Programa de Mestrado Interinstitucional em Bioengenharia
MANOEL DE JESUS MOURA JÚNIOR
ESTUDO POR FT- RAMAN DA AÇÃO DO LED DE BAIXA POTÊNCIA E DO ULTRASSOM TERAPÊUTICO EM MODELO EXPERIMENTAL DE TENDINITE EM RATOS
São José dos Campos – SP 2010
ESTUDO POR FT-RAMAN DA AÇÃO DO LED DE BAIXA POTÊNCIA E DO ULTRASSOM TERAPÊUTICO EM MODELO EXPERIMENTAL DE TENDINITE EM
RATOS
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Mestrado Interinstitucional em Bioengenharia
como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientadores: Profª.Dra. Emilia Ângela Loschiavo Arisawa ,Prof. Dr. Airton Abrahão Martin
São José dos Campos – SP 2010
Autorizo exclusivamenle
parâ ,Ìns acadèmicos
e ciêntÍficos,
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Dissertação apÍovada como requisito parcial
Biomédica, do Programa de Pós-Graduação
Desenvolvimento da Universidade do Vale do banca examinadora:
à obt€nção do grau de Mestre em Engeúada em Bioengenharia. do Inslilulo de Pesquisa e Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte
Prof. Prof. Proi. Prof.
Dr. MARIO OLIVEIRA LIMA (UNIVAP)
Dr. EMILIA ANGI,LA LOSCIIIAVO ARISAWA (U Dr. AIRTON A. MARTIN TNIVAP)
Dra. TATLA.NA DE SOUSA DA CUNHA (LINIFESP)
àaCr"L---Prof. Dra. Sandra Maria Fonseca da Costa Díetor do lP&D Univap
Ao meu pai, que mesmo não estando presente entre nós, nos deixou seu exemplo de honestidade, coerência e otimismo.
poder de Pai.
A minha esposa Sonale, pelo seu amor, compreensão e amizade.
A minha mãe Carmina, por estar presente em todos os momentos de minha vida com seu amor incondicional.
Aos meus irmãos Lisieux, Henrique e Lucimaura pela amizade sincera.
Aos meus diretores Iara Lira, Átila Lira e Antonieta Lira, pela contribuição na minha melhoria e qualidade profissional, como também de meus colegas.
Aos meus orientadores, Emilia Ângela e Airton Abrahão, pelo conhecimento e contribuição dispensados na realização desta dissertação.
Aos meus inestimáveis alunos e colaboradores Janderson Carvalho e José Mário Nunes, pela disposição e garra. Vocês são dez!
Ao professor Figueredo, pela sua grande participação e competência na realização desta pesquisa. Meu muito obrigado!
Ao professor Maia Filho, pela sua ajuda na parte prática e teórica deste projeto. Ao professor Douglas, pela sua paciência em me ensinar Física.
Ao Neto, pela sua contribuição na estatística deste trabalho.
A Maira, pela ajuda na realização da espectroscopia e da estatística Raman. E a todos que de alguma forma contribuíram com este objetivo.
RESUMO
Considerando que estudos indicam que o ultrassom terapêutico (UST) acelera as reparações tendinosas e que o LED promove aumento no número de fibroblastos e da síntese de colágeno, este estudo visou comparar através de análises histomorfométrica, histológica e por Espectroscopia Raman, a ação antiinflamatória das terapias utilizando LED de baixa potência e UST, em modelo experimental de tendinite. Foram utilizados 35 ratos Wistar (220 - 250g), divididos em 4 grupos e dois tempos experimentais (7 e 14 dias): T- indução de tendinite sem tratamento; U- indução da tendinite e tratamento com ultrassom no modo pulsado a 10%, com freqüência de 1MHz, intensidade de 0,5 W/cm² e tempo de 120 segundos; L- indução de tendinite e tratamento com LED terapia utilizando os parâmetros: dosimetria de 4 J/cm², comprimento de onda de 620 nm (+/-20) no tempo de 120 segundos; S- grupo sem indução de tendinite. A indução da tendinite foi realizada com injeção intratendínea de 10µL de colagenase no tendão calcâneo direito dos animais. O resultado histomorfométrico evidenciou efeito antiinflamatório extremamente significante (p< 0,001) quando comparados os grupos U em relação a S, no tempo experimental de 14 dias, e muito significante do mesmo grupo em relação ao grupo T (p<0,01). A análise por espectroscopia Raman mostrou que L7, U7 e U14 apresentaram maior variância, quando todos os grupos foram comparados entre si, fato explicado pelas mudanças bioquímicas teciduais induzidas pelos tratamentos utilizados. Os efeitos benéficos adjuvantes da terapia com LED e UST apresentaram ação antiinflamatória significativa acelerando a reparação tendínea.
ABSTRACT
Whereas studies suggest that therapeutic ultrasound (TUS) accelerates the repair tendon and the LED promotes an increase in the number of fibroblasts and collagen synthesis, this study was to compare by histomorphometric analysis, histology and Raman spectroscopy, the antiinflammatory action of LED therapy using low-power, UST, in an experimental model of tendinitis. We used 35 Wistar rats (220 - 250g) were divided into four groups and two experimental periods (7 and 14 days): T-induced tendinitis without treatment; U-induced tendinitis and treatment with pulsed ultrasound in 10% with a frequency of 1MHz, 0.5 W / cm ² for 120 / 2, L-induced tendinitis and treated with LED therapy using the parameters: dosimetry of 4 J / cm ², a wavelength of 620 nm (+ / - 20) in time of 120 seconds; S-group without induction of tendinitis. Induction of the tendinitis was performed with 10μL of intratendinous injection of collagenase in the animals' right Achilles tendon. The histomorphometric results showed anti-inflammatory effect highly significant (p <0.001) when comparing the groups with respect to U S in the experimental time of 14 days, and very significant in the same group in relation to the T group (p <0.01). The Raman spectroscopy analysis showed that L7, U7 and U14 showed the largest variance, when all groups were compared, a fact explained by biochemical changes induced by tissue treatments. The beneficial effects of adjuvant therapy with LED and UST showed significant anti-inflammatory action by accelerating the tendon repair.
Key words: LED, Ultrasound, tendinopathy, Raman spectroscopy.
2 REVISÃO NA LITERATURA ...24
2.1 Tendões... 24
2.1.1 O processo de reparo em tendão ... 27
2.2 ULTRASSOM...31
2.2.1 A Produção do Ultrassom ... 31
2.2.2 As Propriedades Físicas do Ultrassom... 32
2.2.3 Modos de propagação ... 34
2.2.4 Efeitos Fisiológicos da Aplicação do Ultrassom ... 34
2.2.5 Calibração ... 35
2.2.6 Meios de Acoplamento ... 36
2.2.7 Técnica de Aplicação do Ultrassom ... 36
2.2.8 Manipulação do Cabeçote Transdutor ... 36
2.2.9 Freqüência... 37
2.2.10 Área de Radiação Efetiva (ERA)... 37
2.2.11 Intensidade e Potência... 38
2.2.12 Dosimetria... 38
2.2.13 Duração do tratamento... 38
2.2.14 Indicações e Contra-Indicações ... 39
2.3 LED (Light Emitting Diode) ...39
2.4 Espectroscopia Raman...41
2.4.1 Breve Histórico ... 41
2.4.6 Aplicações Biomédicas... 47 3 OBJETIVOS...49 3.1 Objetivo Geral ... 49 3.2 Objetivo Específico ... 49 4 MATERIAL E MÉTODOS...50 4.1 Aspectos éticos ... 50 4.2 Tipo de pesquisa ... 50 4.3 Delimitação do Universo... 50 4.4 Aparelhos... 51 4.5 LED ... 51 4.6 Ultrassom... 52 4.7 Grupos experimentais... 53 4.8 Tempos experimentais... 55 4.9 Indução da tendinite... 55
4.10 Intervenção terapêutica experimental ... 56
4.11 Eutanásia dos animais ... 56
4.12 Preparação das amostras para análise pela Espectroscopia Raman ... 56
4.13 Realização da Espectroscopia ... 57
4.14 Procedimento pós Espectroscopia Raman ... 59
4.15 Avaliação Histológica... 60
4.16 Avaliação Histomorfométrica... 60
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...62
5.1 Tempo experimental – 7 dias... 62
5.1.1 Tendinite ... 62
5.1.2 Ultrassom ... 63
5.1.3 LED terapia... 64
5.1.4 Histomorfometria... 65
5.2 Tempo experimental – 14 dias... 66
5.2.1 Tendinite ... 66 5.2.2 Ultrassom ... 67 5.2.3 LED terapia... 68 5.2.4 Tendões Sadios ... 69 5.2.5 Histomorfometria... 70 5.3 Espectroscopia Raman... 71 6 CONCLUSÕES ...84 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...85 REFERÊNCIAS ...86 ANEXOS ...98
A tendinite é uma condição inflamatória do tendão agredido (CONTRAN; KUMAR; ROBBINS, 2005), onde o processo inflamatório agudo desencadeia o mecanismo de reparação tecidual. Entretanto, muitas vezes esse processo é exagerado e pode acarretar complicações, prejudicando a qualidade do tecido formado (SALATE, 2002). Tendinopatia é o termo genérico utilizado para descrever todas as doenças originadas nos tendões e ao redor deles (KHAN et al., 1999).
Segundo Lemos (2006), a cada ano observa-se um aumento significativo no número de pacientes que procuram tratamento relatando dor intensa, edema, diminuição na amplitude de movimento, diminuição da força muscular e alterações motoras, entre outros, levando a dificuldade na execução de suas atividades de vida diária e profissional.
Lesões tendinosas são comuns na prática esportiva, estimando-se que correspondam de 30% a 50% do total destas lesões (SALATE, 2002). Segundo Agliett, Buzzi e Insall (1993), a tendinite é um dos principais problemas relacionados às Lesões por Esforço Repetitivo (LER) e Distúrbios Osteomusculares Relacionados ao Trabalho (DORT), sendo esta uma lesão conseqüente à sobrecarga do próprio tendão, levando a microrrupturas em sua estrutura, esgarçamento de suas fibras e degeneração focal. Os numerosos estudos realizados nos últimos cem anos apontam as tendinites como a maior causa de sofrimento dos trabalhadores com atividade manual, bem como de indenizações trabalhistas (OLIVEIRA, 2001; TONIAL, 2004; GADELHA, 2006; LOPES, 2009).
As LER e DORT são, por definição, fenômenos relacionados ao trabalho (KUORINKA; FORCIER, 1995), decorrentes da utilização excessiva imposta ao sistema músculo-esquelético e da falta de tempo para recuperação, caracterizado pela ocorrência de vários sintomas concomitantes ou não, de aparecimento insidioso, geralmente nos membros superiores, tais como dor, parestesia, sensação de peso e fadiga. Abrangem quadros clínicos do sistema músculo-esquelético, adquiridos pelo trabalhador submetido a determinadas condições de trabalho (BRASIL, 2006).
No Brasil, a LER/ DORT representam a segunda causa de afastamento do trabalho, notificando-se 532.434 Comunicações de Acidentes de Trabalho (CATs), sem contar os trabalhadores que pleiteiam na Justiça o reconhecimento do nexo causal, em milhares de ações movidas em todo o País. A cada cem trabalhadores na região Sudeste, por exemplo, um é portador de Lesão por Esforço Repetitivo (AMERICANO, 2009).
A região Nordeste, segundo o DATASUS (2002), apresenta crescimento das taxas de incidência de doenças relacionadas ao trabalho. Em 1996, o índice era 0,9% passando para 1,2% em 1998. Dados abrangendo cinco gerências do Paraná, mostram que em janeiro de 2009 foram mantidos 1.223 benefícios para trabalhadores com indicação de LER/DORT. As categorias profissionais que encabeçam as estatísticas são bancários, metalúrgicos, digitadores, operadores de telemarketing, com maior incidência entre as mulheres e trabalhadores na faixa etária dos 30 aos 40 anos (COORDENAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE DO TRABALHADOR, 2009a).
Atualmente, o único censo existente em Alagoas sobre o número de trabalhadores atingidos pelas LER/DORT foi realizado pelo do INSS, totalizando 1.495 pessoas, embora deva ser ressaltado que esta análise se restringe aos trabalhadores da iniciativa privada (COORDENAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE DO TRABALHADOR, 2009b).
Os métodos tradicionais de diagnóstico são os exames clínicos, como os testes de Mills e Cozen e os exames radiológicos (Raio X e o ultrassom), além de exames laboratoriais como o de Velocidade de Hemossedimentação (VHS). Dentre os tratamentos convencionais, disponibilizam-se uma infinidade de antiinflamatórios não-esteroidais (AINEs), tratamentos fisioterapêuticos convencionais fundamentados na luz, correntes elétricas e no uso de calor profundo, entre outros (PORTER, 1991; CONTRAN; KUMAR; ROBBINS, 2005; SILVA, 2006; HEBERT; BARROS FILHO, 2009).
Nessa perspectiva, novos métodos de diagnóstico e de tratamento estão sendo introduzidos com a finalidade de amenizar e curar esta afecção. Hoje no mercado existem inúmeros recursos que utilizam a luz como terapia, dentre os quais podemos citar Light Emitting Diode (LED’s) e Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (LASER’s), que trabalham em média com uma potência de 4 J/cm², estimulando a aceleração da cicatrização de partes moles, com resultados satisfatórios no processo de regeneração de tendão (REDDY, 1999). O efeito cicatricial estimulado através da luz é caracterizado por três fatores principais. O primeiro se dá pelo incremento na produção de ATP (KARU; PYATIBRAT; KALENDO,
GRECCO et al., 1989). O segundo fator se dá pelo estímulo da microcirculação, melhorando o aporte de elementos nutricionais, associado ao aumento da velocidade mitótica, fazendo com que a multiplicação celular seja facilitada. O terceiro e último fator, até então observado, é a neoformação de vasos a partir dos já existentes (COLLS, 1984; SILVA, 1998).
Como terapêutica de alta freqüência, o ultrassom promove a regeneração tissular e reparação dos tecidos moles, síntese de proteína, aumento da circulação sanguínea, normalização do tônus muscular, ativação do ciclo do cálcio, estimulação das fibras nervosas aferentes, aumento de mobilidade da articulação, efeito sobre os nervos periféricos, aumento da extensibilidade em tecidos ricos em colágeno, redução de espasmos musculares, alívio da dor, resolução de processos inflamatórios crônicos (FUIRINI; LONGO, 1996; BASSOLI, 2001; PLANAS; CERVELLI; PLANAS, 2001; NOGUEIRA, 2008).
Em conjunção a estas novas técnicas terapêuticas, temos como meio diagnóstico in vivo e in vitro a Espectroscopia Raman, que consiste em um processo fundamental de troca de energia entre a luz e a matéria. Quando uma molécula é irradiada por uma radiação eletromagnética, esta radiação pode ser absorvida, transmitida ou espalhada. A maioria da radiação espalhada tem a mesma freqüência da radiação incidente, chamado de espalhamento elástico, ou Rayleigh, pois não há alteração da freqüência da radiação. No entanto, em uma pequena parcela desta radiação ocorre alteração da freqüência, e este espalhamento é denominado inelástico, ou Raman (BALL, 2001).
Esta nova técnica estuda os sistemas biológicos ao mesmo tempo em que caracteriza as alterações bioquímicas em diversas afecções, possibilitando diagnóstico clínico e a implementação terapêutica eficaz em tempo real. Oliveira Filho (2003), corrobora com essa afirmação em seu trabalho demonstrando a automatização do processo de diagnóstico não invasivo em lesões dentárias, utilizando a Técnica de Espectroscopia Raman Multicanal no Infra Vermelho Próximo, concluindo que a referida técnica pode ser usada para o diagnóstico não invasivo de lesões dentárias iniciais, tornando-se um instrumento vital na prevenção da doença Cárie. Moreno (2006) realizou trabalho utilizando células cancerígenas e analisando-as através da Espectroscopia Raman obteve sensibilidade e especificidade de 100% entre as seguintes doenças: carcinoma ductal in situ (CDI in situ); carcinoma ductal inflamatório, carcinoma medular e mucinoso; doença de Paget mamária; alterações funcionais benignas da mama, fibroadenoma e
mama normal. Os resultados confirmam que a Espectroscopia Raman é um método que apresenta alta acurácia para o diagnóstico de doenças mamárias podendo ser considerado para o uso in vivo. Penteado et al (2006) analisou por espectroscopia FT-Raman as alterações bioquímicas nos tecidos normais e degenerados dos tendões do supra-espinhoso do manguito rotador. Os espectros Raman mostraram diferenças nas regiões espectrais de cisteína, aminoácidos, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios. Estas diferenças espectrais foram atribuídas a alterações bioquímicas patológico, devido ao processo degenerativo do tendão. Estes resultados indicam que a espectroscopia Raman pode ser uma ferramenta muito promissora para o diagnóstico da quantificação da degeneração do tendão do supra-espinhoso do manguito rotador.
Considerando o exposto, o presente estudo tem por objetivo comparar o efeito antiinflamatório utilizando LED de baixa potência e ultrassom terapêutico em modelo experimental de tendinite através das análises histológica, histomorfométrica e por espectroscopia Raman, visando à aplicação desta nova tecnologia como método de diagnóstico não invasivo.
2.1 Tendões
Os tendões são estruturas cilíndricas alongadas que conectam os músculos aos ossos e representam um conjunto típico de tecido conjuntivo denso não modelado, formado por feixes densos e paralelos de colágeno, separados por muito pouca quantidade de substância fundamental amorfa, e fibroblastos, possuindo ainda, água e elastina. O colágeno confere resistência e força tênsil, a elastina confere elasticidade e a água capacidade de deformação elástica, com o objetivo de maximizar sua força. Os tendões são relativamente avasculares e contêm apenas uns poucos capilares escassos (STEVENS; LOWE, 2001; LOBATO, 2002; DANGELO; FATTINI, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2008).
A inervação dos tendões, a se julgar pelo padrão encontrado no tendão de Aquiles, é fornecida por nervos dos músculos circunvizinhos e por pequenos fascículos derivados dos nervos cutâneos. Os terminais nervosos podem ser classificados em quatro categorias, de acordo com suas características anatômicas e funcionais: (a) tipo I - corpúsculos de Ruffini; tipo II – corpúsculos de Vater-Pacini; (c) tipo III - órgãos tendinosos de Golgi; e (d) tipo IV - terminais nervosos livres. Os tipos I a III são mecanorreceptores com diferentes patamares de sensibilidade, situados na intimidade e na superfície externa dos tendões, convertendo estímulos de pressão ou tensão em sinais nervosos aferentes. Os terminais nervosos livres transmitem a sensação dolorosa (BJUR, ALFREDSON; FORSGREN, 2005).
Além de colágeno, a matriz extracelular contém fibras elásticas e substância fundamental, composta de proteoglicanos (principalmente decorina e hialuran), glicosaminoglicanos, glicoproteínas estruturais, além de grande número de pequenas moléculas e componentes inorgânicos. Certamente em decorrência de demandas funcionais, há uma grande variação entre diferentes tendões no que se refere ao conteúdo e à distribuição dos tipos de colágeno, bem como aos componentes matriciais (FAN et al., 1997; KANNUS, 2000; COVIZI et al., 2001; FRANCHI et al., 2007).
A junção miotendinosa é uma região anatômica altamente especializada na unidade músculo-tendão, na qual a tensão gerada pelas fibras musculares é transmitida das proteínas contrateis intracelulares para as proteínas extracelulares do tecido conjuntivo (fibrilas de colágeno); na junção osteotendinosa, o tendão transfere a força para um osso rígido; nesta, foram descritas quatro zonas histológicas distintas: (a) tendão; (b) fibrocartilagem; (c) fibrocartilagem mineralizada; e (d) osso (MAFFULI; KADER, 2002; SCHEPSIS; JONES; HAAS, 2002).
O colágeno, especialmente do tipo I, representa 65-80% da massa tendinosa I, contra 1-2% de elastina, sendo produzido pelos tenoblastos e tenócitos, que são, respectivamente, fibroblastos e fibrócitos alongados, localizados entre as fibras colágenas. Os tenoblastos e tenócitos representam cerca de 90-95% da população celular e em muito menor número se encontram condrócitos (em áreas de pressão e inserção tendinosa), células sinoviais (na bainha tendinosa) e as endoteliais e musculares lisas (nos diferentes tipos de vasos do endotendão e epitendão). Os tenócitos são células relativamente inativas e se distribuem num padrão longitudinal esparso entre as fibras colágenas, sendo a porção proximal do tendão mais rica em células que a distal (JOZSA et al., 1989; KIRKENDALL; GARRETT, 1997; KANNUS, 2000; BULLOUGH, 1997).
A estruturação do colágeno no tendão é altamente ordenada e complexa, contendo moléculas de tropocolágeno que consiste de uma cadeia polipeptídica solúvel disposta em hélice tripla, formando ligações cruzadas, originando moléculas de colágeno insolúvel que se agregam em microfibrilas e em unidades visíveis sob microscopia eletrônica. As fibrilas colágenas constituem um feixe de fibrilas, formando a fibra colágena que é o componente básico do tendão. A estrutura tridimensional dos tendões tem sido estudada tanto em humanos como em ratos. De acordo com resultados de pesquisas, a organização estrutural é ordenada de forma hierarquizada, como demonstrada pela Figura 1 (KANNUS, 2000; JOZSA et al., 1991; SQUIER; BAUSCH, 2007).
Figura 1: Organização hierárquica da estrutura do tendão. Fonte: Adaptado de Khan (1999)
Uma delgada bainha de tecido conjuntivo, o endotendão, forma um arcabouço que envolve cada uma das fibras de colágeno, agregando-as para constituir feixes primários de fibras, ou subfascículos, que por sua vez se agrupam em feixes secundários, ou fascículos, e os terciários, o conjunto dos quais constitui o tendão propriamente dito. O endotendão, formado por colágeno tipo III, além de sua função de ligação, constitui uma rede que permite o deslizamento dos grupos de fibras uns sobre os outros, bem como apresentam em seu interior vasos sanguíneos, nervos e vasos linfáticos, que nutrem a parte mais profunda do tendão.O tendão é inteiramente coberto pelo epitendão que, em sua face interna, conecta-se com o endotendão e, na externa, com o paratendão. O epitendão está formado por uma rede filamentosa e relativamente densa de colágeno, com fibrilas longitudinais, oblíquas e transversais. O paradentão tem como principais componentes os colágenos tipos I e III, além de fibras elásticase é revestido na face interna por células sinoviais (ELLIOTT, 1965; JOZSA; BALINT, 1978; KVIST et al.,1985).
As estruturas que circundam os tendões encaixam-se em cinco categorias: (a) as bainhas fibrosas ou retinaculae; (b) as polias; (c) as bainhas sinoviais; (d) faixa peritendinosa (paratendão); e (e) bolsas sinoviais. As bainhas sinoviais são mais frequentemente encontradas nos tendões das mãos e pés. Sob uma camada fibrosa, há duas faixas delgadas, a parietal e a visceral, que formam um túnel peritendinoso preenchido por líquido lubrificante. Nos tendões desprovidos de uma bainha sinovial verdadeira, pode haver o paratendão, descrito anteriormente, para amenizar a fricção. Como acima referido, o tendão é coberto pelo epitendão que, na sua face interna, conecta-se com o endotendão e, na externa, com o paratendão, encontrado, por exemplo,
no tendão de Aquiles ou do calcâneo (WILLIAMS, 1986; FAN et al., 1997; KANNUS, 2000; CORMACK, 2001; COVIZI et al., 2001; FRANCHI et al., 2007).
O tendão do calcâneo é o mais espesso e forte tendão do corpo, formado pela fusão dos músculos sóleo e gastrocnêmio. O músculo gastrocnêmio é composto de uma cabeça medial e lateral que se unem e formão um tendão largo e robusto na face posterior da perna, este se estreita, tornando-o mais arredondado distalmente. O músculo sóleo forma um tendão largo e profundo ao tendão do gastrocnêmio, dirigindo-se para a posição plantar, desliza livremente em sua extensão mais proximal, permitindo o movimento independente dos dois músculos e as suas inserções se fundem e fixam no calcâneo (MOORE; DALLEY, 2006; MAFFULLI; KADER, 2002; SCHEPSIS; JONES; HAAS, 2002).
2.1.1 O processo de reparo em tendão
As células estão constantemente sujeitas a lesões que podem resultar em morte celular e destruição dos tecidos. Em condições favoráveis, a resposta inflamatória aguda é adequada pra controlar o evento lesivo e preparar o local para a recuperação tecidual. O melhor efeito possível, obviamente, seria a resolução do processo inflamatório, com a remoção do exsudato inflamatório e a regeneração celular, ocorrendo substituição das células originais eventualmente perdidas. O resultado final, no entanto, pode ser influenciado por vários fatores locais e sistêmicos. Entre os quais se incluem: tipo, tamanho e localização da lesão, destruição ou dano substancial do arcabouço estromal e das membranas basais, suprimento vascular, infecção e movimentação precoce da área lesada. Nessas circunstâncias, a substituição do tecido lesado se dá por reparação fibrosa, um processo organizado pelo qual um dano tecidual é substituído por uma cicatriz. A cicatrização sobrepõe-se ao processo inflamatório e apenas por motivos didáticos os dois processos são separados (MANTINEZ-HERNANDES, 1999).
O processo de reparação tecidual é complexo e pode ser conceituado como uma cadeia de eventos, cada um completando o anterior e iniciando o subseqüente: hemostasia, inflamação, demolição, proliferação e maturação. O cenário de todo o processo é, portanto, a soma de três respostas: (a) homostática, porque os vasos sangraram; (b) inflamatória, porque houve dano celular, com ou sem infecção; e (c) regenerativa, porque houve perda de células (MAJNO; JORIS, 2004; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
coagulação sanguínea pode ser induzida por qualquer um desses dois mecanismos: (a) pelo contato com o colágeno e (b) por ação de fatores teciduais liberados pelas células lesadas. Além disso, as plaquetas formam tampões que ajudam a deter a hemorragia. É relevante mencionar que produtos dos mecanismos de coagulação também ajudam o processo cicatricial, a trombina atrai macrófagos e induz proliferação fibroblástica, enquanto citocinas e fatores de crescimento derivados de plaquetas têm atividade mitógena e quimiotática para leucócitos e fibroblatos (MAJNO; JORIS, 2004).
Modulado por numerosos mediadores químicos, o processo inflamatório é responsável pela remoção de restos celulares e pelo combate a possíveis agentes invasores, caracterizando-se pela presença de neutrófilos, macrófagos e linfócitos. A fase regenerativa manifesta-se por renovação celular, angiogênese, formação de matriz extracelular e retração da ferida (MAJNO; JORIS, 2004).
Os fenômenos hemostáticos e inflamatórios se reduzem progressivamente até desaparecerem. Na fase de maturação, a matriz temporária contendo colágeno tipo III é removida, sendo depositada a matriz definitiva, rica em colágeno tipo I, ocorrendo ligações cruzadas no colágeno, remodelagem e reabsorção capilar. Essas respostas são orquestradas, entre outros fatores, pelo tipo de lesão e pelo local afetado. No que se refere, ao tendão há certas peculiaridades a serem consideradas (MAJNO; JORIS, 2004; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
A reparação do tendão é classicamente considerada como extrínseca e intrínseca. Um dos modelos experimentais mais utilizados no estudo do processo de reparação é a tenotomização do tendão de Aquiles. A reparação intrínseca produz obliteração do tendão e sua bainha, tendo uma fase exsudativa e uma formativa que, em geral, são muito similares àquelas associadas com a cicatrização de feridas. A extrínseca ocorre através da quimiotaxia de fibroblastos especializados para a lesão a partir das extremidades seccionadas da bainha tendinosa. O processo pode ser dividido em três fases: inflamação, reparação e organização ou remodelação. Na fase inflamatória, que ocorre de três a sete dias após a lesão, células migram dos tecidos peritendinosso extrínsecos, como a bainha tendinosa, periósteo, tecido subcutâneo, bem como do epitendão e endotendão. Inicialmente, a resposta extrínseca supera de longe a intrínseca. Isto resulta no preenchimento rápido do defeito com hematoma, restos teciduais e tecido de
granulação. Fibroblastos migratórios se organizam de forma radial em relação ao sentido das fibras tendíneas e começam a sintetizar o colágeno em torno do quinto dia, e ao longo das cinco semanas seguintes o colágeno é sintetizado continuamente (GIGANTE et al., 1996; WANG, 1998; REDDY; BITTEL; ENWEMEKA, 1999; MAFFULLI; BENAZZO, 2000).
Pesquisa realizada por Gigante e colaboradores (1996) distinguiu as fases do processo de cicatrização do tendão do calcâneo em ratos. Averiguou-se que a fase de inflamação aguda finaliza-se em torno do sétimo dia após a lesão, assim como a fase proliferativa (7 à 15-20 dias), que é caracterizada pela angiogênese e posterior proliferação fibroblástica, desorganização da matriz, síntese de fibras de colágeno, sendo estas de diâmetro mais espessado (400 - 600 Å) do que na fase prévia, fibras elásticas imaturas em máxima concentração (30%) e fibras colágenas ao longo do eixo axial longitudinal do tendão com três semanas após a lesão. A fase de remodelamento ocorre 21 dias após a lesão, sendo que com 6 a 8 semanas o tendão assume um aspecto normal havendo ainda a presença de fibras de colágeno relativamente imaturas. A fase de remodelamento é caracterizada por um aumento na organização da matriz, diminuição do número de células, retorno vascular e nervoso normal, diâmetro das fibras de colágeno de 800 – 1000 Å e considerável aumento na deposição de elastina pelas fibras elásticas.
Enwemeka (1989) relata que as fases mais importantes para uma melhor reparação tecidual se darão na proliferação e remodelamento, onde ocorre o processo de síntese de fibras de colágeno e alinhamento das mesmas no eixo longitudinal do tendão.
Durante a quarta semana, tem lugar um aumento significativo na proliferação de fibroblastos de origem intrínseca, principalmente a partir do endotendão. Estas células assumem o papel principal no processo de cicatrização, tanto para sintetizar como reabsorver colágeno. O tecido recém-formado começa a amadurecer e as fibras de colágeno são cada vez mais orientadas ao longo das linhas tensionais do tendão. Esta fase de reparação continua por dois meses após a lesão inicial. A estabilidade final é adquirida durante a remodelação induzida pelo uso fisiológico normal do tendão. Isto orienta ainda mais as fibras na direção da força. Uma alta expressão do colágeno tipo I parece imprescindível para uma reparação mais rápida do tendão. Para isso, deve ocorrer uma mudança na produção inicial do colágeno de tipo III para a do tipo I. Assim, durante a fase de remodelagem, o colágeno tipo I, mais forte mecanicamente, é produzido em detrimento ao de tipo III, alterando ligeiramente, assim, a proporção inicial destas fibras para aumentar a força no local da cicatrização (ENWEMEKA, 1989; GIGANTE et al., 1996).
dificilmente é obtida. O diâmetro das fibras de colágeno é alterado, favorecendo as fibras mais finas com redução da força biomecânica do tendão. Assim, na tendinopatia e na ruptura do tendão aquiliano, há uma redução na proporção de colágeno tipo I, e aumento significativo na quantidade de colágeno tipo III, resultando na redução da força de tração. Além disso, microlesões recorrentes podem levar ao desenvolvimento de hipertrofia do tecido de reparação, que biologicamente é inferior ao tendão intacto. Na verdade, há evidências de que, no tendão, o processo de remodelagem matricial é contínuo, embora a taxa de renovação seja variável em diferentes localizações e uma alteração na atividade remodeladora está associada ao início da tendinopatia. As principais alterações moleculares incluem expressão aumentada do colágeno tipo III, fibronectina, tenascina C, agrecan e biglican das metaloproteinases, que são enzimas responsáveis pela degradação do colágeno (JOZSA et al., 1990; MAFFULLI et al., 2000; MAFFULLI; MOLLER; EVANS, 2002; CLEGG; STASSBURG; SMITH ,2007; RILEY, 2008).
Fatores de crescimento e várias outras citocinas desempenham um papel fundamental em diferentes etapas da reparação dos tecidos, na medida em que estimulam a proliferação e quimiotaxia celular, favorecem a angiogênese e influenciam a diferenciação celular. Não poderia ser diferente nos tendões. Fatores como o de crescimento-1 semelhante à insulina (IGF-1), o de crescimento de transformação-beta (TGF-β), o de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), o crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o de crescimento do endotélio vascular (VEGF), entre outros, estão aumentados no processo de reparação de tendões. No entanto, devido a sua meia vida biológica limitada e à complexidade do processo de reparação tendinosa, uma simples aplicação de fatores de crescimento provavelmente não terá efeitos significativos. Como não há disponibilidade biológica de proteínas orais, injeções locais repetidas seriam necessárias para se obter níveis terapêuticos aceitáveis, o que, tecnicamente, torna-se difícil.Assim, os trabalhos em sua a grande maioria são realizados em modelos experimentais (GROTENDORST, 1988; MAFFULLI et al., 2002; MOLLOY et al., 2003;CHEN et al., 2008; HOU et al.,2008).
O tendão é relativamente pouco vascularizado e sua nutrição depende em grande parte da difusão do líquido sinovial. No entanto, como em qualquer tecido lesado, a migração leucocitária a partir dos vasos sanguíneos é essencial para o processo de reparação. De fato, as respostas vasculares a danos do tendão e os mecanismos de angiogênese já foram descritos (FENWICK; HAZLEMA; RILEY, 2002).
2.2 ULTRASSOM
O ultrassom vem sendo utilizado na medicina com finalidade terapêutica, aplicado em animais e homens, revelando sua eficiência na resolução de muitas formas de lesões (GUIRRO; GUIRRO, 2007), resolução de edemas e processos inflamatórios (CUNHA, PARIZOTTO; VIDAL, 2001; ROMANO, 2001; MAIA FILHO, 2008; REIS, 2009); tratamento de fraturas, prevenção de aderências e contraturas (PLANAS et al., 1997; LOBATO, 2002), lesões cutâneas e úlceras de pressão (WEICHENTHAL et al., 1997; JOHANNSEN; NYHOLM; KARLSMARK, 1998), hematomas (BERNÁ-SERNA et al., 2005), fins estéticos (MATEO et al., 2000; MENDES, 2000), aplicação de medicamentos (KOZANOGLU et al, 2003; ROSIM, 2003; KOEKE et al., 2005) entre outros.
2.2.1 A Produção do Ultrassom
O aparelho de ultrassom terapêutico consiste de um gerador de corrente elétrica de alta freqüência, conectado a uma cerâmica piezoelétrica sintética de chumbo-zinco-titânio - (PZT) alojada em um transdutor, a qual se deforma na presença de um campo elétrico (STARKEY, 2001; GUIRRO; GUIRRO, 2007). Os transdutores transformam energia mecânica em energia elétrica e seu reverso, elétrica em mecânica. Isso ocorre quando o cristal piezoelétrico, natural ou sintético, é comprimido ou deformado por meio mecânico, resultando em uma pequena carga elétrica dentro do cristal. De modo inverso, se uma carga elétrica for imposta ao cristal, uma vibração da deformação mecânica da estrutura molecular do cristal pode acontecer (KAHN, 2001; MACHADO, 2004).
O efeito piezoelétrico (Figura 2) consiste na variação das dimensões físicas de certos materiais sujeitos a campos elétricos (OKUNO, 1982), fazendo com que o cristal contraia e expanda (PRENTICE, 2004), esse efeito foi descoberto por Pierri e Jacques Curie em 1880 (GUIRRO; GUIRRO, 2007). O ultrassom é produzido por meio do efeito inverso, a vibração do cristal causa a produção mecânica de ondas sonoras de alta freqüência (STRAKEY, 2001).
Figura 2: Efeito Piezoéletrico. Fonte: Prentice (2004).
2.2.2 As Propriedades Físicas do Ultrassom
O som desloca-se na forma de ondas, o que requer um meio natural para a sua transmissão. A onda é um fenômeno natural que tem por finalidade a transferência de energia de um ponto a outro pelo movimento das partículas (GUIRRO; GUIRRO, 2007). As ondas ultrassônicas possuem freqüência entre 20-20.000 Hz. Quando a freqüência está abaixo de 20 Hz, classifica-se como infra-sônica ou sub-sônica e acima de 20.000 Hz, classifica-se como ultrassônica (AGNE, 2005). A freqüência para diagnóstico de imagem varia de 1 a 20 MHz (OKUNO; CALDAS; CHOW, 1982) e para terapia de 0,75 a 3 MHz (PRENTICE, 2004).
Podem ser produzidos três tipos de ondas: Estacionárias, Longitudinais e Transversais. As ondas estacionárias decorrem da sobreposição das ondas ultrassônicas refletidas do músculo/osso ou tecidos moles/ar, sobre as ondas incidentes (meios com impedâncias diferentes). Nas ondas Longitudinais as partículas se deslocam paralelamente à direção do som, sofrendo uma
série de compressões e rarefações, sendo transportadas em meios líquidos e sólidos. As ondas transversas são as ondas que se deslocam perpendicular a onda sonora e podem atravessar apenas sólidos (OKUNO; CALDAS; CHOW, 1982; LOW; REED, 2001; MACHADO, 2004;
PRENTICE, 2004; STARKEY, 2001). Como os tecidos moles são compostos principalmente por líquidos, o ultrassom se propaga primariamente como uma onda longitudinal; porém, quando ele chega ao osso, se transforma em onda transversa (PRENTICE, 2004).
A velocidade com que a onda ultrassônica é transmitida para um meio depende da elasticidade e densidade desde meio. Ela é fundamental, pois é a base para calcular a impedância acústica que é a chave para a absorção (AGNE, 2005). Materiais mais densos e mais rígidos promovem maior velocidade de transmissão. Na freqüência de 1 MHz, o som se propaga pelos tecidos moles a uma velocidade de 1.540 m/s e pelo osso compacto a 4.000 m/s (PRENTICE, 2004).
A intensidade apresenta características diferentes no campo acústico, caracterizando no campo duas regiões distintas: o campo próximo ou zona de Fresnel onde acontecem os picos e depressões dos feixes e os efeitos terapêuticos; e o campo distante ou zona de Fraunhofer onde existe menor uniformidade e maior divergência (BASSOLI, 2001; LOW; REED, 2001; MACHADO, 2004; GUIRRO; GUIRRO, 2007).
Em geral, a energia prefere percorrer uma linha reta; entretanto, quando percorre um meio, seu trajeto é influenciado pelas alterações da densidade. A energia que atinge uma interface entre duas densidades diferentes pode ser refletida, refratada ou absorvida (STARKEY, 2001; GUIRRO; GUIRRO, 2007).
A reflexão ocorre quando uma onda não consegue atravessar a próxima densidade, ou seja, quando a impedância acústica dos meios for diferente (STARKEY, 2001; MACHADO, 2004; AGNE, 2005).
A refração é a mudança na direção de uma onda sonora ou de radiação quando ela passa de um meio ou tipo de tecido para outro (PRENTICE, 2004). Quando a onda de som penetra em um tecido ou interface, forma um ângulo que é chamado de ângulo de incidência, ao sair desse tecido ou interface, forma ângulo diferente que é chamado de ângulo de refração (FUIRINI; LONGO, 1996; STARKEY, 2001; KITCHEN, 2003).
A absorção ocorre através de um meio que recebe a onda e a transforma em energia cinética, que a transformada em calor (STARKEY, 2001; MACHADO, 2004).
2.2.3 Modos de propagação
As ondas ultrassônicas podem se propagar de dois modos, o contínuo e o pulsado. A diferença entre os dois modos está na interrupção da propagação de energia (BASSOLI, 2001). No ultrassom no modo contínuo, a intensidade do som permanece constante, sem modulação, com efeitos térmicos, alteração da pressão e micromassagem durante o tratamento. A energia estará sendo produzida em 100% do tempo (FUIRINI; LONGO, 1996; PRENTICE, 2004) e pode aquecer com eficiência tecidos localizados a 5 cm (ou mais) de profundidade, dependendo da freqüência utilizada (STARKEY, 2001).
No modo pulsado, a emissão é interrompida de forma periódica intercalando pausas com o fim de dissipar o mínimo calor gerado durante o impulso, caracterizando ondas sônicas pulsadas, moduladas em amplitude com freqüências de 16 Hz a 100 Hz, efeitos térmicos minimizados e alteração da pressão (AGNE, 2005).
2.2.4 Efeitos Fisiológicos da Aplicação do Ultrassom
As alterações fisiológicas nos dos tecidos podem ser agrupadas em duas classes, mais há sobreposição entre elas: Efeitos Térmicos e Não-Térmicos (KAHN, 2001; STARKEY, 2001; KITCHEN, 2003). Se todo o calor gerado pelo ultrassom não for dissipado pelos meios fisiológicos normais, ocorrerá o aumento da temperatura local, que resulta em efeitos térmicos. Se a dissipação do calor equivale à geração de calor, não há uma elevação resultante na temperatura, e os efeitos que podem ocorrer são denominados não-térmicos (LOW; REED, 2001).
Os efeitos térmicos e não-térmicos não acorrem de forma isolada no organismo, mas a proporção e a magnitude de cada um deles dependem do ciclo de fornecimento e da intensidade de saída. Quanto maior for o ciclo de fornecimento, maiores serão os efeitos térmicos; quanto maior for à intensidade de saída, maior será a magnitude dos efeitos (STARKEY, 2001). Quando adequado, os parâmetros de tratamento são selecionados; contudo, os efeitos não-térmicos podem estar presentes com efeitos térmicos mínimos (PRENTICE, 2004).
A prevalência de efeitos térmicos do ultrassom sobre os organismos ocorre somente nas intensidades superiores a 1 W/cm2, no modo contínuo, nas freqüências de 1-3 MHz (GUIRRO; GUIRRO, 2007). Existem muitas situações em que o ultrassom produz efeitos biológicos sem, contudo, envolver mudanças significativas na temperatura. Há algumas evidências indicando que os mecanismos não térmicos parecem exercer papel primário na produção de algum efeito terapeuticamente significante (KITCHEN, 2003).
Os efeitos não-térmicos do ultrassom terapêutico incluem: cavitação, microfluxo acústico, ondas estacionárias e micromassagem (KANH, 2001; LOW; REED, 2001; STARKEY, 2001; KITCHEN, 2003; PRENTICE, 2004; AGNE, 2005; GUIRRO; GUIRRO, 2007).
Os efeitos não-térmicos são a regeneração tissular e reparação dos tecidos moles, síntese de proteína, estimulação do calo ósseo, aumento da circulação tissular, diminuição de espasmos, normalização do tônus muscular, ativação do ciclo do cálcio, estimulação das fibras nervosas aferentes (FUIRINI; LONGO, 1996). Em Fisioterapia, o ultrassom tem sido utilizado no tratamento de diversas patologias e seus efeitos sobre os tecidos têm sido objeto de investigações (ROMANO, 2001).
2.2.5 Calibração
O aparelho precisa ser calibrado regularmente, uma vez por semana seria o ideal. O uso constante a que esse tipo de equipamento é submetido no ambiente clínico causa problemas na sua regulagem. É importante observar que a leitura no marcador de potência do aparelho não é um guia acurado sobre o que está realmente sendo emitido do cabeçote. O teste de cavitação deve ser realizado periodicamente e indica a emissão ou não da energia ultrassônica. Neste teste a cavitação deve ser visível na intensidade de 0,1 W/cm², no modo contínuo. Apesar de ser uma análise qualitativa, o teste pode fornecer uma indicação da intensidade emitida pelo transdutor, onde a uma potência de 5,5 a 6,0 W, a qual corresponde a uma intensidade entre 1,3 a 1,8 W/cm², pode-se observar a nebulização da água, desde que a freqüência de oscilação da cerâmica esteja próxima da normalidade (KITCHEN, 2003; GUIRRO; GUIRRO, 2007; NOGUEIRA, 2008).
A maior parte da reflexão da energia ultrassônica é verificada nas interfaces ar-tecido. Para garantir que o máximo de energia seja transmitido ao paciente, à face do transdutor deve estar paralelamente à pele, de modo que ultrassom atinja a superfície em ângulo de 90°. Se o ângulo entre a face do transdutor e a pele for maior do que 15°, grande porcentagem de energia será refletida, e o efeito do tratamento será mínimo (PRENTICE, 2004).
A transmissão adequada da energia ultrassonora para os tecidos depende de um meio de acoplamento que proporcione uma boa combinação entre a impedância acústica do metal da cabeça do transdutor e a pele (LOW; REED, 2001). O objetivo dos meios de acoplamento é excluir o ar da área entre o paciente e o transdutor de modo que o ultrassom possa atingir a área a ser tratada (PRENTICE, 2004).
2.2.7 Técnica de Aplicação do Ultrassom
A aplicação direta é realizada quando a superfície a ser irradiada é razoavelmente plana, sem muitas irregularidades, permitindo o perfeito contato de toda a superfície metálica do transdutor com a pele (GUIRRO; GUIRRO, 2007).
Uma camada de gel deve ser aplicada na área de tratamento em quantidade suficiente para manter um bom contato e lubrificação entre o transdutor e a pele, mas não tanto que permita a formação de bolhas de ar pela movimentação do transdutor (PRENTICE, 2004).
Deve-se aplicar uma pressão constante e firme para manter a fonte de ultrassom em contato com a pele. Pouca pressão pode criar acoplamento insuficiente, e muita pressão diminui a energia transferida para os tecidos, podendo causar desconforto ao paciente (STARKEY, 2001).
2.2.8 Manipulação do Cabeçote Transdutor
Em todos os métodos é importante mover o cabeçote continuamente em relação aos tecidos devido à grande irregularidade do feixe de ultrassom no campo próximo, a reflexão e refração no padrão de absorção de energia nos tecidos que é muito irregular, as ondas
estacionárias que podem se formar causando estase temporária das células sanguíneas circulantes e dano endotelial, e a cavitação instável ou aquecimento excessivo (com altas intensidades) que poderão causar dano tecidual (FUIRINI; LONGO, 1996; LOW; REED, 2001). O transdutor deve ser movimentado lentamente, a uma velocidade aproximadamente de 4 cm/s cobrindo uma área de tratamento de 2 a 3 vezes maior do que a Área de Irradiação Efetiva (ERA) do transdutor (PRENTICE, 2004).
2.2.9 Freqüência
O ultrassom terapêutico caracteriza-se por apresentar uma freqüência de 1 ou 3 mega hertz (MHz), sendo disponível atualmente também o de 5 MHz. Alguns equipamentos apresentam uma maior variação das freqüências na forma de onda pulsada (GUIRRO; GUIRRO, 2007).
O ultrassom de 1 MHz é transmitido através de tecidos mais superficiais e absorvido primariamente nos tecidos mais profundos, em profundidade de 2-5 cm. Com freqüência de 3 MHz a energia ou onda ultrassônica é absorvida nos tecidos mais superficiais com profundidade de penetração entre 1-2 cm, tornando-o ideal para tratar condições superficiais (PRENTICE, 2004).
2.2.10 Área de Radiação Efetiva (ERA)
É a porção da superfície do transdutor que realmente produz a onda sonora. Ela depende da área de superfície do cristal e de condições ideais, combinando com o diâmetro da placa frontal do transdutor. É determinada por meio do mapeamento do transdutor a uma distância de 5 mm da superfície de radiação, registrando todas as áreas com mais de 5% da potência máxima encontradas em qualquer porção da superfície do transdutor (PRENTICE, 2004).
A Área de Radiação Efetiva (ERA), geralmente é menor que a área da face metálica do transdutor. Isso ocorre porque o elemento piezoelétrico não vibra uniformemente. Sendo de 4 cm² para a maioria dos equipamentos nacionais. Alguns equipamentos dispõem de cabeçotes menores
falanges entre outros (AGNE, 2005; GUIRRO; GUIRRO, 2007).
2.2.11 Intensidade e Potência
Na maioria dos equipamentos atuais a intensidade varia entre 0,01-2,0 W/cm² e a partir da intensidade pode-se obter o valor da potência da radiação ultra-sônica emitida. Esse valor é conseguido multiplicando-se a intensidade pela a área de radiação efetiva. A Organização Mundial de Saúde (World Health Organization) limitou a intensidade em, no máximo, 3,0 W/cm², visando proteger o paciente contra efeitos biológicos desfavoráveis (GUIRRO; GUIRRO, 2007).
2.2.12 Dosimetria
A dose é produto da energia irradiada pelo tempo de tratamento. Esse julgamento precisa ser baseado nos fatores conhecidos que governam a absorção do ultrassom (LOW; REED, 2001; GUIRRO; GUIRRO, 2007). Na fase inflamatória, usam-se potências baixas (ultrassom pulsado), evitando-se com isso, efeitos térmicos indesejáveis. Na fase proliferativa, usam-se potências mais altas (ultrassom contínuo), observando a agudicidade e cronicidade das fases (MACHADO, 2004).
2.2.13 Duração do tratamento
As opiniões expostas sobre a duração do tratamento são variáveis. A duração depende da dimensão da área a ser tratada. Recomenda-se que seja despendido um tempo de tratamento total máximo de 10 a 15 minutos; sugere-se que as lesões crônicas se beneficiam de tempos de aplicação mais longos (FUIRINI; LONGO, 1996; LOW; REED, 2001; GUIRRO; GUIRRO, 2007).
2.2.14 Indicações e Contra-Indicações
As indicações do ultrassom são amplas. Entre elas podem-se citar traumatismos do tecido ósseo, de articulações e músculos como anomalias pós-traumáticas, distensões, luxações e fraturas, contraturas, espasmos musculares, neuroma, distúrbios do sistema nervoso simpático, pontos gatilhos, transtornos circulatórios, em condições inflamatórias agudas e crônicas, em reparo de lesões, no fibroedema gelóide, raynaud, úlceras varicosas, entre outras (FUIRINI; LONGO, 1996; STARKEY, 2001; HAYES, 2002; MACHADO, 2004; GUIRRO; GUIRRO, 2007).
O ultrassom pode ser uma terapia efetiva, ou um risco potencial, dependendo de sua forma de aplicação. Existem listas de contra-indicações e precauções como: áreas isquêmicas, tromboflebite e varizes, diretamente sobre endopróteses e implantes metálicos, sobre útero gravídico, pacientes menstruadas, tumores cancerígenos, áreas anestesiadas, infecção ativa, gônadas, área cardíaca, olhos, hemofílicos não tratados, placas epifisárias, alastramento de infecções, (FUIRINI; LONGO, 1996; KAHN, 2001; LOW; REED, 2001; STARKEY, 2001; AGNE, 2005; GUIRRO; GUIRRO, 2007).
2.3 LED (Light Emitting Diode)
Uma das grandes novidades no mercado comercial é o LED (Light Emitting Diode- diodo emissor de luz), que apesar de ser bem difundido na vida moderna, vem sendo recentemente utilizado e investigado na área biológica. A emissão deste tipo de luz se faz de forma não coerente o que a difere da luz laser (ANDRADE et al., 2001).
O LED é uma fonte de luz contínua com alta eficiência luminescente. Constitui-se de um diodo semicondutor (junção P-N) que quando energizado emite luz visível, encaixado em uma cúpula clara de epoxy que atua como uma lente (MAVROPOULOS et al., 2005).
O processo de emissão de luz pela aplicação de uma fonte elétrica de energia é chamado “eletroluminescência”. Geralmente, os LEDs são utilizados em substituição às lâmpadas de sinalização ou lâmpadas piloto nos painéis de aparelhos e instrumentos variados. Os LEDs têm grandes vantagens sobre as lâmpadas incandescentes convencionais. Eles não possuem filamento
atérmicos e possuem menor consumo energético (CORAZZA, 2005).
Desde a introdução da fotoestimulação na medicina, a efetividade de uma variedade de fonte de luz tem sido avaliada. Na última década, alguns pesquisadores demonstram a aplicabilidade do LED terapêutico em estudos experimentais e clínicos, demonstrando eficiência fotobiomoduladora celular semelhante à terapia Laser de baixa potência (LLLT) (BICUDO, 2004; MAVROPOULOS et al., 2005; MACHADO; RODRIGUES; MORAES, 2008).
Diante das evidências demonstradas pela NASA na aplicação do LED, a Food and Drug Administration (FDA) aprovou testes clínicos da aplicação de LEDs na cicatrização de feridas em humanos, devido ao insignificante risco de lesões na pele (WHELAN et al., 2001).
O LED diferencia-se do laser na formação da luz, pois quando o diodo de um laser está contido dentro de uma cavidade ressonante, promove fótons que são amplificados pela emissão estimulada da luz e proporciona feixes de luz coerente e colimado. Por outro lado, no LEDT (LED Terapêutico) não existe esta cavidade óptica, desprovendo a luz de coerência e colimação, mas produz uma banda de espectro eletromagnético próxima do laser, oscilando em uma amplitude de cerca de 20 nm, conforme demonstrado na figura 3 (CORAZZA, 2005; PACHECO, 2007).
Figura 3: Distribuição da energia do Laser e LED por banda espectral. Fonte: Corazza (2005).
A razão do aumento de pesquisas buscando comparar os efeitos da fototerapia com o uso de LEDs em substituição ao laser é que, diferentemente do comprimento de onda, a sua coerência ou sua falta não é um fator importante para o efeito biomodulador (SMITH, 2005). Assim, os LEDs apresentam grande potencial de ação, além de serem mais baratos que os lasers. Karu et al. (2005) analisando os resultados clínicos sob o aspecto das diferentes fontes de luz, afirmaram que não se pode concluir que os lasers têm maior potencial terapêutico que os LEDs.
A principal diferença da luz emitida pelo LED em relação à emitida por um laser é a ausência de coerência, pela alta divergência do feixe luminoso e pela emissão em uma faixa ampla do espectro eletromagnético, oscilando em uma amplitude de cerca de 20 nm (PACHECO, 2007).
Tanto o Laser de baixa potência (coerente) quanto o LED (não coerente) desencadeiam a modulação de processos fisiológicos. A coerência da luz não é responsável pelos efeitos de terapias com laser de baixa potência, pois esta propriedade se perde nas primeiras camadas de tecido biológico (BOULTON; MARSHALL, 1986; PONTINEN, 2000; WHELAN et al., 2000).
A terapia com LED promove o aumento da taxa de síntese de RNA e DNA, síntese de ATP, aumento da taxa de proliferação de células, aumento da taxa de produção de fibroblastos e da síntese de colágenos, aumento da vascularização (KARU; KOLYAKOV, 2005).
Os autores destacaram ainda que, como não existem protocolos bem definidos referentes aos melhores parâmetros terapêuticos dos LEDs, mais estudos são necessários para determinar as doses ideais de irradiação, potência e comprimento de onda, e para investigar os efeitos biológicos resultantes da interação entre a luz LED e o tecido-alvo. (SACONO et al., 2008).
2.4 Espectroscopia Raman
2.4.1 Breve Histórico
Embora Leonardo da Vinci, Rene Descartes, Isaac Newton, e muitos outros tivessem observado o espectro de cores produzido pela passagem da luz solar através de um prisma, as linhas escuras solares não foram descobertas até 1802, quando o médico William Hyde
escuras durante a busca de fontes monocromáticas de radiação (RUST et al., 2005).
Gustav Kirchhoff, em 1859, foi capaz de mostrar conclusivamente em seus estudos que cada substância pura produz um espectro de luz, originando a espectroscopia analítica. Kirchhoff, juntamente com Robert Bunsen, devolveu uma técnica que determinava a composição química da matéria acima do sol, através da análise espectroscópica (KYLE; SHAMPO, 1982).
No sentido de quantificar e explicar a origem de fenômenos espectrais, novos estudos foram realizados no início do século XX, iniciando com o modelo do átomo de hidrogênio até quando Niels Bohr, em 1913, desenvolve uma nova teoria mostrando que os níveis de energia do espectro de hidrogênio podem ser calculados com precisão. Entretanto, Bohr falha quando sua teoria é aplicada a outros elementos que tinham mais de um elétron, levando ao desenvolvimento da mecânica quântica por Werner Heisenberg e Erwin Schrodinger, em 1925, para explicar os espectros de mais elementos (LIPPINCOTT; WHATLEY, 1996).
A partir da descoberta dos espectros originais, foi desenvolvida a espectroscopia atômica moderna. As três principais variedades de espectroscopia em uso hoje são a de absorção, emissão e dispersão. A de absorção inclui a espectroscopia no infravermelho e ultravioleta, onde as medidas do comprimento de onda da luz absorvem uma substância, para dar informações sobre sua estrutura. A de emissão compreende a fluorescência e espectroscopia laser, que mede a quantidade de luz de um determinado comprimento de onda que uma substância reflete. A por dispersão inclui a espectroscopia Raman, detectando e analisando todos os comprimentos de onda que uma substância reflete sobre excitação (LAMBERT et al., 2006).
2.4.2 O Efeito Raman
Em 1928, Chandrasekhara Venkata Raman verificou experimentalmente o efeito Raman, pelo qual ganhou o premio Nobel em 1930. Em 1960 a técnica teve impulso com o advento do laser e começou a ser largamente utilizada na identificação e caracterização de materiais. Há 10 anos iniciaram-se as aplicações em análises biológicas, motivadas pelo desenvolvimento de novas técnicas de laser que fornecem radiação monocromática, por espectrógrafos que permitem uma dispersão eficiente e por detectores que possibilitam alta sensibilidade (BALL, 2001).
O efeito Raman é um processo de troca de energia entre a luz e a matéria. Quando uma molécula é irradiada por uma radiação eletromagnética, esta radiação pode ser absorvida, transmitida ou espalhada. A radiação emitida pode ser de três tipos: espalhamento Stokes, espalhamento anti-Stokes e espalhamento Rayleigh (Figura 4). A maior parte da radiação espalhada tem a mesma freqüência da radiação incidente, ou seja, espalhamento Rayleigh (elástico), pois não há alteração da freqüência da radiação (BALL, 2001; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).
No processo de espalhamento Raman a radiação que interage com a molécula é espalhada com freqüência ligeiramente modificada, sendo esta correspondente à diferença de energia entre dois estados vibracionais. Pode também vir a acontecer a interação inelástica, levando a molécula a um nível de energia excitada e posteriormente ocasionando perda de energia do fóton, sendo este espalhado com freqüências menores do que a da luz incidente. Estas freqüências Raman são denominadas de linhas Stokes. Quando temos matéria no estado excitado, a perda de energia pode ser ocasionada pela colisão da mesma com um fóton, fazendo com que os elétrons sofram uma transição para um estado de energia mais baixa, estas freqüências Raman são denominadas de Anti-Stokes (SALA, 1995).
Figura 4: Esquemas dos mecanismos de espalhamento: (a) Espalhamento Rayleigh - E=0; Espalhamento Raman: (b) Stokes - E = negativo e (c) Anti-Stokes – E= positivo. Ei = Energia Incidente, Es = Energia Espalhada e Ed =
Variação entre a Ei e Es.
Fonte: Sala (1995) adaptado de Faria (2006).
O diagrama da Figura 5 ilustra as trocas energéticas entre os níveis de energia de um sistema molecular. A transição do nível S0 para o nível S1, pela excitação do material com radiação ultravioleta e radiação visível, é acompanhada pela absorção de um fóton; a transição do material do nível S1 para o nível S0 é acompanhada pela emissão de um fóton. Este fóton emitido é denominado fóton fluorescente. A excitação do material com radiação infravermelha permite que apenas os níveis vibracionais sejam excitados, evitando-se a ocorrência da fluorescência (HANLON et al., 2000).
Figura 5: Diagrama dos níveis de energia. Fonte: Adaptado Hanlon (2000).
2.4.3 Classificação da Espectroscopia Raman
A classificação da espectroscopia Raman pode ter como base sua fonte de luz, podendo ser ultravioleta, visível e infravermelho. Este último possui a característica física de diminuir a autofluorescência. Os Lasers mais utilizados são Neudímio Nd:YAG e Titâneo-Safira (Ti:Safira) (SALA,1995).
Outra forma de classificação da Espectroscopia Raman se faz pela tecnologia empregada, podendo ser: Transformada de Fourier (FT-Raman) ou de sistemas dispersivos (SCHRADER et al., 1995).
2.4.4 ER com transformada de Fourier (TF)
A Transformada de Fourier emprega como fonte de excitação na Espectroscopia Raman o laser de Nd:YAG (1064 nm) que elimina a maioria dos fluoróforos, um interferômetro de Michelson-Morley, onde são agrupadas as freqüências do espalhamento Raman em um único sinal e um detector Ge que coleta vários comprimentos de onda em um curto período de tempo, livres da fluorescência, sendo o aparelho refrigerado por nitrogênio líquido (Figura 6). A excitação no infravermelho próximo a 1064 nm minimiza a degradação fotolítica da amostra. Ruídos eletrônicos são produzidos pelo detector Ge, e para adquirir espectro Raman de boa
minutos (MANOHARAN; WANG; FELD, 1996; HANLON et al., 2000).
O espalhamento elástico ou Rayleigh é eliminado através de um filtro, não permitindo que este chegue ao detector, fazendo com que apenas o espalhamento inelástico ou efeito Raman seja detectado. Finalmente, o espectro é produzido, a partir da radiação com a luz laser e posterior leitura do espalhamento inelástico ou Raman. São feitos espectros que funcionam como identificadores de cada molécula e estes são armazenados em um computador acoplado ao sistema FT-Raman (BRUKER, 1994; FERRARO, 1999).
Cada molécula possui um espectro Raman característico transferido por uma freqüência vibracional, através de uma série de picos ou faixas fornecendo uma “impressão digital” dessa molécula o que determina sua composição (LORINCZ et al., 2004).
Figura 6: Representação esquemática do dispositivo para Raman com Transformada de Fourier (TF). Fonte: Manoharan, Wang e Feld (1996).
A tarefa básica de uma análise espectral computadorizada é a utilização de técnicas de reconhecimento de padrões para classificação de imagens espectrais, onde o processo é dividido em 5 etapas bem definidas: aquisição do espectro, filtragem de ruídos, segmentação do espectro, subtração do background, extração das características, classificação dos espectros (PAULA JUNIOR et al., 2000).
Os picos de um espectro têm características específicas como: a distância, a posição, a altura (intensidade), a largura das bases dos picos e a largura total no meio máximo (FWHM) dos
picos, que se transformam em sua assinatura química e a sua análise objetiva a identificação dos picos que compõem o espectro (NATIONAL, 2009).
Várias etapas são necessárias para a extração das características de um espectro, entre elas a calibração, que visa à transformação dos espectros originais de pixel para cm-1. Esta é uma operação que relaciona uma grandeza de saída com uma grandeza de entrada, para um sistema de medida sob condições específicas. A medida centímetro (cm-1) é a unidade de preferência, sendo baseada no conceito de que a energia é diretamente proporcional à freqüência e a freqüência é inversamente proporcional ao comprimento de onda. Portanto a energia é proporcional ao inverso do comprimento de onda. Logo, medindo-se o comprimento de onda em centímetros, a energia poderá ser medida em cm-1 (GUEDES; MOREIRA, 2009).
2.4.5 Análise espectral
A Análise de Componentes Principais (PCA) é uma técnica de análise exploratória multivariada, que transforma um conjunto de variáveis correlacionadas num conjunto menor de variáveis independentes, que são combinações lineares das variáveis originais, designadas por “componentes principais”. Descrita desta forma, a PCA é geralmente encarada como um método de redução dos dados. Mas para além deste objetivo, uma das principais vantagens da PCA é permitir resumir a informação de muitas variáveis correlacionadas em uma ou mais combinações lineares (as componentes principais) independentes, que representam a maior parte da informação presente nas variáveis originais (MAROCO, 2003).
A análise estatística baseada na PCA é atualmente uma das ferramentas mais utilizadas para a classificação dos espectros. Entre as técnicas de análise estatística, a PCA vem sendo empregada com sucesso nas análises espectroscópicas, permitindo a identificação tanto de alterações patológicas como a determinação de parâmetros ópticos de tecidos normais (MANOHARAN, 1998).
biológicos e na identificação de alterações bioquímicas em diversas patologias, oferecendo possibilidades de diagnóstico clínico e ação terapêutica eficiente (MANOHARAN, WANG; FELD, 1996; BARR, DIX; STONE, 1998; OLIVEIRA FILHO, 2003; MORENO, 2006)
Através de fibras ópticas a radiação luminosa pode ser enviada e coletada, consequentemente utilizando-se de cabos especiais inseridos em dispositivos clínicos (laparoscópios, endoscópios, cateteres e agulhas) o espectro Raman pode ser usado na caracterização remota das amostras, e também para o estudo in vivo em tempo real dos tecidos biológicos, componentes bioquímicos em sangue e urina (LEWIS; GRIFFITHS, 1996; DAVIS, TEDESCO; SHAVER, 1999; SHIM et al., 1999; LIMA et al., 2000).
Por meio de um conjunto de freqüências que codificam as informações do material estudado é possível revelar os constituintes moleculares das amostras, detectando as modificações bioquímicas, morfológicas e celulares presentes nas patologias, consequentemente, a analise qualitativa e quantitativa desta amostra pode ser realizada pela espectroscopia Raman, cujas aplicações biomédicas são recentes, promovendo novos estudos com a finalidade de ampliar sua utilização. Os entraves da técnica são devidos à fluorescência, impurezas e outras partículas presentes nas amostras estudadas, dificultando a coleta do espalhamento Raman (CLARK; HESTER, 1995; ROMER et al., 1998; SCHRADER et al., 1999).
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Comparar o efeito antiinflamatório utilizando LED de baixa potência e ultrassom terapêutico em modelo experimental de tendinite.
3.2 Objetivo Específico
Avaliar qualitativamente a remodelação tecidual, incluíndo células inflamatórias, colágeno e vasos sanguíneos e quantitativamente os fibroblastos, presentes na fase inicial e tardia da reparação. As análises serão realizadas através da histopatologia, hsitomorfometria e espectroscopia FT Raman.
4.1 Aspectos éticos
Neste estudo foram seguidas as premissas da COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), tendo sido aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade Integral Diferencial sob protocolo Nº: 086/09 (Anexo A).
4.2 Tipo de pesquisa
A pesquisa estudada foi de caráter qualitativo e quantitativo, de modo experimental destinada a analisar, evidenciar e confirmar as variáveis de interesse no estudo dos animais a serem investigados.
4.3 Delimitação do Universo
Neste estudo foram utilizados 35 ratos machos Wistar pesando entre 220-250 g, com idade entre trinta e sessenta dias. Os animais foram divididos aleatoriamente em 7grupos de 5 animais, mantidos desde o nascimento em um ciclo de claro e escuro de 12 h, com alimentação e água “ad libitum” em uma sala com temperatura e umidade constante (24ºC – 60%) do biotério da Faculdade Santo Agostinho – FSA.
Os animais foram distribuídos e acondicionados em gaiolas-padrão de polietileno, devidamente etiquetados (Figura 7). O experimento foi realizado no Laboratório de Fisiologia da Faculdade Santo Agostinho – FSA, localizado em Teresina – PI. Foi respeitado, antes que se iniciasse a pesquisa, um período de ambientalização/adaptação de 7 dias.
Figura 7: Gaiola padrão de polietileno. Fonte: Laboratório de fisiologia da FSA. 4.4 Aparelhos
Com a intenção de estimular o tecido, foram utilizados dois aparelhos, sendo um ultrassom da marca Ibramed e um aparelho de luz não coerente (LED – Light Diode Estimulation).
4.5 LED
O primeiro equipamento (Figura 8) é um LED, fabricado no Laboratório de Análise de Biomodulação Tecidual do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), o qual possui caneta com o pico da banda de comprimento de onda em 620nm (+/- 20) visível - vermelho, potência média de 30mW e área do spot (S) de 0,5cm², com controle manual de disparo. Este aparelho possui alimentação de 110 a 220 V – 50/60 Hz, e ajuste de densidade de energia em J/cm².
O procedimento para aplicação da terapia se deu de forma pontual, onde o feixe emitido pelo LED cobria por inteiro o sítio da lesão (faixa tenotomizada). O aparelho foi posicionada a 90º do eixo tendíneo com intenção de otimizar a aplicação evitando perda de energia e melhor contato com a pata do animal (FARIA, 2006).
Biomodulação Tecidual do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) antes do início do experimento, sob a responsabilidade da Profª. Drª. R. A. N., através do dispositivo Integrated 2-Watt Broadband Power and Energy Meter System – 13 PEM 001/J (Melles Griot Photonics Components Group – Carlsbad, Califórnia 92011, USA).
Considerando que a densidade de energia indicada para biomodulação tecidual situa-se entre 4 e 6 J/cm² (CRUAÑES, 1984; COLLS, 1984), no presente estudo utilizou-se 4 J/cm² para a terapia com LED, durante 120 segundos. Para o cálculo de densidade de energia empregou-se a equação abaixo:
Figura 8: Aparelho LED caneta com comprimento de onda de 640nm. Fonte: Laboratório de fisiologia da FSA.
O segundo equipamento utilizado no procedimento (Figura 9a e 9b) foi um ultrassom clínico (modelo SONOPULSE SPECIAL, série 000827, da empresa IBRAMED) com gel de acoplamento a base de água com as seguintes características: modo pulsado a 10%, freqüência de 1 MHz, intensidade de 0,5 W/cm2, método de acoplamento direto com movimentos oscilatórios, numa ERA de 1 cm2 , durante 120 segundos (MAIA FILHO, 2008), devidamente calibrado (ANEXO B e C).
O gel clínico aquoso utilizado na pesquisa foi da Indústria Brasileira de Produtos Médicos Ltda., possui registro na ANVISA no 80122200001, e hipoalergênico e isento de sais, apresentando, na sua composição, Polimero Carboxivinílico, Imidazolidil Uréia, Metil parabeno, Corante, 2 amino, 2 metil, 1 propanol (AMP) e água deionizada, tendo sido utilizado a quantidade de 0,5ml (Figura 9c).
Figura 9: Fotografia ilustrativa do método de irradiação ultrassônica a) Ultrassom clínico (modelo SONOPULSE SPECIAL, série 000827, Ibramed®). b) Parâmetros de estimulação do ultrassom. c) Cabeçote com ERA reduzida da
Ibramed®, seringa para medir a quantidade de gel e gel clínico aquoso da RMC. Fonte: Laboratório de Fisiologia da FSA.
4.7 Grupos experimentais a)
c)
