticas dos tecidos, dosagem da droga fotossensibilizadora, tempo e modo de entrega da luz laser. (BRUGNERA Jr & PINHEIRO, 1998).
Garcez et al. (2003a) avaliaram o potencial de redução bacteriana intracanal de canais contaminados com E. faecalis. Vinte dentes extraídos foram divididos em dois grupos comparativos de hipoclorito de sódio 0,5% e de uma pasta composta de azuleno e Endo-PTC. O segundo grupo foi irradiado por laser diodo (685nm, 5min). Observaram que a redução bacteriana foi de 100% no grupo laser.
Garcez et al. (2003b) utilizaram laser diodo (685nm, 50mW, 3min, fibra ótica de ∅365μm) associado ao azuleno em pasta (TPI=5min), obtiveram como resultado efetivo 100% de redução bacteriana em canais contaminados com cultura de
E. faecalis, em seu estudo in vitro.
Garcez et al. (2006), avaliaram, in vitro, a redução microbiana intracanal com a utilização de um laser de diodo (685nm, 10mW, 1,8J, 3min), associado ao fotossensibilizante azuleno + EndoPTC (TPI=5min), frente ao microrganismo E.
faecalis. Nos parâmetros utilizados pelos autores, a FL demonstrou efetiva redução
microbiana no percentual de 93,25%, quando comparada ao NaOCl a 0,5%.
Castro (2006) também utilizou a FL, frente ao microrganismo E. faecalis, com o fotossensibilizante azuleno + EndoPTC (TPI=5min) associado ao laser diodo (685nm, 15mW e 40mW, 2min, 7,2J), obtendo como resultado a redução do microrganismos no percercentual de 100%. Observou ainda que, o laser ou o
fotossensibilizante utilizados de forma isolada não exerceram nenhuma atividade inibidora do crescimento bacteriano.
Kairalla (2006), comparou, in vitro, a redução microbiana promovida pela FL utilizando laser diodo de baixa potência (660nm, 37,7mW, movimentos helicoidais, 10x28s, ∅216μm) e AM (0,01%, TPI=5min) e laser de diodo de alta potência (808nm, 3,5W, 10x10s, ∅200μm). Seu estudo demonstrou efetiva redução microbiana para ambos os métodos frente a bactéria E. faecalis. A autora cita ainda, que os métodos são considerados coadjuvantes à terapia endodôntica.
Soukos et al (2006) avaliaram, in vitro, o efeito da FL intracanal em biofilme de E. faecalis, utlizando laser diodo (665nm, 10mW, 222J/cm2, fibra com difusores cilindricos) associado ao AM (25%, TPI=5min). Os autores consideram a FL uma técnica eficiente na redução microbiana como coadjuvante à terapia convencional.
Foschi et al. (2007) investigaram, in vitro, nos canais radiculares de dentes infectados com E. faecalis, os efeitos da FL do AM (6,25μg/ml, TPI=5min) associado ao laser diodo (665nm, 60J/cm2, fibra ótica ∅500μm). Obtiveram como resultado a redução de 77.5% dos microrganismos viáveis.
Cavalheiro (2007) comparou, in vitro, três técnicas de irradiação intracanal grupo helicoidal (GH) movimentos ápico-cervicais, utilizando fibra óptica ∅=300μm; grupo estacionário (GE) utilizando-se fibra óptica em 3 pontos de cada terço do canal; e grupo onde não foi utilizada a fibra óptica (GSF). Os canais foram preenchidos com AM (0,005%, TPI=2min) Utilizou o laser diodo (660nm, 15mW, 3min). Seus resultados indicaram que a FL intracanal é eficiente em eliminar E. faecalis independente da técnica de irradiação utilizada.
Fonseca et al. (2008) avaliaram a redução das colônias de E. faecalis em canais de dentes humanos extraídos. Utilizaram solução de AT (0,0125%, TPI=5min), que, associados ao laser de diodo (660nm, 50mW, 6,4J/cm2, 5min, fibra ótica ∅=600μm) reduziram a população microbiana em 99,9%. Observaram o decréscimo de UFC no valor de 99%. Ressaltam, porém, que não ocorreu a completa inativação ou remoção de microrganismos, como também não ocorre com a instrumentação de canais infectados. Mostrando-se a FL viável como um agente bactericida no modelo contaminado com E. faecalis.
Bergmans et al. (2008) ao testarem a hipótese que a FL tem um efeito bactericida nos patógenos inoculados nos canais radiculares (S. anginosus, E. faecalis
e F. nucleatum), observaram que para os parâmetros utilizados, ou seja, laser diodo
(15J), associado ao fotossensibilizante AT, obtiveram uma redução bactericida significativa, resultando em 93,8% para S. anginosus, 88,4% para E. faecalis e 98,5% para F. nucleatum, mas não foi possível a esterilização dos canais radiculares. Concluíram que a FL é suplemento para a desinfecção dos canais radiculares.
George & Kishen (2008) avaliaram os mecanismos envolvidos e a influência do fotosensibilizador na morte celular de E. faecalis usando a FL e ainda, a integridade funcional da parede celular, o DNA cromossomial e as proteínas da membrana foram analisadas. As células microbianas foram incubadas com 100μg do fotossensibilizador AM, dissolvidos em água e no composto (glicerol:etanol:água) e foram irradiados com laser diodo (664nm, 63-69J/cm2). Observaram que a ação bactericida da FL foi significantemente alta quando o composto solvente fotossensibilizador foi usado, demonstrando extensivo dano ao DNA cromossomial, além de destruir a integridade funcional da parede celular e membrana do E. faecalis.
2.4 FOTOSSENSIBILIZADORES
Os fotossensibilizadores podem ser administrados por via tópica, intralesional e sistêmica antes da subseqüente exposição à luz. São, em sua maioria, derivados de corantes vitais e caracterizam-se por não serem tóxicos às células humanas em concentrações superiores às requeridas para a inativação microbiana efetiva (WAINWRIGHT, 1998).
Nas últimas décadas, diversos autores se voltaram ao experimento de Raab e diversos fotossensibilizantes foram testados, como os azuis (principalmente o AT e o AM) com cores complementares aos comprimentos de onda apresentado ao laser escolhido (GUTKNECHT & EDUARDO, 2004).
A localização celular do fotossensibilizador depende de sua natureza química: características lipofílicas e anfifílicas, peso molecular, carga iônica e características da ligação protéica, tempo de incubação, concentração, concentração sérica, bem como do fenótipo da célula-alvo, que podem afetar os parâmetros fotofísicos e a sua eficácia, assim como, alterar a via de administração in vivo do mesmo (NYMAN & HYNNINEN, 2004).
O fotossensibilizador ideal caracteriza-se por baixa toxicidade após a administração, não induzindo reação alérgica nem hipotensão e deve absorver a luz no espectro vermelho ou vermelho-distante. Deve, ainda, ser facilmente sintetizado, ser um composto puro, hidrossolúvel e ser eliminado rapidamente pelo paciente (CASTANO, DEMIDOVA e HAMBLIN, 2005). Deve, ainda, ser biologicamente estável,
fotoquimicamente eficaz, seletivo e minimamente tóxico aos tecidos normais (GARCEZ
et al., 2003).
Muitos fármacos fotossensíveis são utilizados em ensaios fotodinâmicos para a erradicação de bactérias, como por exemplo: porfirinas (ASHKENAZI, NITZAN e GÁL, 2003; REDDI et al., 2002), ftalocianinas (LACEY & PHILLIPS, 2002), clorinas (ROVALDI et al., 2000), derivados de porficenos (LAURO et al., 2002), polietilenimina eclorina (GARCEZ et al., 2007) e derivados da fenotiazina como o AM e o AT (KOMERIK & WILSON, 2002; PHOENIX et al., 2003; ZEINA et al., 2003).
Nuñez et al. (2005) avaliaram espectograficamente as alterações ocorridas nos fotossensibilizadores em função do solvente utilizado, da concentração de fotossensibilizantes e da presença de fluído orgânico do meio. Foram selecionados os fotossensibilizantes AM, ATO, e azuleno. Os resultados demonstraram alterações em função da concentração do corante, ou seja, fatores ambientais relacionados à cavidade oral podem alterar o fotossensibilizador e promover a diminuição da eficiência da irradiação.
Garcez et al. (2007) compararam a efetividade da FL, o tratamento endodôntico convencional e a combinação destes tratamentos na eliminação do biofilme bacteriano presente nas infecções de canais radiculares. Contaminaram os canais com bactérias gram negativas e os irradiaram com laser diodo (660nm, 40mW, 9,6J/cm2, 4min, fibra ótica de ∅200μm) em associação com o fotossensibilizador polietilenimina eclorina (e6) (TPI=10min). Observam que a combinação das terapias reduziu em 98% a população bacteriana. Acrescentam que estudos mais clinicamente relevantes devem ser executados, especialmente com microorganismos como E.
FL, quando se comparam com espécies gram negativas como Pseudomonas
aeruginosa.
2.5 FENOTIAZÍNICOS
No final do século XIX, o bacteriologista alemão Paul Ehrlich, notável por seus estudos do sistema imunológico, assistente e seguidor de Koch, descreveu as propriedades do AM, um fotossensibilizante orgânico redox fenotiazínico, que inicialmente ganhou prestígio como corante citológico e como indicador de óxidoredução. e que mais tarde se tornaria o núcleo de um grupo de compostos derivados, constituindo as fenotiazinas Devido às suas propriedades fotoquímicas, têm sido desenvolvidos estudos visando sua aplicação na inativação de bactérias e vírus. (AMARAL, VIVEIROS e KRISTIANSEN, 2001).
O AM e AT são fotossensibilizantes fenotiazínicos aceitos nas prática médica e demonstrados em estudos na literatura. Possuem capacidade fotobactericida contra diferentes organismos incluindo vírus, bactérias e fungos. Apresentam estrutura química e propriedades físico-químicas semelhantes. Embora suas propriedades sejam semelhantes, a eficiência fotodinâmica destes compostos, varia entre os diversos microrganismos (DEMIDOVA & HAMBLIN, 2005).
Os fenotiazínicos são fotossensibilizantes com grande propensão à formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). São considerados hidrofílicos (WAINWRIGHT et al., 1998). Formam complexos metacromáticos com lipopolissacarídeos (LPS) e a grande eficácia fotobactericida do AT pode ser explicada pela sua afinidade por LPS (USACHEVA et al, 2006).
Noodt et al. (1998) avaliaram a ação de um derivado do AM, in vitro, em fibroblastos de hamster. Verificaram que a atividade enzimática do complexo de Golgi, dos lisossomos e do retículo endoplasmático não foi afetada. Porém, a atividade da citocromo c oxidase na mitocôndria estava significativamente reduzida, sendo inativada pela FL. A fluorescência, após 15 minutos, era bem visível nas mitocôndrias, e as membranas nuclear e citoplasmática apresentaram fluorescência fraca. O derivado do AM na concentração de 0,05μg/ml, sem a aplicação do laser, apresentou toxicidade às células sem indução de apoptose. Foi verificado que, 24 horas após a FL, o número de células começou a decrescer proporcionalmente à dose de luz. O derivado do AM aplicado por uma hora, na concentração de 0,05μg/ml e a aplicação do laser por 40s induziram apoptose lentamente, com morte de 60% das células 48 horas após a aplicação da FL. Na concentração de 0,1μg/ml, a apoptose ocorreu rapidamente, cerca de três horas após a aplicação.
De acordo com Harris et al. (2004), o DNA foi o alvo primário dos fotossensibilizantes fenotiazínicos como o AT, após aplicação de luz incoerente (3,15J/cm2, 1,7mW/cm2, 30min). Desses fenotiazínicos, os autores consideram que o dimetil AM tem como alvo as membranas celulares.
A banda de absorção do AM varia entre 620 e 700nm, com ótima penetração nos tecidos e absorção máxima em 665nm em solução aquosa (FERNANDEZ, BILGIN e GROSSWEINER, 1997). Para o AT, a banda máxima de absorção é de 636nm (GARCEZ et al., 2003). O uso desses fotossensibilizantes pode ser tópico ou sistêmico e não apresenta toxicidade. Teichert et al. (2002) relataram que o AM possui baixa toxicidade, com grande aceitação no campo médico devido à sua potencial ação antimicrobiana fotoativa.
De acordo com Usacheva, Teichert e Biel (2001), a permanência do AM e do AT por uma hora, em diferentes concentrações, sem aplicação da luz, apresentou efeito bactericida contra bactérias gram positivas e gram negativas. Podendo passar através dos canais de proteína que são preenchidos por água, presentes na membrana externa das bactérias. Quanto maior a habilidade do fotossensibilizador difundir-se através da membrana, maior será o grau de destruição bacteriana. E, quanto maiores a concentração e a permanência do fotossensibilizador, maior será o efeito bactericida sem a aplicação da luz. O baixo peso molecular desses fotossensibilizantes, suas cargas positivas e a hidrofilia permitem aos mesmos penetrar com sucesso a membrana plasmática bacteriana.
A eficácia dos fotossensibilizadores é avaliada a partir das propriedades fotofísicas e fotoquímicas de seus monômeros. A concentração do AM e do AT para erradicar bactérias depende de sua capacidade de formar dímeros, o que acontece na presença de sais inorgânicos ou com o aumento da concentração dos mesmos, também conhecido como metacromasia. Com isso, ocorre a mudança da absorção máxima do fotossensibilizador a um comprimento de onda menor (USACHEVA, TEICHERT e BIEL, 2003).
Wainwright et al. (1997) testaram, in vitro, os fotossensibilizantes fenotiazíncos AM, AT, novo AM, dimetil AM e azure B frente aos microrganismos gram positivos (S. aureus, E. faecalis, B. cereus) e gram negativos (E. coli, P. aeruginosa), utilizando luz incoerente (350 e 800nm, 1,7mW/cm2, 1h, 6,3J/cm2), resultando em considerável decréscimo na atividade bactericida.
Usacheva, Teichert e Biel (2001) avaliaram a eficácia fotobactericida frente a diferentes bactérias (S. aureus, S. pneumoniae, E. faecalis, H. influenzae, E.
coli e P. aeruginosa) sob as condições de ausência e presença de luz (laser de
argônio-630nm e diodo-664nm) e determinaram nos fotossensibilizadores testados (AM e AT) o mais efetivo. Compararam ainda, o efeito da concentração dos corantes, TPI, a fluência e intensidade da luz laser na destruição de diferentes bactérias. Observaram que ambos os fotossensibilizantes erradicaram todas as bactérias examinadas sob a luz laser. O AT exibiu uma maior atividade bactericida que o AM contra as bactérias tanto na ausência como na presença de luz.
Teichert et al. (2002) utilizaram os fotossensibilizantes AM e AT com o objetivo de avaliar sua eficácia na FL frente microorganismos patogênicos, em diversas concentrações associados ao laser de Argônio (630nm) e ao laser diodo (664nm), 10 e 60J/cm², 50 a 100mW/cm². As concentrações dos corantes foram: 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 e 200μM e foram aplicadas em S. aureus, S. pneumoniae, E. faecalis, H.
influenzae, E. coli e P. aeruginosa. Com os resultados obtidos os autores puderam
observar que todos os microorganismos foram eliminados em algum grau quando expostos ao laser na presença dos fotossensibilizantes. Entretanto, a fotossensibilização dependeu do corante utilizado, sua concentração, fluência e intensidade de potência, assim como da espécie bacteriana envolvida.
Usacheva et al. (2003a) compararam a reatividade dos
fotossensibilizantes (AM e AT - 10μM) nas reações de lipopolissacarídeos (LPS) extraídos de diferentes bactérias gram negativas (E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae
e S. marcescens). O AM e AT na reação metacromática com o LPS resultaram na
geração de dímeros do AM e maior agregados do AT. O maior efeito significante hipocrômico e hipsocrômico na reação tardia com o LPS indicando uma maior eficácia metacromática do AT que AM. O equilíbrio constante do complexo metacromático entre
AT e diferentes LPS foram calculados. A titulação espectrofotométrica do LPS com os fotossensibilizantes foi usada para estimar a peso equivalente do LPS. Concluíram que o AT interage com o LPS mais significantemente que o AM in vitro, sendo este um dos principais fatores determinantes na maior eficácia fotobactericida contra as bactérias gram negativas estudadas.
Usacheva et al. (2003b) investigaram espectrofotometricamente a fototoxicidade na interação entre os fotossensibilizantes fenotiazínicos (AM e AT), frente as bactérias S. aureus, S. pneumoniae, E. faecalis, H. influenzae, E. coli e P.
aeruginosa e induzidos pela luz laser nos comprimentos de onda correspondente ao
dímero e monômero de cada corante. A análise da dimerização para o AM e AT na presença de bactérias indicaram que a habilidade de formarem dímeros foi maior para o AT que para o AM. As bactérias gram negativas induziram a dimerização do corante mais intensamente que para as bactérias gram positivas. Seus resultados forneceram evidência no papel dos dímeros na fotoinativação das bactérias.
Usacheva et al. (2006) estudaram o efeito do Ca+ na eficácia fotobactericida do AM e AT frente às bactérias gram negativas e a afinidade destes fotossensibilizantes por LPS, onde foram expostos a luz laser vermelha. Concluíram que o cloreto de cálcio inibiu a morte bacteriana devido a sua união com o LPS, bem como outros polímeros aniônicos incluindo proteínas presente na membrana. Relataram, ainda que, o LPS está principalmente envolvido na mediação da reação fotoquímica do AT, ao passo que outras proteínas da membrana, estão provavelmente mais envolvidas na reação fotoquímica do AM.
Estudos, como o de Caetano et al. (2007), comprovaram os efeitos fotossensibilizadores do AM (tetrametil-di-amino-di-fenil-tiazina), nas propriedades
morfológicas de vesículas unilamelares gigantes compostas pelo fosfolipídeo 1,2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), e utilizados como um sistema modelo mimetizador da parede celular e considerada um provável alvo para a ação da molécula fotossensibilizadora. Esta observação dos lipossomos gigantes demonstra, em escala microscópica, um padrão nas alterações morfológicas e efeitos de ruptura da membrana, extremamente dependente da concentração da droga, da densidade fotônica e da natureza do substrato no qual as vesículas unilamelares gigantes se encontravam apoiadas.
Nuñez (2007) investigou a dinâmica de agregação dos fotossensibilizadores AM e AT em diferentes solventes, a fim de caracterizar os solventes em relação ao oxigênio molecular (3O2) disponível em cada solução e seu respectivo pH. Observou o efeito da temperatura, sangue e saliva na agregação dos fotossensibilizadores, monitorar a dinâmica de fotodegradação em função da exposição radiante e irradiância e, ainda avaliou a eficiência fotodinâmica microbiologicamente. Seus resultados demonstraram que o uso de banda larga para irradiação foi mais efetivo para na FL. Portanto, para a aplicação clínica da terapia, considera-se que o substrato deve ser considerado e que apropriadas condições de irradiação, solvente e concentração de fotossensibilizador aumentam a eficiência do processo.
Usacheva et al. (2008) estudaram a diferença na eficácia fotobactericida do AM e AT e seus envolvimentos com proteínas, lipopolissacarídeos e sideróforos na membrana bacteriana, ou seja, a fluorescência da bactéria gram negativa P.
aeruginosa. Demonstraram que o AM tem maior interação com o sistema pyoverdin
lipopolissacarídeos afetam a interação com estes biopolímeros e o total de danos bacterianos.
Sharma et al. (2008) investigaram o efeito da ação fotodinâmica do AT na viabilidade e estrutura de biofilmes de S. epidermidis e S. aureus. Observaram significante inativação de células quando os biofilmes estafilococícos foram expostos ao AT (10-80μM) e laser diodo (640nm, 42mW/cm2) simultaneamente, devido ao dano à membrana celular bacteriana no tratamento fotodinâmico. Evidenciaram, ainda, a disrupção da estrutura do biofilme e um decréscimo nos números de células, concluindo que, o tratamento fotodinâmico pode ser viável para a inativação de biofilmes estafilocócicos aderidos à superfícies de implante médicos.
2.6 TÉCNICA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
A técnica de diluição denominada de “Número Mais Provável” (NMP) e, também, chamada de técnica dos tubos múltiplos, foi idealizada por McCrady (1915) para estimar a densidade da população microbiana proveniente de diversas origens e sistemas, a partir da combinação de resultados positivos e negativos (SOUZA & GUERRA, 1998).
Esta técnica tem por base a probabilidade estatística relacionada com a freqüência e ocorrência de resultados positivos mais prováveis em função do número real dos microrganismos presentes. O produto a ser analisado, após homogeneização, é submetido a pelo menos três diluições decimais seriadas. De cada uma dessas diluições, alíquotas iguais são transferidas para três ou cinco tubos contendo o meio de cultura escolhido. Os tubos são incubados, e em seguida, os positivos são
identificados. A expressão dos resultados se dá através do número de tubos positivos em cada uma das diluições empregada determinando-se o NMP por grama ou mililitro de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três ou cinco tubos e de acordo com a tabela da APHA (1984), para a delimitação da expressão numérica (CUNHA & SILVA, 2006).
Também são incluídos os limites de confiança dos números mais prováveis dos microrganismos pesquisados em função da tabela em questão. Os intervalos de confiança de 95% presente das tabelas de NMP oferecem a informação de que, em pelo menos 95% das vezes, há a chance da concentração real do microrganismo alvo estar incluído no intervalo de confiança calculado para cada arranjo de tubos positivos (FRANCO, 2005).
Como na rotina de laboratórios analíticos esse procedimento aumenta em muito o volume de trabalho e de material a ser usado, normalmente são utilizadas apenas três diluições, considerando a estimativa do número esperado do microrganismo em estudo (SOUZA & GUERRA,1998).
3 PROPOSIÇÃO
Constitui proposta do presente estudo avaliar, in vitro, a eficácia da atividade antimicrobiana da Fotossensibilização Letal, utilizando-se o laser diodo InGaAlP, associado à solução aquosa do composto fenotiazínico (azul de metileno e azul de toluidina) em canais radiculares contaminados com o microrganismo
4 METODOLOGIA
4.1 PREPARO DAS AMOSTRAS
O protocolo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia, sob o nº de registro: 0003.3608.000-07. Para a realização deste estudo utilizou-se 24 incisivos inferiores humanos unirradiculares extraídos. Foram selecionados apenas dentes com canais retos, completa formação radicular (estágio 10 de Nolla) e canais radiculares com diâmetro radicular maior que a lima tipo Kerr número 10. O experimento foi desenvolvido na Faculdade de Odontologia e Laboratório de Biotecnologia e Ecologia de Microrganismos - LABEM (UFBA).
Os dentes foram inicialmente descontaminados com hipoclorito de sódio a 5% durante 1h e 30min, cujas superfícies radiculares foram limpas externamente com escavador duplo 20 (Golgran®, SP). Permaneceram armazenados e refrigerados em soro fisiológico a fim de se manterem hidratados até o momento do experimento, quando foram autoclavados a 121ºC por 20min.
As coroas foram seccionadas com discos de carborundum procurando padronizar o comprimento médio das raízes em 14mm. A exploração inicial dos canais foi realizada com limas tipo Kerr número 10, até que a extremidade da mesma chegasse ao forame apical.
O preparo químico-cirúrgico dos canais radiculares foi realizado a 1mm aquém do forame até a lima tipo Kerr nº45 (Dentsply/Maillefer®, Petrópolis, RJ), conforme técnica de Paiva & Antoniazzi (1988). A irrigação-aspiração dos canais
radiculares foi realizada com hipoclorito de Sódio a 1%, com irrigação final com EDTA (ácido diamino tetracético) por 5min e neutralização com soro fisiológico. Após esta fase realizou-se o selamento do forame apical das raízes com resina composta fotoativada Z100®(3M do Brasil Ltda, São Paulo), com a finalidade de evitar a contaminação externa durante os procedimentos posteriores. As raízes foram colocadas em placas de cultura de células (Orange Scientific, Braine-l’Alleud, Bélgica), incluídos em cera utilidade em lâminas New Wax® (Technew, Campo Grande, RJ). Após estes passos foi realizada a esterilização com óxido de etileno (Sete Central de Esterilização Ltda, Salvador, BA). Os demais procedimentos foram realizados em câmara de fluxo laminar (ICS-UFBA) (Fig. 2).
FIGURA 2: Câmara de fluxo laminar com materiais para contaminação
4.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os espécimes foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais conforme Tabela 1.
Tabela 1 Delimitação da Amostra GRUPOS n TRATAMENTO 1 07 Composto Fenotiazínico* 2 07 Laser 3 07 Fotossensibilização Letal 4 - Controle
Negativo 03 Sem tratamento
n = número de dentes
* Composto Fenotiazínico: associação azul de metileno e azul de toluidina.
Os grupos 1, 2 e 3 foram contaminados com 10μl de suspensão de E.
faecalis ATCC 19433 e para as amostras do Grupo 4 (sem tratamento), o soro
fisiológico estéril foi introduzido no canal radicular na mesma quantidade, sem a realização de nenhuma intervenção terapêutica.
4.3 CONTAMINAÇÃO DO SISTEMA ENDODÔNTICO
Para a contaminação do sistema endodôntico foi realizada uma cultura pura de Enterococcus faecalis ATCC 19433, em meio BHI (Brain Heart. Infusion) Difco® (Le Pont de Claix/France). Após 24h observou-se o crescimento pela turvação do tubo, homogeinização por agitação do tubo com o equipamento Vortex, tomada de uma
alíquota de 10μl para um novo tubo contendo 10ml de BHI, transferência para estufa bacteriológica a 36oC por 24h e repetição após 48h.
Uma micropipeta automática foi utilizada para a contaminação dos canais radiculares com 10μl de cultura de E. faecalis em caldo de BHI, com a concentração da bactéria de 1x106 bactérias/ml. Em seguida as aberturas de acesso do conduto foram seladas com uma bolinha de algodão estéril e Coltosol® (Vigodent, Rio de Janeiro, RJ). Os espécimes foram colocados em ambiente estéril e mantidas em estufa a 36ºC e umidade relativa de 100% durante 18h, respeitando o tempo de incubação determinado pela curva de crescimento estabelecida neste estudo, ou seja, fase log ou exponencial, quando o processo de envelhecimento não é detectado entre células de uma mesma população (Fig. 3).
Curva de Crescimento
Enterococcus faecalis
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 4 8 16 24 36 48 72 96 Horas Log de c é ls ./ te m poFIGURA 3: Curva de crescimento do Enterococcus faecalis (LABEM – ICS – UFBA, 2008)
4.4 COLETA
As amostras foram coletadas antes do uso do fotossensibilizador (Grupo 1), laser (Grupo 2) e FL (Grupo 3), para confirmar a contaminação dos canais. A coleta microbiológica foi realizada com auxílio de pinça clínica e cones de papel estéreis nº40 (Dentisply, Petrópolis, RJ) para cada raiz, mantidos no interior do canal por 60s. Este procedimento foi realizado duas vezes, utilizando dois cones de papel para cada canal radicular.
Os cones de papel de cada canal foram colocados em tubos de ensaio (15/100) contendo 9ml de caldo de cultura BHI, homoneiginazados em agitador tipo Vortex, durante 60s. Tal procedimento permite a liberação das bactérias absorvidas pelo cone de papel e a dispersão das mesmas.
Para cada grupo foi preparado um esfregaço em lâmina e corado pelo método de Gram para verificar a morfologia das bactérias, ou seja, sua caracterização.
4.5 TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL
Cada tubo contendo os cones de papel gerou um número de diluições determinado através de estudo piloto. Quanto maior o número esperado do microrganismo pesquisado, maiores são as diluições usadas, aumentando o volume de trabalho e de material a ser utilizado (Fig. 4). Neste estudo foram inoculadas três séries
com diluições decimais de 10-6. Para a leitura final foram consideradas as três diluições mais significativas. Assim, o arranjo de número de tubos foi transposto para tabelas estatísticas que informam o NMP para diferentes combinações de tubos positivos e que incluem os limites de confiança do NMP da bactéria estudada.
FIGURA 4: Distribuição dos tubos contendo o meio de cultura BHI
4.5 FOTOSSENSIBILIZADOR - GRUPO 1
Foi utilizado o composto fenotiazínico, associação do AM e AT na concentração de 100μg/ml em porções iguais (1:1 v/v), formulada na farmácia de manipulação A Fórmula (Salvador, BA).
Após a incubação da suspensão do microrganismo, as raízes tiveram seus canais radiculares impregnados com 10μl do fotossensibilizador por 5min, como
TPI. Irrigação com soro fisiológico estéril e nova coleta. Encaminhamento para estufa bacteriológica a 36oC e com 24 e 48h leitura e coleta dos dados. O composto fenotiazínico foi acondicionado em recipiente de cor âmbar, recoberto por papel alumínio, reforçado com fita isolante e mantido sob proteção da luz e em ambiente refrigerado à temperatura de 4°C a 8°C.
4.6 IRRADIAÇÃO DAS AMOSTRAS COM EQUIPAMENTO LASER E FIBRA ÓTICA - GRUPOS 2 e 3
Foi utilizado o laser semicondutor InGaAIP, Twin Flex® (MMOptics, São Carlos, SP) de emissão contínua (CW), com comprimento de onda (y) 660nm (laser terapêutico vermelho); potência 40mW; densidade de energia de 3,6J/cm2, tempo de
90s, sistema de entrega de feixe por fibra óptica de ∅300μm (preconizado pelo fabricante). Registro do aparelho na ANVISA: 80051420006; Classe 3R: IEC 60825-1/2001 (Interntational Standart) ou Classe 1 Tipo BF. NBR IEC 60601-1.
O processo químico com solução de glutaraldeído 2% foi utilizado por 24h, para a descontaminação da fibra ótica. A fibra foi, então, lavada em água estéril e enxugada com gaze estéril. Estas foram colocadas no bico de metal adicional (autoclavado), rosqueado o mesmo na caneta laser para a realização do procedimento
O Grupo 2 foi trabalhado somente com o laser. O Grupo 3 sofreu a impregnação com o fotossensibilizador e posteriormente as raízes foram irradiadas com o laser. Nos dois grupos a irradiação ocorreu em uma única etapa, com duração de 90s (Fig. 5).
FIGURA 5: Irradiação das amostras com fibra ótica acoplada à peça de mão
A fibra ótica preconizada pelo fabricante foi introduzida no comprimento do canal estabelecido pela odontometria, sem ativação do laser. A partir de então, o laser foi colocado em funcionamento, depois de aferido de acordo com o parâmetro de energia adequado.
Durante todo o procedimento de aplicação do laser, foram utilizados dois bicos de Bunsen criando uma zona de imunidade em torno de 30cm, mantendo o campo de trabalho asséptico.
A partir desta última coleta de cada grupo foram preparadas diluições decimais sucessivas e subseqüentes até 10-6 por transferência de 1ml de alíquota de cada diluição em séries de três tubos (15/100) contendo 9ml de caldo BHI.
Produzindo-se colônias em cultura com crescimento espaçado e Produzindo-separado, viáveis para o processo de contagem (Fig. 6).
FIGURA 6: Tubos contendo meio de cultura BHI para aplicação da técnica NMP
Após as 48h em estufa microbiológica, novos dados foram coletados, observando-se a turbidez dos tubos. O arranjo dos números de tubos positivos das três diluições foram transpostos para tabelas estatísticas de Hoskins que informam o NMP para as diferentes combinações e que ainda incluem os limites de confiança dos números mais prováveis do microrganismo E. faecalis em função desta.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Durante o processo de análise dos dados, a primeira etapa consistiu na análise descritiva e de distribuição das variáveis, em relação aos grupos de estudo. Devido às características destas variáveis (nº inicial de UFC de E. faecalis e variação
do nº de UFC após procedimentos) utilizaram-se testes não paramétricos para verificar as associações entre os períodos pré-procedimentos e pós-procedimentos nos grupos Composto Fenotiazínico (1), Laser (2) e Fotossensibilização Letal (3) (Teste de Kruskal-Wallis) bem como, para comparação entre os grupos (Teste de Mann-Whitney). Em todas as situações foi arbitrado um valor de significância de 5% (p< 0,05) para refutar a hipótese de nulidade. Para todas as análises utilizou-se os programas Excel, versão 3.0 e MINITAB®, versão 14. Para a representação gráfica dos quartis, mínimo, máximo e outliers, construiu-se os diagramas do tipo Box-Plot.
Posteriormente, para a apresentação da análise de eficácia de cada método calculou-se a proporção relativa de redução microbiana a partir de tabela de contingência.
5 RESULTADOS
5.1 ESTATÍSTICA DESCRITIVA
A análise descritiva das variáveis foi realizada segundo grupos de intervenção, utilizando como padrão de referência a contagem de colônias apresentada para cada grupo em NMP/ml X 104, além de seus intervalos mínimo e máximo. A mediana foi selecionada por ser o estimador mais adequado à distribuição.
Devido às características das variáveis (nº inicial de UFC de E. faecalis e variação do nº de UFC após procedimentos) utilizaram-se testes não paramétricos para verificar as associações entre os períodos pré-procedimentos e pós-procedimentos nos grupos Composto Fenotiazínico (1), Laser (2) e Fotossensibilização Letal (3).
5.2 TESTAGEM ENTRE OS CONES
Observou-se que, não houve diferença estatística na comparação entre os cones I e II na maior parte dos grupos (Tabela 2). Somente no grupo controle Fenotiazínico observou-se diferença significativa (p-valor-0,02), optando-se assim pela homogenização entre os cones.
Tabela 2
Testagem entre grupos - NMP/ml x 104 versus Cones no Pré e Pós Tratamento
Cone I pvalor Cone II pvalor
Mediana Intervalo Inter-quartil Mediana Intervalo Inter-quartil Composto fenotiazínico Pré-tratamento Pós- tratamento 240,0 240,0 5,9 10,2 0,14 1100,0 2,4 9,1 4,8 0,02 Laser Pré-tratamento Pós- tratamento 46,0 46,0 7,07,0 0,65 110,093,0 8,0 8,0 0,65 Fotossensibilização Letal Pré-tratamento Pós- tratamento 24,0 4,6 7,3 8,8 0,84 110,0 1,1 7,7 6,2 0,25
5.3 TESTAGENS ENTRE GRUPOS E SEUS RESPECTIVOS CONTROLES
Quando se comparou o tratamento com o seu respectivo controle, somente o grupo laser não apresentou eficácia. Nos grupos fenotiazina e FL, destaca-se a redução significativa (p-valor=0,004) na redução de colônias de 67,0 para 1,6 em ambos os grupos. Este mesmo resultado não foi identificado entre os grupos Controle Laser e Laser, ambos apresentando a mediana de 69,5 (Tabela 3).
Tabela 3
Comparação dos grupos de tratamento com seus respectivos controles.
Grupos Mediana Intervalo
Inter-quartil p-valor
Controle CF X CF 67,0
1,6
19,0
10,0 0,004
Controle Laser X Laser 69,5
69,5 15,0 14,0 0,730 Controle FL X FL 67,0 1,6 19,0 10,0 0,004
5.4 TESTAGEM ENTRE GRUPOS
Quando comparados os grupos de tratamento (Tabela 4; Fig. 8), observou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos 1 – Composto fenotiazínico e 3 – Fotossensibilização letal (p-valor=0,013) e entre os grupos 2 - Laser e 3 – Fotossensibilização letal (p-valor=0,000). Os grupos laser e Composto fenotiazínico tiveram desempenho similar na redução das colônias, sem diferença estatística (p-valor=0,27).
Tabela 4
Comparação entre grupos Teste Kuskal-Wallis – NMP/ml X 104.
Grupos
(mediana; intervalo inter-quartil)
p valor
Composto fenotiazínico X Laser
(25,0;12,8) (69,5; 16,2) 0,27
Composto fenotiazínico X Fotossensibilização Letal (25,0; 12,8) (1,6; 10,6)
0,01
Laser X Fotossensibilização Letal (69,5;16,2) (1,6; 10,6)
grupo N M P / g X 104 laser fotossensibilização fenotiazina controlelaser controlefoto controlefenotiazina 1200 1000 800 600 400 200 0 35 1,6 69,5 69,5 67 780 Boxplot of NMP/g X 104 vs grupo
FIGURA 7: Gráfico tipo Box Plot: resultados referentes aos procedimentos nos grupos de estudo, relacionados com a variação ocorrida entre as coletas pré e pós-procedimento, indicando a distribuição não paramétrica.
5.5 ANÁLISE DA EFICÁCIA
A diminuição percentual de colônias pós-terapia para o grupo tratado somente com Composto Fenotiazínico (grupo 1) foi de 95,51%. Para o grupo tratado somente com Laser (grupo 2) foi de 0%, para o grupo tratado somente com Fotossensibilização Letal (grupo 3) foi de 97,02% (Tabela 5).
Tabela 5
Percentual de redução de colônias (Análise da Eficácia) por grupo
GRUPO % 1 95,51 2 -3 97,02
