Geenius
™
HIV 1/2 Confirmatory Assay
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UM ENSAIO QUALITATIVO PARA CONFIRMAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE
ANTICORPOS INDIVIDUAIS PARA HIV-1 E HIV-2 EM AMOSTRAS DE SANGUE
TOTAL, SORO OU PLASMA
Índice
1. UTILIZAÇÃO PREVISTA ... 1
2. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE ... 1
3. PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO ... 1
4. REAGENTES ... 2
5. AVISOS E PRECAUÇÕES ... 3
6. AMOSTRAS ... 4
7. PROCEDIMENTO ... 5
8. LIMITAÇÃO DO TESTE ... 11
9. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ... 13
10. REFERÊnCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 17
1
1. UTILIZAÇÃO PREVISTA
O Bio-Rad Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay é um teste imunocromatográfico de utilização única para confirmação e diferenciação de anticorpos individuais para Vírus da Imunodeficiência Humana de Tipo 1 e 2 (HIV-1 e HIV-2) em amostras de sangue total obtido mediante picada num dedo, sangue total venoso, soro ou plasma.
O Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay destina-se a ser utilizado como teste adicional para confirmação da presença de anticorpos de HIV-1 e HIV-2 em amostras consideradas repetitivamente reactivas através de procedimentos de rastreio.
2. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE
Descoberto em 1983, o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV/VIH) é um retrovírus identificado como agente etiológico do Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS/SIDA). A SIDA é caracterizada por alterações na população de linfócitos célula T que desempenham um papel preponderante no sistema de defesa imunitária. No indivíduo infectado, o vírus causa uma redução da subpopulação da células T, denominadas células T auxiliares, deixando estes pacientes susceptíveis a infecções oportunísticas e a determinadas malignidades. As principais vias de transmissão são o contacto sexual, a contaminação através de sangue ou produtos do sangue e a transmissão da mãe para o recém-nascido.
No final de 2010 existiam aproximadamente 34 milhões de pessoas a viver com HIV/AIDS em todo o mundo, mais 17% do que em 2001.
Existiram 2,7 milhões [2,4 -2,9] novos casos de infecção por HIV em 2010, incluindo cerca de 390 000 [340 000-440 000] em crianças. Este valor foi 15% menor do que em 2001 e 21% abaixo do número de novas infecções no auge da epidemia em 1997.
Enquanto o vírus do HIV consiste numa molécula de ARN genómico protegida por um capsídeo e um envelope, o envelope do HIV é o principal alvo da resposta do anticorpo humoral. A presença do vírus em pacientes leva a que o sistema imunitário desencadeie a produção de anticorpos de HIV. A detecção destes anticorpos pode ser utilizada como ferramenta de diagnóstico.
O Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay é um teste imunocromatográfico rápido, de utilização simples e fácil. O Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay utiliza antigénios imobilizados para a detecção de anticorpos de HIV-1 e HIV-2 em amostras de soro, plasma ou sangue total.
3. PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO
O Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay utiliza a proteína A de ligação de anticorpo, conjugada com partículas de corante dourado coloidais como conjugado e antigénios (gp36, gp140) HIV-1 (p31, gp160, p24, gp41) e HIV-2, ligados à fase sólida da membrana. A amostra é aplicada ao TUBO DA SAMPLE + BUFFER. Depois de a amostra e do tampão terem migrado para a tira de teste, é adicionado tampão adicional ao tubo do BUFFER. O tampão facilita o fluxo lateral dos produtos libertados e promove a ligação de anticorpos a antigénios.
Numa amostra reactiva, os anticorpos anti-HIV são capturados pelos antigénios imobilizados na área de TEST (bandas 1 a 6): a proteína A dourada coloidal liga-se aos anticorpos capturados, produzindo linhas rosa/púrpura.
Na ausência de anticorpos de HIV, não existem linhas rosa/púrpura na área de TEST.
Em ambos os casos, a amostra continua a migrar ao longo da membrana e produz uma linha rosa/púrpura no CONTROL (C) onde a proteína A está imobilizada.
Imunoglobina G da amostra ligada à proteína A que está imobilizada na zona (C) da fase sólida da membrana e que produz uma linha rosa/púrpura.
Esta linha de Controlo serve para demonstrar que a amostra e os reagentes foram devidamente aplicados e que migraram através do dispositivo.
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A cassete do Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay contém uma banda de Controlo (C) e seis (6) linhas de teste numeradas na cassete correspondente a:
Banda 1: gp36 (HIV-2, peptídeo de envelope) HIV-2 ENV Banda 2: gp140 (HIV-2, peptídeos de envelope) HIV-2 ENV Banda 3: p31 (HIV-1, peptídeo polimerase) HIV-1 POL
Banda 4: gp160 (HIV-1, proteína recombinante de envelope) HIV-1 ENV Banda 5: p24 (HIV-1, proteína recombinante nuclear) HIV-1 GAG Banda 6: gp41 (Grupo M e O) (HIV-1, peptídeos de envelope) HIV-1 ENV
Banda CTRL: Proteína A
4. REAGENTES 4.1 Descrição
Identificação no rótulo Descrição Apresentação Device Membrana de nitrocelulose contendo antigénios HIV-1 e
HIV-2 na área de TEST, proteína A na área de CONTROL e proteína A dourada coloidal na área do tubo BUFFER
20 x 1 Pronto a utilizar
Buffer O conta-gotas do tampão com conservante (azida de sódio < 0,1%, sulfato de gentamicina 0,125%, sulfato de estreptomicina 0,125%)
1 x 5 ml Pronto a ser
utilizado
Microtubes 15 µl Pipetas plásticas de capilaridade microtubos 15 µl (sem anti-coagulante, para protocolo de sangue total obtido mediante picada num dedo)
1 x 20 Pronto a ser
utilizado
4.2 Requisitos de armazenamento e manuseamento
O Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay (Dispositivo e Tampão) deve ser armazenado a uma temperatura entre 2°C a 30°C, até ao prazo de validade mencionado no kit.
Não congelar. Não abrir a bolsa até efectuar um teste.
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5. AVISOS E PRECAUÇÕES
Para utilização em diagnóstico in vitro. Para utilização por profissionais de saúde.
5.1 Precauções de saúde e segurança
• Este kit de teste deve ser manuseado apenas por pessoal devidamente formado. Utilize vestuário de protecção adequado, luvas e protecção ocular/facial e manuseie de forma adequada de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais exigidas.
• O kit de teste contém componentes de sangue humano. Nenhum método de teste conhecido pode oferecer total garantia da ausência de agentes infecciosos. Daí que, todos os derivados de sangue humano, reagentes e amostras humanas devam ser manuseados como meios capazes de transmissão de doença infecciosa, na sequência das Precauções recomendadas, conforme definido pelos regulamentos locais, regionais e nacionais.
• Salpicos biológicos: Os salpicos de material de fonte humana devem ser tratados com potencialmente infecciosos.
Os salpicos que não contenham ácido devem ser imediatamente descontaminados, incluindo a área, materiais e quaisquer superfícies ou equipamento contaminado com salpicos, com um desinfectante químico apropriado eficaz para resíduos biológicos potencialmente perigosos relativos a amostras envolvidas (normalmente uma diluição de 1:10 de lixívia de uso doméstico, 70 a 80% de etanol ou Isopropanol e iodofor [como 0,5% Wescodyne™ Plus, etc.), devendo ser secos.
NOTA: Não coloque soluções que contenham lixívia na autoclave.
• Elimine todas as amostras e materiais utilizados para realizar o teste como se estes contivessem um agente infeccioso. Os resíduos laboratoriais, químicos e biológicos perigosos devem ser manuseados e eliminados em conformidade com todos os regulamentos locais, regionais e nacionais.
• Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns componentes químicos neste kit de teste, consulte a(s) ilustração(ões) indicada(s) nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em www.bio-rad.com.
5.2 Precauções relacionadas com o procedimento
5.2.1 Preparação
• Leio o Folheto do Produto na totalidade antes de utilizar este ensaio. Siga as instruções cuidadosamente. O não cumprimento das mesmas poderá resultar em resultados de teste incorrectos.
• A utilização deste kit de teste com tipos de amostra para além dos especificamente aprovados para utilização com este dispositivo, poderá resultar em resultados de teste incorrectos.
• Este teste deve ser efectuado a uma temperatura entre os 18°C a 30
°
C. Se armazenado refrigerado, antes de utilizar aguarde pelo menos 30 minutos até os reagentes estabilizarem à temperatura ambiente.• NÃO UTILIZE o dispositivo de teste se não existir nenhuma embalagem dessecativa na bolsa do dispositivo. Elimine o dispositivo de teste e utilize um novo dispositivo de uma bolsa que contenha um dessecativo.
• NÃO UTILIZE o dispositivo de teste se a bolsa do dispositivo estiver danificada. • Cada dispositivo teste é apenas para utilização única.
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• Não utilize o dispositivo de teste ou o reagente de kit para além do prazo de validade. Verifique sempre o prazo de validade antes de efectuar qualquer teste.
• Não misture reagentes com números de kits de lotes diferentes.
• É necessária uma iluminação adequada para ler os resultados de teste.
• Se o kit de teste for armazenado a temperaturas fora da temperatura de armazenamento entre os 2°C a 30°C, ou for utilizado fora da temperatura de funcionamento de 18°C a 30
°
C, utilize os Controlos de Confirmação do Geenius™ HIV 1/2, Refª.: 72329, de forma a garantir o correcto desempenho do teste.5.2.2 Processamento
• Depois de o saco fechado ser aberto, o dispositivo deve ser utilizado no espaço de 60 min.
• Não altere o procedimento de teste.
6. AMOSTRAS
O Confirmatory Assay Geenius™ HIV 1/2 pode ser efectuado em amostras de sangue venoso ou de sangue total obtido mediante punção dactilar, soro ou plasma.
6.1 Tipos de amostras Sangue Total Venoso
A extracção de sangue deve ser efectuada de acordo com o procedimento laboratorial para obtenção de sangue venoso. Recolha a amostra num tubo que contenha citrato, heparina ou EDTA. Certifique-se de que o tubo de sangue está bem misturado antes da amostra. Utilize uma pipeta de laboratório para retirar 15 µl de sangue. Teste de imediato, seguindo as instruções do Procedimento de Teste.
Sangue total obtido mediante punção dactilar
Limpe o dedo da pessoa que estiver a ser testada com um toalhete anti-séptico. Deixe o dedo secar bem ou seque com uma compressa esterilizada. Com uma lanceta esterilizada, efectue uma punção da pele mesmo ao lado do centro do dedo e limpe a primeira gota com uma compressa esterilizada, evitando apertar a ponta do dedo para acelerar o sangramento, pois isso poderá diluir o sangue com excesso de fluido de tecido. Recolha 15 µl da amostra da segunda gota tocando com a pipeta do microtubo descartável fornecida na gota de sangue até a pipeta ficar cheia, na sequência do procedimento abaixo.
Teste de imediato, seguindo as Instruções do Procedimento de Teste.
Soro ou Plasma
A extracção de sangue deve ser efectuada de acordo com o procedimento laboratorial para obtenção de amostras de soro ou plasma. Recolha de amostras de soro em tubos que contenham um agente de coagulação que não contenham nenhum anticoagulante (soro). Recolha amostras de plasma em tubos que contenham anticoagulantes com citrato, heparina ou EDTA. Recolha a amostra para um recipiente limpo, de acordo com os procedimentos laboratoriais padrão. Certifique-se de que o tubo de soro ou plasma está bem misturado antes da amostra. Utilize uma pipeta de laboratório para retirar 5 µl da amostra. Teste de imediato, seguindo as instruções do Procedimento de Teste.
6.2 Manuseamento das amostras
O sangue total obtido mediante picada num dedo deverá ser testado imediatamente a seguir à recolha.
As amostras de sangue venoso total podem ser testadas de imediato ou armazenadas a uma temperatura entre 2°C a 8
°
C até 3 dias após a recolha, antes de serem testadas.5
NÃO CONGELE SANGUE TOTAL.As amostras de soro e plasma podem ser testadas de imediato ou armazenadas a uma temperatura entre 2°C a 8
°
C até 7 dias após a recolha, antes de serem testadas.Para um armazenamento a longo prazo, as amostras de soro e plasma devem ser congeladas (a -20°C ou menos).
As amostras não devem ser utilizadas se tiverem passado por mais de 5 ciclos de congelamento-descongelamento. Misture as amostras minuciosa e suavemente após descongelação e deixe-as atingir a temperatura ambiente.
Não foi demonstrada qualquer interferência em amostras contendo até 200 mg/l de bilirrubina ou em amostras lipémicas que contenham até 33 g/l de trioleína ou em amostras hemolizadas que contenham até 2 g/l de hemoglobina. A presença de albumina ou concentração de proteínas anormalmente elevada (120 g/l) também não demonstrou qualquer interferência.
6.3 Transporte de amostras
Se as amostras tiverem que ser transportadas, devem ser embaladas de acordo com as regulamentações relativas ao transporte de agentes etiológicos.
As amostras de sangue venoso devem ser transportadas refrigeradas em embalagens frias ou com gelo seco.
As amostras de soro e plasma devem ser transportadas congeladas em gelo seco.
7. PROCEDIMENTO 7.1 Materiais necessários
Materiais fornecidos
• Dispositivo (20 unidades), Conta-gotas do Tampão (1 x 5 ml) e Microtubos 15 µl (1 x 20) por kit.
• Ver § 4.1 Descrição.
Material necessário fornecido em separado
• Controlos de Confirmação Geenius™ HIV 1/2, Ref.: 72329. Materiais necessários mas não fornecidos
• Relógio ou outro dispositivo para controlo do tempo.
• Pipetador com capacidade para 5 µl (soro/plasma) e 15 µl (sangue venoso) da amostra. • Luvas descartáveis.
• Recipientes para eliminação de resíduos biológicos perigosos.
7.2. Preparação dos reagentes
Todos os componentes do Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay estão prontos a utilizar conforme fornecidos.
7.3 Procedimento do Ensaio PROCEDIMENTO Sangue Total
1.
Remova o dispositivo do Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay da respectiva bolsa e coloque-o numa superfície plana (não é necessário remover o dessecativo da bolsa).
NOTA: Se a embalagem dessecativa não se
encontrar na bolsa, NÃO UTILIZE. Elimine
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o dispositivo de teste e utilize um novo dispositivo de teste.Coloque uma etiqueta no dispositivo de teste com a identificação do paciente ou número de identificação (ver Figura 1 abaixo). Note que o dispositivo do Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay possui seis (6) linhas azuis na área de Teste (sem linha azul na área de Controlo); se não estiverem presentes 6 linhas de cor, NÃO UTILIZE. Elimine o dispositivo de teste e utilize um novo dispositivo de teste.
Sangue total venoso
Ver preparação de amostras no § 6.1 Tipos de amostras.
Sangue total obtido mediante picada num dedo
Ver preparação de amostras no § 6.1 Tipos de amostras.
Passo 1:
Mantenha o microtubo 15 µL horizontalmente e toque na gota de sangue com a ponta. A acção capilar irá automaticamente extrair a amostra até à linha de enchimento e parar.
Passo 2:
Para expulsar a amostra, alinhe a ponta do tubo com a amostra-alvo e aperte o bulbo. Se a amostra não for expelida, mantenha o tubo na vertical e deslize um dedo sobre o orifício de ventilação. Depois, alinhe a ponta da amostra-alvo e aperte o bulbo.
2.
Distribua 15 µl de sangue total no centro do Tubo 1 da SAMPLE + BUFFER do dispositivo (ver Figura 2 abaixo).
Para sangue total venoso utilize uma pipeta de laboratório. Para sangue total obtido mediante
3
Logo depois da adição da amostra, utilize o
conta-gotas do Tampão para adicionar 2 gotas de Tampão (60uL), ao Tubo 1 da SAMPLE + BUFFER (ver Figura 3 abaixo).
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picada num dedo, siga o protocolo utilizando o microtubo 15 µl do kit (ver passo 1 e 2 acima).Figura 2
Figura 3
4. Aguarde 5 a 7 minutos as 6 linhas azuis de
TEST deverão desaparecer da área de TEST rectangular. Caso contrário, elimine o dispositivo de teste e repita o procedimento com um novo dispositivo de teste. NOTA: Uma ligeira coloração azul-esverdeada pode permanecer na membrana, mas nenhuma das linhas de cor actuais deve ser visível nesta altura.
Utilize o conta-gotas do tampão para adicionar
5 gotas (150uL) de Tampão ao Tubo 2 do
BUFFER (ver Figura 4 abaixo).
Figura 4
5. Efectue a leitura do teste entre 20 a 30 minutos após a adição do Tampão ao Tubo 2 do BUFFER
Não efectue a leitura dos resultados após 30 minutos
Efectue a leitura dos resultados numa área bem iluminada.
NOTA: Elimine as pontas de pipeta utilizadas, o
dispositivo de teste e quaisquer outros materiais de teste num recipiente para resíduos biológicos perigosos.
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PROCEDIMENTO Soro ou Plasma
Ver preparação de amostras no § 6.1 Tipos de amostras.
1. Remova o dispositivo do Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay da respectiva bolsa e coloque-o numa superfície plana (não é necessário remover o dessecativo da bolsa). NOTA: Se a embalagem dessecativa não se encontrar na bolsa, NÃO UTILIZE. Elimine o dispositivo de teste e utilize um novo dispositivo de teste.
Coloque uma etiqueta no dispositivo de teste com a identificação do paciente ou número de identificação (ver Figura 1 abaixo). Note que o dispositivo do Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay possui seis (6) linhas azuis na área de Teste (sem linha azul na área de Controlo); se não estiverem presentes 6 linhas de cor, NÃO UTILIZE. Elimine o dispositivo de teste e utilize um novo dispositivo de teste.
Figura 1
2.
Utilizando uma pipeta de laboratório, distribua 5 µl de soro/plasma no centro do Tubo 1 da SAMPLE + BUFFER do dispositivo (ver Figura 2 abaixo).
Figura 2
3
Logo depois da adição da amostra, utilize o frasco conta-gotas de diluente para
adicionar 2 gotas (60uL) do Tampão , ao
Tubo 1 da SAMPLE + BUFFER (ver Figura 3 abaixo).
Figura 3
4.
Aguarde 5 a 7 minutos. Todas as 6 linhas
azuis de TEST deverão desaparecer da área de TEST rectangular. Caso contrário, elimine o dispositivo de teste e repita o procedimento com um novo dispositivo de teste. NOTA: Uma ligeira coloração azul-esverdeada pode permanecer na membrana, mas nenhuma das linhas de cor actuais deve ser visível nesta altura.
Utilize o frasco conta-gotas de diluente para
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adicionar 5 gotas (150uL) de Tampão ao Tubo
2 do BUFFER (ver Figura 4 abaixo).
5.
Efectue a leitura do teste entre 20 a 30 minutos após a adição do Tampão ao Tubo 2 do BUFFER
Não efectue a leitura dos resultados após 30 minutos
Efectue a leitura dos resultados numa área bem iluminada.
NOTA: Elimine as pontas de pipeta utilizadas, os dispositivos de teste e quaisquer outros
materiais de teste num recipiente para resíduos biológicos perigosos.
7.4 Controlo de qualidade
7.4.1 Função de controlo incorporada
A linha de controlo serve como controlo interno incorporado e dá uma confirmação da adição da amostra e do correcto desempenho do teste. Uma linha rosa/púrpura irá surgir na área de CONTROL (C) se o teste tiver sido efectuado correctamente e o dispositivo estiver a funcionar devidamente (Ver: Interpretação dos Resultados de Teste).
7.4.2 Controlo de Qualidade Externo
Os Controlos de Confirmação Geenius™ HIV 1/2, Refª.: 72329 estão disponíveis separadamente para utilização com o Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay.
Recomenda-se a realização dos Controlos de Confirmação Geenius™ HIV 1/2 nas seguintes circunstâncias:
• Ao abrir um novo lote de kits de teste.
• Sempre que for recebida uma nova remessa de kits de teste.
• Se a temperatura da área de armazenamento de teste estiver fora da temperatura entre os 2°C a 30°C.
• Se a temperatura da área de teste estiver fora da temperatura entre os 18 a 30°C. • A intervalos periódicos conforme indicado pelo utilizador.
7.5. Critérios de validação do teste Reactividade da BANDA
Qualquer banda visível, ainda que ténue deve ser considerada reactiva. Critérios de validação
VÁLIDO:
Um teste apenas é válido se surgir uma linha rosa/púrpura na área de CONTROL (C), quer a linha apareça ou não na área de linha de TEST.
(A Banda de Controlo deve ser nítida: uma banda ténue não é aceitável como Banda de Controlo)
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INVÁLIDO:
Se não existir uma linha distinta visível rosa/púrpura (incluindo uma banda ténue) na área de CONTROL (C), o teste é INVÁLIDO
Um teste INVÁLIDO não pode se interpretado. É necessário repetir o procedimento de teste de amostras com um novo dispositivo.
7.6 Interpretação dos resultados
As seguintes definições descrevem os critérios utilizados pelo Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay na determinação da presença/ausência de anticorpos de HIV-1 e/ou HIV-2.
O utilizador, em seguida, analisa os perfis de banda específicos do tipo combinado de cada ensaio, de acordo com os critérios listados na Tabela de Interpretação de Resultados abaixo.
7.6.1 Critérios de interpretação Critérios de interpretação HIV-1
Interpretação Critérios Bio-Rad
POSITIVO
Quaisquer 2 bandas das linhas de teste 4 HIV-1 com pelo menos 1 ENV - gp160 (Banda 4) ou gp41 (Banda 6)
NEGATIVO Sem Banda
INDETERMINADO
1ENV (Banda 4 ou 6) 1GAG (Banda 5) 1POL (Banda 3)
1GAG e 1POL (Bandas 5 e 3)
Critérios de interpretação HIV-2
Interpretação Critérios Bio-Rad
POSITIVO 2 bandas HIV-2 devem estar presentes: gp36 e gp140 (Banda 1 e 2)
NEGATIVO Sem Banda
INDETERMINADO
1 ENV: gp36 (Banda 1) ou gp140 (Banda 2) gp36 (Banda 1) apenas
gp140 (Banda 2) apenas
Critérios de interpretação HIV-1/HIV-2 GLOBAL
A seguinte Tabela de Interpretação de Resultados descreve os critérios utilizados pelo Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay para interpretar os padrões de banda específicos do tipo combinado observados em cada ensaio.
RESULTADO HIV-2 RESULTADO HIV-1 INTERPRETAÇÃO GLOBAL DO ENSAIO
Negativo Negativo HIV NEGATIVO
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Negativo Indeterminado HIV-1 INDETERMINADO
Indeterminado Indeterminado HIV INDETERMINADO
Negativo Positivo HIV-1 POSITIVO
Indeterminado Positivo HIV-1 POSITIVO
Positivo Negativo HIV-2 POSITIVO
Positivo Indeterminado HIV-2 POSITIVO
Positivo
Positivo
caso 1 = 1 ENV HIV-1
(gp 160 ou gp41) + GAG ou POL
caso 2 = 2 ENV HIV-1
(gp 160 e gp41) +/- GAG e/ou +/-POL
HIV-2 POSITIVO
(com reactividade cruzada HIV-1)
HIV POSITIVO NÃO TIPIFICÁVEL
8. LIMITAÇÃO DO TESTE
8.1 Limitações gerais
1. A leitura visual pode introduzir alguma variabilidade na conclusão final entre dois técnicos diferentes ou dois testes diferentes: esta diferença pode estar ligada à subjectividade da interpretação visual.
2. Para um resultado reactivo, a intensidade das linhas de teste não se correlaciona obrigatoriamente com a titulação do anticorpo na amostra.
3. Presume-se que uma pessoa com um resultado confirmado de HIV-1 Positivo ou HIV-2 Positivo está infectada com o vírus, excepto se se tratar de uma pessoa que participou num estudo de vacinação HIV e que desenvolva anticorpos à vacina, podendo ou não estar infectado com HIV.
4. Os indivíduos infectados com HIV-1 e/ou HIV-2 que sejam submetidos a terapia anti-retroviral de alta eficácia (HAART) podem apresentar resultados falsos negativos.
5. A variabilidade dos vírus HIV-1 (grupo M e grupo O) e HIV-2 não exclui a possibilidade de reacções falsas negativas. Nenhum método de teste conhecido oferece total garantia da ausência do vírus HIV.
6. Um resultado não-reactivo não exclui a possibilidade de exposição ao HIV ou de infecção por HIV. Uma resposta do anticorpo a uma exposição pode demorar vários meses até atingir níveis detectáveis. Um teste de rastreio positivo, associado a um teste de confirmação negativo, pode ocorrer durante a primeira fase da infecção; por isso, um resultado negativo indica que a amostra testada não contém anticorpos anti-HIV detectáveis com o Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay. No entanto, um resultado deste tipo não exclui a possibilidade de uma infecção recente por HIV-1/HIV-2. Deve ser testada posteriormente uma nova amostra. 7. Um resultado indeterminado não exclui a possibilidade de exposição ao HIV ou de infecção
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níveis detectáveis. Um teste de rastreio positivo associado a um teste de confirmação indeterminado pode ocorrer durante a primeira fase de infecção; por isso, um resultado indeterminado indica que a amostra testada pode conter anticorpos anti-HIV detectáveis com o Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay. No entanto, um resultado deste tipo não exclui a possibilidade de uma infecção recente por HIV-1/HIV-2. Deve ser testada posteriormente uma nova amostra.
8. O Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay destina-se a ser utilizado como ajuda no diagnóstico de infecções por HIV-1 e/ou HIV-2. As condições relacionadas com HIV e SIDA são síndromes clínicos e o seu diagnóstico apenas pode ser estabelecido clinicamente. 9. O Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay APENAS deve ser utilizado com sangue capilar,
sangue total venoso, soro ou plasma. A utilização de outros tipos de amostras ou o teste de punção venosa de amostras de sangue total recolhidas utilizando um tubo que contenha um anticoagulante que não citrato, heparina ou EDTA poderá não gerar resultados precisos. 10. O Geenius™ HIV 1/2 Confirmatory Assay deve ser utilizado de acordo com as instruções
deste folheto do produto, por forma a obter resultados precisos.
11. A leitura dos resultados de teste antes de 20 minutos ou após 30 minutos, a contar da adição do Tampão em Execução ao Tubo 2 do BUFFER, poderá gerar resultados errados.
8.2 Limitações da interpretação do ensaio
Um perfil "indeterminado" não exclui uma das seguintes situações: seroconversão ou reacção cruzada com outros retrovírus. A homologia entre os vírus HIV-1 e HIV-2 pode conduzir a reactividade cruzada entre ambos os anticorpos anti-HIV-1 e anti-HIV-2 contra os vírus HIV-2 e HIV-1.
As amostras que cumpram os critérios de HIV-1 positivo apresentam, em alguns casos raros, alguma reactividade cruzada numa das bandas de Envelope HIV-2. Na maioria dos casos, este perfil que confirma uma única infecção por HIV-1 não exclui, em casos muito raros, a possibilidade de uma seroconversão HIV-2 secundária (sobreinfecção).
As amostras que cumprem os critérios de HIV-2 positivo podem apresentar reactividade cruzada em uma ou mais bandas HIV-1. Na maioria dos casos, um perfil indeterminado de HIV-1 associado a um perfil de HIV-2 positivo confirma uma única infecção por HIV-2. No entanto, não exclui a possibilidade de uma seroconversão HIV-1 secundária (sobreinfecção). As amostras que cumpram ambos os requisitos de HIV-1 e HIV-2 positivo são geralmente amostras HIV-2 positivo que apresentam reactividade cruzada HIV-1 quando possuem apenas uma banda de envelope detectada (gp160 ou gp41). Estes perfis não excluem a rara possibilidade de uma co-infecção HIV-1-HIV-2.
As amostras HIV não tipificáveis com todas as 4 bandas de envelope detectadas (todas do envelope HIV-1 e do envelope HIV-2) são, na maioria dos casos, amostras HIV-2 positivo com reactividade HIV2 que não podem ser visualmente diferenciadas da reactividade HIV-1. Estes perfis não excluem a possibilidade de uma co-infecção HIV 1/2.
As amostras que cumpram ambos os requisitos de HIV-1 e HIV-2 positivo são, em casos muito raros, amostras HIV-1 positivo que apresentam reactividade cruzada HIV-2.
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9. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO 9.1 Estudo de precisão
Foi testado um painel de precisão (N=6), composto por 3 amostras de soro e 3 amostras de sangue total de diferentes estados de HIV (HIV negativo, HIV-1 positivo, HIV-2 positivo). Para cada estudo de precisão e membro do painel, foi determinada uma percentagem de
concordância como o número de respostas correctamente identificadas comparadas com o estado da amostra.
9.1.1 Repetibilidade
O painel de precisão foi testado em 10 réplicas durante o mesmo ciclo. A medição da repetibilidade foi determinada com concordância de 100% para HIV negativo, HIV-1 positivo e HIV-2 positivo.
Membro do painel
Resultados de repetibilidade para Soro Resultados de repetibilidade para Sangue total N NEG IND POS concordância N NEG IND POS concordância HIV NEG 10 10 0 0 100% 10 10 0 0 100%
HIV-1 POS 10 0 0 10 100% 10 0 0 10 100%
HIV-2 POS 10 0 0 10 100% 10 0 0 10 100%
9.1.2 Precisão intermédia
Precisão por ciclo e dia
O painel de precisão do soro foi testado duplamente em cada ciclo, com 2 ciclos por dia durante 10 dias e o painel de precisão do sangue total foi testado em triplicado por ciclo, com 2 ciclos por dia durante 3 dias. A precisão ciclo-a-ciclo e dia-a-dia foi determinada com concordância de 100% para amostras de HIV negativo, HIV-1 positivo e HIV-2 positivo.
Membro do painel
Resultados da precisão por ciclo e por dia para Soro
Resultados da precisão por ciclo e por dia para Sangue total
N NEG IND POS concordância N NEG IND POS concordância HIV NEG 40 40 0 0 100% 18 18 0 0 100%
HIV-1 POS 40 0 0 40 100% 18 0 0 18 100%
HIV-2 POS 40 0 0 40 100% 18 0 0 18 100%
Precisão por Lote e Operador
O painel de precisão foi testado em duplicado em 2 lotes de reagentes e por 3 operadores com 1 ciclo por dia durante 3 dias. A precisão entre-operadores e entre-lotes foi determinada com concordância de 100% para amostras de HIV negativo, HIV-1 positivo e HIV-2 positivo.
Membro do painel
Resultados da precisão por Lote e por Operador para Soro
Resultados da precisão por Lote e por Operador para Sangue total
N NEG IND POS Concordância N NEG IND POS Concordância HIV NEG 36 36 0 0 100% 36 36 0 0 100%
HIV-1 POS 36 0 0 36 100% 36 0 0 36 100%
HIV-2 POS 36 0 0 36* 100% 36 0 0 36 100% * 2 réplicas apresentaram reactividade cruzada HIV-1
9.2 Desempenho clínico
9.2.1 Especificidade de diagnóstico Dadores de sangue
Um total de 400 amostras (soro, plasma e sangue venoso) recolhidas de 300 dadores não seleccionados conhecidos e dadores pela primeira vez, foram testadas no GeeniusTM HIV 1/2
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Confirmatory Assay num local de banco de sangue. 398 amostras apresentaram um resultado de teste negativo e 2 indeterminado. Os resultados indeterminados que representam 0,5% (2/400)
do total das amostras não foram considerados falsos positivos. A especificidade geral
(verdadeiros negativos/verdadeiros negativos+falsos positivos) nas 398 amostras foi de 100%
(398/398) com um intervalo de confiança a 95% de 99,1;100,0.
Especificidade em dadores de
sangue
Número total
de amostras Negativo Indeterminado Positivo
Especificidade (%) 95 CI (%) Soro (Separador de gel SSTII) 100 98 2 0 (98/98) 100,0 [96,4 - 100,0] Plasma (*) (EDTA-K2) 100 100 0 0 100,0 (100/100) [96,4 - 100,0] Sangue total venoso (EDTA-K2) 200 100 0 0 (200/200) 100,0 [98,2 - 100,0] TOTAL 300 dadores 400 398 2 0 100,0 (398/398) [99,1 - 100,0]
(*) amostras de plasma emparelhadas com amostras de sangue total venoso obtidas dos mesmos 100 dadores (**) Os resultados indeterminados não forma considerados falsos positivos. É necessária mais investigação.
Pacientes hospitalizados e mulheres grávidas
Um total de 508 amostras de 326 pacientes hospitalizados foram testadas no GeeniusTM HIV 1/2 Confirmatory Assay em 2 instalações diferentes. De entre estes pacientes, 99 possuíam apenas uma amostra de soro, 100 possuíam apenas uma amostra de sangue total, 72 possuíam amostras de soro e de sangue total, 30 pacientes possuíam amostras de soro, plasma e sangue total e 25 possuíam amostras de soro, plasma e sangue capilar.
Foram também testadas 30 amostras de soro de mulheres grávidas em 2 locais.
As amostras de sangue total venoso e de plasma foram recolhidas em tubos EDTA-K2 e as amostras de soro em SSTII com tubos com separador de gel. Não foi usado nenhum anticoagulante para a recolha de sangue capilar.
529 amostras obtiveram resultados de teste negativos e 9 indeterminados. Os resultados indeterminados representam 1,7% (9/538) do total das amostras e não foram considerados falsos positivos. A especificidade geral (verdadeiros negativos/verdadeiros negativos+falsos positivos) nas 529 amostras foi de 100% (529/529) com um intervalo de confiança a 95% de 99,3; 100,0.
Local Pacientes Soro novo (Gel SSTII) Plasma novo (EDTA-K2) Fresh venous blood /EDTA-K2 Sangue venoso novo (EDTA-K2) Total de amostras Mulheres gravidas (soro congelado ) Total Local 1 99 99 / / / 99 10 109 Local 2 227 / / 100 / 100 / 100 72 / 72 / 144 / 144 30 30 30 / 90 / 90 25 25 / 25 75 / 75 Local 5 / / / / 20 20 Total 326 226 55 202 25 508 30 538 Negativo / 221 54 201 25 501 28 529 Indeterminado 5(*)(***) 1(*)(***) 1(*)(***) 0 7 (***) 2 (***) 9 (***) Positivo 0 0 0 0 0 0 0 Especificidade (%) / 100.0 (221/221) 100.0 (54/54) 100.0 (201/201) 100.0 (25/25) 100.0 (501/501) 100.0 (28/28) 100.0 (529/52 9) 95 CI (%) / [98.3 - 100.0] [93.4 - 100.0] [98.2 -100.0] N/A(**) [99.3 - 100.0] N/A(**) [99.3 - 100.0]
(*) 1 paciente apresentou 1 resultado indeterminado para soro, sangue venoso e plasma (**) não aplicável no caso de população N<30
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Dadores de sangue com resultados falsos positivos no rastreio
Um total de 275 amostras de soro recolhidas de dadores de sangue com resultados falsos positivos em ensaios de rastreio HIV ELISA foram testadas no GeeniusTM HIV 1/2 Confirmatory Assay em dois locais clínicos.
9.2.2 258 amostras obtiveram resultados de teste negativos e 17 indeterminados.
Os resultados indeterminados representam 6,2% /17/275) do total das amsotras não forma considerados falsos positivos. A especificidade geral (verdadeiros negativos/verdadeiros negativos+falsos positivos) das 258 amsotras foi 100% (258/258) com im intervalo de confiança a 95% de 98,6; 100,0.
Specificity on blood Donors
Total number
specimens Negative Indeterminate Positive
Specificity (%) 95 CI (%) TOTAL 275 donors 275 258 17 (*) 0 (258/258) 100.0 [98.6 - 100.0]
(*) IOs resulatdos indeterminados não foram considerados falsos positivos/mais investigação é necessária
9.2.3 Sensibilidade do diagnóstico Pacientes infectados com HIV-1
Um total de 599 amostras de 263 pacientes confirmados como estando infectados com HIV-1, de 2 locais (155 pacientes no local 1 e 108 pacientes no local 2), foram testadas no GeeniusTM HIV 1/2 Confirmatory Assay
No local 1, foram testadas 108 estirpes de soro novo e plasma emparelhado, 5 de soro novo e 50 de genótipo de HIV-1 (2 CRF01, 5 CRF02, 1 CRF05, 1 CRF06, 2 CRF09, 1 CRF11, 1 CRF12, 1 CRF13, 1 CRF14, 1 CRF15, 1 CRF18, 1 CRF19, 1 CRF22, 1 CRF27, 1 CRF30, 1 CRF36, 1 CRF42, 4 subtipo A, 5 subtipo B, 2 subtipo C, 2 subtipo D, 2 subtipo F, 2 subtipo G, 2 subtipo H, 2 subtipo J, 1 subtipo K, 5 grupo O).
No segundo local, entre os 108 pacientes, 82 possuíam amostras de sangue total, soro e plasma, 20 possuíam amostras de sangue total, sangue total capilar, soro e plasma e 6 possuíam amostras de sangue total capilar, soro e plasma.
As amostras de sangue total venoso e plasma foram recolhidas em tubos EDTA-K2 e as amostras de soro em SSTII com tubos com separador de gel.
Todas as 599 amostras apresentaram um resultado de testes HIV-1 positivo, conduzindo a uma sensibilidade geral de 100% (599/599) com um intervalo de confiança de 95% em [99,4 - 100,0]. A sensibilidade HIV-1 nos pacientes foi de 100% (263/263).
No total de 599 amostras, 3 amostras forma consideradas não tipificáveis quanto a HIV em vez de HIV-1 positivas, por isso, a capacidade de diferenciação HIV-1 do GeeniusTM HIV 1/2 Confirmatory Assay foi de 99,5% (596/599) com um intervalo de confiança de 95% em [98,5 - 99,9].
Local Pacientes Soro novo (Gel SSTII) genotipado Soro Plasma novo (EDTA-K2)
Sangue venoso novo (EDTA-K2) Sangue capilar novo Total de amostras Local 1 100 / / 100 100 / 200 N= 155 5 5 / / / / 5 50 / 50 / / / 50 Local 2 82 82 / 82 82 / 246 N= 108 20 20 / 20 20 20 80 6 6 / 6 / 6 18 Total 263 113 50 208 202 26 599 HIV-1 Positivo 113 49 207 201 26 HIV não tipificável 0 1 1(*) 1(*) 0 Sensibilidade (%) (113/113) 100,0 (50/50) 100,0 (208/208) 100,0 (202/202) 100,0 (26/26) 100,0 (599/599) 100,0 95 CI (%) [97,8 - 100,0] [98,2 - 100,0] [98,2 -100,0] N/A(**) [99,4 - 100,0] (*) amostras de plasma emparelhado com amostra de sangue venoso obtidas do mesmo paciente infectado com HIV-1 (**) não aplicável no caso de população N<30
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Pacientes infectados com HIV-2Um total de 283 amostras de 172 pacientes confirmados como estando infectados com HIV-2 (soro, plasma, sangue venoso e sangue capilar com algumas amostras emparelhadas recolhidas dos mesmos pacientes) foram testadas no GeeniusTM HIV 1/2 Confirmatory Assay em três locais clínicos. Foram obtidas 66 amostras de soro de dois locais clínicos de recolha de amostras. Todas as outras amostras foram obtidas novas dos pacientes.
As amostras de sangue total venoso e de plasma foram recolhidas em tubos EDTA-K2 ou EDTA-K3 e as amostras de soro recolhidas em SSTII com tubos com separador de gel ou tubos secos.
As 281 amostras apresentaram um resultado de teste HIV positivo e 2 apresentaram um resultado de teste HIV-2 indeterminado, conduzindo a uma sensibilidade geral de 99,3% (281/283) com um intervalo de confiança de 95% em [97,5 - 99,9]. Os dois resultados HIV-2 indeterminados (gp140 não detectado) foram obtidos em soro e sangue total recolhidos do mesmo paciente com gp105 negativo, através de um ensaio de confirmação HIV I/II com marcação CE.
Os resultados indeterminados representam 0,7% (2/283) do total das amostras e não foram considerados como falsos negativos. A sensibilidade geral (verdadeiros positivos/verdadeiros positivos+falsos negativos) nas 281 amostras foi de 100% (281/281) com um intervalo de confiança a 95% de 98,7; 100,0: Locais Pacientes Soro novo (Gel SSTII) Soro congelado Plasma novo (EDTA-K2) Sangue venoso novo (EDTA-K2 ou K3) Sangue capilar novo Total de amostras Local 1 5 5 / 5 2 3 15 16 / 16 / / / 16 Local 2 50 / 50 / / / 50 Local 3 101 101 / / 101 / 202 Total 172 106 66 5 103 3 283 HIV-2 Positivo 33 15 3 28 3 82 HIV-2 positivo com reactividade HIV-1 33 19 1 35 0 88 HIV não tipificável 39 32 1 39 0 111 Indeterminado 1(*)(***) 0 0 1(*)(***) 0 2 (***) Sensibilidade (%) (171/171) 100.0 100.0 (5/5) (102/102) 100.0 100.0 (3/3) (281/281) 100.0 95 CI (%) [97.9 - 100.0] N/A** [96.5 - 100.0] N/A** [98.7 – 100.0]
(*) amostras de soro emparelhado com amostra de sangue venoso obtidas do mesmo paciente infectado com HIV-2
(**) não aplicável no caso de população N<30
(***) Os resultados indeterminados não foram considerados como falsos negativos / mais investigação é necessária
Pacientes co-infectados com HIV-1/HIV-2
Um total de 22 amostras de 15 pacientes confirmados como estando co-infectados com HIV-1/ HIV-2 (13 de soro, 2 de plasma e 7 de sangue venoso total emparelhado recolhidas nos mesmos 7 pacientes) foram testadas no GeeniusTM HIV 1/2 Confirmatory Assay em dois locais clínicos. Seis amostras de soro e 2 de plasma foram obtidas num local de recolha de amostras clínicas e as sete amostras de sangue venoso total-soro emparelhadas foram obtidas de novo de pacientes de outro local clínico.
A sensibilidade geral foi 100% (22/22) (soro e sangue venoso total) sem resultados indeterminados. Na primeira declaração, todas as amostras foram correctamente consideradas HIV não tipificáveis (HIV-1 positivo com detecção de dois envelopes e HIV-2 positivo), à excepção de uma amostra de sangue total e uma de soro. O sangue total foi impropriamente considerado HIV-2 positivo devido a uma recente sobreinfecção. Após reavaliação algumas semanas depois, este paciente foi correctamente considerado como HIV não tipificável. O soro foi impropriamente considerado HIV-2 positivo com reactividade HIV-1 em vez de HIV não tipificável, mas foi também impropriamente
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considerado HIV-2 positivo (sem reactividade HIV-1) em vários ensaios de diferenciação HIV com marcação CE. 21 de mais de 22 amostras foram correctamente consideradas HIV não tipificáveis após uma reavaliação do paciente. Por isso, a capacidade de diferenciação HIV-1+2 do GeeniusTM HIV 1/2 Confirmatory Assay foi de 95,5% (21/22).
Amostras de seroconversão HIV-1
A sensibilidade do GeeniusTM HIV1/2 Confirmatory Assay foi avaliada com 32 painéis de seroconversores (154 amostras). 41,6% (64/154) eram positivos com o GeeniusTM HIV1/2 Confirmatory Assay, enquanto 12,3% (19/154) eram positivos com um ensaio Western Blot com marcação CE. A detecção do primeiro ponto de extracção positivo foi, em média, anterior 1,4 (44/32) pontos temporais por painel com o GeeniusTM HIV 1/2 Confirmatory Assay.
Ao testar 83 amostras de seroconversão precoce (negativas ou indeterminadas por Western Blot), 10,8% (9/83) eram positivas com o Geenius™HIV1/2 Confirmatory Assay.
Com base em 10 amostras de seroconversão, testadas num local clínico e em comparação com o mesmo ensaio Western blot de referência, o Geenius™ HIV1/2 Confirmatory Assay mostrou ser mais sensível na detecção de anticorpos para gp41 e apresentou uma sensibilidade semelhante para a detecção de anticorpos para gp160.
O Geenius™ HIV1/2 Confirmatory Assay cumpre os regulamentos mais recentes em termos da sensibilidade prevista com painéis de seroconversão HIV.
9.3 Especificidade analítica
9.3.1 Reactividade cruzada
251 amostras com potenciais reacções cruzadas, representando 29 doenças/estados diferentes testadas positivas para os seguintes marcadores foram testadas no GeeniusTM HIV 1/2 Confirmatory Assay em diferentes locais clínicos.
HTLV I/ II (20), Hepatite C (10 HCV), Hepatite B (10 anti-HBS) e Hepatite A (10 HAV IgG); Citomegalovírus (10 CMV IgG), Epstein-Barr (10 EBV IgG),Herpes Simplex (10 HSV), Rubéola IgG (10), Toxoplasmose IgG (5), Sífilis IgG (10), Cândida (10), Malária (26), Dengue (2), Leishmaniose (2), Vaccinia (10), Vacina contra a gripe (5 Flu), Diálise (10), HAMA (10), Factor reumatóide (10), Multi-transfusão (10), Mieloma (5) Hemofílico (10), Auto-imune como Lupus eritematoso sistémico (12 SLE), Esclerodermia (2), Sjogrens (2), Doença mista do tecido conjuntivo (2 MCTD), anticorpo antinuclear (3 ANA), Cancro (5), Cirrose (5) e Mulheres multíparas (5).
Do total de 251 amostras difíceis, 245 amostras revelaram um resultado negativo e 6 amostras revelaram um resultado indeterminado (indeterminado com HIV-1 Western-Blot e positivo para malária). Os resultados indeterminados representam 2,4% (6/251) do total das amostras e não foram consideradas como falsos positivos. A especificidade geral (verdadeiros negativos/verdadeiros negativos+falsos positivos) foi de 100% (245/245) com um intervalo de confiança a 95% de 98,5-100,0
9.4 Efeito "Hook"
O possível efeito "Hook" foi estudado testando 2 amostras HIV-1 e 2 amostras HIV-2 de alta titulação, puras e diluídas. Não foram observados resultados negativos nem de menor intensidade nas amostras positivas HIV-1 e HIV-2 puras de alta titulação, quando comparadas com os seus formatos mais diluídos (1:10 para 1:100000). A equivalência de resultados entre amostras não diluídas e amostras diluídas demonstra a ausência do efeito "Hook".
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