Aplicações da eletroforese capilar na determinação de princípio ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água fortemente salina

Miguel Bentes Mocherniuk

Aplicações da eletroforese capilar na determinação de princípio

ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água

fortemente salina

Orientador: Prof. Dr. Aderval

Severino Luna (PPGEQ/IQ/UERJ)

Rio de Janeiro

2008

Dissertação apresentada, como requisito

parcial para obtenção do título de Mestre,

ao Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Química, da Universidade do

Estado do Rio de Janeiro. Área de

concentração: Bioprocessos e Tecnologia

Ambiental.

Livros Grátis

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CATALOGAÇÃO NA FONTE UERJ/REDE SIRIUS/NPROTEC

Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total desta tese. _____________________________________________ ________________

Assinatura Data

M688 Mocherniuk, Miguel Bentes.

Aplicações da eletroforese capilar na determinação de princípio ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água fortemente salina / Miguel Bentes Mocherniuk. – 2008.

94 f.

Orientador : Aderval Severino Luna.

Dissertação (mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Química.

1. Eletroforese capilar – Teses. 2. Produtos farmacêuticos – Teses. 3. Ácidos orgânicos – Teses. I. Luna, Aderval Severino. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de Química. III. Título.

Aplicações da eletroforese capilar na determinação de princípio

ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água

fortemente salina

Aprovado em

__________________________________________________

Banca Examinadora:___________________________________________

______________________________________________________

Prof. Dr Aderval Severino Luna (Orientador) PPGEQ/ Instituto de Química da UERJ

__________________________________________________________ Prof. Dr Antonio Carlos Augusto da Costa

PPGEQ/ Instituto de Química da UERJ

___________________________________________________________ Prof . Dr. Ayres Guimarães Dias

Instituto de Química da UERJ

___________________________________________________________ Prof a. Dra Fátima Maria Zanon Zotin

PPGEQ/ Instituto de Química da UERJ

Rio de Janeiro 2008

Dissertação apresentada, como requisito

para obtenção do título de Mestre, ao

Programa

de

Pós-Graduação

em

Engenharia Química, da Universidade do

Estado do Rio de Janeiro. Área de

concentração: Bioprocessos e Tecnologia

Ambiental.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, irmão e minha noiva que sempre me apoiaram e me deram força nas horas difíceis quando pensei em desistir;

Ao Prof. Dr. Aderval Severino Luna, pela competência, dedicação e paciência na orientação deste trabalho e pelo conhecimento transmitido;

Ao Corpo Docente do Curso de Mestrado em Engenharia Química da Universidade do Estado do Rio de Janeiro;

Aos amigos do laboratório da UERJ, Jéssica Pinho, Diego Barros, Fernanda Almeida, Arnaldo Peixoto, Igor Lima, André Matassoli, Thaís Malcher, Marcelo Reis e Otavio Bernardes pelo apoio e colaboração no laboratório;

A todos os colegas da turma do Curso de Mestrado em Engenharia Química da Universidade do Estado do Rio de Janeiro;

Ao Instituto de Química da UERJ, por ter fornecido toda a estrutura para realização deste trabalho;

Enfim, todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para realização deste trabalho.

RESUMO

MOCHERNIUK, Miguel Bentes Aplicações de eletroforese capilar na determinação de princípio ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água fortemente salina, Brasil, 2008. 91f.

Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Instituto de Química, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.

RESUMO

Desde as duas últimas décadas, a eletroforese capilar emergiu como um método alternativo para separação e quantificação de uma variedade de analitos de importância industrial, clínica, biomédica e ambiental. Aspectos relevantes desta técnica, como alta eficiência, alto poder de resolução, maior rapidez, total automação e uma diversidade de esquemas de injeção e detecção foram discutidos intensamente na literatura. Neste trabalho, dois métodos diferentes foram desenvolvidos por eletroforese capilar.

O primeiro método foi desenvolvido para determinação simultânea de ácido acetilsalicílico (AAS) e paracetamol (PAR) em comprimidos por eletroforese capilar por zona (CZE). Uma solução de 25 mmol/L de tetraborato de sódio (BGE) foi a mais adequada para a separação dos analitos. Um capilar de sílica fundida com comprimento total de 50 cm, diâmetro interno de 50 µm e comprimento efetivo de 40 cm foi usado para a separação. Os os analitos foram completamente separados em 8 min com um potencial aplicado de 25 kV, e a detecção foi feita em 226 nm com detector UV. Usou-se ácido benzóico como padrão interno (HBz) para a quantificação das drogas. A validação do método foi feita em termos de linearidade, exatidão, precisão, limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ). A linearidade das curvas de calibração para o AAS e PAR foram 100 – 500 mg/L (R2ajustado =

0,9904), 50 – 300 mg/L (R2ajustado = 0,9906), respectivamente. O método proposto é simples e

adequado para a análise simultânea dos princípios ativos dos comprimidos.

O segundo método foi desenvolvido para a determinação simultânea dos ácidos fórmico, acético e propiônico em água natural fortemente salina por cromatografia eletrocinética micelar ou eletrocromatografia micelar. Um eletrólito de fundo composto por solução de 5 mL de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mmol/L, 0,1 mL de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3.5 mL de água, e 0,9 mL dietanolamina (DEA) 9 mmol/L foi o mais adequado para a separação de todos os analitos. Um tubo capilar de sílica fundida com comprimento total de 50 cm, diâmetro interno de 50 µm e comprimento efetivo de 40 cm foi usado para a separação. Todos

analitos foram completamente separados em 10 min com a diferença de potencial de -20 kV, e a detecção indireta foi feita em 229 nm com detector UV. A validação do método foi feita em termos de linearidade, exatidão, precisão, limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ). A linearidade das curvas de calibração para os ácidos fórmico, acético e propiônico foram 10 – 100 mg/L (R2adjustado > 0,992), para todos eles. Portanto, o método proposto é simples e

adequado para análise simultânea de ácidos orgânicos de baixo peso molecular em água natural fortemente salina.

ABSTRACT

Over the past two decades, capillary electrophoresis has emerged as a very resourceful alternative method for the separation and quantification of a variety of solutes of industrial, clinical, biomedical and environmental importance. Relevant aspects of the technique such as high efficiency, high resolving power, high speed, full automation, and a diversity of injection and detection schemes have been extensively discussed in the literature. In this work, two different methods were developed by capillary electrophoresis.

The first method has been developed for the simultaneous determination of acetylsalicylic acid (AAS) and paracetamol (PAR) in tablets by capillary zone eletrophoresis (CZE). A 25 mmol/L sodium tetraborate background electrolyte (BGE) solution was found to be suitable for the separation of all the analytes. An uncoated fused-capillary of a total length 50 cm (effective length 40 cm) with internal diameter of 50 µm was used for separation. All the analytes were completely separated within 8 min at the applied voltage of 25 kV, and detection was performed at 226 nm with an UV detector. Benzoic acid was used as internal standard (I. S.) for the quantification of the drugs. Validation of the method was performed in terms of linearity, accuracy, precision, limit of detection (LOD), and quantification (LOQ). The linearity of the calibration curves for AAS, and PAR were 100 – 500 mg/L (R2adjusted =

0,9904), 50 – 300 mg/L (R2adjusted = 0,9906), respectively. Thus, the proposed method is

simple and suitable for the simultaneous analysis of active ingredients in tablets dosage forms. The second method has been developed for the simultaneous determination of formic, acetic, and propionic acids in highly saline natural water by micelar electrokinetic capillary chromatography (MEKC or MECC). An background electrolyte composed of 5 mL of benzoic acid 10 mmol/L, 0.5 mL of cetyltrimethylammonium bromide 0.5 mmol/L, 0.1 mL of EDTA 0.1 mmol/L, 3.5 mL water, and 0.9 mL diethanolamine 9 mmol/L solution was found to be suitable for the separation of all the analytes. An uncoated fused-capillary of a total length 50 cm (effective length 40 cm) was used for separation. All the analytes were completely separated within 10 min at the applied voltage of - 20 kV, and indirect detection was performed at 229 nm with an UV detector. Validation of the method was performed in terms of linearity, accuracy, precision, limit of detection (LOD), and quantification (LOQ). The linearity of the calibration curves for formic, acetic and propionic acids were 10 – 100 mg/L (R2adjusted > 0.992), for all of them. Therefore, the proposed method is simple and

suitable for the simultaneous analysis of low-molecular mass organic acids in highly saline natural water.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Soluções tamponadas para eletroforese capilar...34

Tabela 2 - Aditivos de eletrólito usados em eletroforese capilar...35

Tabela 3 - Aplicações da eletroforese capilar por zona (CZE)...37

Tabela 4 - Tipos e propriedades dos agentes tensoativos...39

Tabela 5 - Aplicações da cromatografia eletrocinética micelar (MECC)...42

Tabela 6 – Seleção do modo de eletroforese capilar...42

Tabela 7 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos fármacos...64

Tabela 8 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos ácidos orgânicos...65

Tabela 9 - Parâmetros da curva de calibração do AAS e PAR por CZE...71

Tabela 10 - Análise estatística da curva de calibração do AAS e PAR por CZE...71

Tabela 11 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do AAS...71

Tabela 12 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do PAR...71

Tabela 13 - Estudo da precisão intra-corridas do método desenvolvido para determinar AAS e PAR por CZE...73

Tabela 14 - Parâmetros da curva de calibração dos ácidos orgânicos por MKCE...79

Tabela 15 - Análise estatística da curva de calibração dos ácidos orgânicos por MKCE...79

Tabela 16 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido fórmico...79

Tabela 17 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido acético...79

Tabela 18 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido propiônico...80

Tabela 19 – Resultados da medida da precisão ...82

LISTAS DE FIGURAS

Figura 1 - Sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia...18 Figura 2 - Foto do sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia...19 Figura 3 - Cassete utilizado no sistema de eletroforese capilar da Lumex, Rússia modelo...19 Figura 4 - Seqüência de eventos na separação de dois solutos pelos quatro modos da eletroforese...22 Figura 5 - Efeito de pH no fluxo eletroosmótico...25 Figura 6 - Perfis de fluxos capilares...26 Figura 7 - Seção transversal do gradiente de temperatura e o perfil da velocidade eletroforética...29 Figura 8 - Eletroforese capilar por zona...31 Figura 9 - Cromatografia eletrocinética micelar...38 Figura 10 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 8,0...66 Figura 11 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2...66 Figura 12 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 10,4...67 Figura 13 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2...68 Figura 14 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 50 mmol/L, pH = 9,2...68 Figura 15 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2, potencial aplicado = 15 kV………...69

Figura 16 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2, potencial aplicado = 20 kV...69

Figura 17 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2, potencial aplicado = 25 kV...70

Figura 18 – Curva de calibração do AAS por eletroforese capilar por zona...72 Figura 19 – Curva de calibração do PAR por eletroforese capilar por zona...72

Figura 20 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH = 4,8...75

Figura 21 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH = 5,3...76

Figura 22 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH = 5,8...76

Figura 23 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH = 5,3.Potencial aplicado = -15 kV...77

Figura 24 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH = 5,3.Potencial aplicado = -20 kV...78

Figura 25 – Curva de calibração do ácido fórmico por eletroforese capilar por MECK...80 Figura 26 – Curva de calibração do ácido acético por eletroforese capilar por MECK...80 Figura 27 – Curva de calibração do ácido propiônico por eletroforese capilar por MECK...81

LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BSA Albumina de soro bovina

CAPS Ácido 3-(ciclohexilamino)-1- propanosulfônico

CE Eletroforese capilar

CGE Eletroforese capilar em gel

CIEF Eletroforese capilar por focalização isoelétrica CITP Isotacoforese capilar

CMC Concentração micelar crítica CTAB Brometo de cetiltrimetil amônio CZE Eletroforese capilar por zona

DMF Dimetilformamida

DMSO Sulfóxido de dimetila

E Força do campo elétrico

EDTA Ácido etilenodiaminetetraacético EOF Fluxo electroosmótico

EPF Fluxo eletroforético

HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência

LC Cromatografia líquida

Ld Comprimento do tubo capilar até o detector

Lt Comprimento capilar total

MECC/MEKC Cromatografia eletrocinética micelar ou eletrocromatografia micelar MES Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico

µep Mobilidade eletroforética

PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida PCR Reação da polimerase em cadeia

pI Ponto isoelétrico

SDS Dodecilsulfato de sódio

THF Tetrahidrofurano

Tris Tris(hidroximetil) amino metano

UV Ultravioleta

V volt

V Potencial elétrico

Veo Velocidade do fluxo electroosmótico

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO...16

1 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...17

1.1 - Eletroforese capilar...17

1.1.1 Modos de injeção da amostra……….19

1.1.2 Sistemas de detecção………..20

1.1.3 Modos de separação por eletroforese……….21

1.1.4 Terminologia da eletroforese capilar………..22

1.1.5 Eletroosmose………..23

1.1.6 Dinâmica do fluxo, eficiência e resolução……….25

1.1.7 O diâmetro capilar e o aquecimento Joule……….28

1.1.8 Efeito do potencial elétrico e da temperatura……….30

1.1.9 Modos de eletroforese capilar……….30

1.1.10 Eletroforese capilar de zona……….31

1.1.10.1 Tubos capilares………..31

1.1.10.2 Efeito do pH………...32

1.1.10.3 Solução tampão………..33

1.1.10.4 Ligação de espécies químicas na parede do tubo capilar………..35

1.1.10.5 Revestimento do capilar………36

1.1.10.6 Aplicações da CZE………36

1.1.11 Cromatografia eletrocinética micelar (MECC ou MEKC)………...37

1.1.11.1 Micelas………..38

1.1.11.2 Mecanismo de separação………...40

1.1.11.3 Ordem de migração...41

1.1.11.4 Uso de modificadores orgânicos………...41

1.1.11.5 Aplicações da MECC...42

1.1.12 Selecão do tipo de eletroforese capilar……….42

1.2 Métodos de determinação de ácido acetilsalicílico (AAS)…...……….43

1.3 Métodos de determinação do paracetamol (PAR)………43

1.4 Métodos de determinação de ácidos orgânicos……….44

1.5 Validação de métodos analíticos univariados ………...46

1.5.1 Linearidade: o ajuste da curva de calibração………..47

1.5.2 Teste de linearidade………48

1.5.3 Sensibilidade do método: o limite de detecção e o limite de quantificação ……..49

1.5.3.1 Limite de detecção: método visual………..49

1.5.3.2 Limite de detecção: método da razão sinal-ruído………50

1.5.3.3 Limite de detecção: método baseado em parâmetros da curva analítica……….50

1.5.4.1 Limite de quantificação: método visual...51

1.5.4.2 Limite de quantificação: método da razão sinal-ruído………51

1.5.4.3 Limite de quantificação: método baseado em parâmetros da curva analítica….51 1.5.5 Precisão ………..51

1.5.6 Exatidão ………..52

1.5.7 Robustez……….53

1.6 Validação de métodos eletroforéticos para análise de produtos farmacêuticos ……….53

1.6.1 Especificidade...53

1.6.2 Linearidade e faixa da curva analítica………55

1.6.3 Exatidão e estudo de recuperação………...55

1.6.4 Precisão………...56

1.6.4.1 Repetibilidade ………..56

1.6.4.2 Precisão intermediária……….57

1.6.4.3 Reprodutibilidade………57

1.6.5 Estabilidade das soluções………...57

1.6.6 Robustez……….58

1.6.7 Limites de detecção e quantificação………...58

2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL………60

2.1 Instrumentação………60

2.2 Soluções, reagentes e materiais ………..60

2.2.1 Solução estoque de ácido acetilsalicílico 1000 mg/L……….61

2.2.2 Solução estoque de paracetamol 1000 mg/L………..61

2.2.3 Solução estoque de ácido benzóico 500 mg/L ………..61

2.2.4 Solução tampão de borato 25 mmol/L (pH = 9,20)………61

2.2.5 Solução tampão de borato 50 mmol/L (pH = 9,20)………61

2.2.6 Solução estoque de aspirina 5000 mg/L……….61

2.2.7 Solução estoque de paracetamol 7500 mg/L………..63

2.2.9 Solução estoque de ácido acético 1000 mg/L……….63

2.2.10 Solução estoque de ácido propiônico 1000 mg/L……….63

2.2.11 Solução tampão pH = 5,3……….63

2.3 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por CZE...63

2.4 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por MECC ……….64

2.5 Curvas de calibração dos fármacos para a determinação por CZE...64

2.6 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos para a determinação por MEKC...65

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ………..66

3.1 Estudo univariado do método de determinação de AAS e PAR por CZE…….66

3.1.1 Efeito do pH da solução tampão…...………..66

3.1.2 Efeito da concentração do eletrólito suporte………..67

3.1.3 Efeito do potencial aplicado………...69

3.1.4 Robustez……….70

3.1.5 Curvas de calibração………...70

3.1.6 Precisão………...72

3.1.7 Limites de detecção e quantificação………...73

3.1.8 Calibração pelo método do padrão interno……….73

3.2 Estudo univariado do método de determinação de ácidos orgânicos por MEKC……….74

3.2.1 Efeito do pH da solução tampão……….74

3.2.2 Efeito do potencial aplicado………...77

3.2.3 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos………78

3.2.4 Precisão………...81

3.2.5 Limites de detecção e quantificação………...82

4. CONCLUSÕES………..84

5. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS...85

INTRODUÇÃO

A química exerce um papel preponderante no meio ambiente. É comum o público atribuir às substâncias químicas sintéticas os principais problemas de poluição, responsabilizando seus criadores por isso. Porém, passam despercebido, especialmente para o grande público, que muitos dos problemas ambientais somente foram resolvidos quando utilizados os conhecimentos da ciência, em particular da química (LUNA, 2003).

Quando o meio ambiente é abordado, torna-se cada vez mais claro a necessidade de se aprofundar os estudos nessa área. Interdisciplinar por excelência, esse campo demanda conhecimentos e técnicas de diferentes fontes, entre as quais se destaca a química analítica. Neste contexto, a química analítica exerce um papel fundamental, pois oferece uma pletora de métodos e técnicas para identificação e quantificação de analitos em uma gama imensa de matrizes (LUNA, 2003).

Acontece que nem sempre os conteúdos mais refinados dessa área do conhecimento são disponibilizados. Além disso, os profissionais das ciências ambientais provêm de diversas áreas, portanto costumam ter familiaridade com laboratório analítico, mas não detêm necessariamente uma formação que lhes possibilite atentar para as particularidades deste campo (LUNA, 2003).

Mesmo o químico precisa receber uma preparação adequada nesse domínio. A importância de se empenhar nesse sentido fica patente quando pensamos que, a despeito de todo o desenvolvimento instrumental, o fator determinante da confiabilidade dos dados levantados continua sendo a formação do pesquisador (LUNA, 2003).

Para a separação de misturas e quantificação dos componentes são empregadas técnicas clássicas de separação, tais como: cromatografia em suas diversas modalidades e a eletroforese. Neste contexto, a eletroforese capilar surge como um técnica alternativa promissora, esta pode ser empregada como substituinte de cromatografia líquida e, em muitos casos, como a única alternativa possível (LUNA, 2003).

Neste trabalho, utilizaram-se duas técnicas da família eletroforese capilar: eletroforese capilar por zona (CZE) e cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) ou eletrocromatografia micelar como técnicas de quantificação de princípios ativos de preparações farmacêuticas, e ácidos orgânicos de massa molecular baixa em amostras de águas naturais fortemente salinas. A literatura relata a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) como uma técnica de grande aceitação na indústria farmacêutica, porém somente recentemente a eletroforese capilar foi introduzida nas farmacopéias

americana (USP, 2000), francesa (PHARMACOPÉE EUROPÉENNE, 2001) e japonesa (JP FORUM 1999). Esta técnica surgiu como uma técnica alternativa ou complementar para aplicação na área de insumos e preparações farmacêuticas. Portanto, o uso de eletroforese capilar na indústria farmacêutica surgiu a menos uma década, o que significa uma nova área de pesquisa e desenvolvimento. A determinação de ácidos orgânicos de massa molar baixa é usualmente feita por cromatografia gasosa (GC), porém o fato destes analitos se encontrarem em meio aquoso fortemente salino, inviabiliza a sua determinação direta por esta técnica. Tal surgiu, a oportunidade de se explorar a cromatografia eletrocinética micelar para esta finalidade.

Portanto, o objetivo desse trabalho foi desenvolver um método de análise para a quantificação dos princípios ativos de fármacos (ácido acetilsalicílico e paracetamol) por CZE e outro método de análise para a quantificação dos ácidos: fórmico, acético e propiônico por MEKC em amostras de águas naturais fortemente salinas.

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1 Eletroforese capilar

A eletroforese capilar (CE) é uma família de técnicas relacionadas que empregam tubos capilares finos (d.i. = 20-200 µm) para realizar separações de moléculas grandes e pequenas com elevada eficiência. Nestas separações são empregados potenciais elétricos elevados que podem gerar fluxos eletroosmótico e eletroforético de soluções tamponadas e de espécies iônicas, respectivamente, dentro do tubo capilar (BAKER, 1995).

As propriedades da separação e o eletroferograma resultante têm características que se assemelham a um cruzamento da eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) tradicional com a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (BAKER, 1995).

A CE oferece um formato inovador para as técnicas de separação, pois: • emprega tubos capilares onde ocorre a separação eletroforética;

• utiliza um campo elétrico muito alto, freqüentemente mais alto que 500 V/cm;

• usa a tecnologia de um detector moderno e faz com que o eletroferograma seja semelhante ao de um cromatograma;

• tem eficiência igual ou superior ao da cromatografia em fase gasosa capilar; • requer uma quantidade mínima de amostra;

• é facilmente automatizado para uma análise quantitativa precisa e tem facilidade de uso;

• consume uma quantidade limitada de reagentes, com volumes tipicamente da ordem de 1 a 10 nL;

• é aplicável para uma seleção ampla de analitos quando comparada com outras técnicas analíticas de separação (TAVARES, 1997).

A configuração instrumental básica para CE consiste de um tubo de sílica fundida com uma janela óptica, uma fonte controlada com potencial elevado, dois elétrodos, dois reservatórios com solução tampão e um detector que pode ser: ultravioleta, fluorescência, quimiluminescência, espectrometria de massas ou eletroquímico (BAKER, 1995).

As extremidades do tubo capilar são colocadas em dois reservatórios, um contendo a solução tampão com a janela óptica alinhada com o detector e o outro contendo a amostra. Depois de encher o tubo capilar com a solução tampão, a amostra pode ser introduzida imergindo a extremidade do tubo capilar no recipiente da solução

amostra e elevando o tubo capilar submerso cerca de 30 cm acima do reservatório da solução tampão colocado do lado do detector. Virtualmente todo o trabalho antes de 1988 em CE era executado em instrumentos com esta configuração básica. Apesar de relativamente fáceis de usar, estes primeiros sistemas eram inconvenientes para análise de rotina e muito imprecisos para análise quantitativa (BAKER, 1995).

Um diagrama de um instrumento moderno, o sistema de eletroforese capilar, modelo Capel 105M (Lumex, Rússia), é ilustrado na Figura 1.

Figura 1 – Sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia.

Quando comparados aos primeiros instrumentos desenvolvidos, este instrumento é completamente automatizado, pois oferece o controle computadorizado de todas as operações como a injeção hidrodinâmica da amostra, o uso de um amostrador automático e de um coletor de fração, o controle preciso da temperatura e um sistema de dissipação de calor avançado. A automatização é crítica para CE, pois uma operação repetível é exigida para uma análise quantitativa precisa (BAKER, 1995).

As figuras 2 e 3 mostram o sistema de eletroforese capilar empregado e a janela ótica do sistema de detecção, respectivamente.

Figura 2 – Foto do sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia.

Figura 3 – Cassete utilizado no sistema de eletroforese capilar da Lumex, Rússia modelo Capel 105 M, em destaque a janela de detecção.

1.1.1 Modos de injeção da amostra

Os resultados das análises podem ser diretamente influenciados pelo tipo de injeção realizada na eletroforese capilar. Existem duas maneiras de se introduzir amostras do CE no tubo capilar: injeção eletrocinética (onde um gradiente de potencial é estabelecido ao longo do capilar) ou injeção hidrodinâmica (no qual utiliza-se um gradiente de pressão).

Durante a injeção eletrocinética o potencial é aplicado por um tempo já estipulado anteriormente, sendo a amostra introduzida a partir do resultado da combinação da velocidade eletroosmótica e eletroforética. No método hidrodinâmico a pressão pode ser através de pressurização ou vácuo em um dos reservatórios de solução,

ou por gravidade onde se eleva um dos reservatórios de amostras em relação ao outro e é introduzido por sifonagem. Neste caso o volume da amostra irá depender de vários fatores tais como: tempo de injeção, viscosidade da solução tampão, diferença da pressão estabelecida etc.

Comparando-se os dois tipos de injeção a hidrodinâmica é mais precisa que a eletrocinética, porém um aumento significativo pode ocorrer na zona da amostra resultando um perfil parabólico o qual é característico em casos de fluxos induzidos por pressão (TAVARES, 1996).

1.1.2 Sistemas de detecção

Existem diversos tipos de detectores utilizados em eletroforese capilar. Um dos mais comuns é o espectrofotométrico de absorção no UV/Vis que permitem seleção do comprimento de onda na faixa de 190 a 700 nm (QUEIROZ & JARDIM, 2001). Vários critérios devem ser observados na escolha de um detector adequado para que um experimento tenha êxito, tais como: versatilidade, alta sensibilidade, baixo nível de ruído, vasta linearidade de respostas, linha de base estável, insensibildade ao fluxo e mudanças de temperatura e respostas a todo o tipo de substâncias utilizando um pequeno volume de amostra. Para que não se tenha dúvida em relação aos resultados, procura-se utilizar um detector com uma relação conhecida e reprodutível garantindo assim uma análise mais precisa dos resultados (WESTON & BROWN, 1997).

Basicamente os detectores podem ser classificados em dois tipos: universais e específicos. O modo de funcionamento dos detectores universais é feito através da medição entre a diferença de alguma propriedade do soluto em relação à solução. A desvantagem desse tipo de detector em relação ao específico é apresentar menor sensibilidade e intervalo dinâmico.

No caso dos detectores específicos a medição é realizada através de alguma propriedade específica do soluto, estando incluídos como exemplos os fotodetectores (baseados na absorção do UV/Vis), os espectrômetros de massa, os detectores amperométricos e radiométricos, etc.

A grande vantagem do uso desse tipo de detector ocorre quando a matriz da amostra é complexa e principalmente quando se deseja minimizar algum tipo de interferência do fundo. Além disso é mais sensível do que os detectores universais, fornece intervalos mais amplos de resposta linear e melhor relação sinal/ruído (TAVARES, 1996).

Dentre os diversos tipos de detectores em CE, estão incluídos os de fluorescência, espectrômetro de massa, fluorescência por laser-induzido, condutividade, amperométrico, radiométrico, refratométrico, etc. (BAKER, 1995). Na figura 3 pode-se observar um cassete utilizado no sistema de eletroforese capilar da Lumex, Rússia modelo Capel 105 M.

1.1.3 Modos de separação por eletroforese

Os modos de separação por eletroforese são classificados como: fronteira móvel, zona, isotacoforese e focalização isoelétrica.

Na eletroforese por fronteira móvel, uma quantidade razoável da amostra é colocada em um tubo, preenchido com uma solução tampão. Após a aplicação do campo elétrico, os componentes da amostra migram em determinada direção com uma velocidade característica que depende da mobilidade do componente. A separação completa nunca é atingida, pois apenas os componentes de maior mobilidade podem ser parcialmente purificados, enquanto que as bandas dos outros componentes sofrem diversos graus de sobreposição (TAVARES, 1996).

A eletroforese de zona é também uma técnica de fronteira móvel, pois a amostra é introduzida no meio tamponado, como uma banda de espessura pequena. Quando o campo elétrico é aplicado, cada zona migra de forma independente, com velocidade constante, mas diferenciada em função de sua própria mobilidade. As modalidades da eletroforese em solução livre, gel e micelar pertencem a essa categoria (TAVARES, 1996).

Em isatocoforese, a amostra é inserida entre soluções, o eletrólito líder e o eletrólito terminador. Ambos, cátions e ânions podem ser determinados por esse modo, entretanto em misturas distintas. A Figura 4 ilustra a separação isotacoforética de uma mistura de cátions. Nesse exemplo, o eletrólito líder deve conter um cátion cuja mobilidade é maior que a mobilidade de qualquer componente catiônico da amostra. Por outro lado, o eletrólito terminador deve conter o cátion de menor mobilidade. Quando o campo elétrico é estabelecido, gradientes diferentes de potencial evolvem cada banda, de tal forma que todos os cátions migram com velocidade constante e única. Em regiões onde cátions de menor mobilidade estão presentes, o campo elétrico é mais intenso. Entretanto, estes solutos movem-se com a mesma velocidade que os solutos de maior mobilidade, estes últimos submetidos a campo elétrico mais fraco. Consequentemente, as velocidades das bandas individuais são auto-normalizadas (TAVARES, 1996).

A focalização isoelétrica envolve a separação de solutos anfotéricos em um gradiente de pH. Sob a influência do campo elétrico, um soluto carregado negativamente migra em direção ao anodo. Durante a migração, o soluto atravessa regiões de pH progressivamente menor. Assim, uma fração cada vez maior do maior do soluto torna-se protonada, e dessa forma, a carga elétrica é alterada durante a migração. Naturalmente, a carga total do soluto é nula e sua migração é interrompida. Cada componente da amostra migra para uma região de pH igual ao seu ponto isoelétrico e permanece nessa posição enquanto o campo elétrico estiver atuando (TAVARES, 1996).

Figura 4 – Seqüência de eventos na separação de dois solutos pelos quatro modos da eletroforese. Adaptado de TAVARES,1996.

1.1.4 Terminologia da eletroforese capilar

Existem algumas diferenças significantes entre a nomenclatura usada na cromatografia e na eletroforese capilar. Por exemplo, um termo fundamental na cromatografia é o tempo de retenção. Em eletroforese, em condições ideais quando nada é retido, o termo análogo se torna tempo de migração. O tempo de migração (tm) é o

detecção. Outros termos fundamentais são definidos a seguir, nos quais se incluem a mobilidade eletroforética, µep (cm2/Vs), a velocidade eletroforética, Vep (cm/s), e a força

de campo elétrico, E (V/cm) (TAVARES, 1996). As relações entre estes fatores são mostradas na Equação 1. t m d ep ep

L

V

t

L

E

V

=

=

µ

Várias características importantes podem ser retiradas desta equação:

1) A velocidade eletroforética é calculada dividindo-se o comprimento do tubo capilar até o detector (Ld) pelo tempo de migração, tm.

2) A mobilidade eletroforética é obtida pela divisão da velocidade eletroforética pela força do campo elétrico aplicado. A mobilidade é independente do potencial aplicado e do comprimento do tubo capilar, mas é altamente dependente no tipo de tampão usado, do pH, assim como da temperatura.

3) Dois comprimentos capilares são importantes: O comprimento do tubo capilar para o detector, Ld, e o comprimento total, LT. Enquanto a separação mensurável ocorre no

segmento capilar, Ld, a força de campo elétrico é calculada dividindo o potencial

elétrico pelo comprimento do tubo capilar inteiro, Lt. O comprimento do tubo em

excesso, Lt - Ld, é exigido para fazer a conexão com o reservatório da solução tampão. A Equação 1 só é útil na determinação da mobilidade aparente. Para calcular a mobilidade real, o fenômeno do fluxo electroosmótico deve ser levado em consideração. Para apresentar um eletroferograma reprodutível, o fluxo electroosmótico deve estar cuidadosamente controlado (TAVARES, 1996).

1.1.5 Eletroosmose

Um dos fundamentais processos que dirigem a CE é a eletroosmose. Este fenômeno é uma conseqüência da carga superficial na parede do tubo capilar. Os tubos de sílica fundidos, que são tipicamente usados nas separações eletroforéticas, têm grupos silanóis ionizáveis em contato com a solução tampão contida dentro do tubo capilar. O pI da sílica fundida é aproximadamente 1,5. O grau de ionização é controlado principalmente pelo pH da solução tampão (BAKER, 1995).

E

V

πη

εξ

4

=

onde ∈ é a constante dielétrica, η é a viscosidade do tampão, e ξ é o potencial zeta medido na camada plana próximo da interface líquido-sólido. A parede do tubo capilar carregada negativamente atrai íons positivos do tampão, criando-se assim uma dupla camada elétrica. Quando um potencial é aplicado no tubo capilar, os cátions da porção difusa da camada dupla migram na direção do cátodo, carreando água. O resultado desse processo é um fluxo líquido da solução tampão na direção do elétrodo negativo. Esse fluxo eletroosmótico (EOF) pode ser bastante robusto, com uma velocidade linear ao redor de 2 mm/s em pH = 9 em tampão de borato 20 mM. Para um tubo capilar de 50 µm de diâmetro interno, isto se traduz em uma vazão de cerca de 4 nL/s. Em pH = 3, o EOF é muito menor, cerca de 0,5 nL/s. O potencial zeta é relacionado ao inverso da carga por unidade da área da superfície do tubo capilar, do número de elétrons de valência e da raiz quadrada da concentração do eletrólito. Como isto é uma relação inversa, aumentando-se a concentração do eletrólito diminui-se o EOF. Como será mostrado posteriormente, o fluxo eletroosmótico deve ser controlado ou até suprimido para viabilizar certos modos de eletroforese capilar. Por outro lado, o EOF torna possível uma determinação simultânea de cátions, ânions e espécies neutras em uma única corrida. Em pH neutro ou alcalino, o EOF suficientemente é mais forte que a migração eletroforética fazendo com que todas as espécies migrem para o elétrodo negativo. A ordem de migração processa-se na seguinte ordem: cátions, espécies neutras e ânions (TAVARES, 1996).

O efeito do pH no EOF é ilustrado na Figura 5. Imagine que um sal interno como um peptídeo está sendo separado nas condições descritas na Figura 5. Em pH alto, EOF é grande e o peptídeo está negativamente carregado. Apesar da migração eletroforética do peptídeo para o elétrodo positivo (anodo), o EOF é superior, fazendo com que o peptídeo migre para o elétrodo negativo (cátodo). Em pH baixo, o peptídeo está positivamente carregado e EOF é muito pequeno. Deste modo, a migração eletroforética do peptídeo e do EOF são para o elétrodo negativo. Em tubos capilares não tratados, a maioria dos solutos migra para o elétrodo negativo não importando a carga quando a solução tampão tiver um pH acima de 7,0. Em tampão de pH ácido, a

maioria dos sais internos e cátions também migrarão para o eletrodo negativo (BAKER, 1995).

Figura 5. Efeito do pH no fluxo eletroosmótico. Adaptado de QUEIROZ, 2007.

Para assegurar que um sistema está corretamente controlado, é freqüentemente necessário medir o EOF. Isto é feito injetando-se um soluto neutro e medindo-se o tempo que leva para alcançar o detector. Solutos como o metanol, acetona, e óxido de mesitila são freqüentemente empregados. Na cromatografia eletrocinética micelar (MECC) técnica que será discutida posteriormente, um requisito adicional imposto é que o soluto marcador não se particione na micela. Para técnicas como eletroforese capilar por focalização isoelétrica (CIEF) ou isotacoforese capilar (CITP), o EOF deve ser suprimido. Isto é possível recobrindo-se o tubo capilar com teflon. Aditivos como a metilcelulose também são efetivos na supressão do EOF (BAKER, 1995).

1.1.6 Dinâmica do fluxo, eficiência e resolução

Quando se emprega um sistema pressurizado como na cromatografia líquida, as forças de fricção na interface sólido-líquido nas paredes da coluna provocam uma queda de pressão substancial. Até em sistemas abertos, as forças de fricção, mesmo com vazão baixa, são severas o suficiente para resultar em perfis de fluxo laminar ou parabólico. Como conseqüência do fluxo parabólico, a seção transversal do fluxo, vista na Figura 6, mostra o que ocorre no tubo capilar, o que provoca um fluxo mais alto no meio e próximo à zero na parede de tubo capilar. Este variação no fluxo resulta em um significativo alargamento do pico (BAKER, 1995).

Figure 6. Perfis de fluxos capilares.

Em sistemas eletricamente dirigidos, a força motriz do EOF é uniformemente distribuída ao longo do comprimento inteiro do tubo capilar. Como resultado, não existe queda de pressão e o fluxo é uniforme através do tubo capilar, exceto muito perto da parede onde a velocidade novamente se aproxima de zero (BAKER, 1995).

A eficiência de um sistema pode ser derivada dos princípios fundamentais (TAVARES, 1995).

A velocidade de migração, vep, é simplesmente definida por:

L

V

E

V

=

µ

=

µ

O tempo de migração, tm, é definido como:

V

L

V

L

t

_µ

=

=

Durante a migração pelo tubo capilar, ocorre uma difusão molecular levando a dispersão do pico, σ2:

V

L

D

t

D

_µ

σ

2

2

=

=

onde Dm é o coeficiente de difusão do soluto cm2/s. O número de pratos teóricos é dado

pela expressão seguinte:

2 2

σ

L

N =

Seção transversal de um fluxo eletroosmótico

Substituindo-se a Equação (5) na Equação (6): m ep

D

V

N

2

µ

=

A dispersão do pico, σ2, neste sistema simples é assumida ser uma difusão relacionada com o tempo. A equação (7) indica que macromoléculas de proteínas e DNA, que possuem coeficientes de difusão pequenos, Dm, fornecem um número de

pratos teóricos elevados. Além de com o uso de potenciais elevados promove-se uma maior eficiência e diminui-se o tempo de separação. O limite de potencial aplicado com a tecnologia existente é próximo a 30 kV. O limite prático da força do campo (pode-se usar tubos capilares muito pequenos para gerar uma força de campo alto) é o aquecimento Joule. Esse aquecimento é uma conseqüência da resistência do tampão para seguir o fluxo de corrente. Pode-se estimar o número de pratos teóricos, tomando-se como exemplo a proteína do coração do cavalo, a mioglobina (massa molar = 13.900 g/mol) como ilustração, onde µep = 0.65 x 10-4 cm2/Vs (tampão de bicina/TEA 20 mM,

pH = 8,5) e Dm = 1 x 10-6 cm2/s com 30 KV, obtém-se um número de pratos teóricos

igual a 975.000 (BAKER, 1995).

O conceito de pratos teóricos pode ser melhor compreendido adotando-se o seguinte modelo: em uma coluna cromatográfica contendo finas secções ou pratos, irá ocorrer um equilíbrio do soluto entre a fase móvel e a estacionária. Com o movimento do soluto através da coluna (de um prato teórico a outro), a eficiência vai aumentando, com isso, quanto maior for o número de pratos teóricos maior será a eficiência da coluna (Weston, Brown, 1997).

Apesar da limitação difusional, a CE é ainda útil para moléculas pequenas porque nas separações µep é uma função da relação carga/íon. As moléculas pequenas

tendem a ser mais móveis. Por exemplo, a mobilidade do sulfato de quinina é 4 x 10-4 cm2/Vs. Apesar do coeficiente de difusão deste analito ser alto, Dm = 0.7 x 10-5 cm2/s, o

número de pratos teóricos é igual a 857.000 quando o potencial aplicado é de 15 KV (BAKER, 1995).

A resolução, Rs, entre duas espécies é dada pela expressão:

N

R

µ

µ

∆

=

4

1

onde ∆µep é a diferença em mobilidade eletroforética entre as duas espécies, µ_epé a

mobilidade eletroforética média das duas espécies e N é o número de pratos teóricos. Substituindo-se o número de pratos teóricos na Equação (8):

(

)

D

V

R

µ

µ

177

,

0

=

A Equação (9) indica que se pode melhorar a resolução aumentando-se o potencial aplicado. Para duplicar a resolução, o potencial aplicado deve ser quadruplicado. A chave para se melhorar a resolução é aumentar a ∆µep. O controle da mobilidade é

realizado pela seleção do tipo adequado de eletroforese capilar concomitante com a seleção do tampão mais conveniente (TAVARES, 1996).

1.1.7 O diâmetro capilar e o aquecimento Joule

A produção de calor em CE é o resultado inevitável da aplicação de um campo de força alto. Dois problemas importantes surgem da produção de calor: gradientes de temperatura através do tubo capilar e mudanças de temperatura com o tempo devido à dissipação de calor ineficaz. A taxa de geração de calor em um tubo capilar pode ser expressa como:

LA

iV

dt

dH =

onde L é o comprimento do tubo capilar e A é área da seção transversal. Como i = V/R e R = L/kA onde k é a condutividade térmica.

2 2

L

kV

dt

dH =

A quantidade de calor gerado é proporcional ao quadrado da força do campo elétrico. Assim, a diminuição do potencial aplicado e o aumento do comprimento do tubo capilar provocam um efeito dramático no calor gerado. O uso de solução tampão com baixa condutividade é útil, porém o carregamento da amostra pode ser prejudicado. Gradientes de temperatura dentro do tubo capilar são conseqüência da dissipação de calor. Como o calor é dissipado por difusão, a temperatura no centro é superior à das paredes do tubo capilar (BAKER, 1995).

Figura 7 – Seção transversal do gradiente de temperatura e o perfil da velocidade eletroforética.

Como a viscosidade é mais baixa em temperaturas mais altas, isto ocasiona um aumento no EOF, assim como na mobilidade eletroforética. A mobilidade eletroforética, para a maioria dos íons, aumenta cerca de 2% por grau Kelvin. A resultante deste fato é um perfil de fluxo que se assemelha a um fluxo hidrodinâmico, como o conseqüente alargamento do pico. Trabalhando-se com tubos capilares de diâmetro pequeno melhora-se a situação por duas razões: a corrente que passa pelo tubo capilar é reduzida pelo quadrado do raio do tubo capilar e o calor é mais prontamente dissipado através do percurso radial mais estreito (BAKER, 1995). O gradiente térmico resultante é proporcional ao quadrado do diâmetro do tubo capilar, o qual pode ser obtido da seguinte equação abaixo:

K

Wr

T

4

24

,

0

=

∆

onde W é a potência, r é o raio do tubo capilar, e K, a condutividade térmica.

O segundo problema é dissipação de calor ineficaz. Se calor não é removido em uma taxa equiparada à sua produção, um gradual aumento de temperatura irá ocorrer até que o equilíbrio seja alcançado. Dependendo das condições específicas experimentais, uma flutuação no tempo de migração resultará em variações no EOF e na velocidade eletroforética. Os tubos capilares, com diâmetro estreito, ajudam na dissipação de calor, mas sistemas de refrigeração efetivos são necessários. Líquidos são usados na remoção de calor e no controle de temperatura do tubo capilar. O diâmetro interno do tubo capilar varia de 20-200 µm. Do ponto de vista de resolução, o tubo capilar com menor diâmetro interno produz a melhor a separação, porém reduz drasticamente o limite de detecção em virtude da pequena quantidade de amostra introduzida e do estreito caminho ótico (TAVARES, 1996).

Os tubos capilares estreitos são também os mais propensos a entupir. Como as soluções são filtradas com filtros de porosidade pequena (<0,45 µm), o entupimento

raramente ocorre na faixa mencionada. Quando a filtração for impraticável para amostras com partículas em suspensão, recomenda-se fazer uma centrifugação com 6000 rpm por 5 minutos (BAKER, 1995).

1.1.8 Efeito do potencial elétrico e da temperatura

As velocidades electroosmótica e eletroforética são diretamente proporcionais à força do campo, portanto o uso de um potencial mais alto permite uma redução nos tempo de separação. A teoria prediz que tempos de separação pequenos darão as eficiências mais altas, pois a difusão é a característica mais importante que contribui para o alargamento dos picos. O fator limitante é o aquecimento Joule. Experimentalmente, o potencial elétrico mais favorável é determinado fazendo-se corridas com potenciais crescentes até que a deterioração na resolução seja observada. As expressões da mobilidade eletroforética (Eq. 13) e do fluxo electroosmótico (eq. 2) contêm um termo de viscosidade no denominador. A viscosidade é uma função de temperatura; portanto torna-se necessário um controle eficiente da temperatura. Com o aumento da temperatura, a viscosidade diminui; deste modo a mobilidade eletroforética aumenta também. Algumas soluções tampão, como Tris tem o pH fortemente dependente da temperatura. A maioria de separações são realizadas à 25°C (temperatura ambiente). Com um líquido refrigerante no tubo capilar é possível manter excelente controle de temperatura, até com solução tampão de concentração alta e tubos capilares com diâmetros maiores. Sempre que o controle de temperatura começa a se tornar um problema, a estratégia habitual é para usar um tubo capilar com diâmetro menor (menor corrente reduz o aquecimento produzido) ou um tubo capilar mais longo (maior área de superfície para dissipar o calor gerado). O controle de temperatura é a razão principal para usar uma concentração baixa (por exemplo, 20 mM) da solução tampão ou trabalhar em temperaturas elevadas (BAKER, 1995).

1.1.9 Modos de eletroforese capilar

A eletroforese capilar (CE) inclui uma família de técnicas que têm operações consideravelmente diferentes e separações características. Nesta revisão, somente serão discutidas as seguintes técnicas:

• Eletroforese capilar de zona (CZE)

1.1.10 Eletroforese capilar de zona

A eletroforese capilar de zona (CZE), também conhecida como eletroforese capilar em solução livre é a forma mais simples de CE. O mecanismo de separação é baseado nas diferenças da razão de massa/carga. A homogeneidade da solução tampão e a força de campo constante ao longo do comprimento do tubo capilar são fundamentais para a CZE (BAKER, 1995).

Após a injeção e a aplicação do potencial elétrico, os componentes da mistura se separam em zonas discretas como mostradas na Figura 8.

Figura 8 – Eletroforese capilar por zona

O parâmetro fundamental, a mobilidade eletroforética, µep, pode ser obtida da

teoria de Debye-Hückel-Henry

R

q

πη

µ

6

=

onde q é a carga líquida, R é o raio de Stokes e η é a viscosidade. A carga líquida é normalmente dependente do pH. Por exemplo, dentro do faixa de pH de 4-10, a carga líquida do sódio é constante, assim como a sua mobilidade. Outras espécies como o acetato ou o glutamato estão negativamente carregados dentro daquela faixa de pH e deste modo têm mobilidades negativas (eles migram para o eletrodo positivo). Em pH alcalino, sua migração ainda será para o eletrodo negativo por causa do EOF. “sais internos” de aminoácidos, proteínas e peptídeos exibem cargas inversas ao do seu pI e, igualmente, migram na direção da mobilidade eletroforética. As separações de moléculas grandes e pequenas podem ser realizadas por CZE. Até moléculas pequenas, onde as diferenças na razão carga/massa não são grandes, podem ainda ser separáveis (BAKER, 1995).

1.1.10.1 Tubos capilares.

Os tubos capilares com um diâmetro interno de 25-75 µm são normalmente empregados. Sílica fundida é o material de escolha devido à sua transparência no UV, durabilidade (quando recoberto com poliimida) e o potencial zeta. Um tubo capilar novo deve ser condicionado antes de poder ser usado. O pré-tratamento do tubo capilar consiste na passagem de uma solução de NaOH 0,1 mol/L por 10 minutos, 5 minutos com a água e 10 minutos com a solução tampão de corrida. Este procedimento de condicionamento é importante para assegurar que a superfície do tubo capilar esteja completamente e uniformemente carregada. Para alguns métodos é necessário regenerar a superfície do tubo capilar entre corridas com a solução de NaOH 0,1 mol/L, e em casos extremos, com uma solução de NaOH 1 M. O procedimento de regeneração é freqüentemente necessário se ocorre mudanças nos tempos de migração de uma corrida para outra. Isto é mais comum quando se usa solução tampão na faixa de pH = 2-6. A regeneração é raramente necessária quando se trabalha em pH>9. Deve-se fazer esse procedimento de descontaminação diariamente no início dos experimentos a menos que a amostra ou os componentes de matriz estejam aderindo nas paredes do tubo capilar. Enquanto isso não é muito sério com tubos capilares de sílica, prejuízos podem ser significativos quando se faz a descontaminação de tubos capilares quimicamente modificados (BAKER, 1995).

O procedimento seguinte maximizará as chances de sucesso ao armazenar um tubo capilar.

1) Enxagüar o tubo capilar com solução de NaOH 0,1 mol/L por alguns minutos. (Não faça esse tratamento com tubos capilares quimicamente modificados) 2) Enxagüar por 5 minutos com a água destilada e deionizada.

3) Colocar um frasco vazio sem tampa, na saída e introduza N2 pelo tubo capilar por 5

minutos.

4) Remover o cartucho capilar do instrumento (BAKER, 1995).

1.1.10.2 Efeito do pH.

Em um pH elevado onde o EOF é significativo, a ordem de migração das espécies é dada por cátions, espécies neutras e ânions. Nenhumas das espécies neutras serão separadas, pois a carga líquida é zero. Os ânions ainda migrarão em direção ao cátodo porque o EOF é maior que a migração eletroforética. Em pH mais baixo, onde o EOF é muito reduzido, os cátions e ânions podem ser medidos, embora não seja

possível em uma única corrida. Para medir ânions, o ânodo deve estar além da janela de detecção. Igualmente, para medir os cátions, o cátodo deve estar além da janela de detecção. A configuração adequada é obtida simplesmente invertendo a polaridade dos elétrodos. O impacto do pH no analito também pode ser significativo, particularmente para sais internos complexos como os peptídeos. A carga nestas combinações é dependente do pH e a seletividade da separação é afetada substancialmente pelo pH. Como uma regra geral, selecione um pH que seja pelo menos duas unidades acima do pKa do analito para assegurar uma ionização completa. Em pH altamente alcalino, o

EOF pode ser tão rápido que separações incompletas podem ocorrer. Certas separações de proteína podem ocorrer em pH ácido. Nessas condições, a parede do tubo capilar está descarregada. As proteínas nessas condições estarão positivamente carregadas e não irâo interagir eletrostaticamente com a parede do tubo capilar, embora uma interação hidrofóbica possa ainda acontecer. A limitação desta técnica é a precipitação da proteína. No pI da proteína, a simetria do pico tende a ser pobre (BAKER, 1995).

1.1.10.3 Solução tampão.

Quando a separação envolve solutos com caráter ácido-base, a mobilidade eletroforética do soluto depende do pH do eletrólito. Nesse caso, emprega-se o termo mobilidade efetiva a qual incorpora o produto das mobilidades eletroforéticas das espécies em equilíbrio e a distribuição das concentrações relativas de cada espécie no pH considerado (TAVARES, 1997).

Uma variedade grande de soluções tampão pode ser empregada em CZE. Um tampão é mais efetivo na faixa de uma ou duas unidades de pH do seu pKa. Por

exemplo, o fosfato é usado ao redor pH = 2,5 e pH = 7, e borato ao redor pH = 9,O. A concentração de tampão típica é de 50-100 mM. Soluções tamponadas de sais internos como bicina, tricina, CAPS, MES e Tris são comuns na separação de proteínas e peptídeos. A vantagem do tampão de sal interno é sua condutividade baixa quando este for empregado em torno do pI. A vantagem nisso é a baixa corrente líquida e a redução do aquecimento Joule. Em certas soluções tamponadas, particularmente aquelas direcionadas para separações de proteína, sais como cloreto, fosfato, e sulfato são adicionados ao meio do tampão. Esses sais adicionados afetam a conformação da proteína, que por sua vez impactam na separação. A concentração do sal também pressiona o EOF devido em parte ao rompimento da dupla camada elétrica nas camadas

próximas das paredes do tubo capilar. Uma limitação importante na quantidade de sal adicionado na preparação do tampão é o aquecimento Joule (BAKER, 1995).

Tabela 1. Soluções tamponadas para eletroforese capilar (TAVARES, 1997).

Solução tampão Faixa de pH útil

Fosfato 1,14 – 3,14

Acetato 3,76 – 5,76

Fosfato 6,20 – 8,20

Borato 8,14 – 10,14

Soluções tamponadas de sais internos

MES 5,15 – 7,15

PIPES 5,80 – 7,80

HEPES 6,55 – 8,55

TRICINA 7,15 – 9,15

TRIS 7,30 – 9,30

Vários aditivos de solução tampão podem ser empregados para mudar a seletividade da separação. O uso de aditivos é indicado em quatro situações: para alterar a mobilidade do soluto, modificar o fluxo eletroosmótico, solubilizar os solutos ou componentes da matriz da amostra e reduzir a interação de certos solutos com a parede do capilar, ou minimizar a adsorção. Ou seja, os aditivos de tampão alteram, entre outras coisas, as mobilidades eletroforéticas. Em outras palavras, duas combinações que têm as mobilidades idênticas em um sistema de tampão simples podem ser diferenciadas com aditivos. Outros aditivos, como agentes tensoativos ou ciclodextrinas, formam um ambiente heterogêneo que define uma nova classe de CE que será visto posteriormente. Todas as soluções tamponadas devem ser filtradas através de uma membrana filtrante de 0,45 µm antes do uso (BAKER, 1995).

Tabela 2 – Aditivos de eletrólito usados em eletroforese capilar (BAKER, 1995).

Aditivo Função e/ou Efeito

Ácidos sulfônicos Agente formador de pares iônicos e modificadores da carga superficial

Aminas Bloqueiam os sítios ativos na superfície do capilar, recobrindo os grupos silanóis livres. Reduzem adsorção e assimetria do pico.

Anfólitos Reduzem a interação soluto-capilar, melhoram a resolução e simetria do pico.

Ciclodextrinas Usados nas separações quirais e como complexantes auxiliares na separação de espécies neutras.

Éter de coroa Usados nas separações quirais e como complexantes auxiliares na separação de íons metálicos.

Glicóis Reduzem a interação soluto-capilar, auxiliam na solubilidade de solutos orgânicos e reduzem o EOF.

Íons de metais de transição

Modificam a mobilidade de certos solutos e afetam a resolução.

Polímeros de celulose Agentes modificadores de EOF

Sais inorgânicos Reduzem o EOF, alteram a conformação da proteína e previnem a adsorção soluto-capilar.

Solventes orgânicos Aumentam a solubilidade de solutos orgânicos. Reduzem a interação soluto-capilar. Agentes modificadores do EOF. Agentes tensoativos

catiônicos

Revertem a carga da parede do tubo capilar. Revertem o fluxo EOF.

Uréia Solubiliza proteína e desnatura oligonucleotídeos

1.1.10.4 Ligação de espécies químicas na parede do tubo capilar

Um problema na CZE é de natureza eletrostática, o qual permite a ligação de espécies catiônicas nas paredes do tubo capilar. Este efeito é observado com proteínas quando se trabalha em um tampão que tem um pH abaixo do pKa do analito. Esse

problema pode ser superado trabalhando-se com, pelo menos duas pH unidades acima do pKa da proteína, mas em alguns casos, o pH mais alto pode não pode ser favorável

para a separação. Apesar destes problemas, proteínas, especialmente aquelas de tamanho semelhante, podem ser melhor separadas em solução livre. O uso de tubos capilares quimicamente modificados é um de vários modos que podem servir para reduzir a ligação nas paredes do tubo capilar (BAKER, 1995).

1.1.10.5 Revestimento do capilar.

A redução ou eliminação de EOF pode ser útil nas separações eletroforéticas. No entanto, o fato mais interessante é a habilidade para eliminar a adsorção do soluto. Uma grande variedade de revestimentos é possível, inclusive com o uso de algumas fases usadas na cromatografia em fase gasosa capilar. O uso de camadas hidrofílicas tem grande utilidade na supressão da adsorção de substâncias hidrofóbicas. Ligações eletrostáticas também podem ser suprimidas. O revestimento hidrofóbico e o uso de tensoativos não-iônicos como os aditivos de tampão surgem também como iniciativas promissoras. Muitas companhias estão começando a introduzir tubos capilares de fase ligada. Esses tubos capilares devem estender a faixa de substâncias capazes de serem separadas por CZE (BAKER, 1995).

1.1.10.6 Aplicações da CZE

CZE é muito útil na separação de proteínas e peptídeos onde a resolução completa pode ser freqüentemente obtida para analitos que diferem por um aminoácido substituinte. Outras aplicações, onde o CZE pode ser útil inclui a determinação de ânions inorgânicos e cátions como aqueles tipicamente separados por cromatografia de troca iônica. Moléculas pequenas de insumos e produtos farmacêuticos podem ser freqüentemente separadas desde que elas possuam cargas. Na maioria dos casos, a técnica de cromatografia eletrocinética micelar dá resultados superiores para espécies carregadas como também para moléculas pequenas neutras. Este modo de CE será discutido mais tarde. Um resumo de aplicações, inclusive com indicativo da solução tampão usada, é dado na Tabela 3.

Tabela 3 – Aplicações da eletroforese capilar por zona (CZE)

Analito Tampão Referência

Dipeptídeos/proteínas H3PO4 150 mM, pH = 1,5 MCCORMICK (1988)

β – Lactoglobulinas Borato 50 mM, KCl 50 mM

DONALD &. JORGENSON (1988)

Endorfinas Citrato 20 mM, pH = 2,5 GROSSMAN, COLBURN, LAUER et al. (1989)

Ribonucleases CAPS 20 mM, pH = 11,0 GROSSMAN, COLBURN, LAUER et al. (1989) Hormônios de crescimento humano Fosfato 100 mM, pH = 2,6 e pH = 8,0 FRENS,WU E HANCOCK, (1989)

Ânions Salicilato 25 mM, pH = 4 GROSS & YEUNG (1989) Fármacos (paracetamol et

all.)

Borato 10 mM, pH = 9 AZHAGVUEL & SEKAR (2007)

Fármacos (paracetamol et all.)

Borato 40 mM SDS 0,5 mM, pH = 6.2

MARÍN & BARBAS (2004)

Ânions BTA 3 mM, TEPA 1,5

mM e Tris 15 mM, pH = 8,4

YING & KAP (2003)

1.1.11 Cromatografia eletrocinética micelar (MECC ou MEKC)

A limitação primária da eletroforese capilar em solução livre é a impossibilidade de separar espécies neutras a menos que existam diferenças significativas de massa molar. Geralmente, as espécies neutras migram no capilar por ação exclusiva do EOF, não havendo discriminação espacial e/ou temporal dos solutos na chegada ao detector (TAVARES, 1997). No entanto, Terabe e colaboradores introduziram uma versão modificada da eletroforese capilar, a eletrocromatografia micelar ou cromatografia eletrocinética micelar (MECC). Nesta técnica, adicionam-se agentes tensoativos ao eletrólito de corrida, em condições adequadas para a formação de micelas, formando assim um sistema cromatográfico de duas fases. O eletrólito representa a fase primária, a qual é transportada eletroosmoticamente sob ação do campo elétrico, enquanto que as micelas representam a fase secundária, ou pseudo-estacionária, a qual é transportada por uma combinação de eletroforese e eletroosmose. A partição diferenciada de solutos

neutros entre estas duas fases é responsável pela seletividade da separação. A adição de um complexante auxiliar minimiza os problemas de co-eluição em MECC (TAVARES, 1997; TERABE et all., 1984).

1.1.11.1 Micelas.

As micelas são agregados anfifílicos (compostos que se caracterizam por possuir em sua estrutura uma região polar iônica ou não, e uma região apolar a qual pode ser representada por uma ou mais cadeias hidrocarbônicas), conhecidos como agentes tensoativos. Essas substâncias são moléculas de cadeia longa (10 – 50 unidades de carbono) e se caracterizam por ter uma cauda hidrofóbica longa e um grupo hidrófilo na cabeça. As micelas normais são formadas em solução aquosa com a cauda hidrofóbica, com a cauda apontando para dentro e a cabeça hidrófila apontando para fora da solução aquosa. Um desenho esquemático é mostrado na Figura 9. As micelas são formadas como uma conseqüência do efeito hidrofóbico, isto é, elas se formam para reduzir a energia livre do sistema. A cauda hidrofóbica do tensoativo não pode ser solvatada em solução aquosa. Acima da concentração do tensoativo conhecida como concentração micelar crítica (CMC), o agregado está completamente formado. Mudanças físicas na tensão da superfície, viscosidade e na capacidade de espalhamento de luz acompanham a formação da micela. Micelas reversas, que se formam em solventes orgânicos, ainda não foram estudadas em MECC (BAKER, 1995).