RESISTÊNCIA VARIETAL À CVC
Luiz Carlos DonadioPaulo Sérgio de Souza Elena P. G. Jaimes
Jaboticabal - SP Funep
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2001
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Donadio, Luiz Carlos
D674r Resistência varietal à CVC / Paulo Sérgio de Souza e Elena P. G. Jaimes. -- Jaboticabal : Funep, 2001
29 p. : il. ; 21 cm. (Boletim citrícola, 19) 1. CVC - Resistência varietal. I. Título.
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO ... 1 2. RESISTÊNCIA VARIETAL À CVC ... 4 3. EXPERIMENTO 1 – Variedades da Itália, Portugal e
Espanha ... 5 4. EXPERIMENTO 2 – Variedades da França e Itália ... 15 5. EXPERIMENTO 3 – Variedades da França, Itália e
Espanha ... 19 6. CONSIDERAÇÕES GERAIS... 26 7. LITERATURA CITADA ... 27
RESISTÊNCIA VARIETAL À CVC
1. INTRODUÇÃO
A CVC mantém-se como a doença dos citros mais importante da última década pelos prejuízos que tem causado à citricultura brasileira, inicialmente para o Estado de São Paulo e depois para os demais estados citrícolas. Sua importância decorre do fato de afetar todas as variedades de laranja-doce, a espécie mais importante da citricultura nacional, e também boa parte das outras espécies e dos porta-enxertos usados comercialmente. Algumas variedades de tangerinas e de híbridos têm mostrado maior resistência à doença, causada por uma bactéria (Chang et al., 1993; Hopkins, 1989), o que leva a supor que existe alguma resistência genética em espécies e tipos de citros. Isso levou ao estudo de avaliação do comportamento de variedades cítricas em relação à doença, pela inoculação ou simples observação do seu comportamento em presença do patógeno.
Sabendo-se que apenas as quatro variedades de laranja-doce-Pêra, Natal, Valencia e Hamlin perfazem cerca de 97 % da espécie plantada no Estado de São Paulo e que são o grupo mais importante para a indústria de citros do Brasil, a procura por outras variedades resistentes à CVC torna-se importante como opção para diversificação e também para controle da doença. Na última década, cerca de 100 milhões de plantas cítricas foram plantadas, tanto para reposição de pomares velhos, como para substituição daqueles afetados por doenças como a CVC, sendo em sua maioria das citadas variedades e boa parte oriunda de viveiros sem controle de sanidade, o que faz supor possam ter sido plantadas já infectadas pela doença (Amaro et al., 1997). Isso levou à constatação de que cerca de 4,l milhões de plantas entre zero e cinco anos de idade em l996 estavam com CVC. Nesse
mesmo ano, 34,1 % de todas as plantas cítricas do Estado de São Paulo tinham a doença em algum grau de infecção. Dados recentes do Fundecitrus (2001) indicam que 36,44 % da plantas cítricas das regiões de São Paulo e Triângulo Mineiro apresentam a doença em níveis 1 e 2 de severidade.
O levantamento do Fundecitrus de 2001 mostra também que a incidência da CVC é diferente de acordo com a região, ou seja, no E. de São Paulo, a região mais afetada é a do Norte, com 48,6 %, seguida da Noroeste, com 40,85 %, e próxima da do Centro, com 39,01, e do Sul, com apenas 17,33 %. A Figura 1 mostra estes dados para os níveis 1 e 2 da doença.
Figura 1. Incidência de CVC por região – 2001 em São Paulo
(Fonte: Fundecitrus).
Considerando a faixa etária dos pomares paulistas, atualmente a faixa entre zero e 2 anos tem a menor incidência da CVC, com 7,17 %, seguida pela faixa acima de 10 anos de idade, com 29,70 %, estando nas faixas entre 3 e 5 anos e 6 e 10 anos as maiores incidências da doença, com 43,04 e 48,5 %, respectivamente. Esses dados talvez reflitam os maiores cuidados com o plantio de mudas sadias nos últimos anos para a faixa etária mais baixa, como o efeito dos plantios do início da década para as faixas etárias entre 3 e 10 anos, no caso da maior incidência. A Figura 2 mostra esses dados. Os levantamentos de l996 a 2001 da incidência de CVC nos
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Norte Noroeste Centro Sul
Nota 1 Nota 2 Total
pomares paulistas de citros mostram uma tendência de crescimento da doença, o que vem ocorrendo também em outros estados. A Figura 3 mostra os dados do citado período, em que nos três últimos anos há uma certa estabilização ao redor de 36 % de plantas afetadas. Apesar dos diversos métodos de controle aplicados e dos resultados satisfatórios obtidos com o uso de mudas sadias, poda (Carlos et al., 1997) e controle do vetor, os danos econômicos à citricultura causados pela CVC são muito elevados, o que poderia ser minimizado com o uso de variedades resistentes.
Figura 2. Incidência de CVC por idade – 2001 em São Paulo
(Fonte: Fundecitrus).
Figura 3. Incidência de CVC – 1996 a 2001 em São Paulo (Fonte:
2. AVALIAÇÃO DE RESISTÊNCIA VARIETAL À CVC
Estudos de resistência varietal à CVC têm sido feitos por várias instituições, mostrando desde o início a suscetibilidade das variedades comerciais de laranja-doce (Machado et al., 1992 e Li et al., l996a) e também de várias outras da mesma espécie. Alguns outros trabalhos mostraram que há diferença, mesmo entre laranjas-doces, e que outras espécies e variedades podem ser resistentes à doença (Machado et al., l994; Beretta et al., l993; Laranjeira et al., 1996a, Pompeu Jr. et al., 1998).
A CVC ataca quase todas as variedades comerciais de laranja-doce no Brasil (Lee et al., 1992). Li et al. (1996a), mediante estudo com 128 variedades ou clones de laranja-doce, verificaram que os sintomas de CVC começam a se apresentar três meses após a inoculação artificial, tanto dentro como fora de estufa. Li (1997) constatou ausência de sintomas típicos de CVC e também ausência da bactéria Xylella fastidiosa em testes sorológicos em kunquat, limão ‘Siciliano’, lima ‘Mexicana’, lima-ácida ‘Tahiti’, laranja-azeda, pomelos ‘Marsh Seedless’ e ‘Star Ruby’, tangerinas ‘Poncã’, ‘Dancy’ e ‘Satsuma Okitsu’, e híbridos (‘Satsuma’ x ‘Natal’) 1, 2 e 3. Em função desses resultados, este grupo de citros foi considerado como resistente à bactéria.
Estudos realizados com diferentes variedades de citros verificaram que, nas condições de Mirassol, apenas a laranja ‘Westin’ mostrou-se como promissora em termos de potencial de convivência com a doença (Laranjeira et al., 1996). Em estudo realizado por Li et al. (1996a), tanto dentro como fora de estufa, por meio de inoculação artificial, verificaram-se diferenças de suscetibilidade entre clones de laranja ‘Natal’, em que o clone Natal 1 mostrou-se menos afetado pela doença que os demais clones testados.
Quanto aos porta-enxertos, vários deles apresentam-se resistentes ou tolerantes à doença, porém esapresentam-se
comportamento não confere resistência às variedades copas testadas sobre os mesmos (Li et al., 1996b).
Devido às dificuldades de obtenção de híbridos com características agronômicas desejáveis, acompanhadas de tolerância ou resistência à CVC, torna-se imprescindível avaliar os materiais genéticos já existentes e mantidos usualmente em coleções de Banco Ativo de Germoplasma (BAG) como, por exemplo, o do Centro de Citricultura “Sylvio Moreira” (CCSM), em Cordeirópolis, SP. Muitas variedades de laranjas pertencentes ao citado BAG já foram testadas e mostraram-se suscetíveis à doença (Li, 1997). Dessa forma, a introdução e a avaliação de materiais genéticos diferentes, de outros bancos de germoplasma, poderão ampliar as chances de obtenção de variedades de laranja-doce ou de seus híbridos com resistência ou tolerância à doença (Mourão Filho et al., 1997).
A Estação Experimental de Citricultura de Bebedouro mantém vários experimentos nessa linha de pesquisa, com apoio do Fundecitrus, da Embrapa (Cenargen), do CNPq e da Fapesp. Os resultados parciais dessas pesquisas são aqui comentados.
3. EXPERIMENTO 1 – Variedades da Itália,
Portugal e Espanha
O experimento foi conduzido na Estação Experimental de Citricultura de Bebedouro (E.E.C.B.), Bebedouro, SP, em estufa, coberta com plástico transparente, tendo nas laterais tela antiafídica com malha de 1 mm.
Os genótipos estudados são constituídos de 34 variedades de laranja-doce (Citrus sinensis L. Osbeck), 5 de tangerinas (C. reticulata Blanco) , 3 de tangelos (C. reticulata x C. paradisi), 2 de citranges (Poncirus trifoliata x C. sinensis), 1 de tangor (C. reticulata x C. sinensis), 1 de pomelo (C. paradisi Macf), 1 de limão (C. limon (L.) Burm. f.) e 1 híbrido ([C. reticulata x C. paradisi] x P. trifoliata)
introduzidos pela E.E.C.B. de bancos de germoplasma da Itália, de Portugal e da Espanha.
Foto 1. Mudas das variedades multiplicadas em viveiro telado
na EECB.
A implantação e a condução do experimento foram iniciada pela semeadura, em abril de 1997, em tubetes contendo substrato à base de casca queimada de pínus (95% de Plantimax, 3% de orgânico humificado, 0,5% de superfosfato simples e 40 g de sulfato de zinco), realizadas em estufa.
Após atingirem o tamanho de 20 cm, selecionaram-se os melhores exemplares, que foram transplantados, em outubro de 1997, para sacos plásticos de 4 litros (tamanho 15x25 cm), com substrato à base de solo (65% de terra areno-argilosa, 20% de esterco de curral, 10% de vermiculita, 3% de adubo orgânico humificado, 1% de superfosfato simples, 0,5 % de calcário dolomítico e 0,5% de NPK 12-06-12) e mantidos em estufa.
Procedeu-se à adubação foliar uma vez por semana, com solução contendo NPK (10-04-07) – 150 mL/100L e
microelementos (6,0% de sulfato de Zn, 2,0% de Mn, 0,5% de ácido bórico) – 150mL/100L, durante todo o ensaio.
Foram ainda realizados, sempre que necessários, controle de pragas e doenças, desbrota de plantas, capinas e irrigação. Para que a temperatura interna da estufa não ultrapassasse 35oC, fez-se o controle por meio de irrigação, quando necessário.
Para obtenção de ramos como fontes da bactéria X. fastidiosa foram selecionadas plantas de laranjeiras ‘Pêra’ apresentando sintomas típicos da doença em folhas e/ou frutos. Dessas plantas foram retirados os ramos para obtenção de garfos, de 4 cm de comprimento, tendo de 3 a 4 folhas com sintomas da CVC, e com idade de cerca de um ano, para inoculação por meio de enxertia (Foto 2).
O método de inoculação utilizado foi o de enxertia em pé-franco, por garfagem lateral com ramos finos doentes. Utilizaram-se três plantas de cada um dos quarenta e oito genótipos. Após a inoculação, as plantas foram podadas (aproximadamente um mês após o pegamento do enxerto), a cerca de 15 cm acima do solo, deixando-se, quando possível, uma gema no topo, do mesmo lado acima, e próximo do ramo fino enxertado (Foto 3).
Foto 3. Poda, após inoculação para brotação e avaliação de CVC.
Para o preparo das amostras para o teste de PCR retiraram-se 5 folhas maduras, principalmente da primeira vegetação. Após desinfecção superficial, com auxílio de tubo plástico e seringa, que foi encaixada no pecíolo da folha, contendo água destilada e esterilizada, promoveu-se a coleta de 15 gotas de exsudados do pecíolo de 4 a 5 folhas, pela pressão do êmbolo da seringa. A suspensão foi agitada, incubada em banho a 56oC por 30 min., agitada novamente e incubada por 10 min em banho fervente. O teste de PCR foi realizado no Fundecitrus.
No preparo das amostras para o teste ELISA utilizaram-se 5 folhas maduras da utilizaram-segunda vegetação. Em utilizaram-seguida, realizou-se desinfecção superficial, retirada do pecíolo juntamente com a nervura central, e posteriormente foram picadas com auxílio de lâmina de barbear e trituradas, em tampão PBS. Após filtração e acondicionamento, os extratos foram armazenados a -20 oC, até o momento de uso.
A determinação da bactéria deu-se por meio da metodologia DAS (Doble Antibody Sandwich) descrita por Chang et al. (1993), com anticorpos e conjugados produzidos na França.
As avaliações de sintomas foram feitas por contagens das lesões típicas de CVC, conforme a sintomatologia descrita por Rossetti & De Negri (1990); Lee et al. (1992); e Machado et al. (1992). As contagens de lesões foram feitas da 1ª à 3ª vegetação, nas primeiras 5 folhas.
Nas duas primeiras vegetações, 7 meses após a inoculação, não foram observados sintomas da doença. Em função disso, foram feitos testes de PCR de forma aleatória em algumas plantas, confirmando a presença da bactéria. Pôde-se verificar a presença de reações positivas nas plantas inoculadas das variedades de tangerina Cami e laranjas Setúbal, Pala e Doblefina.
A partir desses resultados fez-se um controle da irrigação, visando a induzir estresse nas plantas, evitando uma condição ótima de umidade. Assim, algumas plantas começaram a apresentar sintomas típicos, na primeira vegetação.
Algumas das variedades introduzidas apresentaram sintomas aos 8 meses após a inoculação, ao contrário do que observaram outros autores, os quais verificaram a presença de sintomas 3 meses após a inoculação.
Chang et al. (1993), por meio de inoculação mecânica, transmitiram a bactéria, e comprovaram pelo método sorológico ELISA, 3 meses após a inoculação, e os sintomas,
10 meses após. Nunes (1999), estudando vários métodos de transmissão, verificou, por meio de encostia com plantas sintomáticas, que mudas de laranja ‘Pêra’ em tambores plásticos de 100L, mantidas em local com tela antiafídica, apresentaram sintomas 4 meses após a inoculação. De acordo com esse mesmo autor, as plantas foram mantidas desde o início do experimento nessas condições, o que pode ser fator preponderante na eficiência da transmissão e expressão dos sintomas. Em outros experimentos desenvolvidos em estufa plástica, não foram obtidos os mesmos resultados.
Foto 4. Sintomas de CVC em plantas inoculadas.
Quanto à presença de sintomas, verifica-se que, na primeira vegetação, as variedades de laranja Doblefina, China,
Grada e tangerina Cami apresentaram sintomas nas três plantas inoculadas, e as laranjas Seleta tardia, Pardilhó, Vale dos Besteiros, Pala, Tua S/S, R.A.H., Tua Graúda, Amares, Portela, Setúbal 2, Tua Ponte, Tua 2, Murtera-IVIA-54, Tua, Setúbal e tangerina Carvalhaes apresentaram sintomas em duas plantas inoculadas, enquanto as variedades de laranja Vanilla, Maçã, Belladona, Prata da Ponte, Convento, Biondo di Caccia, Berna IVIA-43, Castellana IVIA-64-3, Torregrossa IVIA 103-6 e as variedades de tangerina Vaso e o pomelo T apresentaram sintomas em uma planta inoculada.
As variedades que apresentaram sintomas e deram resultados positivos nos testes PCR e ELISA foram laranjas Doblefina, China, Grada, Pala, Tua Graúda, Amares, Tua 2, Murtera-IVIA-54, Tua, Setúbal, Vanilla, Convento e tangerina Cami. O tangor Dweet IVIA-C-165 não apresentou sintomas, porém foi positivo nos testes utilizados, e as demais variedades, que não se encontram na Tabela 1, não apresentaram sintomas, e os testes utilizados foram negativos. Na segunda e terceira vegetações, as variedades de laranja Doblefina, Seleta tardia, Vale dos Besteiros, Pala, Tua s/s e Tua apresentaram sintomas nas folhas. De modo geral houve supressão dos sintomas da doença em quase a totalidade dos materiais, embora em alguns deles a presença da bactéria tenha sido detectada por meio dos testes empregados.
Nunes (1999) constatou, em condições de campo, que algumas plantas sintomáticas, em determinadas épocas do ano, se mostraram negativas nos testes de DIBA e PCR. Esses resultados estão de acordo com Hopkins (1989), segundo o qual X. fastidiosa pode viver no xilema das plantas assintomáticas, mas quando o hospedeiro encontra-se estressado, principalmente por fatores ambientais, os sintomas podem desenvolver-se. Por essas características, o autor sugere que essa bactéria seja um patógeno fraco e oportunista.
Tabela 1. Sintomas foliares e resultados dos testes PCR e ELISA
para detecção de CVC em variedades cítricas. EECB. 2001.
Os resultados dos testes, DAS-ELISA e PCR, encontram-se na Tabela 1. As variedades de laranja doce ‘Seleta Tardia’,
‘Setúbal’, ‘Amares’, ‘Murtera-IVIA-54’, ‘Doblefina’ e o tangor ‘Dweet-IVIA-C-165’ mostram-se suscetíveis à CVC, pois os dois testes foram positivos; juntamente com as variedades de laranja-doce ‘Tua’, ‘China’, ‘Vanilla’, ‘Tua Graúda’, ‘Tua 2’, ‘Pala’, ‘Convento’, ‘Grada’ e o híbrido ‘Mineola’ x P. trifoliata foram suscetíveis, pois um dos testes foi positivo. Dessas, apenas o híbrido ‘Mineola’ x P. trifoliata não apresentou sintomas. As demais não apresentaram sintomas nesse período de avaliação e foram negativas aos testes utilizados, podendo ser resistentes à CVC.
Estudos conduzidos em condições de campo constataram que todas as variedades de laranja estudadas apresentaram sintomas, comportando-se como suscetíveis à doença (Pompeu Jr., 1998). No presente estudo, foi verificado que poucas variedades de laranja estudadas apresentaram sintomas, comportando-se como suscetíveis à doença.
Em relação aos testes ELISA e PCR utilizados, verificou-se, pelo teste de concordância, que, no geral, 63% dos resultados obtidos foram confirmados pelos dois testes, enquanto, dentro das repetições, esse número foi maior. Isso se deve à amostragem em épocas e em estágios de desenvolvimento diferentes.
Como conclusões, de acordo com os dados obtidos neste experimento, pôde-se obter que, entre as variedades, híbridos e/ou clones testados, os que se expressaram positivos ao teste de PCR são considerados suscetíveis à Xylella fastidiosa; quanto à demais, os dados obtidos não permitem conclusões definitivas. Entretanto, pode-se aventar a possibilidade de que algumas variedades possam ser resistentes à CVC, o que seria muito importante para a citricultura. Por isso foi dado prosseguimento a este trabalho, visando testar novamente as variedades em condições de campo e inoculação por planta infectada com CVC (Fotos 5 e 6), cujos resultados devem ser obtidos até 2002.
Foto 5. Porta-enxerto ‘Cravo’ enxertado em planta de ‘Pêra’
doente, para obtenção de fonte de inóculo.
4. EXPERIMENTO 2 – Variedades da França e
Itália
Neste experimento foram testadas 24 variedades de tangerinas, 25 de tangores, 2 de tangelos, 2 de laranja-doce e 1 de pomelo.
Cada um dos 54 genótipos e a laranja ‘Pêra’ constaram de 4 plantas (repetições), as quais foram enxertadas com ramos contaminados.
A enxertia e a inoculação foram feitas ao mesmo tempo com as variedades copas e inoculadas com ramos contaminados com a bactéria no porta-enxerto. Entretanto, um mês após tornou-se necessário refazer a enxertia para inoculação em 40% dos genótipos testados, uma vez que não houve bom “pegamento”.
A metodologia para a inoculação da bactéria foi semelhante à descrita no Experimento 1. Um mês após a enxertia e a inoculação, as plantas foram podadas para induzir a formação de novas brotações da copa enxertada.
Após a implantação do experimento as plantas desenvolveram-se dentro de sacos plásticos de 4 litros (tamanho 15 x 30 cm), com substrato à base de casca de pínus semidecomposta (80%) e vermiculita expandida média (20%), 800 g de superfosfato simples/m³. Durante o desenvolvimento do porta-enxerto, foi feita fertirrigação, na concentração de 600 g de nitrato de cálcio, 390 g de nitrato de potássio, 140 g de monofosfato amônico, 280 g de sulfato de potássio, 200 g de sulfato de magnésio e 15 g de hidróxido de ferro por 100 L de água.
Quando as plantas foram levadas à estufa, onde o experimento foi conduzido, foram adubadas com 40 g de Osmocote 22-4-8. Os microelementos foram aplicados semanalmente mediante adubações foliares com solução contendo 6,0%, sulfato de Zn, 2,0% de Mn e 0,5% de ácido bórico, à base de 150 mL, durante todo o período de realização do ensaio.
Para obtenção dos ramos infectados pela CVC adotou-se a mesma metodologia descrita no Experimento 1.
Os testes de PCR e de ELISA realizaram-se em diferentes épocas, sendo o primeiro aos 8 meses após a inoculação e o segundo aos 11 meses. Os resultados acham-se na Tabela 2.
Tabela 2. Sintomas e testes de PCR e ELISA para CVC em
variedades de tangerinas e híbridos e outras espécies. EECB. 2001.
Tabela 2. Continuação...
OTA = Clementina x Tarocco; OMO = Clementina x Moro
A alta porcentagem de reinoculações, observada no primeiro experimento foi também reportada por Nunes (1999). Explica-se pela qualidade dos ramos inoculados, pois por serem altamente infectados pela bactéria é de esperar-se que não possuam a mesma capacidade de desenvolvimento apresentadas por um ramo sadio, prejudicando o sucesso do pegamento.
As variedades deste experimento não apresentaram sintomas típicos da CVC, após a inoculação.
Na avaliação realizada oito meses após a inoculação os resultados dos testes ELISA e PCR foram positivos para uma planta do híbrido OTA 14, duas plantas do tangor OMO 30 e uma planta dos híbridos OTA 14, OTA 23, OMO 17, mandarinas Rodeking SRA 431, Clementina de Nules VCR, Satsuma Miyagawa SRA 444, Encore SRA 190, Ampefy SRA 495, Satsuma Salzara SRA 341, OTA 15, Natal Tighskin SRA 481 e laranja ‘Pêra’ foram positivos só para a PCR.
As variedades Clementina Commune SRA 92, os híbridos OTA 11, OTA 35, OMO 29, Satsuma Saigon SRA 227 e duas plantas de laranja ‘Pêra’, que não foram positivas pela PCR, deram positivas no teste ELISA. Nos materiais restantes não foi detectada a presença da bactéria por nenhum dos testes aplicados.
A partir dos quatro meses após a inoculação, deu-se início às avaliações mensais de sintomas, porém até o mês de janeiro de 2001, quando foi feito o segundo teste, nenhuma planta apresentou sintomas. Entretanto, na segunda avaliação, realizada 11 meses após a inoculação, detectaram-se como positivas para os testes PCR e ELISA duas plantas do híbrido OTA 23, das quais uma havia sido detectada na primeira avaliação pelo teste de PCR; uma planta dos híbridos OMO 30 e laranja ‘Pêra’, que também foram detectadas pelo teste de PCR na primeira avaliação; e uma planta mandarina A. Peau Lisse, laranja Berna Peret IVIA 336, OMO 14, OMO 31, OTA 29, OTA 35 e OTA 27, os quais não foram detectadas na primeira avaliação.
A bactéria foi detectada exclusivamente por PCR em uma planta de mandarina Encore SRA 190, que também foi positiva na primeira avaliação, e em uma planta de mandarinas Antillase SRA 497, Satsuma Saigon SRA 227, Clementina Oroval SRA 335 e híbrido OMO 15, nos quais não foi detectada CVC na primeira avaliação.
Uma planta de mandarinas Page SRA 159, Ampefy SRA 495, Clementina Tomatera SRA 535, tangelo Allspice SRA 327 e híbridos OMO 24, OMO 30, OMO 31, OMO 17, OTA 14 e OTA 34 foram constatados como positivos pelo teste ELISA e não pelo PCR.
Os primeiros sintomas nas plantas inoculadas com Xylella fastidiosa foram observados a partir do 7º mês após a inoculação, sendo que estes testes foram observados nas variedades tangelo Allspice SRA 327, híbridos OMO 15, OMO 30, OMO 29, OMO 31, OTA 29, OTA 28, OTA 15 e laranja Sakatoro SRA 407.
Os genótipos mandarinas Fortune SRA 31, Fewtrell SRA 418, Lebom SRA 425, Clementina IVIA 355, Clementina Reina SRA 534, tangor Temple Sue Linda SRA 467, tangelo Mapo SRA 450, tangores H-56, OMO 12, OMO 28, OMO 16, OMO 13, OTA 12, OTA 32, OTA 33 e pomelo Ray Ruby SRA 604 não apresentaram sintomas nem foram positivos para os testes PCR e ELISA.
5. EXPERIMENTO 3 – Variedades da França,
Itália e Espanha
Para a condução do experimento foram utilizadas 55 variedades cítricas, introduzidas via borbulhas sadias pela Estação Experimental de Citricultura de Bebedouro (EECB), com a colaboração do Cenargen e Fundecitrus, de bancos ativos de germoplasma (BAG) da Itália, Córsega e Espanha (IVIA).
As variedades são as seguintes: laranjas - Fullamenuda IVIA 92, Valência Campbell, Sanford SRA 404, Hall SRA 394, Rotuna SRA 511, Clanor SRA 391, Barlerin SRA 568, Premier SRA 510, Navelina SRA 332, Fukuhara SRA 561, Gem SRA 393, Yoshida Navel SRA 558, Newhall Navel SRA 343,Casa Grande SRA 183, Barile SRA 559, Berna IVIA 43 e Pêra;
tangerinas - Mandarina Fewtrell SRA 418, Satsuma Kowano
SRA 167, Changsha SRA 413, Beaty of Glen Retreat SRA 261, Fuzhu SRA 599, Satsuma Unshu SRA 529, Malvasio SRA 115, Redskin SRA 428, East Índia SRA 414, Ponkan Yoshida SRA 585, Late Emperor SRA 423, Wallent SRA 438, Zanzibar SRA 442, Ananás SRA 410, Burgess SRA 412, Macaque SRA 426, Nova SRA 158, Clem. Commune SRA 85, Clem. Ragheb SRA 386, Clem. Oroval SRA 335, Clem. Commune SRA 88, Clementina 2kr Monreal, Clem. Oroval Y. 45, Clem. Nules SRA 389; tangores - OTA 17 (Clementina x Tarocco), OMO 20 (Clementina x Moro), OMO 27 (Clementina x Moro);
limões - Malti SRA 636, Kutdiken SRA 530, Asaasli SRA 632,
Fino SRA 344, Lapithou SRA 541, Menton SRA 625, Yedi-veren SRA 479, Karystine SRA 623, Walker SRA 6; tangelos - Nova SRA 158, Thornton Vero SRA 460, Guyane SRA 448 e Nocatee SRA 452. As citadas variedades e a ‘Pêra’ foram enxertadas em limoeiro ‘Cravo’, em agosto de 1997. Essas plantas permaneceram em uma estufa protegida com cobertura plástica e as laterais com tela antiafídica (malha 1 mm), na Estação Experimental de Citricultura de Bebedouro, São Paulo.
Todas as variedades deste experimento também estão sendo retestadas no campo e pela inoculação de plantas de Pêra infectadas com a bactéria da CVC, o que poderá comprovar os dados obtidos até o ano que vem, podendo resultar na seleção de variedades ou híbridos tolerantes à doença.
Foram inoculadas as 55 variedades por garfagem de ramos finos. Para cada variedade havia três repetições (2 plantas inoculadas e 1 planta testemunha). Para avaliar o comportamento à CVC, duas plantas de cada uma das variedades cítricas citadas foram podadas após 3 meses, a cerca de 15 cm do solo, deixando uma gema germinativa no topo da variedade enxertada. Do mesmo lado e embaixo, e próximo desta gema, enxertou-se um ramo fino doente de
laranja ‘Pêra’. Uma planta testemunha (não inoculada), por variedade, foi somente podada.
Durante a condução do experimento, foi utilizada uma metodologia de avaliação visual da incidência da doença por meio de contagens de lesões da CVC, conforme a sintomatologia descrita por Rossetti & De Negri (1990), Lee et al. (1992) e Machado et al. (1992). Foram feitas duas contagens de lesões da CVC em folhas, nos meses de julho e outubro de 1999.
As contagens de lesões foram realizadas na primeira e a segunda vegetação, nas primeiras cinco folhas de cada uma das vegetações selecionadas. Obteve-se uma média de número de lesões por folha para cada contagem (Tabela 3). Para a severidade da CVC na primeira vegetação das variedades cítricas, notou-se que todas as variedades sempre mostraram, em média, alguma incidência da doença, e não havia diferenças significativas entre elas quanto à severidade, indicando que as mesmas reagiram em um mesmo nível em relação à doença.
As outras variedades não citadas na Tabela 3 não apresentaram sintomas visuais da clorose variegada dos citros (CVC), ou seja, não foi possível identificar sintomas que caracterizam a doença, por meio de observações visuais.
As variedades Barlerin SRA 568, Gem SRA 393, Menton SRA 625, Lapithou SRA 541, Karystine SRA 623, Zanzibar SRA 442, Macaque SRA 426, Redskin SRA 428, Clem. Ragheb SRA 386, Clem. Commune SRA 88, Clem. Nules SRA 389 e tangelo Thornton Vero SRA 460 apresentaram sintomas da doença na 1ª vegetação, não ocorrendo o desenvolvimento da doença na segunda vegetação, até os 15 meses após a inoculação.
As variedades Sanford SRA 404, Clanor SRA 391, Premier SRA 510, Navelina SRA 332, Fuzhu SRA 599, Satsuma Unshu SRA 529, Barile SRA 559, tangelo Nova SRA 158 e Clem.
Oroval Y.45 apresentaram os sintomas visuais da doença somente na 2ª vegetação, não ocorrendo na 1ª vegetação.
As demais variedades apresentaram desenvolvimento dos sintomas tanto na primeira como na segunda vegetação, o que indica que estas variedades podem ser mais suscetíveis à CVC.
A avaliação da doença pelo teste sorológico (ELISA) para Xylella fastidiosa nas variedades de citros avaliadas neste experimento deu os seguintes resultados:
Na Tabela 3 estão apresentadas as variedades inoculadas submetidas ao teste sorológico ELISA para detecção da bactéria X. fastidiosa. As variedades cujo teste foi positivo são: Fullamenuda IVIA 92, Fewtrell SRA 418, Valência Campbell, OTA 17, Hall SRA 394, Rotuna SRA 511, Premier SRA 510, Gem SRA 393, Karystine SRA 623, Walker SRA 6, Casa Grande SRA 183 e Satsuma Unshu SRA 529. Para as demais variedades o teste serológico foi negativo.
Separando as variedades em grupos de laranjas, limões, tangerinas, tangelos e híbridos, nota-se que cada grupo apresentou alguma variedade positiva segundo o teste sorológico, concordando em parte com Laranjeira et al. (1996) e Li et al. (1996).
Nas variedades tangerina Fewtrell SRA 418 e tangor OTA 17, foi detectada a CVC somente mediante teste sorológico, não sendo constatada por meio de observação de sintomas nas folhas. As duas variedades cítricas laranja-doce Premier SRA 510 e tangerina Satsuma Unshu SRA 529 apresentam os sintomas na 2ª vegetação e foram positivas no teste ELISA. Já nas variedades laranjas-doces Gem SRA 393 e limoeiro verdadeiro Karystine SRA 623 apareceram sintomas somente na 1ª vegetação.
Tabela 3. Resultados de teste ELISA e sintomas visuais (número
médio de lesões) para CVC, em variedades cítricas, após inoculação (EECB, 2001).
Tabela 3. Continuação...
Resultados de teste ELISA e sintomas visuais (número médio de lesões) para CVC, em variedades cítricas, após inoculação (EECB, 2001).
Em função dos resultados obtidos, pode-se concluir, nas condições do experimento, que: são possivelmente mais suscetíveis à CVC as variedades de laranjas-doces Fullamenuda IVIA 92, Valencia Campbell, Hall SRA 394, Rotuna SRA 511, Casa Grande SRA 183 e limoeiro verdadeiro Walker SRA 6.
A contagem de lesões pela observação de sintomas visuais da CVC não é um método seguro para avaliar a severidade da doença, pois nas variedades de tangerina Fewtrell SRA 418 e híbrido OTA 17 não se pôde verificar sintomas visuais nas folhas das vegetações avaliadas, porém detectou-se a presença da bactéria mediante teste ELISA.
Algumas variedades não apresentaram sintomas, e a bactéria da CVC não foi detectada, o que pressupõe uma possível resistência, o que poderá ser confirmado nos testes de campo, com outro método de inoculação. Podem ser consideradas, até o momento, como resistentes à bactéria, necessitando de avaliações futuras para confirmação dos resultados obtidos. Todas as variedades deste experimento também estão sendo retestadas no campo e pela inoculação de planta de Pêra infectada com a bactéria da CVC, o que poderá comprovar os dados obtidos até então, podendo resultar na seleção de variedades ou híbridos tolerantes à doença (Fotos 7 e 8).
Foto 7. Planta inoculada com ramo doente de ‘Pêra’ no campo.
Foto 8. Vista geral do experimento de variedades para estudo
6. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Os dados gerais obtidos mostram que os sintomas nas folhas para muitas variedades de laranja doce foram positivos, isto é, houve algum tipo de sintoma, mesmo que pequeno ou representado por poucas e pequenas lesões. Entretanto esse tipo de avaliação mostrou-se inadequado, pois pode se confundir os sintomas de CVC com outros como o sarampo ou deficiências nutricionais, comuns em plantas em recipientes. Para PCR e ELISA apenas parte das variedades deu positivo, sendo que algumas variedades que deram positivo por um teste não repetiram no outro teste o mesmo resultado. Sendo o PCR o teste mais indicado, as variedades que foram positivo para CVC por este teste podem ser consideradas as mais suscetíveis à doença, sendo as que deram negativo possíveis resistentes, devendo ser melhor testadas.
Muitas variedades de tangerinas e híbridos testados em relação a CVC não deram sintomas foliares até 180 dias após a inoculação. Entretanto quando se aplicou os testes de PCR e ELISA varias delas deram positivo, indicando que estes testes são mais sensíveis e que há tangerinas e tangores suscetíveis à CVC. Para PCR algumas variedades e híbridos deram positivo, sendo que entre os híbridos os tangelos se mostraram mais tolerantes e os tangores mais suscetíveis. Entre clones da mesma variedade, como por exemplo entre as Satsumas ou Clementinas, há clones suscetíveis e outros possíveis resistentes. Parece, portanto, que a laranja doce, que é considerada suscetível à CVC, transmite esse carácter aos tangores, seus híbridos com tangerinas.
Laranjas doces, limões, tangerinas e híbridos foram testados por inoculação de ramos doentes com CVC, sendo que a maioria deu sintomas nas folhas, mas poucos no teste ELISA. Os sintomas foliares variaram muito de intensidade, o que pode levar a suspeita de alguma confusão com outros sintomas, como no caso dos limões, considerados resistentes,
mas com sintomas em algumas variedades. Estas, entretanto, podem ser híbridas, embora com características de limão. Esse método de contagem de lesões nas folhas não se mostrou eficiente. Quando não foi feito o teste de PCR, como no caso de um grupo de variedades, os resultados obtidos devem ser considerados preliminares, devendo ser reavaliados.
Como conclusão preliminar dos resultados comentados nos três experimentos pode-se dizer que se confirmou a maior suscetibilidade das laranjas doces e alguns dos seus híbridos, enquanto as tangerinas, tangelos e pomelos se mostraram mais resistentes à CVC. Entretanto há grupos de tangerinas mais suscetíveis que outras. Os métodos de inoculação e a transmissão da CVC não foram muito eficientes, havendo casos nos quais a doença aparecia em uma das plantas inoculadas e não em outras. O tempo para aparecer sintomas também variou de um experimento para outro, o que pode ser atribuído à época de inoculação ou às variedades testadas em cada um. Como os resultados não foram conclusivos, os testes de campo por mais tempo é que darão a palavra final quanto ao comportamento em relação à CVC do germoplasma avaliado.
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