A diminuição percentual de colônias pós-terapia para o grupo tratado somente com Composto Fenotiazínico (grupo 1) foi de 95,51%. Para o grupo tratado somente com Laser (grupo 2) foi de 0%, para o grupo tratado somente com Fotossensibilização Letal (grupo 3) foi de 97,02% (Tabela 5).
Tabela 5
Percentual de redução de colônias (Análise da Eficácia) por grupo
GRUPO % 1 95,51 2 -3 97,02
6 DISCUSSÃO
Neste estudo foram utilizados dentes humanos extraídos conservados em solução salina estéril (SHOOP et al, 2004). Optou-se pelo método de esterilização com óxido de etileno, que permitiu obter esterilização total de todo o conjunto dos grupos, ou seja, os dentes foram colocados em placas de cultura de células, incluídos em cera utilidade (FEGAN & STEIMAN, 1995).
O microrganismo selecionado para este estudo foi a bactéria gram positiva, E. faecalis. (KISHEN, GEORGE e KUMAR, 2006; PECIULIENE et al, 2000). Neste estudo analisou-se a eficácia da FL ante ao microrganismo E. faecalis, por este não ser sensível ao preparo químico-cirúrgico de rotina, por sua prevalência nas situações de fracasso (SIQUEIRA Jr. et al., 2004), por se tratar de um microrganismo que produz mono infecções, por sua capacidade de penetrar nos canalículos dentinários (LIN et al, 2005; FRANZEN et al, 2007) por ser mais sensíveis à FL in vitro de 100 a 1000 vezes comparando-se a espécies gram negativas (GARCEZ et al, 2007).
Na tentativa de retratar uma situação clínica real, objetivou-se trabalhar com a quantidade de bactérias encontradas no interior dos condutos radiculares mais próximas do que ocorre na situação clínica e, também, ao estudo prévio da curva de crescimento da bactéria estudada.
Inoculou-se uma quantidade de bactéria em torno de 106bac/ml, de acordo com as pesquisas da literatura, em que são encontrados infecção no conduto radicular, por ser um valor médio de bactérias recuperadas e por se saber que, este
número de CFU/ml observado na literatura, varia de 104 a 109 (SUNDQVIST, 1992; PECIULIENE et al, 2000; PECIULIENE et al, 2008).
A suspensão inoculada no interior do conduto radicular, 10μl em cada conduto, foi similar à maioria dos estudos nos quais os efeitos bactericidas no interior do conduto radicular foram pesquisados (GARCEZ et al, 2003; KLEISLER et al, 2003; GARCEZ et al, 2007; FONSECA et al, 2008)
Existem diferenças metodológicas relativas ao tempo de permanência do inócuo no interior do conduto radicular até o momento do tratamento. Uma curva de crescimento foi realizada com o propósito de estabelecer as características de crescimento da cepa de E. faecalis, para nortear o tempo de aplicação do tratamento. As diferentes fases da curva de crescimento do E. faecalis mostram-se influentes na formação de biofilme, onde a maior formação ocorreu no final da fase exponencial e início da fase estacionária (MARQUES, 2004).
O estudo piloto deste trabalho revela o tempo inicial da fase estacionária diferente de Marques (2004). Utilizou-se o tempo de crescimento de 18h, quando a suspensão de microrganismos se encontrava no final da fase logarítmica e início da fase estacionária de crescimento. Neste momento ocorre o aumento de resistência bacteriana ao estresse oxidativo externo, além do aumento do nível de antioxidantes intracelulares. Alguns autores sugerem que o efeito letal da FL parece estar relacionado à fase de crescimento exponencial (NUÑEZ, 2007; NYSTRÖM, 2003).
A técnica do NMP utilizada neste estudo permitiu estimar a densidade de microrganismos viáveis presente nos tubos sob análise. Este tipo de análise é principalmente utilizado quando se espera um baixo número de microrganismos. As amostras são preparadas de forma que o meio e as condições de incubação permitam
a recuperação e detecção de ao menos uma célula viável do organismo alvo (FRANCO, 2003).
O grupo controle negativo foi inoculado com soro fisiológico estéril e sem tratamento. Quando aplicada a técnica do NMP não houve crescimento em nenhuma das diluições encontradas.
Os fotossensibilizantes AM e AT foram selecionados devido à baixa toxicidade, aceitação no campo médico e potencial antimicrobiano fotoativo (GARCEZ
et al., 2003). Na contagem de microrganismos submetidos à terapia fotodinâmica foram relatadas reduções estatisticamente significantivas (ZANIN, et al., 2002).
A escolha deste composto ocorreu devido a sua capacidade de absorção da luz no comprimento de onda que varia de 625 a 660nm (WAINWRIGHT, 1998). Algumas bactérias, como E. faecalis, não absorvem a luz visível, daí a necessidade de um fotossensibilizador para que se fixe a sua membrana, atraindo a luz para a mesma.
Os resultados deste estudo sugerem que a composição do AM associado ao AT, por agirem em sítios diferentes e específicos dentro da célula bacteriana, poderia alcançar uma ação antimicrobiana suplementar.
Wainwright (1998) considerou como vantagem o uso da FL por apresentar pouca probabilidade de permitir o aparecimento de bactérias resistentes, ser de fácil manuseio e aquisição e de baixo custo, proporcionar a morte microbiana mais rápida, sem a necessidade de manutenção de altas concentrações na área infectada por grandes períodos de tempo (ZANIN, et al., 2002), envolver mínimos efeitos colaterais, ausência de ação sistêmica (TEICHERT et al., 2002).
Embora já esteja bastante documentado para os fenotiazínicos quando elaborados separadamente, a comparação deste estudo quanto ao elemento
fotossensibilizador, não foi possível, uma vez que não foram encontradas pesquisas na odontologia com este composto.
A concentração utilizada para o composto fenotiazínico foi de 100μg/ml (1:1, v/v). Os resultados obtidos nos grupos da FL e do composto fenotiazínico utilizado sem laser, demonstraram um efeito bactericida sobre o microrganismo estudado, resultando em reduções estatisticamente significantes.
A concentração do AM e do AT para erradicar bactérias depende de sua capacidade de formar dímeros, com isso, ocorre a mudança da absorção máxima do corante a um comprimento de onda menor (USACHEVA, TEICHERT e BIEL, 2003).
Quanto maior a concentração do fotossensibilizante, maior sua atividade antimicrobiana. O baixo peso molecular desses corantes, suas cargas positivas e a hidrofilia permitem penetrar com sucesso na membrana plasmática bacteriana (USACHEVA, TEICHERT e BIEL, 2001). Estes fatos corroboram com o resultado obtido neste estudo, no qual o grupo onde se utilizou o composto fenotiazínico isoladamente, sem a presença da luz laser ocorreu redução bacteriana no percentual de 95,51%.
Diversos pesquisas apresentaram eficiência nas concentrações para o AT: de 10 µg/ml a 200 µg/ml (KÖMERIK et al., 2002; KÖMERIK et al., 2003; MATEVSKI et al., 2003; FONSECA et al., 2008); e para o AM: de 10 µg/ml a 200 µg/ml (USACHEVA, TEICHERT e BIEL, 2001; USACHEVA, TEICHERT e BIEL, 2003a; USACHEVA, TEICHERT e BIEL, 2003b; KRESPI et al., 2005; MARINHO, 2006; KAIRALLA, 2006; FOSCHI et al., 2007).
Optou-se por uma concentração testada tanto para o AM, como o AT. Concentração esta, capaz de eliminar as bactérias em associação com o laser e, se
empregada sozinha, fosse eficaz na redução microbiana. Portanto, estabeleceu-se a concentração do corante em 100 µg/ml (SEAL et al. 2002; ZEINA, et al., 2003; MARINHO, 2006; ZANIN et al., 2006).
O tempo necessário para que o corante se ligue à bactéria alvo é conhecido como tempo de pré-irradiação (TPI)(SEAL et al. 2002; ZANIN et al., 2002), consagrou-se por ser o tempo necessário para que o corante possa passar através dos canais de proteína da membrana plasmática bacteriana e empregnar a célula (USACHEVA, TEICHERT e BIEL, 2001). O TPI estabelecido para este estudo foi de 5min, que está de acordo com as pesquisas de Marinho, 2006; Kairalla, 2006; Foschi et
al., 2007; Fonseca et al., 2008.
Para o grupos do composto fenotiazínico e da FL, após o TPI, o corante foi removido por meio de lavagem com soro fisiológico estéril, o que viabilizou ao máximo sua remoção, observando-se neste momento o manchamento da dentina.
A dentina pode ser impregnada pelo corante devido à concentração e ao TPI do composto fenotiazínico utilizado. Por este motivo, estudos como o de Garcez et
al. (2003) e Brasil (2006), associam o corante azuleno ao endo PTC. Afirmam que esta associação é facilmente removida do canal por irrigação com solução salina, água ou hipoclorito de sódio, afastando o risco de manchamento do dente.
A redução microbiana realizada com laseres de baixa potência já tem sido demonstrada, especialmente naqueles estudos onde o laser está associado ao corante. Foi utilizado o laser semicondutor InGaAIP, Twin Flex® (MMOptics) de emissão contínua (CW), com comprimento de onda 660nm (laser terapêutico vermelho); potência 40mW; densidade de energia 3,6J/cm2 (preconizado pelo fabricante); tempo
90s; sistema de entrega de feixe por fibra óptica de 300μm, apresentando ressonância ao composto fenotiazínico empregado como corante.
Obteve-se uma redução bacteriana de 97,02% para o grupo onde se utilizou a FL; de 95,51% para o grupo onde se utilizou somente o composto fenotiazínico e nenhuma redução para o grupo onde se utilizou o laser diodo de baixa potência isoladamente frente a suspensão da bactéria E. faecalis.
O equipamento de diodo de baixa potência foi selecionado por seu sucesso em estudos sobre FL, por sua portabilidade, dimensões reduzidas, facilidade no transporte, manuseio, versatilidade e baixo custo. Neste estudo, foi irradiada a luz laser de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante do aparelho de laser, que já havia sido testado em outros estudos (GARCEZ et al., 2007; GARCEZ et al., 2008).
Existe uma grande discrepância quando se compara os protocolos utilizados na irradiação laser. Estes parâmetros não podem ser confrontados em sua totalidade, pois há variação da densidade de potência, densidade de energia, tempo de irradiação, diâmetro da fibra ótica, fotossensibilizador, tempo de pré-irradiação, concentração, forma de irradiação. Além do que, devem ser considerados os diferentes microrganismos testados, estágios fisiológicos diversos dos mesmos, variações anatômicas presentes nos canais radiculares, como seu comprimento e calibre, o que faz com que se proponha a busca de protocolos diferenciados para a FL em canais radiculares com lesões persistentes (BRASIL, 2006).
No presente estudo, os resultados testando a eficácia frente aos microrganismos E. faecalis, coincidem com os estudos de Garcez et al (2006), que utilizou o laser diodo (660nm) obtendo uma redução significativa, assim como os
estudos de Kairalla, 2006; Muller, 2006; Soukos et al, 2006; Foschi et al, 2007; Bergmans et al., 2008 e Fonseca et al., 2008. Confirmando que, a dose preconizada de 3,6J/cm2 foi suficiente para reduzir a bactéria estudada, no grupo onde foi utilizada a técnica da FL.
Neste estudo utilizou-se de fibra com diâmetro (∅) de 300μm, compatível com o diâmetro do último instrumento endodôntico. Esta é constituída do núcleo (polymethyl-metacrylate) e a capa (fluorinated polymer). Comprimento de cada fibra: 55mm; diâmetro inicial 1mm com redução do diâmetro, na ponta, até 0,3mm; porcentagem de acoplamento óptico em torno de 30%.
A geometria da fibra utilizada neste estudo apresenta superfície cônica, atuando como difusores de energia favorecendo a distribuição homogênea dos fótons ao longo do canal, direcionando a radiação com um mínimo de perdas (RIBEIRO, 2006). Com o objetivo de diminuir a perda de energia, a porção da fibra ótica, que não foi introduzida no canal radicular, foi recoberta por fita isolante preta. A flexibilidade da fibra utilizada neste estudo permitiu atingir os canais com poucos graus de curvatura e que não podem ser preparados até lima nº40.
Observamos durante a execução deste estudo que, para que a entrega da luz laser seja distribuída o mais homogênea possível, procurando reduzir a distância entre as fibras e as paredes dentinárias, é necessário que fibras óticas com diferentes
taper sejam desenvolvidas, a fim de se evitar a perda de energia. Na região apical ocorreu melhor adaptação da fibra. Estas observações combinam com os comentários de Ribeiro (2006).
Sabe-se também que, os fatores ambientais relacionados à cavidade oral podem alterar a ação do fotossensibilizador e promover a diminuição da eficiência da
irradiação. Os resultados encontrados nos estudos in vitro de Matevski et al. (2003) e Nunes et al (2005), nos quais foram estudadas a presença de sangue, saliva e outros fluidos, alterando à absorção da luz na FL e atuando como uma barreira às bactérias, devem ser mais considearados..
Diversos estudos clínicos têm sido realizados testando a ação cumulativa de técnicas e procedimentos a procura de melhores resultados. É importante, no entanto, observar a avaliação da metodologia empregada, a fim de que seja reproduzível na clínica odontológica e assim transpor para o padrão in vivo, como sugerido por Garcez et al. (2008).
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente estudo, permitem concluir que:
• A Fotossensibilização Letal mostrou-se eficaz como agente bactericida no modelo de dente contaminado com Enterococcus faecalis num percentual de 97,02%.
• Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos da Fotossensibilização Letal e do composto fenotiazínico.
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