ANDRÉA MARTINI RIBEIRO
ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS E
OSMORREGULATÓRIAS EM Prochilodus lineatus
EXPOSTOS AO CHUMBO
Londrina – Paraná 2007
ANDRÉA MARTINI RIBEIRO
ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS E
OSMORREGULATÓRIAS EM Prochilodus lineatus
EXPOSTOS AO CHUMBO
Supervisor de Estágio
Dra. Cláudia Bueno dos Reis Martinez
Londrina – Paraná 2007
Monografia apresentada ao Curso de
Graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Estadual de Londrina
como um dos requisitos à obtenção do
título de Bacharel em Ciências
Biológicas.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Cláudia Bueno dos Reis Martinez
Profa. Dra. Marta M. Souza
Profa. Ms. Marina Mori Camargo
DEDICATÓRIA Dedico este trabalho ao meu amado filho João Guilherme.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora Profa. Dra. Cláudia Martinez pela paciência, pelo apoio e ensinamentos.
Agradeço a todos os colegas de laboratório: Bel, Carol, Dalita, Esther, Gabriel, Jaque, Jú, Kathya, Lindalva, Lú Loira, Luzinha, Mari, Marina, Michel, Rafa, Renata e Vanessa.
Agradeço aos meus colegas de turma e amigos, que se fizeram presentes durante o decorrer de toda a graduação.
Agradeço em especial à minha querida amiga Amanda, pela amizade incondicional.
Agradeço aos meus pais pela presença constante.
SUMÁRIO Pág. 1. Introdução 1 2. Revisão de Literatura 4 3. Objetivos 10 4. Artigo 11
RESUMO
Prochilodus lineatus é uma espécie de peixe neotropical com hábito alimentar detritívoro. Esta espécie caracteriza-se um ótimo bioindicador, uma vez que se mostra bastante sensível à presença de poluentes aquáticos. Sua distribuição abrange as Bacias Paraíba do Sul, Paraguai e Paraná. Nesta última localiza-se o município de Londrina, onde por muitos anos funcionou uma fábrica de baterias automotivas, empreendimento que tem como uma de suas principais matérias primas o chumbo. Este metal pesado é extremamente tóxico e seus efeitos são cumulativos. Uma vez no ambiente, o chumbo liga-se fortemente ao sedimento, sendo facilmente ingerido por animais detritívoros, como o P. lineatus. Em peixes, dentre os índices que podem sofrer alterações causadas pelo chumbo estão, os parâmetros hematológicos (conteúdo de hemoglobina, número de eritrócitos e hematócrito), glicêmico e osmorregulatórios (atividade da enzima Na+/K+-ATPase e íons plasmáticos). Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar as possíveis alterações hematológicas, glicemicas e osmorregulatórias em P. lineatus causadas pela exposição aguda e subletal ao chumbo. Para tanto, juvenis desta espécie foram expostos a uma concentração de 0,5 mg.L-1 de chumbo dissolvido (Pb) ou apenas à água (CTR), durante 6, 24 e 96 horas. Sangue e brânquias foram coletados para as análises. Os resultados obtidos mostraram que os valores de hematócrito, RBC e hemoglobina aumentam no período inicial e diminuiram passadas 96 horas. Os valores de glicose plasmática mostraram tendências de variação em todos os tempos experimentais. Enquanto os valores do íon cloreto no plasma se mantiveram inalterados, os valores de potássio aumentam significativamente e os de sódio apresentaram uma clara tendência à diminuição. Este resultado foi, ainda, acompanhado de uma tendência da diminuição da atividade da enzima Na+/K+-ATPase. O aumento dos parâmetros hematológicos no período experimental mais curto (6h) indica o aumento do número de hemácias circulantes, provavelmente como resultado da contração esplênica, em conseqüência da resposta ao estresse. Já no período de exposição mais longo (96h), a redução dos parâmetros hematológicos indica o possível efeito do chumbo nos processos de síntese de hemoglobina e eritrócitos, ou ainda a ocorrência de um processo de hemólise, visto que os valores de potássio plasmático aumentaram significativamente. Pode-se ainda prever que concentrações mais altas desse metal poderiam interferir de forma negativa sobre a osmorregulação deste peixe, visto que a atividade da enzima Na+/K+-ATPase e consequentemente o íon sódio nesta concentração de chumbo, apresentaram uma tendência à diminuição de seus valores.
Palavras-Chave: ecotoxicologia, hematologia, osmorregulação, Prochilodus lineatus, chumbo.
1. INTRODUÇÃO
O desejo do homem moderno pelo desenvolvimento de novos recursos é incansável. Estes recursos, por sua vez, desempenham um importante papel na sociedade como geradores de benefícios, quanto à produção de bens de consumo, impostos e empregos (YABE e OLIVEIRA, 1998). Entretanto, o desejo de aprimoramento científico e a busca por novas tecnologias, pode acarretar sérios problemas ao meio-ambiente, principalmente para as bacias hidrográficas, onde vêm sendo depositados uma ampla gama de rejeitos.
O chumbo é comumente utilizado nas indústrias de tintas, vidros, e baterias, e também na indústria petroquímica como aditivos em combustíveis, sendo, portanto, uma importante fonte de contaminação ambiental. Muito pesado e extremamente maleável, o chumbo resiste muito mais à corrosão do que a maioria dos metais, ligando-se também à maior parte deles (PAOLIELLO e CHASIN, 2001).
Os óxidos de chumbo são amplamente utilizados nas placas de baterias elétricas e acumuladores (PbO e 2PbO.PbO2), como agentes componentes na manufatura da borracha (PbO), como ingredientes nas tintas (Pb3O4) e como constituintes de vitrificados, esmaltes e vidros (PAOLIELLO e CHASIN, 2001).
Com o objetivo de caracterizar a bacia do ribeirão Cambé quanto à presença de poluentes, no município de Londrina – PR, Yabe e Oliveira (1998) identificaram diversos metais pesados em águas superficiais. As estações de coletas seguiam desde o manancial da bacia até o Lago Igapó I, passando por um trecho onde se encontrava uma fábrica de baterias. As concentrações médias de chumbo encontradas na água aumentavam em direção à jusante, extrapolando em grande
proporção os níveis máximos permitidos pela legislação nacional vigente. Nas proximidades da fábrica de baterias, Yabe e Oliveira (1998) registraram variações bruscas de pH, que ocasionou um aumento significativo nas concentrações dos metais estudados. Ao longo de todo o percurso analisado do ribeirão houve a presença sistemática dos elementos chumbo, níquel, cádmio, cromo e cobre, introduzidos por fontes cuja origem está na urbanização e industrialização, além de ferro, alumínio, manganês, cálcio e mercúrio, originados, principalmente, do carreamento de partículas por meio das águas de escoamento.
O complexo de lagos (Igapó I, II, III e IV), localizado no município de Londrina foi projetado em 1957, como uma solução para o problema da drenagem do ribeirão Cambé (PML, 2007). Este complexo de lagos abriga, portanto, diversas espécies nativas de peixes que anteriormente habitavam aquele ribeirão.
O peixe characiforme Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1836) é um animal endêmico das bacias do Paraíba do Sul (FISHBASE, 2007), Paraná e Paraguai (FISHBASE, 2007; FUGI et al., 1996). Detritívoro, consome quase exclusivamente finas partículas do lodo, onde estão contidos sedimentos inorgânicos, que é a parcela mais considerável da sua dieta, além de detritos orgânicos e diatomáceas (FUGI et al., 1996). Esta espécie caracteriza-se como um ótimo bioindicador, uma vez que mostra-se bastante mostra-sensível a poluentes, podendo mostra-ser, portanto, empregada com sucesso em testes de toxicidade (MARTINEZ e CÓLUS, 2002).
Após a captação de chumbo pelos peixes, este se acumula principalmente nas brânquias, fígado, rins e ossos. Também foram identificadas altas concentrações de chumbo em ovos de peixes expostos à níveis elevados deste metal
(WHO apud PAOLIELLO e CHASIN, 2001). Portanto, testes fisiológicos tornam-se de fundamental importância para a determinação da toxicidade deste elemento para essa espécie neotropical de peixe.
Atualmente, biomarcadores fisiológicos têm se mostrado de fundamental importância na avaliação e quantificação tanto da exposição quanto dos efeitos de poluentes ambientais (WINKALER et al., 2001). Sabe-se que diversos poluentes são capazes de causar alterações morfológicas e funcionais nos mais diversos tecidos dos peixes. Entretanto, os metais pesados, além de provocarem alterações no epitélio das brânquias, podem alterar a atividade da enzima Na-K-ATPase e, dessa forma, o fluxo normal de íons (SKIDMORE, 1970; PINHEIRO, 2004). Outras importantes alterações fisiológicas que podem ser encontradas em peixes expostos a poluentes além dos desajustes iônicos, incluem alterações hematológicas e metabólicas (MAYER, 1992; WINKALER et al., 2001).
2. REVISÃO DE LITERATURA
O chumbo é um elemento relativamente abundante na crosta terrestre, tendo uma concentração média entre 10 e 20 mg/kg. As maiores fontes naturais de chumbo são emissões vulcânicas, intemperismo geoquímico e névoas aquáticas (PAOLIELLO e CHASIN, 2001).
O chumbo ocorre numa variedade de minérios, sendo a galena (sulfeto de chumbo) a mais importante fonte primária de chumbo e a principal fonte comercial. A produção de chumbo no Brasil refere-se principalmente ao chumbo secundário, obtido a partir da recuperação do metal de sucatas e rejeitos (PAOLIELLO e CHASIN, 2001).
Materiais e dispositivos que contém chumbo não podem ser descartados no ambiente, devem ser reciclados. Mas a reciclagem é um processo com grandes desafios, já que grande quantidade de resíduos são gerados e ocorrem emissões de gases e efluentes contaminados com o chumbo (JOST, 2001).
Na reciclagem da bateria chumbo-ácido estão envolvidos três processos: quebra da bateria, redução e refinamento do chumbo. Dentre as fontes comuns de impacto ambiental deste processo de redução, destacam-se: rejeitos contaminados com chumbo, poeira contaminada com chumbo (dos filtros), emissão de SO2, emissão de compostos clorados e produção de dejetos. Em média, cerca de 300-350 kg de dejetos são produzidos para cada tonelada de chumbo metálico, e cerca de 5% desses dejetos são compostos de chumbo (JOST, 2001). Uma vez lançado no ambiente, o chumbo pode ser transformado de uma espécie inorgânica para outra, ou de um tamanho de partícula para outro. Entretanto, como elemento, não está sujeito a
degradação (PAOLIELLO e CHASIN, 2001).
Em sistemas aquáticos contaminados, apenas uma pequena fração do chumbo encontra-se dissolvida na água, pois a maior parte do metal liga-se fortemente ao sedimento. O chumbo é extremamente tóxico e seus efeitos são cumulativos e, na maioria das vezes, se desenvolvem após uma exposição prolongada (WHO, 1989).
Um dos fatores mais importantes que influenciam a toxicidade aquática deste metal é a concentração iônica livre, a qual interfere na disponibilidade do chumbo para os organismos (PAOLIELLO e CHASIN, 2001). A toxicidade do sal inorgânico do chumbo é muito dependente de condições ambientais, como a dureza da água, pH, quantidade de partículas orgânicas e salinidade (HODSON, 1979; DEMAYO et al., 1982; WHO, 1989). A toxicidade deste elemento não está, portanto, ligada apenas às concentrações da espécie metal, mas também à capacidade de absorção da biota aquática (HODSON et al., 1980).
Cada poluente é capaz de gerar diferentes alterações em determinado animal, e estas alterações, quando usadas a fim de identificar danos, são chamadas biomarcadores (WINKALER et al., 2001). Os biomarcadores constituem importantes ferramentas para monitorar o equilíbrio do ecossistema aquático e têm sido empregados em diversos programas de monitoramento em vários países (ADAMS et al., 1990; WALKER et al., 1996). Atualmente, os biomarcadores fisiológicos, histológicos e bioquímicos vêm sendo utilizados amplamente para apontar e quantificar tanto a exposição quanto os efeitos de contaminantes ambientais (ADAMS et al., 1990; WINKALER et al., 2001).
através da avaliação da sobrevivência e do sucesso reprodutivo das populações (RANKIN et al., 1982), nas disfunções fisiológicas, alterações estruturais em órgãos e tecidos e modificações comportamentais que levam ao prejuízo do crescimento e reprodução (ADAMS et al., 1990). A biota aquática é, portanto, uma boa alternativa como indicador dos metais biologicamente disponíveis. E, pela definição, metal absorvido pela biota deve estar biologicamente disponível (HODSON et al., 1980).
Soluções letais de chumbo (assim como muitos outros metais pesados) causam aumento da formação de muco nos peixes. Esse excesso de muco coagula-se sobre o corpo do animal acumulando-se principalmente sobre as brânquias, interferindo na função respiratória, podendo causar morte por hipóxia (ARONSON apud EISLER, 1988). Em concentrações de chumbo maiores que 10 µg.L-1 são esperados efeitos severos em peixes expostos por um longo tempo (DEMAYO et al., 1982).
Peixes que são cronicamente expostos ao chumbo mostram uma grande variedade de sinais de envenenamento: curvatura espinhal, usualmente lordose (SIPPEL et al., 1982; HOLCOMBE et al., 1976); degeneração da nadadeira caudal (SIPPEL et al., 1982); destruição dos neurônios espinhais (SIPPEL et al., 1982); atrofia muscular (SORENSEN, 1991); paralisia (SORENSEN, 1991); mudanças comportamentais (SORENSEN, 1991); alterações sanguíneas (DEMAYO et al., 1982; SORENSEN, 1991; HEATH, 1995; MARTINEZ et al., 2004); inibição da enzima ALA-D em eritrócitos, fígado e tecidos renais (HODSON, 1979; JOHANSSON-SJOBECK e LARSSON, 1979); extravasamento de eritrócitos (DEMAYO et al., 1982); elevação da concentração de chumbo no sangue, ossos, brânquias, fígado e rins (HOLCOMBE et al., 1976); destruição do epitélio respiratório (HOLCOMBE et al., 1976); alterações na
osmorregulação (AHERN e MORRIS, 1998; ROGERS et al., 2003; MARTINEZ et al., 2004) inibição do crescimento (HOLCOMBE et al., 1976); retardamento da maturação sexual (DAVIES et al., 1976); alterações histológicas de brânquias (MARTINEZ et al., 2004), testículos e ovários (KUMAR e PANT, 1984); e até morte (EISLER, 1988).
Dentre os parâmetros hematológicos que podem ser alterados pela presença de chumbo, estão conteúdo de hemoglobina, número de células vermelhas e hematócrito. Dá-se o nome de hematócrito ao volume ocupado pelas células vermelhas sangüíneas. Diferentes espécies de peixes podem apresentar grande variação neste índice (STREIT, 1998). A medida dos valores de hematócritos foi sugerida como um possível indicador de condições poluídas, sendo que esse índice mostrou-se útil em alguns casos, como para peixes expostos ao cádmio (LARSSON et al., apud HUGHES, 1987). Um aumento do valor do hematócrito pode ser causado, por exemplo, por danos nas brânquias em decorrência de hipóxia interna, ocorrendo, neste caso, um inchaço dos eritrócitos (HEATH, 1995).
Dawson (1935) verificou que a exposição a altas concentrações de chumbo causou anemia e hemólise das células sanguíneas vermelhas de Ictallurus nebulosus. Anemia hemolítica em peixes é característica de curta exposição (até 90 horas) a uma concentração de até 15 mg Pb.L-1 (DEMAYO et al., 1982).
Outros índices que podem sofrer alterações após a exposição do animal a um agente estressor, são o conteúdo de hemoglobina, o número de eritrócitos (red blood cells – RBC) e o volume corpuscular médio (VCM). A baixa concentração de hemoglobina, assim como a redução do número de eritrócitos, são as causas do quadro de anemia desenvolvido por animais expostos a contaminantes (HEATH, 1995).
O principal efeito do chumbo no sistema hematopoiético, entretanto, é a morte prematura das células vermelhas sanguíneas maduras e a inibição da formação da hemoglobina através da inativação da enzima ácido δ-aminoleviúnico desidratase (ALA-D) (HODSON, 1979; PAOLIELLO et al., 1993; CALDEIRA et al., 2000). Resultando, mais uma vez em anemia nas exposições a altas concentrações.
As brânquias também podem sofrer mudanças na morfologia devido à uma ação ou como uma resposta aos poluentes ambientais, representando assim estratégias adaptativas a fim de manter íntegras suas funções (LAURENT e PERRY, 1991). As brânquias dos peixes exercem papéis vitais, visto que, além de serem o principal sítio de trocas gasosas (SCHMIDT-NIELSEN, 2002; HUGHES, 1982) também estão envolvidas nos processos de osmorregulação (FLIK e VERBOST, 1993; SCHMIDT-NIELSEN, 2002), equilíbrio ácido-básico (EVANS et al., 1982), excreção de compostos nitrogenados (MACHADO, 1999; SCHMIDT-NIELSEN, 2002) e gustação (HUGHES, 1982). As brânquias possuem rastros branquiais que impedem que partículas sólidas entrem em contato com os filamentos e as lamelas, podendo causar injúrias. Entretanto, se agentes irritantes encontrarem-se dissolvidos na água, inevitavelmente entrarão em contato com os filamentos branquiais e com as lamelas respiratórias, podendo alterar a morfologia normal da brânquia (RANKIN et al., 1982; LUVIZOTTO, 1994).
Metais pesados, além de provocarem alterações no epitélio das brânquias, podem alterar a atividade da enzima Na+/K+-ATPase e, dessa forma, o fluxo normal de íons (SKIDMORE, 1970). Em condições normais, um peixe dulcícola deve captar os íons do meio e eliminar água. Essa captação é feita principalmente pelas
brânquias, onde encontram-se as células cloreto, ricas em mitocôndrias, e relacionadas com o transporte ativo de íons (RANDALL et al., 2000; MARTINEZ e CÓLUS, 2002). Estas células possuem em suas membranas baso-laterais grande quantidade da enzima Na+/K+-ATPase, além de outros trocadores na membrana apical (EVANS et al., 1999). Esta enzima revelou-se bastante sensível a diversos tipos de contaminantes, podendo ser eficazmente utilizada para o monitoramento das condições ambientais (STAGG et al., 1992).
Em seu trabalho, Ahern e Morris (1998) averiguaram que a espécie de lagostim Cherax destructor tem um decréscimo de 40% na atividade da enzima Na+/K+ -ATPase das brânquias quando exposto in vivo a uma concentração sub-letal de chumbo de 0,5 mg.L-1 por um período de 21 dias. E este decréscimo é ainda maior quando o experimento é repetido in vitro.
A interrupção do mecanismo osmorregulatório por metais, geralmente está associada à inibição da atividade da enzima Na+/K+-ATPase nas brânquias e talvez também no intestino (MARTINEZ et al., 2004). Martinez et al. (2004) sugeriram que o chumbo pode inibir a Na+/K+-ATPase nas brânquias em Prochilodus lineatus causando prejuízo na hiperregulação do sódio plasmático. Variáveis fisiológicas tais como as concentrações plasmáticas dos íons sódio, potássio e cloreto, assim como a osmolaridade, podem ser, portanto, empregadas como bons biomarcadores de efeitos crônicos de contaminantes em peixes (RANKIN et al., 1982; ABEL, 1989).
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a ocorrência de alterações fisiológicas relacionadas a índices hematológicos, iônicos e enzimáticos na espécie de peixe neotropical Prochilodus lineatus.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
o Realizar testes estáticos agudos com concentrações sub-letais de chumbo com Prochilodus lineatus, por períodos de 6, 24 e 96 horas.
o Determinar os parâmetros sangüíneos (hematócrito, RBC e hemoglobina) nos peixes expostos ao chumbo.
o Determinar as concentrações plasmáticas dos íons sódio, potássio e cloreto, a osmolaridade e a glicemia nos peixes expostos ao chumbo.
o Verificar a atividade da enzima Na+/K+-ATPase nas brânquias dos animais em contato com o metal.
4. ARTIGO:
Alterações Hematológicas e Osmorregulatórias em
Prochilodus lineatus
Expostos ao Chumbo
A.M. Ribeiro, M.B.F.A. Vilela, C.B.R. Martinez
RESUMO
O chumbo é um poluente relativamente comum no meio aquático, e é sabidamente capaz de gerar diversas alterações nos organismos que vivem neste meio. Apesar do grande número de estudos já realizados com peixes de clima temperado, seus efeitos para espécies neotropicais ainda são pouco conhecidos. Assim, juvenis de Prochilodus lineatus foram expostos a uma concentração de 0,5 mg de chumbo dissolvido.L-1 por períodos de 6, 24 e 96 horas. Medidas do conteúdo de hemoglobina, RBC e hematócrito foram tomadas, assim como concentração da glicose e dos íons cloreto, sódio e potássio plasmáticos e da osmolaridade, e ainda a atividade branquial da enzima Na+/K+-ATPase. Foram encontradas alterações significativas no hematócrito dos peixes expostos ao chumbo por 6 e 96 h, e pequenas variações nos outros índices hematológicos. O potássio plasmático apresentou-se aumentado, indicando o rompimento de células sanguíneas. As concentrações iônicas de sódio apresentaram tendência de diminuição, assim como a atividade da enzima Na+/K+-ATPase, nos animais expostos ao chumbo. Os resultados obtidos indicam que na espécie neotropical P. lineatus a concentração de chumbo testada afeta a hiperregulação do sódio e a capacidade de transporte de oxigênio.
Palavras-Chave: ecotoxicologia, hematologia, osmorregulação, Prochilodus lineatus, chumbo.
Introdução
O chumbo é um metal pesado extremamente maleável, comumente utilizado nas indústrias de tintas, vidros e baterias (PAOLIELLO et al., 2001), e como elemento não está sujeito a degradação (PAOLIELLO e CHASIN, 2001). A reciclagem de materiais contendo chumbo gera grande quantidade de resíduos, o que facilita a contaminação do ambiente por este metal (JOST, 2001). Na bacia do ribeirão Cambé (Londrina-Pr-Brasil) Yabe e Oliveira (1998) constataram que as concentrações de chumbo dissolvido presentes em trechos do ribeirão cercados por atividades urbanas e industriais superavam, em grandes proporções (até 4,5 ± 0,49 mg Pb.L-1), os níveis permitidos pela legislação então vigente (até 0,5 mg Pb.L-1) (CONAMA, 1986).
Dentre os peixes que compõem a ictiofauna desta bacia está o Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1836) (FISHBASE, 2007; FUGI et al., 1996), um peixe neotropical da família Characiforme com hábito alimentar detritívoro (FUGI et al., 1996). Esta espécie é considerada um ótimo bioindicador, uma vez que mostra-se bastante sensível à presença de poluentes aquáticos, podendo ser, portanto, empregada com sucesso em testes de toxicidade (WINKALER et al., 2001; MARTINEZ e CÓLUS, 2002). Em seu trabalho, Martinez et al. (2004) encontraram alterações em diversos índices fisiológicos de P. lineatus expostos ao chumbo. Os autores reportaram que o peixe exposto por um longo período a esse contaminante tem suas funções metabólicas comprometidas, uma vez que os níveis de proteína, lipídeos e glicose apresentam-se diminuídos.
dentre os quais pode-se destacar alterações na atividade a enzima Na+/K+-ATPase e conseqüente desajuste no balanço iônico (ROGERS et al., 2003; PINHEIRO, 2004), alterações sanguíneas (DEMAYO et al., 1982; WINKALER et al., 2001; MARTINEZ et al., 2004) e mudanças nos níveis de glicose (WINKALER et al., 2001; MARTINEZ et al., 2004).
Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar e quantificar as possíveis alterações fisiológicas e enzimáticas, relacionadas à osmorregulação e aos parâmetros sanguíneos, que ocorrem na espécie neotropical de peixe Prochilodus lineatus quando exposta por curtos períodos a concentrações subletais do contaminante chumbo.
Material e Métodos
Condições experimentais
Juvenis de Prochilodus lineatus (Peso=9,26 ± 3,22 g; CT=9,7 ± 1,1 cm e CP=7,7 ± 0,9 cm; n=74), fornecidos pela Estação de Piscicultura – UEL, foram mantidos por uma semana em tanques de 300L sob condições de temperatura, pH e oxigênio controladas para aclimatação. Os peixes foram alimentados a cada 48 horas, sendo que 24 horas antes do início do experimento a alimentação foi suspensa.
Procederam-se testes estáticos de exposição aguda por períodos de 6, 24 e 96 horas. Foram utilizados aquários de 100 L, contendo 80 L de água, divididos em dois grupos, experimental (contendo nitrato de chumbo) e controle (contendo apenas água), ambos com réplicas. O grupo experimental foi exposto a uma concentração nominal de chumbo 3,13 mg.L-1 (que corresponde a 5 mg.L-1 de Pb(NO3)2) e em cada um dos aquários foram colocados 8 peixes. Os aquários foram isolados para evitar interação entre os peixes, e cobertos para simular o ambiente natural desses animais, o fotoperíodo foi de 12:12 (C:E) e os peixes não foram alimentados durante o decorrer de todo o experimento. Diariamente foram tomadas as medidas de temperatura, oxigênio dissolvido, pH e condutividade da água, que se mantiveram em (média ± D.P.): 23,02 ± 2,1º C; 7,41 ± 0,22; 7,05 ± 0,61 mgO2.L-1; 63,55 ± 7,3 µS.cm-1 respectivamente. As quantidades de chumbo dissolvido e de chumbo total foram medidas em amostras de água coletadas ao final de cada experimento para os aquários experimentais e suas réplicas e para os controles através de
espectrofotometria de absorção atômica. Os testes in vivo tiveram duração de seis meses (mar – ago/2007).
Amostragem
As amostragens foram realizadas sempre no período da manhã. Imediatamente após a retirada do animal da água, este foi anestesiado com benzocaína diluída em água (0,12 g.L-1) para a coleta do sangue pela veia caudal, com seringas descartáveis lavadas com anticoagulante (heparina). O sangue foi armazenado em tubos plásticos de 1,5 mL a 4º C até o momento das análises. As medidas biométricas foram então tomadas e o animal sacrificado por secção medular. Suas brânquias foram imediatamente removidas com o auxílio de material de dissecção, lavadas com solução salina e os filamentos branquiais foram separados e armazenados em tampão SEI (Sacarose, EDTA, Imidazol) e congelados a -20º C.
Parâmetros analisados
Cerca de 20 µL de sangue de cada animal foram usados para a determinação do hematócrito em microcapilares de vidro selados em uma das extremidades e centrifugados (5.000 rpm por 5 min). Um cartão de padronização foi utilizado para estimar a porcentagem das células sangüíneas. Outros 5 µL foram colocados em 1 mL de tampão formol citrato para a contagem de eritrócitos (RBC) em Câmara de Neubauer espelhada, sob microscópio de luz. Outra parcela do sangue total foi usada para a determinação da quantidade de hemoglobina pelo método da cianometahemoglobina com kit comercial (Labtest, Brasil) em espectrofotômetro (leitura
em 540 nm). A partir dos dados de hematócrito, hemoglobina e RBC pôde-se calcular os valores dos índices hematimétricos: Volume corpuscular médio (VCM = Htc x 10/RBC), hemoglobina corpuscular média (HCM = Hb x 10/RBC) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM = Hb x 100/Htc).
Do sangue restante foram obtidas amostras do plasma pela centrifugação (5.000 rpm por 15 min), e estas foram congeladas (-20º C) até a realização das análises. Primeiramente foram medidos os valores da osmolaridade de cada uma das amostras em osmômetro de congelamento. A glicemia foi então determinada usando-se o método colorimétrico pela glicose-oxidase com auxílio do kit comercial (Labtest, Brasil) em espectrofotômetro (leitura em 505 nm). O plasma foi diluído em água destilada (1:100) para a obtenção dos valores da concentração dos íons sódio e potássio, com fotômetro de chama e comparados a padrões de concentrações conhecidas. Já a quantidade de cloreto plasmático foi analisada pelo método tiocianato de mercúrio em espectrofotômetro (leitura em 470 nm) através de kit comercial (Analisa, Brasil). Todas as amostras foram feitas em duplicatas.
Para a determinação da atividade da enzima Na+/K+-ATPase, os filamentos branquiais de cada animal foram homogeneizados em tampão SEI (Sacarose, EDTA, Imidazol e β-mercaptoetanol) em diluição de 20x, centrifugados (por 10 min em 15.000 rpm a 4º C) e ao sobrenadante adicionou-se saponina (1:100). Dez microlitros desta solução foram colocados em cada cavidade da microplaca juntamente com 100 µL de solução de ouabaína ou KCl contendo 3 mM de Na2ATP, a placa foi incubada no escuro por 30min, e 200 µL do reagente de cor (H2SO4, molibdato de amônia e Fe2SO4.7H2O) foram adicionados para parar a reação. Cada uma das
amostras foi analisada em triplicata (3 com cloreto de potássio e 3 com ouabaína) em leitora de microplacas (leitura em 620 nm). Como branco da reação, utilizou-se água e, como padrão, solução de fósforo 0,65 mM (Sigma). A medida da concentração das proteínas das brânquias foi feita através do método de Lowry et al. (1951) em espectrofotômetro (leitura em 700 nm).
Análise estatística
Os dados estão apresentados como média ± desvio padrão. Os resultados obtidos para cada um dos parâmetros analisados foram comparados entre si através de teste t de Student (ANOVA). Foram considerados significativos valores de P ≤ 0,05. Todos os testes foram aplicados de acordo com Zar (1999).
Resultados
Os resultados para os níveis de chumbo na água mostraram que a concentração uma média do chumbo total foi de 2,25 mg.L-1, e de chumbo dissolvido, de 0,5 mg.L-1 nos aquários experimentais, enquanto nos aquários controle constatou-se total ausência deste metal.
Os resultados obtidos (Média ± D.P.) mostraram que os peixes expostos ao chumbo (Pb) durante 6 h apresentaram aumento significativo no valor do Hcto (33,20 ± 4,26%) em relação ao controle (CTR) (25,60 ± 3,57%). Quando expostos por 24 h os valores do grupo Pb e CTR foram iguais, mas houve um decréscimo significativo do Hcto nos peixes expostos ao Pb por 96 h (27,20 ± 3,16%) em relação ao CTR (32,82 ± 5,91%) (Fig. 1a). Observaram-se também tendências de aumento da Hb e RBC nos animais expostos ao Pb durante 6 h, enquanto os animais exposto ao metal por 96 h apresentaram uma tendência de redução destes valores, em relação ao CTR (Fig. 1b e 1c).
Tabela 1: Volume corpuscular médio (VCM), Hemoglobina corpuscular média (HCM) e Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h.
VCM (µm3) HCM (pigm.cel-1) CHCM (%) Tempo (h) CTR Pb CTR Pb CTR Pb 6 129,2±18,6 (5) 176,8±29,1 (4) * 32,3±7,3 (5) 22,0±0,8 (4) * 25,7±7,7 (5) 12,8±2,6 (4) * 24 151,5±23,7 (4) 144,9±10,9 (4) 49,7±7,1 (4) 36,4±9,1 (4) 33,2±5,7 (4) 25,2±6,6 (4) 96 134,0±19,7 (5) 130,8±7,5 (7) 43,5±9,5 (5) 44,8±7,6 (7) 32,4±4,7 (5) 34,3±5,5 (7)
Hematócrito 0 10 20 30 40 6 24 96 Tempo (h) (% ) (a) * * RBC 0 1 2 3 6 24 96 Tempo (h) (n º c e ls .m m - ³) (b) Hemoglobina 0 3 6 9 12 15 6 24 96 Tempo (h) (g .d L -1 ) CTR Pb (c)
Figura 1: (a) Hematócrito (Htco), (b) RBC e (c) Hemoglobina (Hb) em Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h. As barras indicam média e as linhas verticais o D.P. * indica diferença significativa em relação ao CTR (P ≤ 0,05).
Os índices hematimétricos (VCM, HCM e VHCM) dos animais expostos ao Pb por 6 horas variaram significativamente dos daqueles expostos somente à água pelo mesmo período (Tab. 1). O volume médio dos eritrócitos (VCM) dos peixes experimentais aumentou (176,9 ± 29,1 µm3) em relação ao CTR (129,2 ± 18,6 µm3). Em contrapartida, a quantidade de hemoglobina por célula e a concentração da mesma (HCM e CHCM) do grupo experimental (22,0 ± 0,8 pigm.cel-1 e 12,8 ± 2,6%, respectivamente) diminuíram em relação ao CTR (32,3 ± 7,3 pigm.cel-1 e 25,7 ± 7,7%, respectivamente) (Tab. 1).
Figura 2: Concentração de glicose plasmática de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h. As barras indicam média e as linhas verticais o D.P.
Os valores da glicose plasmática apresentaram uma tendência de aumento nas primeiras horas (6 e 24 h) e uma posterior tendência ao decréscimo nos animais experimentais passadas 96 horas (Fig. 2). Os valores da osmolaridade se mantiveram inalterados (Tab. 2).
Glicose 0 8 16 24 32 40 6 24 96 Tempo (h) (m g .m L -1 ) CTR Pb
Tabela 2: Concentrações plasmáticas de sódio e cloreto e osmolaridade de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h.
[Na+] (mM) [Cl-] (mM) Osmolaridade (mOsm.L-1.H2O)
Tempo (h)
CTR Pb CTR Pb CTR Pb
6 168,5±7,9 (8) 149,0±36,0 (9) 110,8±5,8 (8) 110,6±5,8 (8) 330,1±8,7 (9) 336,1±16,4 (8)
24 154,0±10,0 (7) 160,4±18,5 (5) 97,1±4,4 (13) 92,9±9,2 (6) 341,2±21,8 (6) 321,2±16,6 (6)
96 170,2±24,9 (9) 137,4±42,2 (8) 89,5±7,6 (8) 91,8±8,2 (9) 297,5±14,0 (4) 295,8±3,6 (4)
Os valores referem-se à média±D.P. (n).
A atividade da enzima Na+/K+-ATPase apresentou redução na atividade em todos os tempos experimentais, sendo que no tempo de 96 h, esta redução foi de quase 50%, entretanto as diferenças não foram significativas (Fig. 3).
Figura 3: Atividade a enzima Na+/K+-ATPase de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h. As barras indicam média e as linhas verticais o D.P.
Os resultados dos níveis de potássio plasmático dos animais expostos ao Pb no tempo experimental de 24 h apresentaram-se significativamente maiores
Na+/K+-ATPase 0 25 50 75 100 6 24 96 Tempo (h) (% ) CTR Pb
(4,96 ± 0,32 mM) do que os encontrados no grupo CTR (4,31 ± 0,34 mM), assim como os dos peixes expostos ao Pb por 96 h (7,27 ± 4,89 mM) com relação aos seus respectivos controles (4,89 ± 0,3 mM), confirmando a tendência que se apresentou no tempo inicial de 6 horas (Fig. 4). O íon sódio manteve-se inalterado, tendendo, entretanto, a uma diminuição nos tempos de 6 e 96 h. Os valores experimentais de cloreto plasmático foram iguais aos encontrados nos animais CTR em todos os tempos (Tab. 2).
Figura 4: Concentração de potássio plasmático de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h. As barras indicam média e as linhas verticais o D.P. * indica diferença significativa em relação ao CTR (P ≤ 0,05).
Potássio 0 3 6 9 6 24 96 Tempo (h) (m M ) CTR Pb
*
*
* *Discussão
A presença de chumbo na água causa um aumento do número de células produtoras de muco nas brânquias dos peixes, aumentando, conseqüentemente, a produção do mesmo (HEATH, 1985; MACHADO, 1999). Além disso, esse metal pode causar um afastamento do epitélio branquial na tentativa de evitar que o contaminante seja absorvido pelo organismo (WINKALER et al., 2001; CAMARGO e MARTINEZ, 2007). Assim, tanto o aumento do espaço de difusão entre o sangue e a água, quanto o excesso de muco produzido têm a função de tornar mais difícil a entrada do chumbo através das brânquias. Estas, entretanto, revelaram-se más adaptações, uma vez que com o aumento do espaço de difusão sangue/água e com a barreira criada pelo muco, a tomada de oxigênio pelas brânquias é dificultada, resultando, assim, em uma hipóxia interna (HEATH, 1985; WINKALER et al., 2001; MARTINEZ et al., 2004; CAMARGO e MARTINEZ, 2007).
A falta de oxigênio causada pelas alterações branquiais influencia, por sua vez, na porcentagem a que as células correspondem do sangue, podendo alterar, assim, o valor do hematócrito (HEATH, 1985; WINKALER et al., 2001; MARTINEZ et al., 2004). Portanto, o aumento deste índice (Fig. 1a), assim como o aumento dos outros valores hematimétricos (número de hemáceas circulantes e concentração de hemoglobina) encontrados nos peixes expostos ao chumbo por 6 horas, podem indicar uma possível contração esplênica resultante da resposta à baixa concentração de oxigênio sanguíneo (MARIANO, 2006).
Já no período de exposição mais longo (96 h), a redução encontrada nos parâmetros hematológicos (Fig. 1) indica o possível efeito do chumbo nos processos de síntese de hemoglobina e eritrócitos. É sabido que o chumbo é capaz de causar inibição na atividade da enzima ácido delta-aminolevulinico desidratase (δ ALA-D) (JOHANSSON-SJOBECK e LARSSON, 1978; HODSON et al., 1980b). Esta enzima, por sua vez, desempenha um importante papel na síntese da hemoglobina, e sua inibição reflete a presença de chumbo na água (HODSON et al., 1980a e 1980b; CALDEIRA et al., 2000). Entretanto, acredita-se que o tempo experimental em questão não tenha sido suficiente para interferir sobre esta enzima provocando tais alterações.
Rogers et al. (2003) encontraram alterações nos valores de hematócrito em experimentos realizados com trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss) expostas ao chumbo. Porém, estes autores creditaram ao método amostral a razão da diminuição dessa porcentagem, uma vez que nenhuma outra alteração que pudesse indicar a causa da diminuição foi observada. Contudo, o aumento do potássio plasmático encontrado no presente trabalho, sugere que a real causa da diminuição do hematócrito e dos outros parâmetros hematológicos em P. lineatus esteja no rompimento de células sanguíneas. Sabe-se que o potássio é um íon encontrado em altas concentrações no interior das células (SCHIMIDT-NIELSEN, 2002), portanto quando o valor de potássio plasmático encontra-se elevado, infere-se que tenha ocorrido hemólise. Talvez exista uma relação entre este rompimento das células sanguíneas com a redução encontrada na atividade da enzima Na+K+-ATPase, uma vez que a inibição desta enzima pode causar um aumento do influxo de sódio a favor do gradiente, juntamente com o aumento da entrada de água favorecida pelo gradiente
osmótico, o que acaba causando inchaço das células e conseqüente ruptura das membranas (THAKER apud NICARETA, 2004).
O aumento da glicose plasmática nos tempos inicias (6 e 24 h) aponta que os organismos expostos ao contaminante estiveram submetidos à uma situação de estresse, mostrando uma tendência à mobilização de reservas energéticas, possivelmente através da liberação de catecolaminas (HEATH, 1995; MARTINEZ e CÓLUS, 2002). Martinez et al. (2004) já descreveram elevações nas concentrações deste parâmetro para P. lineatus expostos a concentrações de 24 e 71 mg.L-1 de chumbo. O resultado encontrado nos peixes expostos ao chumbo por 96 h mostra, entretanto, uma tendência de decréscimo neste índice, sugerindo o esgotamento das reservas energéticas e um possível processo de exaustão (HEATH, 1995; WINKALER et al., 2001), tendências estas também observadas por Martinez et al. (2004).
Vários solutos influenciam na osmolaridade do plasma, e embora nenhuma mudança tenha sido verificada neste índice, apesar das pequenas alterações ocorridas com as concentrações de glicose, sódio e potássio, é possível que outros íons não analisados, como o magnésio e o cálcio (AHERN e MORRIS, 1998; ROGERS et al., 2003), estejam compensando este balanço. Amado et al. (2006) verificaram que o chumbo aumenta as concentrações de cloreto plasmático na hemolinfa do caranguejo Dilocarcinus pagei na presença de sal na água, por outro lado, diminuições nos valores deste íon foram verificadas em trutas arco-íris expostas ao chumbo no trabalho de Rogers et al. (2003). Contudo, no presente trabalho nenhuma alteração foi verificada neste parâmetro.
A osmorregulação, por sua vez, faz-se essencial para a sobrevivência de peixes de água doce, uma vez que o ambiente em que vivem proporciona um alto gradiente iônico favorecendo as perdas de íons (RANDALL et al., 2000; SCHMIDT-NIELSEN, 2002). A captação destes íons na água é regulada pela enzima Na+/K+ -ATPase (EVANS et al, 1982; MACHADO, 1999; WINKALER et al., 2001; MARTINEZ et al., 2004; ATLI e CANLI, 2007), que tem sua atividade facilmente alterada pela presença de chumbo (AHERN e MORRIS, 1998; MACHADO, 1999; MARTINEZ et al., 2004; THAKER apud NICARETA, 2004). A diminuição de quase 50% da atividade desta enzima encontrada nos animais experimentais expostos ao chumbo por 96 h, vai ao encontro dos resultados obtidos por Rogers et al. (2003) para truta arco-íris expostas ao mesmo metal. Estes autores reportaram que a atividade da Na+/K+ -ATPase dos peixes experimentais reduziu cerca de 40% a partir da 48ª hora e que esta proporção se manteve nas horas seguintes. E associado a isso, assim como verificaram Rogers e seus colaboradores (2003) para truta arco-íris, e Martinez et al. (2004) para P. lineatus, o decréscimo das concentrações de sódio no plasma dos animais expostos ao chumbo também foi constatado neste trabalho.
Em conclusão, os resultados obtidos indicam que a concentração subletal de chumbo testada promoveu lise dos eritrócitos de P. lineatus e inibiu a atividade da enzima Na+K+-ATPase nas brânquias, prejudicando, portanto, a hiperregulação de sódio e o transporte de O2 pelo sangue dos peixes.
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