UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS RODOLFO FRED BEHRSIN

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

RODOLFO FRED BEHRSIN

ACURÁCIA DA ADENOSINA DESAMINASE E DA BIÓPSIA PLEURAL FECHADA COM AGULHA DE COPE PARA O DIAGNÓSTICO DE DERRAME PLEURAL TUBERCULOSO

NITEROI – RJ 2016

  I

RODOLFO FRED BEHRSIN

ACURÁCIA DA ADENOSINA DESAMINASE E

DA BIÓPSIA PLEURAL FECHADA COM

AGULHA DE COPE PARA O DIAGNÓSTICO

DE DERRAME PLEURAL TUBERCULOSO

T e s e s u b m e t i d a a o P r o g r a m a d e P ó s - G r a d u a ç ã o e m C i ê n c i a s M é d i c a s d a U n i v e r s i d a d e F e d e r a l F l u m i n e n s e c o m o p a r t e d o s r e q u i s i t o s n e c e s s á r i o s à o b t e n ç ã o d o G r a u d e D o u t o r . Á r e a d e C o n c e n t r a ç ã o : C i ê n c i a s M é d i c a s .

ORIENTADOR: Prof. Dr. Gilberto Perez Cardoso

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Cyro Teixeira da Silva Junior

NITERÓI – RJ 2016

  II B421 Behrsin, Rodolfo Fred

Acurácia da adenosina desaminase e da biópsia pleural fechada com agulha de Cope para o

dignóstico de derrame pleural tuberculoso / Rodolfo Fred Behrsin. - Niterói, 2016.

 42 f.

Orientador: Gilberto Perez Cardoso

Co-orientador: Cyro Teixeira da Silva Junior

Tese (Doutorado em Ciências Médicas) – Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Medicina, 2016.

1. Derrame pleural. 2. Adenosina desaminase. 3. Biópsia. I. Titulo.

  III

RODOLFO FRED BEHRSIN

ACURÁCIA DA ADENOSINA DESAMINASE E DA

BIÓPSIA PLEURAL FECHADA COM AGULHA DE COPE

PARA O DIAGNÓSTICO DE DERRAME PLEURAL

TUBERCULOSO

P r o f . D r . Alair Augusto Sarmet Moreira Damas dos Santos (UFF – Presidente)

P r o f . D r a . A n a l ú c i a R a m p a z z o X a v i e r ( U F F ) P r o f . D r a . E l i z a b e t h G i e s t a l d e A r a u j o ( U F F ) P r o f . D r . A l e x a n d r e P i n t o C a r d o s o ( U F R J ) P r o f . D r . E d u a r d o H a r u o S a i t o ( U E R J ) NITERÓI - RJ 2016

  IV

AGRADECIMENTOS

Meus agradecimentos:

• Aos meus pais, Rudoph Behrsin e Dzidra Cerpe Behrsin que me prepararam e orientaram da melhor forma;

• Aos meus orientadores: Prof. Dr. Gilberto Perez Cardoso e Prof. Dr. Cyro Teixeira da Silva Junior;

• Ao Prof. Dr. Cyro Teixeira da Silva Júnior pelo planejamento e análise estatística dos dados, mais que professor e orientador, meu mentor;

  V RESUMO

Introdução: A biópsia fechada com agulha (CNPB) tem sido históricamente o padrão ouro para o diagnóstico de tuberculose pleural. A enzima adenosina deaminase (ADA) é um eficiente e novo biomarcador para o diagnóstico de tuberculose e é medida no líquido pleural. Este presente trabalho de pesquisa teve como objetivo comparar a acurácia diagnóstica dos níveis da ADA-P com o exame histopatológico pleural colhido com CNPB em pacientes com tuberculose pleural.

Métodos: Este estudo prospectivo consiste em dois grupos de exames com o diagnóstico de derrame pleural. ADA-P foi medida em 218 pacientes com derrame pleural de várias causas e análise histopatológica foi realizada em 157 pacientes.

Resultados: CNPBs foram analisadas em pacientes com tuberculose (n=122) e outras doenças: adenocarcinoma (n=23), linfoma (n=5), lúpus eritematoso sistêmico (n=4), carcinoma de células escamosas (n=2) e carcinoma de pequenas células (n=1). De acordo com a curva ROC, o melhor ponto de corte (cut-off) para o valor da ADA-P (pelo método colorimétrico de Giusti & Galanti) foi igual ou superior a 40,0 UI/L. A acurácia diagnóstica para o teste da ADA-P foi de 83% e para a histopatologia com CNPB foi de 78,8% (AUC Z estatistica=0,293, p=0,7695). Qui-quadrado= 24,41 (p<0,0001) para associação entre ADA-P e histopatológico pleural. O coeficiente de correlação tetracórico igual a 0,563 significou alta correlação entre os dois exames.

Conclusão: No Brasil ou outros países com elevada incidência de tuberculose, a atividade da ADA-P possui alta acurácia e é um teste não invasivo para o diagnóstico de tuberculose pleural e deve ser incentivado. Sua alta performance diagnóstica poderia contribuir para tornar a biópsia pleural desnecessária.

Descritores: derrame pleural, tuberculose, adenosina desaminase, biópsia pleural, diagnóstico

  VI ABSTRACT

INTRODUCTION: Closed needle pleural biopsy (CNPB) has historically been the gold standard procedure for the diagnosis of pleural tuberculosis. The adenosine deaminase (ADA) enzyme is an efficient new biomarker assay for tuberculosis that is measurable in pleural fluids. In the present research study we aimed to compare the diagnostic accuracy of P-ADA (pleural adenosine deaminase) measurements and histopathology from CNPB in patients with pleural tuberculosis.

METHODS: This prospective study consisted of two groups of exams with a proven diagnosis of pleural effusions. P-ADA was measured in 218 patients with pleural effusion due to various causes, and histopathological analysis of 157 CNPBs.

RESULTS: CNPBs was performed in patients with tuberculosis (n=122) and other diseases: adenocarcinoma (n=23), lymphoma (n=5), systemic lupus erythematosus (n=4), squamous cell carcinoma (n=2), and small cell lung cancer (n=1). According to the ROC curve, the optimal cut-off value of the P-ADA (Giusti & Galanti colorimetric method) was equal to or greater than 40.0 U/L. The diagnostic accuracy of the P-ADA test was 83.0%, and for histopathology on CNPB tissue, it was 78.8% (AUC Z statistic=0.293, p=0.7695). Chi-square=24.41 (p<0.0001) for association between the P-ADA assay and the pleural histopathology. Tetrachoric correlation coefficient=0.563 (high correlation). CONCLUSION: In Brazil or other country with a high incidence of tuberculosis, P-ADA activity is an accurate non-invasive test procedure for the diagnosis of tuberculous pleural effusions, and its use should be encouraged. The high diagnostic performance of the P-ADA test could contribute to the diagnosis of pleural TB and render a CNPB unnecessary. Key words: pleural effusion, tuberculosis, adenosine deaminase, pleural biopsy, diagnosis

  VII

LISTA DE TABELAS E FIGURAS

Descrição e Número

Título/Legenda Página

Tabela 1 Características demográficas e níveis de ADA-P nos líquidos pleurais de 218 pacientes com tuberculose (casos) e outros diagnósticos comprovados (controles) de síndrome do derrame pleural

21

Tabela 2 Rendimento da ADA-P (valor de referência maior ou igual a 40, 0 UI/L) e do histopatológico pleural conclusivo (decorrente de

CNPB) para diagnóstico de tuberculose pleural

24

Figura 1 Curva ROC comparando as AUCs da ADA-P e do histopatológico pleural oriundo de CNPB (variáveis dicotômicas) para o diagnóstico de tuberculose pleural. Níveis de ADA-P: AUC = 0,83; IC95% = 0,77-0,88. CNPB: AUC = 0,787; IC95% = 0,679-0,873. A comparação das AUCs não foi estatisticamente significativo (AUC total = 0,293, p = 0,7695).

Abreviaturas. ADA-P: análise da adenosina desaminase no líquido pleural; CNPB=biópsia pleural fechada com agulha; AUC= área sob a curva ROC; HISTO-P=histopatológico pleural.

  VIII

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ADA - adenosina desaminase total

ADA-P - análise da adenosina desaminase no líquido pleural ADA-1 – subunidade 1 da ADA total

ADA-2 – subunidade 2 da ADA total ANA - anticorpos antinucleares AUC - área sob a curva ROC BTS - British Thoracic Society

CEA – antígeno carcinoembriônico ou embrionário CNPB - biópsia pleural fechada com agulha de Cope CYFRA 21-1 – fragmentos solúveis da citoqueratina 19 DLH ou LDH – enzima desidrogenase lática

DOR – diagnostic odds ratio (razão de chance) Es – especificidade

HISTO-P - histopatológico pleural

HIV - vírus da Imunodeficiência Humana HUAP – Hospital Universitário Antônio Pedro

IC 95% - Intervalo de confiança com 95% de probabilidade IFCC - Federação Internacional de Química Clínica

LR - likelihood ratio ou testes de razão de verossimilhança

NAATs - testes de amplificação de ácidos nucléicos NSE – enolase neurônio específica

  IX P – prevalência da doença na região estudada ROC – Receiver Operating Characteristic RVN - razão de verossimilhança negativo RVP - razão de verossimilhança positivo SDP – síndrome do derrame pleural Se – sensibilidade

STARD - Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy TB – tuberculose

UFF – Universidade Federal Fluminense VPN – valor preditivo negativo

VPP – valor preditivo positivo

WHO – Organização Mundial de Saúde

Xpert MTB/RIF – Método de diagnóstico molecular rápido de tuberculose (MTB) e resistência à rifampicina (RIF)

  X SUMÁRIO

Capítulo Nome Página

I Introdução 11

II Objetivos 14

III Casuística, Material e Métodos

15

IV Resultados 21

V Discussão 27

VI Conclusões 34

VII Considerações finais 35

  11 I – INTRODUÇÃO

O derrame pleural é uma síndrome que pode acompanhar diversas doenças, quer primárias da pleura, quer secundárias a lesões do parênquima pulmonar ou a enfermidades sistêmicas (Light, 2013).

A síndrome do derrame pleural, apesar de todos avanços tecnológicos ocorridos nos últimos anos, ainda apresenta dificuldades para o diagnóstico da causa básica, principalmente, em serviços de saúde não-especializados para diagnóstico de doenças torácicas. A literatura mundial relata que, atualmente, mesmo sendo o paciente exaustivamente investigado, em 11 a 20 % dos casos a causa fica sem ser estabelecida (Light, 2013).

O diagnóstico sindrômico de derrame pleural é realizado pela análise do quadro clínico, de imagem convencional e/ou especializada e, eventualmente, pela cintilografia (Light, 2013).

Os procedimentos de toracocentese, biópsia pleural fechada com agulha, toracoscopia vídeo-assistida (VATS), pleuroscopia e toracotomia são necessários para o diagnóstico da causa de síndrome do derrame pleural (Light , 2013).

Os materiais para exames decorrentes dos procedimentos acima são: líquido pleural, fragmentos de pleura parietal e/ou visceral e parênquima pulmonar (Light, 2013).

A tuberculose pleural é a forma extrapulmonar mais comum no Brasil, representando 15% de todos os casos de TB, comprometendo 48% do número total de casos de TB extrapulmonar (Seiscento et al., 2009).

No Brasil, a TB é a causa predominante entre várias doenças infecciosas na população (Seiscento et al., 2009).

A tuberculose (TB) permanence como um sério problema mundial de saúde pública (WHO, 2014). Em 2014, de acordo com a Organização Mundial de Saúde houve uma incidência de 9,0 milhões de casos de tuberculose em todo mundo, responsável por cerca de 1,5 milhões de óbitos (WHO, 2014).

  12

O diagnóstico de tuberculose pleural não é facil de ser estabelecido devido a natureza paucibacilar do líquido pleural. O líquido pleural geralmente se acumula devido a uma reação de hipersensibilidade a proteínas do M. tuberculosis e a carga bacilar neste fluído é baixa dificultando a sua visualização (Bedrossian, 1998).

O quadro clínico e de imagem, além dos testes convencionais como baciloscopia e cultura do M. tuberculosis no líquido pleural tem portanto baixa sensibilidade e baixo valor preditivo negativo para o diagnóstico de tuberculose pleural (Hooper et al., 2010).

Novas modalidades de testes diagnósticos como testes de amplificação de ácidos nucléicos (NAATs) são necessários para simplificar a análise, reduzir custos e aumentar a acurácia diagnóstica em países em desenvolvimento. O interferon-gama é um biomarcador com elevada acurácia, porém apenas em pesquisas clínicas (Hooper et., 2010; Porcel e Light, 2013).

A biópsia pleural fechada com agulha (CNPB) tem sido historicamente considerado o procedimento “padrão áureo” para diagnóstico de tuberculose pleural (Hooper et., 2010; Porcel e Light, 2013). No entanto, este procedimento pode acarretar algumas complicações cirúrgicas e algumas limitações se realizado por profissional pouco experiente. As diretrizes da British Thoracic Society relata importantes complicações das biópsias de pleura com agulha de Abrams incluindo óbito secundário a hemorragia (Hooper et al., 2010). Considerando estas dificuldades de procedimentos e exames, o diagnóstico de síndrome de derrame pleural de causa indeterminada é comum no Brasil e no exterior (Silva Junior, 2012; Porcel e Light, 2013).

Biomarcadores são definidos como alterações celulares, bioquímicas ou moleculares que são mensuráveis em meios biológicos, tais como tecidos humanos, células ou líquidos orgânicos (Mayeux, 2004).

Recentemente a definição de biomarcadores foi ampliada para incluir as características biológicas, que podem ser efetivamente medidas e avaliadas como indicadores de processos biológicos normais, patogênicos, ou devido a resposta farmacológica resultante de intervenção terapêutica (Mayeux, 2004).

Na prática clínica, os biomarcadores incluem ferramentas e tecnologias que podem ajudar a compreender a predição de riscos, causa, diagnóstico,

  13

progressão, regressão, estratificação ou desfecho do tratamento de uma determinada doença (Mayeux, 2004).

Os biomarcadores podem ser de diversos tipos, tais como, fisiológicos (funções de órgãos), físicos (alterações características em estruturas biológicas), histológicos (amostras de tecido obtidas por biopsia) e anatômicos. Podem ser células específicas, genes, enzimas, hormônios ou moléculas diversas. Os mais relevantes em investigação médica são os marcadores bioquímicos, que podem ser obtidos com relativa facilidade a partir de líquidos orgânicos (Mayeux, 2004).

A adenosina desaminase (ADA) é um importante biomarcador bioquímico (enzimático) tanto para tuberculose pleural quanto para várias outras serosites por tuberculose (exemplo: tuberculose abdominal). A atividade da ADA correlaciona-se com infiltrações de células CD4+ na pleura e no líquido pleural e forma-se durante a resposta imune local (Tung et al., 2011). É um biomarcador inespecífico da ativação dos linfócitos T e um modulador da diferenciação das células T.

Existem duas isoenzimas da ADA total, ADA1 e ADA2. ADA2 é encontrada apenas em monócitos e macrófagos enquanto a ADA1 é presente em uma variedade maior de células (Tung et al., 2011).

A dosagem da ADA total é um exame com elevada sensibilidade, especificidade, razão de verossimilhança positiva e valor preditivo positivo para diferenciar tuberculose pleural de derrames pleurais malignos (Silva Junior, 2012; Light e Porcel, 2013). Por essa razão, esse exame deve ser recomendado quando uma toracocentese, sem grande potencial de complicações, pode ser realizada como procedimento cirúrgico inicial.

  14 II – OBJETIVOS

1 - Geral:

Avaliar a determinação da enzima adenosina desaminase no líquido pleural (ADA-P) como biomarcador para o diagnóstico de tuberculose pleural com valor de referência determinado a partir da casuística estudada.

2 – Específicos:

a) Determinar os parâmetros diagnósticos (índices de sensibilidade, especificidade, valores preditivos, razões de verossimilhança e odds ratio) para análise de desempenho do teste da ADA-P, com o limiar crítico discriminativo estipulado, com finalidade de diagnosticar tuberculose pleural, na casuística do Ambulatorio de Pesquisa em Doenças Pleurais do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP);

b) Comparar o rendimento (acurácia) do biomarcador ADA-P e do exame histopatológico, decorrente de biópsia pleural percutânea fechada com agulha de Cope, para o diagnóstico de tuberculose pleural.

  15 III – CASUÍSTICA, MATERIAL E MÉTODOS

1 – Delineamento

Estudo epidemiológico primário, observacional com a finalidade de diagnóstico. Classifica-se também como um estudo prospectivo, realizado com pacientes que foram consultados progressivamente até o diagnóstico da causa, tratamento e evolução da síndrome pleural.

Esse estudo prospectivo, foi conduzido entre os anos de 2002 e 2011 no Ambulatório de Pesquisa em Síndrome do Derrame Pleural, do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP). O delineamento do estudo foi aprovado pelo comitê de Ética do HUAP, um hospital terciário vinculado a Universidade Federal Fluminense, localizado na cidade de Niterói, Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Um termo de consentimento informado escrito foi obtido de todos os pacientes (Parecer do CEP do HUAP/UFF, número 80/02).

2 – Critérios de inclusão e critérios de diagnóstico das causas de síndrome do derrame pleural (SDP)

Os critérios diagnósticos usados para os derrames pleurais foram baseados em critérios publicados previamente (Porcel e Light, 2013).

O conjunto de critérios usados para o diagnóstico definitivo de tuberculose pleural foi o quadro clínico com acompanhamento ambulatorial por seis meses, associado aos exames que contribuem para o diagnóstico de tuberculose pleural. Os exames considerados diagnósticos para tuberculose pleural foram: baciloscopia no líquido pleural, cultura de Micobactérias, e histopatológico pleural, associados aos exames de citopatologia e citologia do líquido pleural sugestivas (linfocitose acima de 90%, células mesoteliais e histiocitárias escassas, hemorragia discreta e componentes do granuloma). No exame do histopatológico pleural foi considerado a presença de granulomas no tecido de biópsia pleural na ausência de outras doenças granulomatosas (Bancroft e Gamble, 2008). O presente trabalho não considerou o teste tuberculínico importante para o diagnostico de tuberculose pleural.

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O diagnóstico de transudato e exsudato pleural foi realizado com base nos critérios preconizados por Light e Mcgregor (1972) e Maranhão et al., (2010), no quadro clínico e imagem do paciente.

O diagnóstico de empiema pleural foi confirmado pelo quadro clínico e de imagem do paciente em associação com biomarcadores de empiema no líquido pleural (glicose, DLH, gram, cultura e antibiograma, leucograma). O aspecto de líquidos pleurais espessos e de aparência purulenta também foi considerado para o diagnóstico.

Quilotorax foi considerado com líquidos pleurais com elevada concentração de triglicerídeos acima de 110mg/dL em pacientes com fatores etiológicos.

O diagnóstico de lúpus eritematoso sistêmico foi confirmado pelo quadro clínico do paciente e pela análise de biomarcadores no sangue e no líquido pleural. Especificamente pacientes com derrames pleurais exsudativos, teste de células LE positivo e títulos de anticorpos antinucleares (ANA) acima de 1:160 no líquido pleural.

O diagnóstico de tromboembolismo pulmonar/infarto pulmonar com derrame pleural foi confirmado pelo quadro clínico do paciente, aliado a outros exames necessários para o esclarecimento do diagnóstico. Cabe citar os fatores de risco presentes associados a angiotomografia computadorizada de tórax, níveis de D-dímero no sangue periférico e ultrassonografia dos membros inferiores como uma abordagem alternativa.

Para o diagnóstico de adenocarcinomas ou outros tipos de neoplasias malignas, o exame de citopatologia para células neoplásicas, histopatológico pleural, ganglionar ou pulmonar foram suficientes, com auxílio de biomarcadores tumorais pleurais sugestivos de malignidade, tais como NSE, CEA, CYFRA 21-1, entre outros.

O diagnóstico de hemotórax traumático foi confirmado em um paciente com trauma de tórax fechado.

3 – Roteiro para os procedimentos cirúrgicos

Nos casos em que a toracocentese ou a CNPB não foram suficientes para confirmar o diagnóstico, os pacientes eram encaminhados para realizar

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procedimentos mais invasivos (cirurgia por toracoscopia vídeo assistida - CTVA, pleuroscopia ou toracotomia).

As toracocenteses e as CNPBs foram realizadas no centro cirúrgico do ambulatório do HUAP utilizando-se agulha de Cope após anestesia local (Ernst et al., 2003).

Ultrassonografia transtorácica e tomografia computadorizada de tórax não foram utilizadas para orientar os procedimentos cirúrgicos.

Os sinais vitais foram obtidos e os pacientes foram monitorados continuamente antes de cada procedimento cirúrgico.

Uma CNPB foi considerada suficiente se pelo menos 3 a 5 amostras de fragmento pleural parietal fossem obtidos no mesmo local da toracocentese (Chalhoub et al., 2000).

A solicitação de radiografias convencionais de tórax, após os procedimentos de toracocentese e CNPB, não eram solicitadas como rotina porque, em mãos experientes, a complicação mais freqüente (pneumotórax) ocorre em aproximadamente 1% dos casos de toracocentese, com conseqüências clínicas mínimas (Doyle et al., 1996).

4 - Critérios de exclusão dos pacientes da casuística

Os critétios de exclusão considerados foram os listados a seguir: contra indicação absoluta ou recusa de realizar toracocentese ou outro procedimento cirúrgico diagnóstico; uso de corticoterapia; hemólise do líquido pleural; insuficiência renal; derrame pleural de causa indeterminada; infecção pelo HIV ou outras doenças imunossupressoras embora a ADA não seja afetada pelo HIV (Riantawan et al., 1996) e recusa em assinar o termo de consentimento.

5 – Ensaio para dosagem da ADA-P

A avaliação da ADA-P pelo método colorimétrico descrito por Giusti e Galanti (1984) e a montagem artesanal dos grupos de reagentes necessários para dosagem foram planejados e realizados no laboratório do Prof. Roberto Paes de Carvalho no Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense.

A dosagem da ADA-P tem como base as medidas das concentrações de amônia. A amônia é gerada quando a ADA total reage com o substrato adenosina.

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A definição química de uma unidade de ADA total é a quantidade de ADA necessário para produzir 1 µmol de amônia por minuto de substrato sob condições experimentais.

Água estéril bidestilada foi usada para preparar as soluções para produção do kit in house e minimizar quantidades residuais de amônia. No final da reação química, a formação da cor azul foi quantificada com um espectrofotômetro a 628 nm. Tanto os resultados positivos quanto os negativos foram liberados após calibração do espectofotômetro com líquidos pleurais considerados controles. Todos os líquidos pleurais foram coletados em tubos estéreis e sem anticoagulantes para a dosagem da ADA total.

6) Avaliação Histopatológica

O exame histopatógico da pleura foi realizado de acordo com os procedimentos do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal Fluminense.

O tecido pleural foi fixado em formalina (10%), seccionado a 5 µm e feito coloração com hematoxilina-eosina, Ziehl-Neelsen, imunohistoquimica e cultura do tecido pleural em meio Lowenstein Jensen (Bancroft e Gamble, 2008).

O achado de granuloma no tecido pleural é aceito no Brasil como diagnóstico histopatológico de tuberculose pleural, em pacientes sem imunossupressão ou doença pulmonar sugestiva de sarcoidose, tularemia e artrite reumatóide (Barbosa Junior et al., 1995).

A tuberculose está presente em mais de 95% dos granulomas pleurais. Necrose caseosa e presença de bacilos álcool ácidos resistentes não precisam ser encontrados no tecido pleural (Barbosa Junior et al., 1995).

7) Análise Estatística

Neste estudo, foi analisado tanto a estatística descritiva quanto a estatística inferencial com todos os dados usando o programa de computador MedCalc, versão 13.1.2.

Os dados laboratoriais foram analisados usando análise univariada. Um valor de p (bicaudal) abaixo de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo para rejeitar a hipótese nula e definir um erro tipo I.

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a)O teste de D’Agostino-Pearson foi usado para conhecer a distribuição de normalidade dos dados primários. Todos os dados foram expressos como medidas de médias e desvio padrão (SD).

b) Os níveis de ADA-P foram medidos nos pacientes com tuberculose pleural e em pacientes com derrames pleurais não tuberculosos que originou o grupo controle. Para comparar as diferenças nos níveis de ADA-P entre os dois grupos (casos de tuberculose e controles) foi realizado o teste do qui-quadrado sem a correção de Yates;

c)O teste do Qui-quadrado também foi usado com o propósito de medir a associação entre os resultados da ADA-P e o resultado do histopatológico pleural em uma tabela de contingência 2x2. Este é um teste estatístico significativo para dados categóricos;

d)A análise da correlação entre resultados da ADA-P e histopatologia (variáveis dicotômicas) com o coeficiente tetracólico;

e)Teste t de Student foi usado para comparar diferenças entre médias aritméticas das idades dos pacientes;

f) Um teste de Kruskal-Wallis seguido do teste post-hoc de Dunn foi usado para comparar tuberculose versus três ou mais amostras independentes do grupo controle.

g) Curva ROC. Calculada para selecionar o melhor ponto de corte (cut off) para as dosagens de ADA. Um valor igual ou maior que 40 UI/L foi selecionado de acordo com a maior razão de verossimilhança positiva do teste da ADA-P após os dados serem calculados pelo MedCalc (Neves et al., 2004). h) As acurácias dos exames da ADA-P e histopatológico pleural, ambos com dados dicotomizados, foram calculadas e comparadas a partir das áreas sob a curva ROC (AUC) com 95% de intervalo de confiança (95% de IC). As AUCs foram calculadas de acordo com o método não paramétrico trapezóide (Hanley e McNeil, 1983). O cálculo da AUC é uma estimativa da eficiência diagnóstica de um exame ou biomarcador, ou seja, é um índice importante para descrever e comparar a performance dos testes diagnósticos.

8) Tamanho da amostra selecionada para cálculo do valor de referência e acurácia da ADA-P

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A Federação Internacional de Química Clínica (IFCC) e diversos autores preconizam a utilização de, no mínimo, 120 indivíduos para validação de testes diagnósticos com distribuição não-paramétrica (Solberg, 1987; Henny, 2009).

  21 IV - RESULTADOS

1)Características dos pacientes

As características demográficas dos pacientes são mostradas na tabela 1.

A idade média dos pacientes com derrame pleural por tuberculose foi 41,15 ± 16,25 anos.

Quando a idade média dos pacientes portadores de tuberculose pleural foi comparada com a média de idade dos pacientes de outros grupos os resultados obtidos foram: adenocarcinoma (teste t de Student; p<0,0001), transudato (teste t de Student, p<0,0001), linfomas (teste t de Student, p=0,081), empiema (teste t de Student, p=0,626), e parapneumônico (teste t de Student, p=0,039).

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tuberculose, transudato, adenocarcinoma e empiema pleural (tabela 1).

2)Causas de síndrome do derrame pleural com exames da ADA-P O grupo total com avaliação dos níveis de ADA-P consistiu de 218 pacientes categorizados em sete subgrupos (tabela 1): tuberculose (n=122), transudato por insuficiência cardíaca congestiva (n=27), adenocarcinomas (n=23), empiema não tuberculoso (n=12), parapneumônico simples e complicado (n=10), linfomas (n=5) e outras causas de síndrome do derrame pleural (n=19), incluindo tromboembolia pulmonar (n=8), lupus eritematoso sistêmico (n=4), quilotórax (n=3), carcinoma de células escamosas (n=2), carcinoma de pequenas células (n=1) e hemotórax traumático (n=1).

O teste do Qui-quadrado comparou as médias de dosagens dos valores de ADA-P dos pacientes com tuberculose pleural com as médias aritméticas de dosagens da ADA-P do grupo de pacientes com outras causas de SDP (controles). O valor de p bicaudal encontrado foi extremamente significativo (Qui-quadrado=104,26; p<0,0001) – tabela 1.

O teste estatístico de D’Agostino-Pearson rejeitou a distribuição de normalidade para as dosagens de ADA-P no grupo de pacientes com tuberculose pleural e nos controles (tabela 1). Em sendo assim, todos os testes utilizados para avaliação estatística da ADA-P foram não paramétricos.

3) Causas de síndrome do derrame pleural (SDP) com exames histopatológicos decorrentes de biópsia pleural fechada com agulha de Cope (CNPB)

O grupo que realizou exames histopatológicos de fragmentos de pleuras parietais (n=157), decorrentes de CNPB foi diagnosticado com as seguintes causas de SDP: tuberculose (n=122), adenocarcinoma (n=23), linfomas (n=5), lupus eritematoso sistêmico (n=4), carcinoma de células escamosas (n=2) e carcinoma de pequenas células (n=1).

4) Diagnóstico diferencial da ADA-P para a síndrome do derrame pleural

  23

A comparação entre as médias aritméticas e os desvios padrões dos níveis de ADA-P entre os pacientes com tuberculose e as outras causas de SDP foi estatisticamente significativa (teste de Kruskal-Wallis, p<0,0001), de acordo com a apresentação na tabela 1. Os casos com os valores de ADA-P não apresentaram valor de p significativo (teste de Dunn, p>0.05) entre pacientes com linfomas e empiemas pleurais (teste de Dunn, p>0,05) - tabela 1. Entretanto, a análise da ADA-P auxiliou no diagnóstico diferencial entre tuberculose pleural e adenocarcinomas, transudatos e derrames pleurais parapneumônicos (teste de Dunn, p<0,0001) - tabela 1.

5)Parâmetros diagnósticos da ADA-P e da CNPB como biomarcadores de tuberculose pleural

Os parâmetros diagnósticos selecionados a partir da curva ROC das dosagens de ADA-P e dos exames de histopatologia pleural decorrente das CNPB foram avaliados quanto aos índices de sensibilidade, especificidade, valores preditivos, razões de verossimilhanças, diagnostic odds ratio e acurácia.

Esses índices são importantes para estabelecer a potencial utilidade dos exames estudados (testes ou biomarcadores) para a investigação diagnóstica dos pacientes com tuberculose pleural.

A performance da ADA-P com valor ótimo de corte igual ou superior a 40,0 IU/L e do histopatológico pleural decorrente das CNPBs são mostrados na Tabela 2.

O teste estatístico do Qui-quadrado demonstrou a utilidade da ADA-P para a investigação diagnóstica de derrames pleurais por tuberculose em relação ao histopatológico decorrente da CNPB conforme apresentado na tabela 2 (Qui-quadrado=24,41, p<0,0001).

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6 – Controle de qualidade do biomarcador ADA-P

Para prevenir erros neste estudo usamos os critérios metodológicos recomendados pela Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy (STARD) e por outros autores especialistas em testes diagnósticos (Bossuyt et al., 2003; Metz, 2008). O STARD é um comitê de diversos especialistas que elaborou um documento (relatório final) com diversas recomendações em uma checklist com o objetivo de melhorar a acurácia de testes diagnósticos. A padronização STARD garante mais clareza, rigor metodológico e possibilidade de comparação dos estudos de métodos diagnósticos.

As medidas padronizadas para validação de um teste diagnóstico ou biomarcador recomendadas pelo STARD são os índices de sensibilidade, especificidade, os valores preditivos positivo e negativo, o odds ratio, as razões de verossimilhança e a área sob a curva ROC (AUC). Acurácia é avaliada pela AUC. Os autores definem a acurácia diagnóstica como a habilidade de

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discriminar clinicamente entre dois grupos de individuos (doentes e não doentes).

A acurácia é a medida do rendimento (performance) de um teste diagnóstico. A AUC varia de 0 a 0,5 em um teste diagnóstico sem utilidade clínica e de mais 0,5 a 1,0 para testes que fazem a diferença entre doença e ausência de doença (Metz, 2008).

Para o diagnóstico de tuberculose pleural, o valor da AUC calculado para a dosagem da ADA-P foi maior que o calculado para o exame do histopatológico pleural por CNPB (Figura 1). Entretanto, essa diferença não foi estatisticamente significativa (Estatística Z = 0,293, p=0,7695).

Thomas G. Tape (2015) do Centro Médico da Universidade do Estado de Nebraska (EUA) recomenda em um guia acadêmico tradicional classificar uma AUC como excelente (0,90-1,0), boa (0,80-0,90), regular (0,7-0,8), razoavél (0,60-0,70), pobre (0,50-0,60) e sem efeito (0,40-0,50). De acordo com essa classificação, a eficácia diagnóstica da ADA-P e do exame histopatológico pleural são boa e regular, respectivamente.

Figura 1. Curva ROC comparando as AUCs da ADA-P e do histopatológico pleural oriundo de CNPB (variáveis dicotômicas) para o diagnóstico de tuberculose pleural. Níveis de ADA-P: AUC = 0,83; IC95% = 0,77-0,88. CNPB: AUC = 0,787; IC95% = 0,679-0,873. A comparação das AUCs não foi estatisticamente significativo (AUC total = 0,293, p = 0,7695).

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Abreviaturas. ADA-P - análise da adenosina desaminase no líquido pleural; CNPB - biópsia pleural fechada com agulha; AUC - área sob a curva ROC; HISTO-P - histopatológico pleural.

  27 V - DISCUSSÂO

A síndrome do derrame pleural, apesar de todos avanços tecnológicos ocorridos nos últimos anos, ainda apresenta dificuldades para o diagnóstico da causa, principalmente, em serviços de saúde não especializados para doenças torácicas.

O relato na literatura mundial de que em 11% a 20% dos casos de SDP a causa fica sem ser estabelecida, o que leva o paciente a ser classificado como tendo um diagnóstico de derrame pleural de causa indeterminada (Hirsch et al., 1979; Porcel e Light, 2013). Esse dado estatístico é o que torna ainda mais fascinante o estudo dessa síndrome. Novos procedimentos para a retirada de materiais e realização de exames são cada vez menos invasivos.

Na casuística estudada para esta pesquisa, 10% dos pacientes permaneceram com diagnóstico indeterminado, apesar de exaustivamente investigados com procedimentos e exames disponíveis. A frequência menor do que a literatura relata, pode ser explicado pelo fato do Ambulatório de Pesquisa em Pneumologia do HUAP/UFF, ser um centro de referência e pesquisa com profissionais especificamente habilitados para os procedimentos e exames realizados.

Nos últimos anos um grande número de biomarcadores, visando uma causa específica, vêm sendo pesquisados e testados em diversas enfermidades que se apresentam ou evoluem com síndrome do derrame pleural. É neste contexto que o estudo da enzima adenosina desaminase é importante, especialmente, em países onde as taxas de incidência e prevalência de tuberculose, ainda, permanecem elevadas.

Apesar da realidade epidemiológica, diversos autores nacionais e internacionais preconizam que para o diagnóstico da causa de síndrome do derrame pleural (Barbosa et al., 1995; Capellozi et al., 1997; Chalhoub., 2000), o procedimento de toracocentese, para a retirada de líquido pleural, deve ser simultaneamente precedido de uma biópsia pleural fechada com agulha para a retirada de fragmentos pleurais.

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O presente trabalho foi um estudo prospectivo que avaliou e comparou a acurácia de dois exames para o diagnóstico de tuberculose pleural.

Diversos estudos diagnósticos têm concluído que uma elevação nos níveis da ADA-P faz um diagnóstico de tuberculose pleural com sensibilidade entre 80% e 100% e especificidade entre 89% e 100% quando dosada pelo método colorimétrico de Giusti e Galanti. Os pontos de corte da ADA-P variaram entre 35,0 UI/L e 70,0 UI/L nos trabalhos pesquisados para uma meta-análise brasileira (Morrison e Neves, 2008).

Os parâmetros diagnósticos elevados encontrados no presente trabalho foram similares aos relatados por outros autores presentes na meta-análise de Morrison e Neves (2008) - tabela 2. A elevada acurácia da análise bioquímica para a ADA-P pode contribuir para o diagnóstico da tuberculose pleural.

Ao contrário da sensibilidade (Se) e da especificidade (Es), que são índices somente conhecidos depois do diagnóstico definitivo da doença estudada e medem a capacidade discriminativa do teste, os valores preditivos dizem quais são as probabilidades de um determinado paciente ter ou não, doença sob suspeita (Griner et al., 1981).

Na prática clinica para interpretação de um resultado (valor) de um biomarcador ou exame, mais importante do que conhecer a sensibilidade e especificidade isoladas, é conhecer os conceitos de valores preditivos e seus determinantes (Kawamura, 2002). Os valores preditivos (VP) do teste, isto é, a probabilidade de, perante um resultado positivo (VPP) ou negativo (VPN), existir ou não doença. Os VPP e VPN podem ser calculados a partir de seus determinantes, incluindo a prevalência (P) da doença na região estudada, por fórmulas estatísticas simples, conforme apresentado a seguir:

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A partir das equações acima as relações entre essas variáveis podem ser interpretadas da seguinte maneira (Kawamura, 2002): a) quanto maior a sensibilidade, maior será o VPN, isto é, maior será a probabilidade de, perante um resultado negativo, não haver doença; b) quanto maior a especificidade, maior será o VPP, isto é, maior será a probabilidade de, perante um resultado positivo, haver doença; c) quanto maior a prevalência da doença, maior será o VPP e menor será o VPN, isto é, quanto mais prevalente (frequente) é uma doença mais provável é encontrar verdadeiros positivos (aumentando o VPP), mas também é mais provável encontrar falsos negativos (diminuindo o VPN).

O VPP da ADA-P na casuística (tabela 2) traduz a alta probabilidade de que um paciente com o exame da ADA-P positivo, isto é, acima do limiar crítico discriminativo calculado, tenha tuberculose pleural. Quanto maior a prevalência de uma doença, maior o valor preditivo positivo de um teste para seu diagnóstico (Griner et al., 1981).

O VPN da ADA-P na casuística estudada (tabela 2) traduz a alta probabilidade de que um paciente com o exame da ADA-P negativo, isto é, abaixo limiar crítico discriminativo calculado, não tenha tuberculose pleural (Griner et al., 1981).

Os likelihood ratio são traduzidos pelo professor LUIZ MENDES ANTAS, em seu Dicionário de Termos Técnicos Inglês-Português, como “testes de razão de verossimilhança”.

Likelihood ratio indica em quantas vezes o resultado de um teste diagnóstico é capaz de mudar a probabilidade de se ter uma doença (Jaeschke et al, 1994). Contrastando com os valores preditivos, os likelihood ratios não são influenciados pela prevalência da doença na casuística estudada. Um likelihood positivo (LR+ ou RVP), indica quanto a probabilidade da doença aumenta se o teste for positivo.

No caso específico da ADA-P (tabela 2), para o diagnóstico de tuberculose pleural, a RVP positiva calculada foi de 5,9. O histopatológico pleural teve uma RVP de 21,28.

Para que um exame tenha propriedade discriminativa, na identificação de uma determinada doença, a RVP desta enfermidade precisa ser maior do que

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1,0 (um). Valores mais altos indica grande propriedade discriminativa (Heffner, 1998).

Um likelihood negativo ou RVN indica quanto a probabilidade da doença diminui em um paciente com um teste negativo. A RVN da ADA-P, na casuística mencionada, foi de 0,23 e do histopatológico pleural de 0,44. A RVN negativas menores do que 1,0 (um), indica grande poder discriminativo do exame, no caso de ausência da doença. Valores muito menores do que 1, indica um poder discriminativo acentuado do teste (Heffner, 1998).

Qualquer paciente com ADA-P maior ou igual a 40,0 UI/L, tem 5,9 vezes a mais de chance (likelihood ratio) de ganhar um diagnóstico de tuberculose pleural. Em outras palavras, a razão de verossimilhança de um teste positivo (RVP) mede o quanto é mais provável de ser um teste positivo nos doentes do que nos não-doentes. A razão de verossimilhança de um teste negativo (RVN) mede o quanto é mais provável de ser o teste negativo nos doentes que nos não-doentes.

A razão de chances de diagnóstico ou diagnostic odds ratio (DOR) é uma combinação estatística da sensibilidade, especificidade e dos valores de RVP e RVN. É o resultado também da RVP dividida pela RVN (Souza e Ribeiro, 2009).

O DOR também é de extrema utilidade e importância para avaliar a qualidade e desempenho de um teste diagnóstico. Isto porque é uma medida estatística de desempenho global do teste; pode ser facilmente obtida pelo produto cruzado da tabela de contingência 2 x 2 e porque é freqüentemente constante a despeito do ponto de corte utilizado para o exame nos diversos estudos (Souza e Ribeiro, 2009).

No nosso estudo o DOR do histopatológico pleural foi o dobro da ADA-P, respectivamente, 48,36 e 24,72 (tabela 2).

O procedimento de CNPB para exame das superficies pleurais ainda é considerado por vários autores o exame “padrão áureo” para confirmar o diagnóstico de tuberculose pleural (Poe et al., 1984; Silva Junior, 2012; Porcel, 2013; Porcel e Light, 2013). Entretanto, complicações importantes como pneumotórax podem ocorrer entre 3% e 20% dos pacientes submetidos a CNPB e não tratados com ventilação mecânica. Cerca de 20% destes

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pacientes necessitam drenagem pleural (Poe et al., 1984; ACP, 1985; Sokolowski Jr et al., 1989; Hooper et al., 2010).

Em mãos experientes o procedimento de CNPB não apresenta complicações fatais, mas a literatura relata várias complicações potenciais como casos de hemotórax e pneumotórax hipertensivos (Hooper et al., 2010). Outras complicações da CNPB incluem dor, tosse, não obtenção de líquido, reação vasovagal, edema de reexpansão pulmonar, hipovolemia, hematoma subcutaneo, infecção pleural, febre transitória, laceração de diafragma, coração, pulmão (fístula broncopleural), fígado e baço (Hooper et al., 2010).

A CNPB tem contra-indicações e risco aumentado para certas condições quando realizada por médico inexperiente e sem supervisão direta. A principais contra-indicações incluem: coagulopatia, inabilidade do paciente em cooperar; derrame pleural muito pequeno, infecção de parede torácica, grandes quantidades de líquido pleural (mais de 1,5L) removidos muito rapidamente, condições de instabilidade clínica, uso de anticoagulantes e pacientes com contagem de plaquetas abaixo de 50 000/mm cúbico (Sokolowski Jr et al., 1989; Hooper et al., 2010).

No estudo atual os autores presenciaram duas complicações raras com a CNPB: semeadura de células malignas ao longo do trajeto da agulha de Cope e quebra da ponta de uma agulha de Cope não utilizada anteriormente, mas sem perda do fragmento na cavidade pleural. Um acidente similar foi relatado por Fité et al. (1989) com uma agulha de Abrams. Chang et al. (1999) relataram um acidente com a ponta de uma agulha de biópsia pleural que quebrou na cavidade pleural. (25)

A complicação de pneumotórax e a sensibilidade diagnóstica são semelhantes entre as agulhas de Cope e de Abrams (Gouda et al., 2006).

Biópsia pleural via toracoscopia ou pleuroscopia são indicadas como procedimento cirúrgico diagnóstico complementar e de rotina para tuberculose pleural e derrame pleural maligno se os procedimentos de toracocentese e CNPB não forem conclusivos para confirmação do diagnóstico (Son et al., 2014).

Na literatura médica a pesquisa sobre a sensibilidade do exame histopatológico obtido por CNPB para o diagnóstico de tuberculose pleural variou de 40,0% a 90,0% (Raj et al., 1998; Hira e Ranjan, 2011; Hooper et al.,

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2010; Solooki e Miri, 2013; Pereyra et al., 2013). Esses trabalhos originais não mencionam a acurácia da CNPB para o diagnóstico de tuberculose pleural.

Um estudo brasileiro de pleurites inespecíficas por análise morfométrica mostrou que a presença de fibrina com granulação no tecido submesotelial conectivo tinha 100% de especificidade para o diagnóstico de tuberculose pleural. Este achado mais a presença de granuloma aumentam o rendimento da análise histopatógica para tuberculose pleural (Capelozzi et al., 1997).

Para avaliar a correlação entre a ADA-P e o histopatológico pleural decorrente da CNPB foi utilizado a correlação não paramétrica tetracórica. Este é um teste estatístico muito usual para descrever a relação entre variáveis dicotômicas (positivo ou negativo, conclusivo ou inconclusivo). Neste estudo um coeficiente de correlação tetracólico de 0,563 foi indicativo de alta correlação entre os dois exames (Tabela 2). Não foram encontrados trabalhos na literatura para comparação.

Os nossos resultados mostraram a superioridade da análise do líquido pleural com a ADA-P no diagnóstico de tuberculose pleural. Também em comparação com a citologia para a malignidade do líquido pleural, CNPB foi de utilidade diagnóstica apenas em 7% de 414 pacientes estudados por Prakash e Reiman (1985) quando a citologia convencional foi inconclusiva.

De acordo com Arnold et al. (2015) em uma população de baixa incidência de tuberculose, o valores da ADA-P maiores que 35,0 UI/L em derrames pleurais linfocíticos faz da tuberculose pleural o mais provável diagnóstico mas não substitui a biópsia pleural como padrão áureo na investigação.

Atualmente novos biomarcadores estudados (interleucina 23 e interleucina-33) apresentaram menor acurácia diagnóstica em comparação com a ADA-P para o diagnóstico de tuberculose pleural (Valdés et al., 2014; Li et al., 2015).

Em contraste com a análise da ADA-P, a sensibilidade e especificidade do exame Xpert MTB/RIF para análise direta de M. tuberculosis no líquido pleural foram de 43,6% e 98,6%, respectivamente, em países com elevada prevalência de tuberculose (Du et al., 2015).

O procedimento de toracocentese também é importante associado com o tratamento com drogas tuberculostáticas em derrames volumosos para alívio

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da dispnéia e para profilaxia de espessamento pleural residual (Bhuniya et al., 2012).

A presença de artrite reumatoide como causa de SDP possivelmente diminuiria o índice de especificidade da ADA-P. Assim como os linfomas e os empiemas pleurais, a artrite reumatóide representa casos de falso-positivos na avaliação da ADA-P (Neves et al., 2004).

  34 VI - CONCLUSÕES

Após análise estatística e de acordo com os objetivos do trabalho conclui-se que:

1) a determinação da enzima adenosina desaminase no líquido pleural (ADA-P) como biomarcador para o diagnóstico de tuberculose pleural foi avaliada com um valor de referência selecionado de 40,0 UI/L;

2) em países com elevada incidência e prevalência de tuberculose como o Brasil, a atividade da ADA-P é um teste acurado para o diagnóstico de tuberculose pleural;

3) após comparação com o exame histopatológico decorrente de CNPB a alta performance diagnóstica da ADA-P pode contribuir para o diagnóstico de TB pleural e tornar a CNPB desnecessária como primeiro procedimento diagnóstico cirúrgico.

  35 VII- CONSIDERAÇÕES FINAIS

A dosagem da ADA-P é um exame válido para o diagnóstico diferencial na síndrome do derrame pleural (SDP). Esta conclusão é decorrente dos elevados índices de valores preditivos e seus determinantes, além da sua elevada acurácia, calculados para o diagnóstico de uma doença com alta prevalência na casuística estudada (tuberculose pleural).

A dosagem da ADA-P deve ser encorajada como exame inicial para avaliação da SDP no Brasil. Entretanto, assim como outros autores nós acreditamos que a biópsia pleural fechada por agulha não está obsoleta para o diagnóstico de TB pleural.

Procedimentos invasivos com potenciais complicações para um diagnóstico devem ser indicados após a avaliação de biomarcadores específicos com alta acurácia como a ADA-P. Entretanto, um biomarcador deve ser avaliado em conjunto com o quadro clínico, imagem e perfil epidemiológico de uma doença.

  36 VIII - REFERÊNCIAS

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