Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes em. excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil

Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes em

excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil

Recife-PE

2008

II

ANDRÉ LUIZ CABRAL MONTEIRO DE AZEVEDO SANTIAGO

Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes em

excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil

TESE APRESENTADA AO CURSO

DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS DO DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA, CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO,

COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE

DOUTOR EM BIOLOGIA DE

FUNGOS.

Orientadora: Profª. Drª. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti Co-orientadora: Profª. Drª. Elaine Malosso

Recife-PE 2008

III Santiago, André Luiz Cabral Monteiro de Azevedo.

Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes em excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil / André Luiz Cabral Monteiro de Azevedo Santiago. – Recife: O Autor, 2008.

111 xxx folhas: il., fig., tab.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Departamento de Micologia. Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos, 2008.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Coprófilos. 2. Dimargaritales. 3. Variabilidade Genética 4. Mucorales. 5. Zoopagales. I. Título.

582.281.2 CDU (2.ed.) UFPE

V A minha esposa Bruna, aos meus pais, Vinícius e Ana e irmãos, Felipe, Fernanda e Beatriz por todo apoio, amor e confiança.

VI AGRADECIMENTOS

À professora Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti pela orientação e atenção desde a iniciação científica.

À professora Dra. Elaine Malosso pela co-orientação apoio e atenção.

À professora Sandra Trufem por toda a ajuda na identificação dos Zygomycetes desde a iniciação científica.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro o qual possibilitou a realização deste trabalho.

À coordenação e aos professores do Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos pelo apoio e ensinamentos.

À minha esposa Bruna e aos meus pais Vinícius e Ana e irmãos Felipe, Fernanda e Beatriz pelo carinho, apoio, confiança e compreensão.

À professora Leonor Costa Maia pela revisão de dois dos artigos escritos e pelo total apoio durante o todo o curso.

Ao Professor Paulo Santos pela ajuda com as análises estatísticas.

Às amigas Marielle, Danielle e Liliani e a professora Dra. Neiva Tinti pela importante ajuda com os experimentos de biologia molecular.

Aos amigos Dr. Gladstone Silva e Dr. Bartolomeu dos Santos pela essencial ajuda na purificação do rDNA e nas análises dos seqüenciamentos dos espécimes.

Aos amigos de turma pela ajuda e agradável convivência durante o curso de Doutorado.

Aos amigos do laboratório de Pós-Graduação em Biologia de Fungos: Micheline, Luciana, Ivone, Josilene, Daniele, Sílvia, Flávia e Eduardo pela agradável convivência durante todo o curso.

Aos amigos Elisandro, Bruno, Tatiana, Felipe, Marcela e Jadergudson pela amizade e ajuda.

Ao amigo Felipe Reis pela ajuda na revisão da língua inglesa em alguns dos trabalhos produzidos.

À direção do Zoológico da Reserva de Dois Irmãos pela permissão concedida para a coleta dos excrementos e ao tratador dos animais, Damião dos Santos, pela ajuda nas coletas.

Aos demais amigos do Departamento de Micologia por todo apoio e amizade. Aos funcionários do Departamento de Micologia por toda ajuda.

VII Aos que, de alguma maneira, contribuíram para a minha formação intelectual e profissional.

VIII

SUMÁRIO Pág.

1.1.2 - Zoopagales Bessey ex R. K. Benjamin. ... 6

1.1.3 - Dimargaritales R. K. Benjamin, 1979 ... 7

1.2 - Fungos coprófilos ... 7

1.3 - Isolamento de Zygomycetes de excrementos ... 9

1.4 - Taxonomia Molecular ... 14

1.5 - Marcadores moleculares em seqüências gênicas baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)...15

1.6 - Espaçador Interno Transcrito (ITS) do DNA Ribossomal ... 16

1.7 - Genética Molecular dos Zygomycetes ... 16

1.8 - Variabilidade genética intra-específica nos Zygomycetes ... 17

2 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 19

CAPÍTULO I - Zygomycetes em excrementos de herbívoros do Parque de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil...31

CAPÍTULO II - Variabilidade genética em Mucorales isolados de excrementos de herbívoros no Parque de Dois Irmãos, Recife, Pernambuco Brasil ... 56

CAPÍTULO III - Gilbertella persicaria (Mucorales): um novo relato para o Brasil ... 77

CAPÍTULO IV – Pilobolus (Mucoraceae) em excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil...84

IX

SUMÁRIO (CONTINUAÇÃO)

CAPÍTULO V - Mucor guilliermondii: uma espécie rara isolada de excrementos de

herbívoro nos neotrópicos ... 98

CAPÍTULO VI - Dimargaris: uma nova ocorrência para o continente sul americano...105

2 - CONCLUSÕES GERAIS ... ....110 ANEXOS

X

LISTA DE FIGURAS Pág.

CAPÍTULO I

Figura 1: Número de táxons de Zygomycetes ocorrentes entre junho/2005 e maio/2006 em excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. A. Em função da pluviosidade média mensal. B.

Em função da temperatura média mensal. 44

CAPÍTULO II

Figura 1: Análise filogenética de Mucorales isolados de excremento de

herbívoros. A árvore é um fenograma de máxima parcimônia baseado em um alinhamento de 520 bases da região ITS do rDNA. Os números nos ramos indicam a porcentagem de recuperação de 1000 “bootstraps” (> 60%). As seqüências obtidas no “GenBank” são precedidas pelos números

de acesso. 75

Figura 2 Análise filogenética de Mucorales isolados de excremento de

herbívoros. A árvore é um fenograma de “Neighbor Joining” baseado nas distâncias de Kimura-2-parâmetros obtidas de um alinhamento de 520 bases da região ITS do rDNA. Os números nos ramos indicam a porcentagem de recuperação de 10.000 “bootstraps” (> 60%). As seqüências obtidas no “GenBank” são precedidas pelos números de acesso. 76 CAPÍTULO III

Figura 1: Gilbertella persicaria A) Esporangióforo com esporângio

imaturo; B): Esporangióforo com esporângio imaturo e columela C) Columela; D) Clamidósporos; E, F) Esporangiósporos. Escala: A=25 µm;

B=50 µm; C=50 µm, D=25 µm; E=25 µm; F=10 µm. 80

CAPÍTULO IV

Figura 1: Pilobolus crystallinus var. crystallinus A) Vesícula

subesporangial e esporângio; B) Vesícula subesporangial e columela; C) Trofocisto; D) Esporangiósporos; P. crystallinus var. kleinii E) Vesícula subesporangial e esporângio; F) Vesícula e columela; G) Trofocisto; H) Esporangiósporos; P. crystallinus var. hyalosporus I) Vesícula subesporangial e esporângio; J) Vesícula subesporangial e columela; K) Trofocisto; L) Esporangiósporos; P. lentiger var. lentiger M) Vesícula subesporangial e esporângio; N) Vesícula subesporangial e columela; O)

XI

LISTA DE FIGURAS (CONTINUAÇÃO)

Figura 2: Pilobolus lentiger var. minutus A) Vesícula e esporângio; B)

Vesícula e columela; C) Trofocisto; D) Esporangiósporos; P. longipes E) Vesícula e esporângio; F) Vesícula e columela; G) Trofocisto; H) Esporangiósporos; P. roridus var. roridus I) Vesícula e esporângio; J) Vesícula e columela; K) Trofocisto; L) Esporangiósporos; P roridus var. umbonatus M) Vesícula e esporângio; N) Trofocisto; O) Esporangiósporos. 94

CAPÍTULO V

Figura 1: Mucor guilliermondii A) Esporangióforo com esporângio; B)

Esporângio; C) Esporangióforo com columela; D) Esporangiósporos.

Escala: A = 40µm; B = 20µm; C = 4µm; D = 5µm. 101

CAPÍTULO VI

Figura 1: Dimargaris bacillispora A, B) Esporóforos e cabeças férteis em

diferentes estágios de desenvolvimento; C) Hifa com septo e cavidade lenticular; D) Merosporangiosporos. Escala: A = 25µm; B = 25µm; C =

XII

LISTA DE TABELAS Pág.

CAPÍTULO I

Tabela 1: Alimentação dos herbívoros da Reserva Ecológica de Dois

Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil (Dados fornecidos pela

administração da Reserva). 36

Tabela 2: Análise química dos excrementos dos herbívoros da Reserva

Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. 36 Tabela 3: Zygomycetes ocorrentes nos excrementos de herbívoros da

Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. 39 Tabela 4: Freqüência de ocorrência de Zygomycetes nos excrementos de

herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco,

Brasil durante o período de junho/2005 a maio/2006. 41

Tabela 5: Análise de dissimilaridade de SIMPLER da composição de

espécies entre os excrementos dos herbívoros da Reserva Ecológica de

Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. 43

CAPÍTULO II

Tabela 1: Mucorales isolados de excrementos de herbívoros da Reserva de

Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. 73

Tabela 2: Origem geográfica dos espécimes seqüenciados e disponíveis no

XIII

RESUMO

Os excrementos de herbívoros têm sido citados como um dos principais substratos para o isolamento de Zygomycetes. No entanto, existem poucos estudos relacionados ao conhecimento da composição de espécies desse grupo nesses substratos e à variabilidade genética existente entre Zygomycetes oriundos de diferentes regiões geográficas. Os objetivos desse trabalho foram: a) isolar e identificar Zygomycetes a partir de excrementos de herbívoros do Recife, Pernambuco, Brasil; b) comparar o número e a composição de espécies de Zygomycetes ocorrentes nos excrementos dos diferentes animais e entre os meses do ano; c) comparar as seqüências das regiões ITS do rDNA de Mucorales isolados com seqüências das mesmas espécies provenientes de diferentes regiões geográficas e depositadas no “GenBank”. A partir de coletas mensais (junho/2005 a maio/2006) de excrementos de anta, camelo, jumento-branco, cervo-nobre, “waterbuck”, lhama, cavalo e cutia, foram identificados 39 táxons de Zygomycetes distribuídos em 15 gêneros. Os resultados indicaram que a composição e o número de táxons variam para cada herbívoro e que a sazonalidade influencia a composição de espécies de Zygomycetes nos excrementos, mas não o número de táxons. Polimorfismo genético entre isolados de Cunninghamella elegans, Mycocladus blakesleeanus e Mucor circinelloides f. circinelloides foi constatado, enquanto os espécimes de Rhizopus oryzae foram incluídos em um mesmo clado. As quatro formas de M. circinelloides conhecidas formaram um grupo, não sendo possível a diferenciação genética entre as mesmas com a metodologia utilizada.

Palavras-chave: coprófilos; Dimargaritales; variabilidade genética; Mucorales; Zoopagales

XIV

ABSTRACT

Herbivore dung has been cited as one of the main substrates for isolation of Zygomycetes. However, there are few studies about species composition in these substrates and genetic variability between Zygomycetes from different geographic regions. The aims of this work were: a) To identify and isolate Zygomycetes from herbivore dung from Recife, Pernambuco, Brazil; b) To compare the number and species composition of Zygomycetes occurring in different animal dung and months; c) To compare the ITS rDNA sequences of the Mucorales isolates with sequences of the same species from different geographic regions deposited in the GenBank. The dung of tapir, camel, white-donkey, deer, waterbuck, llama, horse, and agouti were collected monthly from June/2005 to May/2006. Overall, thirty nine taxa, distributed in 15 genera, were identified. The results indicate that the number of taxa and species composition varies for each animal. The season influence Zygomycetes composition on dung but not the number of taxa. Polymorphism between different isolates of Cunninghamella elegans, Mycocladus blakesleeanus and Mucor circinelloides f. circinelloides was found; however, all specimens of Rhizopus oryzae were included in one clade. The molecular method employed here did not allow the four known forms of M. circinelloides to be resolved as the isolates formed one clade.

1

1 - INTRODUÇÃO GERAL

Os Zygomycetes são fungos que se caracterizam pela produção de um esporo de resistência, de parede espessa, denominado zigósporo, o qual se desenvolve dentro de um zigosporângio formado após fusão completa de dois gametângios, iguais ou desiguais, que podem surgir do mesmo micélio ou de micélios distintos (Alexopoulos et al., 1996). Embora espécies de Zygomycetes economicamente importantes possam ser isoladas de uma grande variedade de substratos (Cardoso et al., 1992; Domsch et al., 1993; Alexopoulos et al., 1996), os excrementos de herbívoros oferecem as melhores condições para o crescimento e desenvolvimento das mesmas, pois são constituídos por nitrogênio, alto teor de vitaminas, sais minerais, restos de hemácias e micróbios do rúmen, além de apresentarem pH neutro a levemente básico (Dix & Webster, 1995). Entretanto, são poucos os relatos da ocorrência e composição dos Zygomycetes neste substrato. No Brasil, a partir de excrementos de herbívoros, poucas espécies de Mucor (Batista et al., 1961a; Batista et al., 1961b; Batista et al., 1961c; Trufem, 1984; Trufem & Viriato, 1985; Alves et al., 2002), Absidia (Batista et al., 1961a; Batista et al., 1961b; Batista et al., 1961c; Trufem & Viriato, 1985), Circinella (Trufem & Viriato, 1985), Rhizopus (Batista et al., 1961a), Syncephalastrum (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985b) e Phycomyces (Trufem & Viriato, 1985) foram isoladas. Espécies de Pilobolus (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985a), Pilaira (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985a), Syncephalis (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985b), Piptocephalis (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985b) e Dispira (Viriato & Trufem, 1985b) foram reportadas, mas não isoladas.

A identificação de Zygomycetes economicamente importantes, mesmo nos dias atuais, tem sido baseada em características morfofisiológicas (White et al., 2006). Em contraste, métodos moleculares são universalmente aplicados e fornecem segurança na sistemática desses microrganismos, sendo utilizados tanto para a identificação quanto para estudos de variabilidade genética (Hibbett, 1992). A elaboração e o aprimoramento de técnicas e de diferentes marcadores moleculares como “Random amplified polymorphic DNA” (RAPD), “Restriction fragment length polymorphism” (RFLP), “microsatellite PCR fingerprinting”, seqüenciamento da região ITS do rDNA, Microssatélites e Sítio de “Splicing” do íntron, têm colaborado com os estudos taxonômicos dos fungos (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Kumeda & Asao, 2001; Dendis et al., 2003). Schwarz et al. (2006) mostraram que o seqüenciamento da região ITS é

2 uma técnica segura para a identificação de gêneros e espécies de Zygomycetes. No entanto, são poucos os relatos envolvendo a biologia molecular na identificação de Zygomycetes (Voigt et al., 1999; Nagao et al., 2005; Iwen et al., 2007).

Análises de variabilidade genética são importantes por fornecerem dados para estudos filogenéticos, taxonômicos, de genética populacional e monitoramento de amostras com potencial biotecnológico. Em Zygomycetes, algumas técnicas como análise de isoenzimas, RAPD, RFLP, “microsatellite PCR fingerprinting” têm sido aplicadas para o conhecimento da variabilidade genética de espécies fitopatógenas e com potencial biotecnológico. Embora comparações da região ITS do rDNA possam apresentar resultados mais apurados para análises de variabilidade genética intra-específica, raros estudos têm enfocado o seqüenciamento de regiões de DNA para essa finalidade (Takó & Csernetics, 2005).

Tendo em vista que pouco se conhece sobre a ocorrência de Zygomycetes no Brasil, principalmente em excrementos de herbívoros e, considerando-se importância da biologia molecular como ferramenta adicional para a identificação de fungos em nível específico e para estudos de variabilidade genética, este trabalho teve como objetivos: isolar e identificar Zygomycetes a partir de excrementos de herbívoros do Recife, Pernambuco, Brasil; comparar o número e a composição de espécies de Zygomycetes ocorrentes nos excrementos dos diferentes animais e entre os meses do ano e comparar as seqüências das regiões ITS do rDNA de Mucorales isolados com seqüências das mesmas espécies provenientes de diferentes regiões geográficas e depositadas no “GenBank”.

3

1.1 - Zygomycetes

Os Zygomycetes são caracterizados por apresentarem micélio bem desenvolvido, constituído por hifas cenocíticas que contêm septos apenas na base das estruturas reprodutivas, como esporângios ou gametângios e, ocasionalmente, em outras partes, quando o micélio envelhece (Alexopoulos et al., 1996). No entanto, algumas espécies de Dimargaritales e Kickxellales apresentam septos espaçados regularmente desde o início da formação do micélio (Benny et al., 2001). A reprodução sexual ocorre pela produção de zigósporos e a assexual dá-se pela produção de esporangiósporos no interior de esporângios comumente globosos ou levemente achatados, podendo apresentar-se cilíndricos, clavados e em forma de halteres, apofisados ou não. Esporangíolos e merosporângios são comumente observados (Viriato, 2003). Assexuadamente, algumas espécies produzem clamidósporos, artrósporos e podem se reproduzir por gemação. A forma de levedura pode ocorrer em condições anaeróbicas, em concentrações de glicose superiores a 5% e na presença de fenetil – álcool (Alexopoulos et al., 1996). O micélio de alguns Zygomycetes pode produzir rizóides que fixam o fungo ao substrato e estolões que conectam grupos de rizóides. Quanto ao hábito, os Zygomycetes podem ser sapróbios, simbiontes e parasitas de plantas, fungos e animais. Várias espécies deste grupo de fungos podem ser isoladas de solo, água, fezes, grãos estocados, frutos, folhas e outros órgãos de plantas vivas, fungos, vertebrados e invertebrados (Cardoso et al., 1992; Alexopoulos et al., 1996).

Kirk et al. (2001) descreveram os Zygomycetes contendo 10 ordens, 32 famílias, 124 gêneros e 870 espécies. Significante alteração foi a remoção dos fungos micorrízicos arbusculares de Zygomycota e sua reclassificação em um filo separado, Glomeromycota (Schüßler et al., 2001). Hoje, 9 ordens de Zygomycota são aceitas: Asellariales, Dimargaritales, Endogonales, Entomophthorales, Harpellales, Kickxellales, Mortierellales, Mucorales e Zoopagales (White et al., 2006). O mais recente trabalho sobre classificação filogenética dos fungos (Hibbett et al., 2007) propôs a extinção do Filo Zygomycota, baseando-se em contrariedades verificadas entre os resultados de Liu et al. (2006), que afirmaram a monofilia de Zygomycota, e os resultados de James et al. (2006), os quais sugeriram que Zygomycota é polifilético. Diante desta divergência, foram propostos quatro subfilos com sede incerta: Mucoromycotina Benny, subphylum nov. (ordens: Mucorales Fr., Endogonales Moreau ex R. K. Benj. e Mortierellales Caval.-Sm.), Entomophthoromycotina Humber,

4 subphylum nov. (ordem: Entomophthorales G. Winter, Rabenh.), Zoopagomycotina Benny, subphylum nov. (ordem: Zoopagales Bessey ex R.K. Benj.) e Kickxellomycotina Benny, subphylum nov. (ordens Kickxellales Kreisel ex R. K. Benj., Dimargaritales R. K. Benj., Harpellales Lichtw. & Manier e Asellariales Manier ex Manier & Lichtw).

1.1.1 - Mucorales Schröter

Com mais de 300 espécies descritas (Hawksworth et al., 1995), esta é a maior ordem dentre os subfilos propostos por Hibbett et al. (2007).

A ordem Mucorales continha, inicialmente, quatro famílias (van Tieghem, 1878), sendo outras posteriormente adicionadas por vários autores. Hesseltine (1955) dedicou-se ao tratamento desta ordem incluindo as famílias Choanephoraceae, Cunninghamellaceae, Endogonaceae, Kickxellaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pilobolaceae e Thamnidiaceae. Benjamin (1959), Boedijn (1959) e Ellis & Hesseltine (1974) adicionaram Syncephalastraceae, Piptocephalidaceae, Dimargaritaceae, Helicocephalidaceae, Radiomycetaceae e Saksenaeaceae à ordem Mucorales. Benjamin (1979) criou a ordem Dimargaritales e validou as ordens Endogonales, Zoopagales e Kickxellales. O mesmo autor removeu as famílias Helicocephalidaceae e Piptocephalidaceae para a ordem Zoopagales, bem como Endogonaceae para ordem Endogonales. Dimargaritaceae e Kickxellaceae foram incluídas em Dimargaritales e Kickxellales, respectivamente. Contribuições oferecidas por Mirza et al. (1979), von Arx (1982), Benny et al. (1985), Benny (1991) e Benny et al. (1992) incluíram as famílias Dicranophoraceae, Absidiaceae, Phycomycetaceae, Mycotyphaceae, Gilbertellaceae e Sigmoideomycetaceae em Mucorales. Posteriormente, Tanabe et al. (2000) transferiram Sigmoideomycetaceae para Zoopagales. Recentemente, Meyer & Gams (2003) incluíram Micromucor, Mortierella, Mucor e Umbelopsis em Umbelopsidaceae. Atualmente, são apenas reconhecidas as famílias Mucoraceae e Umbelopsidaceae, desde que as demais famílias de Mucorales foram colocadas em sinonímia com Mucoraceae (Benny, 2005).

Os representantes dos Mucorales são denominados “fungos do açúcar”, sendo pioneiros na decomposição da matéria orgânica (Trufem, 1978). Tipicamente, o soma dos Mucorales é um micélio bem desenvolvido, cenocítico em algumas espécies, apresentando septos na base de estruturas reprodutivas, sendo mais facilmente visualizados em micélios mais “velhos”. Entretanto, em algumas espécies, septos

5 irregularmente espaçados podem ser observados, desde o início de sua formação (Alexopoulos et al., 1996). Exceto por Umbelopsidaceae, cujas espécies formam colônias de crescimento restrito e lento, todos os outros Mucorales produzem colônias de crescimento rápido com abundante micélio aéreo, aspecto cotonoso ou pulverulento e coloração que varia em tons de branco, cinza, marrom, amarelo e alaranjado, preenchendo toda a placa de Petri em menos de uma semana (Benny, 2005).

Estruturas com funções de absorção, fixação e disseminação, como rizóides e estolões, são comumente visualizadas e clamidósporos são freqüentemente formados na hifa vegetativa ou em estruturas de reprodução (Benjamim, 1959). A reprodução assexual é realizada por aplanósporos produzidos em esporângios localizados no ápice dos esporangióforos, que podem estar isolados ou em grupos. Podem ainda ser simples ou apresentarem ramificações monopodiais, simpodiais, racemosas ou cimosas (Viriato, 2003). Em alguns Mucorales, a produção dos esporangiósporos ocorre dentro dos esporangíolos, os quais podem apresentar-se cilíndricos, sendo denominados merosporângios (Alexopoulos & Mims, 1996). As columelas são comumente esféricas, clavadas, depressas, ovóides, campanuladas e elipsóides, com ou sem projeções apicais. Podem apresentar parede lisa, incrustada, com ou sem colarete. A reprodução sexual ocorre pela formação de zigósporos produzidos em zigosporângios formados pela fusão de gametângios similares ou, mais raramente, não similares (Benjamin, 1959; O’Donnell, 1979; Alexopoulos et al., 1996; Benny et al., 2001; James & O’Donnell, 2004). Em Mucorales, o heterotalismo é mais comum do que o homotalismo e a reprodução sexual não foi documentada para muitas espécies (O’Donnell et al., 2001).

De maioria sapróbios, Mucorales são alguns dos fungos mais comumente isolados de matéria orgânica vegetal e animal em decomposição, de solos e excrementos, sendo todos facilmente crescidos em meios de cultura. Algumas espécies são parasitas e patógenas de fungos e animais, incluindo as causadoras de infecções sistêmicas em humanos, especialmente em pacientes imuno-comprometidos (Jeffries, 1985; Rinaldi, 1989; De Hoog et al., 2000; Ribes et al., 2000). Outras são conhecidas por causarem doenças em plantas e sementes (Partida-Martinez & Hertweck, 2005) e o apodrecimento de frutas e sementes estocadas (James & O’Donnell, 2004). Em contraste, espécies benéficas são tradicionalmente utilizadas na produção de alimentos fermentados na Ásia (Hesseltine, 1986; Nout & Kiers, 2005). Espécies de Mucor, Cunninghamella e Rhizopus, dentre outras, são capazes de sintetizar produtos industriais como amilase, lipase, inulinase, pectinase, renina, protease e outros metabólitos

6 (Cordeiro-Neto et al., 1997; Alves et al., 2005; Santiago & Souza-Motta, 2006). São também empregadas na produção de ácidos cítrico, linolênico, aracdônico, oxálico e láctico (Yin et al., 1998; Zhou et al., 1999; Kavadia et al., 2001; Magnuson & Lasure, 2004). Estudos envolvendo a utilização dos Mucorales em processos de biorremediação de metais pesados (Yan & Viraraghavan, 2003; Zafar et al., 2007) têm sido realizados.

1.1.2 - Zoopagales Bessey ex R. K. Benjamin

Quando Bessey (1950) propôs a ordem Zoopagales, três famílias foram incluídas: Zoopagaceae Drechsler ex Drechsler emend. Duddington, Harpellaceae Léger & Duboscq. e Genestellaceae Léger & Gauthier, as duas últimas atualmente pertencentes aos Trichomycetes. Posteriormente, Alexopoulos & Mims (1979) e Benjamin (1979) incluíram Cochlonemataceae e Piptocephalidaceae em Zoopagales e Tanabe et al. (2000), baseados em comparações nas seqüências da região 18S do rDNA, adicionaram Sigmoideomycetaceae à ordem. De acordo com Benny (2005), hoje são reconhecidas as famílias Cochlonemataceae, Piptocephalidaceae, Helicocephalidaceae, Sigmoideomycetaceae e Zoopagaceae.

Todos os representantes dessa ordem são parasitas ou predadores de pequenos animais e fungos. A aparência do talo desses organismos varia de acordo com a espécie. Nos representantes predadores, o soma consiste de um micélio com ramificações irregulares, sendo coberto com uma substância viscosa que facilita a adesão da presa. Os animais capturados são “invadidos” por um haustório delgado e ramificado. Nas espécies endoparasítas, o soma consiste de hifas curtas e espessas, ramificadas ou não, podendo apresentar forma de espiral. Nas espécies ectoparasitas, um esporo que adere externamente ao hospedeiro funciona como um talo e os nutrientes são absorvidos por um haustório ramificado que surge do esporo e se estende para dentro do hospedeiro. A reprodução assexuada, na maioria dos Zoopagales, ocorre por esporangiósporos de várias formas e a sexuada por zigósporos (Alexopoulos et al., 1996). Os esporangiósporos dos Zoopagales são delimitados simultaneamente, acompanhados pelo aparecimento de zonas hialinas separando os mesmos (Saikawa, 1986; Saikawa & Sato, 1991).

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1.1.3 - Dimargaritales R. K. Benjamin

A ordem Dimargaritales compreende apenas uma família (Dimargaritaceae) contendo quatro gêneros: Dimargaris, Dispira, Spinalia e Tieghemiomyces. (Benjamin, 1965; Zycha et al., 1969; Hesseltine & Ellis, 1973; Benjamin, 1979; Benny et al., 1992). Todas as espécies são micoparasitas produtoras de haustórios, parasitando a maioria dos Mucorales. A maior parte dos Dimargaritaceae são coprófilos, embora várias espécies possam ser isoladas do solo. São cultivados, em laboratório, em colônias de Cokeromyces recurvatus Poitras, exceto Dispira simplex R. K. Benj. (Benjamin, 1959; 1961) e D. implicata Misra & Lata (Misra & Lata, 1979), as quais normalmente são parasitas de espécies de Chaetomium (Benjamin, 1979; Benny, 2005). Apresentam micélio ramificado, septado, produzindo esporóforos simples ou ramificados. Os septos das hifas apresentam cavidades lenticulares, contendo plugues que se dissolvem em KOH (2-3%). Reproduzem-se assexuadamente por esporangiósporos produzidos em merosporângios bi-esporados que se formam diretamente de uma vesícula terminal ou de ramificações esporíferas especializadas que surgem de uma vesícula ou de um ápice não inflado do esporóforo. As ramificações esporíferas podem ser simples ou ramificadas. A reprodução sexual ocorre pela produção zigósporos hialinos, mais ou menos globosos, com parede lisa ou ornamentada. A parede dos zigosporângios apresenta-se delgada e lisa (Benny, 2005). Em Dimargaris bacillispora R. K. Benj. e D. oblongispora B. S. Mehrotra & Baijal, o esporangíolo inicial se alonga e depois ocorre uma constrição central, formando dois esporangiósporos iguais. Em outros membros da família, os merosporângios se desenvolvem acropicamente (Benjamin, 1966). Na maturidade, a parede dos esporangiósporos apresenta camada dupla quando visualizada por microscópio eletrônico de transmissão e fragmentos das paredes merosporangiais se aderem às seções laterais dessa parede (Benjamim, 1979).

1.2 - Fungos coprófilos

Os fungos coprófilos são aqueles que habitam excrementos de animais ou estão associados a esses substratos, incluindo solos contaminados com fezes. São importantes componentes do ecossistema, responsáveis pela decomposição de materiais fecais e pelo fluxo de carbono, nitrogênio e energia (Angel & Wicklow, 1974; Wicklow, 1981), além de serem utilizados como fonte de nutrientes para artrópodes coprófagos e micófagos (Halffter & Matthew, 1971). A maioria desses fungos é encontrada em excrementos de

8 mamíferos não selvagens, selvagens e de aves (Krug et al., 2004). Os excrementos são um rico substrato para o crescimento dos fungos, pois contêm carbono, nitrogênio, vitaminas, sais minerais, além de apresentarem pH entre 6,5 e 7,0 e elevada capacidade de retenção de água (Dix & Webster, 1995).

As espécies coprófilas podem ser diferenciadas em obrigatórias e facultativas. As primeiras incluem indivíduos cujos esporos precisam, necessariamente, passar pelo trato digestivo dos animais para que haja a quebra de dormência dessas células pelas enzimas gástricas produzidas (Dix & Webster, 1995). De acordo com Viriato (2003), “tais espécies geralmente não crescem em meios de cultura sintéticos, exceto se apresentarem em sua composição sais biliares, pepsina ou outras substâncias que estimulem a germinação, simulando as condições existentes no trato digestivo do animal”. Segundo o mesmo autor, “as espécies coprófilas secundárias ou facultativas são aquelas que se desenvolvem sobre este tipo de substrato, mas passíveis de crescimento em meios de cultura sintéticos e não necessitam passar pelo trato digestivo de animais para que seus esporangiósporos germinem. Geralmente, seus esporos se encontram no solo e, em contato com as fezes, são estimulados a germinar, colonizando o substrato com se fosse qualquer outro tipo de matéria orgânica”.

Os fungos coprófilos freqüentemente crescem e esporulam em condições específicas. Portanto, diferentes micobiotas podem ocorrer em condições de umidade e temperatura variadas. O pH ótimo também pode variar mas, geralmente, os fungos coprófilos exibem crescimento satisfatório em meios com pH 7,0 (Krug et al., 2004). Outros fatores como: intensidade de luz (Morinaga et al., 1980), competição fúngica intra e inter-específica (Harper & Webster, 1964), presença de insetos predadores de fungos (Helsel & Wicklow, 1978), tempo mínimo requerido para a esporulação (Harrower & Nagy, 1979) e teor de umidade (Pasricha et al., 1994) influenciam a composição e diversidade da micobiota nos excrementos. Estudos realizados por Abdullah (1982), Angel & Wicklow (1975), Parker (1979) e Wicklow et al. (1980) sugerem que os diferentes herbívoros apresentam micobiota variada e que a composição de fungos encontrada nos excrementos de ruminantes varia em relação ao observado nas fezes dos não ruminantes. Segundo Lundqvist (1972), o habitat do hospedeiro parece ser mais importante do que o substrato.

Em se tratando se Zygomycetes, apenas espécies de Pilobolus podem ser consideradas coprófilas obrigatórias, sendo necessária a adição de extrato de fezes ou

9 hemina ao meio de cultura para que as mesmas sejam cultivadas em laboratório. Alguns gêneros de Zygomycetes como Basidiobolus, Conidiobolus, Coemansia, Absidia, Circinella, Mucor, Mycotypha, Parasitella, Pirella, Radiomyces, Rhizomucor, Rhizopus, Thamnidium, Helicocephalum, Piptocephalis, Syncephalis e Sigmoideomyces apresentam, tipicamente, muitas espécies coprófilas e não coprófilas. Entretanto, Dimargaris, Dispira, Tieghemiomyces, Kickxella, Spirodactylon, Spiromyces,

Benjaminiella, Chaetocladium, Cokeromyces, Dichotomocladium, Ellisomyces,

Fennelomyces, Phascolomyces, Phycomyces, Pilaira, Thamnostylum, Utharomyces, Zychaeae, Reticulocephalis e Thamnocephalis apresentam espécies predominantemente coprófilas, mas podem ocorrer poucas espécies não coprófilas. Outros gêneros como Mortierella, Dissophora, Actinomucor, Backusella, Blakesleea, Choanephora, Cunninghamella, Gilbertella, Helicostylum, Micromucor, Protomycocladus, Syncephalastrum, Rophalomyces e Stylopage apresentam espécies primariamente colonizadoras de outros substratos. Entretanto, podem ser verificadas algumas espécies coprófilas (Krug et al., 2004).

1.3 - Isolamento de Zygomycetes de excrementos

Estudos de diversidade e sucessão de fungos coprófilos têm sido realizados em vários países (Bell, 1975; Wicklow et al., 1980; Wicklow, 1981; Piontelli et al., 1981; Ebersohn & Eicker, 1997; Caretta et al., 1998; Richardson, 2001a; Richardson, 2001b; Nyberg & Persson, 2002; Masunga et al., 2006). No entanto, são raros os que se referem, exclusivamente, aos Zygomycetes coprófilos, estando grande parte dos relatos concentrados no gênero Pilobolus (Foos & Rakestraw, 1985; Foos, 1989; Nand & Mehrotra, 1968; 1977; Hu et al., 1989), visto ser o único gênero de Zygomycetes que apresenta espécies essencialmente coprófilas (Krug et al., 2004).

Grove (1934) realizou importante estudo taxonômico sobre Pilobolus isolados de excrementos de herbívoros no Canadá, que incluiu a delimitação de nove espécies reconhecidas e sete consideradas duvidosas, além de descrições e ilustrações dos espécimes observados. O autor descreveu P. crystallinus, P. longipes, P. roridus, P. kleinii, P. sphaerosporus, P. heterosporos, P. oedipus, P. umbonatus e P. nanus.

Foos & Rakestraw (1985) descreveram Pilobolus crystallinus (excrementos de cavalo e boi), P. kleinii (boi) e P. longipes (cavalo e pônei) em Ohio, EUA.

Em um estudo da diversidade de Pilobolaceae no “Yellowstone Nacional Park” (EUA), Foos (1989) descreveu Pilobolus crystallinus, P. kleinii e P. roridus isolados de

10 excrementos de cervos e Foos & Royer (1989) isolaram, na mesma localidade, P. crystallinus (excrementos de antílope, “bighorn sheep”, bisão, alce e “mule deer”), P. kleinii (antílope, “bighorn sheep”, bisão, alce, cavalo e cervo) e P. roridus (antílope, “bighorn sheep”, alce, cervo e “mule deer”).

Boedijn (1959) relatou a ocorrência de Zygomycetes em excrementos de animais na Indonésia. Foram reportadas Absidia merdaria, A. ramosa, A. corymbifera, (animal não informado), Coemansia reversa (excremetos de coelho), C. erecta (morcego), Helicostylum nigricans (animal não informado), Phascolomyces articulosus (rato), P. kleinii (porco), P. morinii (coelho), P. hyalosporus (carneiro), P. crystallinus (animal não informado) e Utharomyces epallocaulus (rato).

Nand & Mehrotra (1968, 1977) reportaram 10 espécies de Pilobolus isoladas de excrementos e de solo na Índia: P. crystallinus (excrementos de búfalo, boi e camelo), P. oedipus (humanos), P. umbonatus (boi), P. borzianus (solo), P. roridus (cabra, coelho e pavão), P. sphaerosporus (gato, pavão e boi), P. longipes (cavalo), P. kleinii (cavalo, jumento e cabra), P. nanus (rato) e P. heterosporus (rato, boi e pavão).

Hu et al. (1989) delimitaram Pilobolus em cinco espécies compreendendo sete variedades: P. crystallinus var. crystallinus, P. crystallinus var. hyalosporus, P. crystallinus var. kleinii, P. lentiger var. lentiger, P. lentiger var. minutus, P. longipes, P. oedipus, P. roridus var. roridus e P. roridus var. umbonatus.

Em um estudo sobre a sucessão de fungos coprófilos em excrementos de canguru e coelho na Austrália, Nagy & Harrower (1979) identificaram 22 espécies de fungos, das quais Pilaira anomala, Pilobolus crystallinus, Rhizopus nigricans e Mucor mucedo foram verificadas nos excrementos dos dois animais citados.

McCarthy (2000) estudou a sucessão de fungos em fezes de eqüinos coletadas nos estábulos de Armidale, Austrália (30°31’S, 151°39’L), incluindo os Zygomycetes. Vinte e seis gêneros foram identificados, incluindo 8 Zygomycetes (Cunninghamella spp., Mortierella spp., Mucor spp., Pilaira spp., Pilobolus spp. Piptocephalis spp., Rhizopus spp. e Syncephalis spp.).

Piontelli et al. (1981) verificaram a diversidade de fungos coprófilos em eqüinos no Chile. Foram identificados 82 táxons representando 53 gêneros. Dentre os Zygomycetes, foram verificados Pilobolus kleinii, Mucor hiemalis, M. circinelloides, M. racemosus, M. parvispora, Actinomucor elegans, Chaetocladium brefeldii, Piptocephalis lepidula, Rhopalomyces elegans e Thamnostylum piriforme.

11 Delgado-Ávila et al. (2005) isolaram 11 gêneros e 15 espécies de fungos provenientes de amostras de excrementos de animais coletadas em 17 municípios do Estado de Zulia, Venezuela. Dentre os Zygomycetes, foram citados Pilobolus crystallinus, Rhizopus stolonifer, Mucor fragilis, Mortierella capitata, Mycotypha indica, Ellisomyces anomallus, Rhopalomyces elegans e Utharomyces epallocaulus, sendo os 5 últimos táxons reportados como novas ocorrências para a Venezuela.

Abdullah (1982) verificou a presença de fungos coprófilos em excrementos de jumento, carneiro e camelo coletados em áreas de deserto semi-árido no sul do Iraque. Quarenta espécies foram reportadas (34 Ascomycetes, 3 Zygomycetes e 1 fungo anamórfico). Dentre os Zygomycetes, Pilobolus kleinii (excrementos de jumento e camelo), Pilaira sp. (jumento e carneiro) e Mucor sp. (jumento, carneiro e camelo) estiveram presentes.

Ebersohn & Eicker (1997), ao estudarem a sucessão de fungos coprófilos isolados de excrementos de elefante, girafa, zebra, leopardo, “blue wildebeest” e “steenbok”, na África do Sul, verificaram a ocorrência de Pilobolus kleinii, P. crystallinus, P. longipes e Rhizopus stolonifer, dentre outras espécies pertencentes a outros grupos de fungos.

Estudo sobre a diversidade de fungos em excrementos de zebra, antílope, búfalo e hipopótamo no Estado de Marula, Quênia, foi realizado por Caretta et al. (1998). Cento e setenta e três espécimes de fungos representando 40 gêneros e 59 espécies foram reportadas. Apenas 5 Zygomycetes (8,5%) estiveram dentre os fungos isolados. Foram verificados Actinomucor elegans (excrementos de “reedbuck”), Mucor sp. (búfalo africano), M. hiemalis f. hiemalis (boi zebu), Pilobolus sp. (“bushbuck” e “waterbuck”) e P. crystallinus (“reedbuck”, “steenbok”, impala, “bushbuck”, “waterbuck”, búfalo africano, boi zebu e eland).

A diversidade e ocorrência de fungos coprófilos em excrementos de carneiro, boi, cervo, coelho, lebre e galo coletados em diferentes latitudes [Inglaterra, Austrália, França, Ilhas Gregas, Costa Rica, Porto Rico, República Dominicana, Ilhas Canárias e Brasil (Mato Grosso do Sul)] e em duas estações do ano (verão e inverno) foram estudadas por Richardson (2001a). Trinta e duas espécies foram identificadas, estando apenas Pilaira moreauri (excrementos de cervo e carneiro), Pilobolus crystallinus (cervo, carneiro e boi) e P. kleinii (cervo, carneiro, boi e coelho) dentre os Zygomycetes verificados. Basicamente, foram observadas diferenças significativas na composição da

12 micota entre os excrementos dos variados animais e entre as fezes coletadas nas diferentes latitudes e nas duas estações do ano.

Caretta & Piontelli (1996) estudaram a ocorrência de fungos coprófilos em excrementos de cervo em Pavia (Lombardia, Itália). Foram coletadas, durante o verão, 80 amostras de excrementos de cervos confinados em um parque. Quarenta gêneros distribuídos em 57 espécies foram registrados. Foram isoladas Mortierella reticulata, Mucor bainieri, M. hiemalis, M. plumbeus, M. racemosus, Phycomyces blakesleeanus, Pilobolus kleinii, Piptocephalis lepidula, Rhizopus stolonifer, Syncephalis cornu e Thaminidium elegans. Dentre as espécies obtidas, M. hiemalis apresentou maior freqüência de ocorrência (76,2%).

Nyberg & Persson (2002) citaram a ocorrência de Pilobolus crystallinus em excrementos de alce na província de Angermanland na Suíça.

Vánová & Kubátová (2004) estudaram a diversidade de fungos coprófilos em regiões contaminadas por resíduos industriais na Polônia e na República Tcheca. Cinqüenta táxons foram isolados de 23 amostras de excrementos de coelho, lebre e cervo coletados durante o verão e inverno. Foram verificados 10 táxons pertencentes aos Zygomycetes: Mucor hiemalis f. hiemalis, M. hiemalis f. corticola, M. circinelloides, M. mucedo, M. wosnessenskii, Cunninghamella elegans, C. echinulata, Pilaira anomala, Pilobolus crystallinus e Rhizopus stolonifer. Dentre as espécies ocorrentes, M. hiemalis f. hiemalis apresentou freqüência de ocorrência mais elevada (21,7%). Com exceção de M. circinelloides, todas as espécies foram verificadas em excrementos de cervo e apenas C. elegans, C. echinulata, Mucor hiemalis f. hiemalis e P. crystallinus não ocorreram em fezes de coelho ou lebre. Segundo os autores, maioria dos Zygomycetes foi verificada nas amostras coletadas durante o verão.

Batista (1948) e Batista & Pontual (1948), descreveram P. kleinii (excrementos de boi), P. nanus (porco), P. longipes (cavalo), P. crystallinus (caprinos) e P. argentinus (cavalo) em Recife, Pernambuco.

Batista et al. (1961a) registraram a ocorrência de fungos em 629 amostras de excrementos de bovinos em Recife, alimentados com ração. Vinte e oito espécies foram isoladas, dentre as quais Absidia repens, Mucor racemosus e Rhizopus nigricans pertenciam aos Zygomycetes. A ocorrência de A. repens e M. racemosus foi também registrada por Batista et al. (1961a, b) em excrementos de galináceos, suínos, caprinos, eqüinos e asininos em Recife.

13 Trufem (1984) relatou a ocorrência de Zygomycetes em excrementos de cabra-de-malta, camelo, carneiro-da-montanha, cavalo, girafa, gnu, orix, veado-catingueiro e zebra, mantidos na Fundação Parque Zoológico do Estado de São Paulo. Dez espécies de Mucorales foram verificadas: Mucor hiemalis, M. mucedo, M. plumbeus, Pilaira anomala, Pilobolus crystallinus, P. kleinii, Piptocephalis repens, Syncephalis cornu e S. tengi. A autora constatou diferenças no número de espécies entre os excrementos dos animais, sendo as fezes de orix as mais propícias para a ocorrência de Mucorales, com 10 espécies ocorrentes, seguidas pelas fezes de cabra de malta, camelo, carneiro-da-montanha (5 espécies), girafa (4), veado-catingueiro (3), zebra (2) e cavalo (1).

Em um estudo sobre a diversidade de espécies de Zygomycetes em excrementos de herbívoros, mantidos em cativeiro na Fundação Parque Zoológico do Estado de São Paulo, Viriato & Trufem (1985b) e Trufem & Viriato (1985) analisaram 80 amostras de excrementos de cabra-de-malta, camelo, carneiro-da-montanha, égua, girafa, guanaco, gnu, orix-cimitarra, orix-gazela, veado-catingueiro e zebra. Dentre as espécies facilmente isoladas em meio de cultura, foram obtidas Mycocladus ramosus (como Absidia ramosa) (fezes de orix-cimitarra e orix-gazela), Circinella minor (orix-cimitarra, veado-catingueiro e zebra), C. muscae (girafa, guanaco, orix-cimitarra e zebra) C. umbellata (cabra-de-malta, carneiro-da-montanha, guanaco, orix-cimitarra, gazela e veado-catingueiro), Mucor circinelloides (girafa), M. fuscus (gnu, orix-cimitarra e zebra), M. hiemalis (cabra-de-malta, carneiro-da-montanha, égua, guanaco, gnu, orix-cimitarra, orix-gazela, veado-catingueiro e zebra), M. mousanensis (girafa), M. mucedo (cabra-de-malta, girafa, gnu, guanaco, orix-cimitara, veado-catingueiro e zebra), M. piriformis (camelo, girafa, orix-cimitarra e zebra) e Phycomyces blakesleeanus (égua). Dentre as espécies que não crescem facilmente em meios de cultura, foram reportadas Dispira cornuta (égua e guanaco), Piptocephalis repens (cabra-de-malta, égua, girafa, guanaco, orix-gazela, veado-catingueiro e zebra), Syncephalis asymmetrica (camelo e zebra), S. cornu (égua e girafa), S. penicillata (girafa), S. sphaerica (égua), S. tengi (égua) e Syncephalastum verruculosum (égua).

Viriato & Trufem (1985a) relataram a ocorrência de nove espécies de Pilobolus em excrementos de onze mamíferos herbívoros (cabra-de-malta, camelo, carneiro-da-montanha, égua, girafa, guanaco, gnu, orix-cimitarra, orix-gazela, veado-catingueiro e zebra), mantidos em cativeiro na Fundação Parque Zoológico de São Paulo. Foram descritas as espécies P. crystallinus, P. kleinii, P. sphaerosporus, P. pullus, P.

14 heterosporus, P. borzianus, P. morinii, P. longipes e P. oedipus. Os autores forneceram chave de identificação para as espécies descritas.

Richardson (2001b) verificou a diversidade de fungos em excrementos de boi, ovelha, cervo, cavalo e capivara coletados em Bonito, Brasil (56°30`W, 21°0,5`S) e Corumbá (57°4,5`W, 19°26,5`S). Foram isolados 75 espécimes representando 32 espécies de fungos. Dentre os Zygomycetes, apenas Pilobolus crystallinus (fezes de cervo e carneiro) e P. sphaerosporus (carneiro, capivara e cavalo) foram reportadas.

Alves et al. (2002) verificaram a ocorrência de Mucor em excrementos de bisão, boi, búfalo, cabra, coelho, cutia, eland, cavalo, ovelha e veado-catingueiro coletados no Parque Dois Irmãos e Departamento de Zootecnia da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Foram isoladas Mucor circinelloides f. circinelloides (fezes de bisão e boi), M. circinelloides f. griseocyanus (bisão, cabra, carneiro, coelho, eland e veado-catingueiro), M. circinelloides f. janssenii (coelho, eland e veado-veado-catingueiro), M. circinelloides f. lusitanicus (veado-catingueiro), M. hiemalis f. hiemalis (bisão, cabra, cavalo, coelho e cutia), M. hiemalis f. luteus (cabra, cavalo, carneiro, coelho e cutia), M. genevensis (carneiro e cutia), M. piriformis f. piriformis (cavalo), M. piriformis f. nanus (bisão), M. racemosus f. chibinensis (bisão, cabra, coelho e cutia), M. subtilissimus (cavalo) e M. variosporus (veado-catingueiro). Maior diversidade foi verificada nas fezes de bisão, coelho, cutia e veado-catingueiro.

Viriato (2003) verificou a ocorrência de Pilobolus em excrementos de camelo, cavalo, cutia, guanaco, orix, veado-catingueiro, cervo-nobre e zebra na Fundação Parque Zoológico de São Paulo. Foram descritas 11 espécies, sendo uma desconhecida para a ciência: Pilobolus sp., P. oedipus, P. sphaerosporus, P. borzianus, P. longipes, P. nanus, P. morinii, P. heterosporus, P. crystallinus, P. pullus e P. kleinii.

1.4 - Taxonomia Molecular

A taxonomia clássica dos Zygomycetes baseia-se na identificação das espécies considerando-se diferentes características macroscópicas (ex: cor a aspecto das colônias) e microscópicas (ex: morfologia e dimensão dos esporangióforos, esporângios, esporangíolos, merosporângios, columelas, trofocistos, vesículas subesporangiais, esporangiósporos e merosporangiosporos). Morfologia, dimensão e coloração dos zigosporângios (estruturas de reprodução sexuada) também são características utilizadas como critérios taxonômicos. Entretanto, em alguns casos, existe grande dificuldade na identificação das espécies deste grupo, devido à elevada

15 diversidade fenotípica existente. Torna-se, portanto, necessária a utilização de métodos moleculares que forneçam segurança na sistemática desses microrganismos, sendo utilizados tanto para a identificação como para estudos de variabilidade genética (Hibbett, 1992). A elaboração e o aprimoramento de técnicas e de diferentes marcadores moleculares como “Random amplified polymorphic DNA” (RAPD), “Restriction fragment length polymorphism” (RFLP), “Microsatellite PCR fingerprinting” e seqüenciamento da região ITS, têm colaborado com o estudo taxonômico dos fungos, pois permitem a verificação de variabilidade genética (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Kumeda & Asao, 2001; Dendis et al., 2003). No entanto, o sequenciamento de diferentes alvos moleculates, incluindo a região ITS (região menos conservada) do rDNA tem sido utilizado com segurança para identificação de espécies de fungos (Kobayashi et al., 2004; Schwarz, 2006).

1.5 - Marcadores moleculares em seqüências gênicas baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Dentre as técnicas moleculares utilizadas para estudos genéticos dos fungos, a reação em cadeia da polimerase (PCR) tem se mostrado eficiente por ser um método rápido, específico e sensível que auxilia a detecção e identificação dos micorganismos (Scheu et al., 1998). Esta técnica, descrita por Kary Mullis em 1980, consiste na amplificação in vitro de determinada seqüência de DNA, utilizando a enzima termorresistente DNA polimerase, cofatores, desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTP´s) e oligonucleotídeos que flanqueiam a região alvo e pareiam-se às fitas opostas do DNA. A mistura destes componentes adicionada ao DNA molde é colocada em um termociclador em que 3 temperaturas (1 ciclo) são alternadas para que ocorra a amplificação do DNA. Um ciclo de PCR consta das etapas de desnaturação, anelamento e alongamento ou polimerização. Na primeira, o DNA é desnaturado em função do aumento da temperatura (92-95 °C). Na segunda etapa, ocorre uma redução da temperatura (35-60 °C), permitindo a hibridação dos iniciadores com as seqüências complementares do DNA. Em seguida, a temperatura é elevada a 72°C para que a DNA polimerase realize a extensão da cadeia a partir de cada terminal 3` dos iniciadores (Ferreira & Gratapaglia 1998). Os produtos da amplificação são observados, após a eletroforese, em gel de agarose corado com brometo de etídio.

16 A possibilidade de gerar grandes quantidades de fragmentos de DNA de segmentos específicos do genoma foi um dos aspectos fundamentais dos avanços na pesquisa científica proporcionados pela PCR. O seqüenciamento das regiões amplificadas permite, por exemplo, a identificação rápida de espécies de microrganismos, além de auxiliar em estudos de diagnóstico e melhoramento genético de plantas e animais, de filogenia e de possibilitar o conhecimento sobre variações genéticas intra-específicas (Ferreira e Gratapaglia 1998; Paccola-Meirelles, 1998; Stummer et al., 2000, Driver et al., 2000).

1.6 - Espaçador Interno Transcrito (ITS) do DNA Ribossomal

Em eucariontes, o rDNA é encontrado em unidades repetidas dentro da região organizadora nucleolar. Cada unidade consiste de regiões altamente conservadas dos genes que codificam o rRNA 18S, 5,8S e 28S, intercaladas por regiões variáveis de espaçadores não-codificantes. Cada unidade de transcrição é composta de uma região promotora líder (ETS – “External Transcribed Spacer”), uma região codificadora do rRNA 18S, um espaçador não-codificante interno (ITS1), uma região codificadora de rRNA 5,8S, outro espaçador não-codificante interno (ITS2), uma região codificadora de rRNA 28S e, finalmente, um segmento intergênico espaçador não-transcrito, IGS (Polanco et al., 1998; Lewin 2001). Por ocorrerem em múltiplas cópias no genoma, as seqüência de rDNA são facilmente amplificáveis por PCR (Edel et al., 1996).

As regiões ITS evoluem rapidamente, sendo apropriadas para discriminar espécies relacionadas ou, até mesmo, variedades de uma mesma espécie. O fato das regiões ITS serem curtas (500 a 800pb), flanqueadas por segmentos conservados e aparecerem em grande número de cópias no genoma, permite que sejam amplificadas e seqüenciadas com facilidade (Fungaro, 2000; Guimarães & Sá, 2002).

1.7 - Genética molecular dos Zygomycetes

A maioria dos relatos envolvendo a genética molecular dos Zygomycetes concentra-se em estudos filogenéticos (Nagahama et al., 1995; Jensen et al., 1998; O`Donnell et al., 1998; Tanabe et al., 2000; Tanabe et al., 2004; White et al., 2006), em que diferentes regiões do DNA de espécimes previamente identificados e estocados em bancos de culturas são utilizadas como alvo para o entendimento das relações evolutivas deste grupo. Poucos são os trabalhos acerca da utilização da biologia molecular como

17 ferramenta para a identificação bem como para o estudo de variabilidade genética intra-específica dos Zygomycetes (Galgóczy, 2005).

Ferramentas moleculares têm se mostrado eficientes na identificação de fungos, principalmente os responsáveis por micoses em humanos (Iwen et al., 2002). As regiões 18S e 28S do rDNA são as mais conservadas, sendo utilizadas para comparação de organismos distantemente relacionados e, em alguns casos, entre diferentes gêneros. Variações individuais entre repetições do rDNA podem ser observadas em ambas as regiões ITS, as quais têm mostrado suficiente variabilidade para discriminar isolados em nível específico e intra-específico (Hibbett, 1992; White et al., 1990; Chen et al., 2000; Chen et al., 2001).

Há evidências de que o seqüenciamento direto dos produtos de PCR obtidos com auxílio de iniciadores ainda é a alternativa mais segura para a identificação genética dos Zygomycetes (Kobayashi et al., 2004). No entanto, são poucos os relatos da utilização da biologia molecular na identificação desse grupo. Voigt et al. (1999), estudando as regiões 28S do rDNA de 42 espécimes de Zygomycetes clinicamente importantes, desenvolveram iniciadores para PCR espécie-específicos, visando a rápida identificação dos mesmos. Nagao et al. (2005) realizaram a identificação de espécies de Rhizopus baseando-se no seqüenciamento da região ITS. Schwarz et al. (2006) validaram o seqüenciamento da região ITS dos Zygomycetes como uma técnica eficaz para a identificação de 54 espécimes pertencentes a 16 espécies, sendo o mesmo verificado por Iwen et al. (2007) na identificação de Mucor circinelloides. Entretanto, os autores relatam a carência de dados disponíveis no "GenBank" para comparação das seqüências de rDNA de vários Zygomycetes.

1.8 - Variabilidade genética intra-específica nos Zygomycetes

Estudos sobre variabilidade genética são importantes por fornecerem dados para estudos filogenéticos, taxonômicos, análises de genética populacional e monitoramento de amostras com potencial biotecnológico. Em Zygomycetes, algumas técnicas como análise de isoenzimas, RAPD, RFLP e “microsatellite PCR fingerprinting” têm sido aplicadas para o conhecimento da variabilidade genética de espécies fitopatógenas e com potencial biotecnológico (Takó & Csernetics, 2005). Os diferentes padrões de bandas observados entre isolados de uma espécie, com a utilização das técnicas supracitadas, indicam a variabilidade genética intra-específica em Zygomycetes.

18 Vágvölgyi et al. (2001) identificaram variações genéticas entre 12 isolados de Mucor genevensis dos EUA e África do Sul, utilizando as izoenzimas catalase, glutamato desidrogenase, malato desidrogenase, superóxido dismutase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Seis padrões eletroforéticos foram verificados pela utilização da catalase e 4 padrões foram observados com o uso de glicose-6-fosfato desidrogenase e malato desidrogenase. Apenas 3 padrões eletroforéticos foram observados para as enzimas superóxido desmutase e glutamato desidrogenase. Polimorfismo genético em Rhizomucor pussillus foi verificado por Vastag et al. (1998) através da análise das isoenzimas fosfatase ácida, β-esterase, glutamato desidrogenase e glucose-6-fosfato desidrogenase. Maior variabilidade foi observada com a última enzima, em que 6 padrões eletroforéticos foram vizualizados, enquanto apenas dois padrões foram citados para as enzimas fosfatase ácida e glutamato desidrogenase. Elevado polimorfismo em 31 espécimes de M. hiemalis, isolados de diferentes regiões geográficas, foi verificado por Havens (1976), pela análise das isoenzimas álcool desidrogenase, benzaldeído oxidase, α-esterase, desidrogenase láctica e desidrogenase málica. Maior variação foi observada pela α-esterase, que apontou 16 padrões eletroforéticos. Vágvölgyi et al. (1996) observaram diferentes padrões eletroforéticos entre 59 isolados de Mucor piriformis, utilizando as izoenzimas catalase, α-esterase, glucose-6-fosfato desidrogenase, lactato desidrogenase, malato desidrogenase e superóxido dismutase. Quatro diferentes padrões eletroforéticos foram observados pela utilização da α-esterase e glucose-6-fosfato desidrogenase, enquanto a utilização da malato desidrogenase apontou apenas 2 padrões eletroforéticos.

A partir do uso da técnica de RAPD, Bidochka et al. (1995) encontraram três diferentes padrões de amplificação do DNA para 8 espécimes de Entomophaga grylli originados do Canadá, EUA e Austrália, utilizando 3 diferentes iniciadores. Burmester & Wöstemeyer (1994) reportaram a elevada variabilidade entre sete isolados de Parasitella parasitica (3 isolados dos EUA e 4 com origem geográfica indeterminada), utilizando 4 diferentes iniciadores. Papp et al. (2001) verificaram 9 padrões de amplificação para 16 espécimes de Gilbertella persicaria, isoladas em diferentes locais na Califórnia, utilizando 6 iniciadores distintos e Vágvölgyi et al. (2004) reportaram 3 diferentes padrões de amplificação entre 29 espécimes Rhizopus stolonifer, provenientes da Califórnia, Japão, Suíca, Holanda e Índia, utilizando 6 iniciadores. Os diferentes padrões de amplificação observados entre isolados de uma espécie, com a utilização do RAPD, demonstram a variabilidade genética intra-específica destas espécies.

19 Park et al. (2003) verificaram variabilidade genética entre 20 isolados de Rhizopus com o uso da técnica de RFLP em combinação com PCR, utilizando a região ITS (ITS1-5,8S-ITS2) como alvo. Dois diferentes padrões de bandas foram verificados em Rhizopus oryzae isolados dos EUA, Japão e Coréia. ITS-RFLP foi aplicado por Chakrabarti et al. (2003) para diferenciar Apophysomyces elegans de outras espécies de Zygomycetes, enquanto a técnica de “microsatellite PCR fingerprinting” foi utilizada para a análise de polimorfismo genético intra-específico em isolados de A. elegans. Dois padrões de bandas foram observados para os 12 isolados estudados com a utilização dos iniciadores GTG5 e GAC5. A análise da variabilidade genética intra-específica em

Cunninghamella echinulata e C. elegans, aplicando o protocolo de ITS-RFLP (utilizando duas enzimas de restrição) e “microsatellite PCR “fingerprinting” (utilizando os iniciadores GTG5 e GAC5), foi realizada por Lemmer et al. (2002). Foram verificados 2 padrões de bandas entre 3 isolados de C. elegans (origem geográfica não informada) e 2 padrões de bandas entre 2 espécimes de C. echinulata isolados dos EUA e Índia.

2 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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