TÍTULO: RESPOSTA INFLAMATÓRIA INDUZIDA PELA SALIVA DE AEDES AEGYPTI
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): THAMY CAROLINE DE SOUZA SILVA
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): ANDERSON DE SÁ NUNES
1. RESUMO
Durante a hematofagia, fêmeas de Aedes aegypti inoculam saliva na pele de seus hospedeiros vertebrados, modulando suas funções imunes e facilitando a transmissão de patógenos. Além disso, diversos patógenos co-evoluíram com seus vetores de forma a explorar essas atividades e já foi demonstrado que a saliva de mosquitos tem a capacidade de promover aumento da infectividade dos microorganismos que transmitem. Avaliamos o perfil migratório de células induzido por diferentes doses de extrato de glândula salivar (EGS) de A. aegypti, inoculadas intraperitonealmente. Nossos resultados mostraram que houve recrutamento celular para a cavidade peritoneal dos camundongos de maneira dose dependente, com predominância de células mononucleares e neutrófilos. Posteriormente comparamos a peritonite induzida por EGS de A. aegypti com aquela provocada pelo tioglicolato, um potente estímulo inflamatório, e avaliamos os resultados por citometria de fluxo. Observamos diferenças no infiltrado inflamatório induzidos por esses dois estímulos. Enquanto o EGS induz recrutamento de populações de linfócitos T, linfócitos B e neutrófilos, o tioglicolato induziu o recrutamento de macrófagos, linfócitos T e grande número de neutrófilos.
2. INTRODUÇÃO
Mosquitos são os vetores de patógenos humanos mais importantes, transmitindo um amplo espectro de doenças infecciosas, e o mosquito Aedes
aegypti, está entre as espécies mais relevantes, sendo o vetor de doenças como a
febre amarela, a febre Chikungunya e a dengue. Durante o repasto sanguíneo, a saliva de fêmeas de Aedes aegypti é inoculada na pele de seu hospedeiro. Esta saliva contém uma grande variedade de componentes com atividades hemostáticas e imunomoduladoras (FRANCISCHETTI et al., 2009; SÁ-NUNES & OLIVEIRA, 2010). A inserção da probóscide já é capaz de causar uma pequena lesão no momento da picada, o que gera uma reação inflamatória. E trabalhos clássicos demonstraram que a secreção salivar é responsável por respostas inflamatórias e alérgicas no hospedeiro e antígenos da glândula salivar estão envolvidos na elicitação de reações imediatas e tardias na pele causadas pelas picadas dos mosquitos (HECHT, 1928; MCKIEL, 1959). O recrutamento celular envolvido na picada do mosquito, assim como em qualquer resposta inflamatória, é um evento
vital para o desenvolvimento da resposta imunológica do hospedeiro. O número e os tipos celulares presentes na imunidade inata influenciam o desenvolvimento da resposta imune adquirida e consequentemente, em futuras respostas imunes. Para o combate dos patógenos transmitidos pelos vetores é importante o entendimento dos mecanismos de ação de sua saliva sobre a imunidade dos hospedeiros.
A imunidade do hospedeiro pode, aparentemente, afetar a capacidade dos mosquitos de se alimentar e/ou de se reproduzir, como foi comprovado pela imunização de coelhos com o extrato total de A. aegypti, que causou uma redução de 24 a 31% na fecundidade das fêmeas que se alimentaram nesses coelhos (SUTHERLAND, 1974). Sendo assim é de se esperar que os vetores tenham desenvolvido moléculas imunomoduladoras em sua saliva durante a evolução da hematofagia e diversos patógenos co-evoluiram de forma a explorar essas atividades.
3.OBJETIVOS
Avaliar o perfil de migração celular induzido por diferentes doses de extrato de glândula salivar (EGS) de fêmeas de A. aegypti para a cavidade peritoneal de camundongos.
4. METODOLOGIA
Glândulas salivares de fêmeas de A. aegypti foram dissecadas em salina e processadas. O extrato de glândula salivar (EGS) foi preparado, teve sua concentração proteica determinada e foi armazenado em alíquotas a -80° C até o momento de uso. Camundongos fêmeas da linhagem BALB/c foram divididos em grupos de 5-6 animais. O grupo controle, chamado “grupo PBS”, recebeu intraperitonealmente (i.p.) 0,5 mL de PBS somente. Outros grupos de animais foram inoculados i.p. com diversas doses de EGS de A. aegypti diluídos em 0,5 mL de PBS. Um último grupo de animais foi inoculado i.p. com 1 mL de solução de tioglicolato 3%. Após 12 h, o lavado da cavidade peritoneal (LCP) foi coletado injetando-se 3 mL de PBS/citrato de sódio (0,38%) gelado, seguido de uma massagem suave no local e da recuperação do máximo volume possível do LCP contendo os leucócitos do exsudato. As células foram ressuspendidas em 1 mL de PBS/citrato de sódio. A contagem total de células por cavidade foi feita em câmara
de Neubauer diluindo-se 10 µL da amostra em 190 µL de solução de Turk (diluição 1:20). A contagem diferencial das células foi feita pela confecção de lâminas em citocentrífuga, coradas com corante hematológico e analisadas em microscopia óptica. Em alguns casos diferenciação das células mononucleares retiradas da cavidade peritoneal foi feita por citometria de fluxo (FACS), avaliando-se a expressão dos marcadores de superfície CD3, CD19 e F4/80. Para a marcação das células obtidas no lavado da cavidade peritoneal com os anticorpos CD3, anti-CD19 e anti-F4/80, as células foram centrifugadas, ressuspendidas em tampão de FACS (PBS contendo 1% de soro fetal bovino) e contadas. Alíquotas contendo o mesmo número de células de cada grupo foram transferidas para placas de 96 poços de fundo arredondado e incubadas por 15 minutos a 4º C com anticorpo anti-CD16/CD32 (diluição final 1:1000) para bloqueio dos receptores Fc presentes em fagócitos. A seguir, foram adicionados anticorpos para os marcadores já descritos anteriormente, conjugados com fluorocromos e em diluições apropriadas, seguido de uma nova incubação por 30 min. a 4º C, protegida da luz. Após lavagem, as células foram transferidas para tubos de polipropileno de 12 x 75 mm e as amostras foram adquiridas no citômetro FACSCalibur. O número absoluto de cada tipo celular identificado foi calculado pela multiplicação de sua respectiva porcentagem com o número total de células. A análise estatística das diferenças entre as médias dos grupos experimentais foi feita utilizando-se análise de variância (ANOVA) seguido do pós-teste Tukey, com significância mínima estabelecida em P<0,05.
5. DESENVOLVIMENTO
Como mencionado anteriormente, é de se esperar que os vetores tenham desenvolvido moléculas imunomoduladoras em sua saliva durante a evolução, o que acaba trazendo um benefício para os patógenos na hora de infectar seus hospedeiros e causar doenças (DE MOURAet al., 2007; EDWARDS et al., 1998; LIMESAND et al., 2000; TITUS; RIBEIRO, 1988). De fato, foi comprovado que o EGS de A. aegypti inibe a proliferação de linfócitos de camundongo in vitro induzida por concanavalina A (CROSSet al., 1994; WASSERMAN et al., 2004) e por LPS (WASSERMAN et al., 2004). Também foi demonstrado que a imunidade contra componentes da saliva de diferentes espécies de mosquito é capaz de reduzir a
transmissão das doenças causadas pelos mesmos (DONOVANet al., 2007; GOMES
et al., 2008; KAMHAWI et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2008).
Resolvemos reavaliar o influxo de células para a cavidade peritoneal induzido por diferentes doses de EGS e também comparar a inflamação induzida pelo EGS com aquela induzida pelo tioglicolado, um estímulo inflamatório clássico e utilizado em diversos trabalhos da literatura até os dias de hoje (ARGYRIS, 1968; ASHERSON;ZEMBALA, 1970; STEFFENSet al., 2005; SIet al., 2010; MONTEIROet
al., 2011). Analisamos as amostras por citometria de fluxo e assim refinamos nossas
análises das populações envolvidas na migração celular induzidas por EGS e tioglicolato.
6. RESULTADOS
A Figura 1 mostra que e EGS de A. aegypti induziu migração de células totais para a cavidade peritoneal de maneira dose-dependente. Observamos aumento no número de células estatisticamente significativo quando comparado ao grupo PBS (p ≤ 0,001) somente no grupo inoculado com a dose de 10 µg.
Células totais PBS µg EGS 1 µg EGS 2,5 g µ EGS 5 µg EGS 10 0 100 200 300 400 500 600 * C é lu la s / C a v id a d e ( x 1 0 4)
Figura 1. Migração de células totais para a cavidade peritoneal de camundongos BALB/c. Os animais
foram inoculados com PBS somente ou com diversas doses de EGS de A. aegypti (indicadas na figura). Após 12 h, o LCP foi coletado e as células foram contadas conforme descrito no item 4. (* p ≤ 0,05 versus grupo PBS).
A contagem diferencial realizada nas lâminas desse experimento mostra que o infiltrado induzido por EGS consistiu de células mononucleares (Figura 2A) e de neutrófilos (Figura 2B). Poucos eosinófilos (Figura 2C) e mastócitos (Figura 2D)
estiveram presentes na cavidade peritoneal de animais inoculados com PBS ou com as diferentes doses de EGS de A. aegypti.
Mononucleares PBS µg EGS 1 µg EGS 2,5 g µ EGS 5 µg EGS 10 0 100 200 300 400 500 * C é lu la s / C a v id a d e ( x 1 0 4) Neutrófilos PBS µg EGS 1 µg EGS 2,5 g µ EGS 5 µg EGS 10 0 50 100 150 200 C é lu la s / C a v id a d e ( x 1 0 4) Eosinófilos PBS µg EGS 1 µg EGS 2,5 g µ EGS 5 µg EGS 10 0 50 100 150 200 C é lu la s / C a v id a d e ( x 1 0 4) Mastócitos PBS µg EGS 1 µg EGS 2,5 g µ EGS 5 µg EGS 10 0 50 100 150 200 C é lu la s / C a v id a d e ( x 1 0 4)
A
B
D
C
Figura 2. Migração de células mononucleares (A), neutrófilos (B), mastócitos (C) e eosinófilos (D)
para a cavidade peritoneal de camundongos BALB/c. Os animais foram inoculados com PBS somente ou com diversas doses de EGS de A. aegypti (indicadas na figura). Após 12 h, o LCP foi coletado e as células foram contadas conforme descrito no ítem4. (* p ≤ 0,05 versus grupo PBS).
O EGS induziu aumento de 63% na população de células totais no peritôneo, enquanto o tioglicolato induz aumento de quase 300%, comparado ao grupo PBS (p ≤ 0,001 – Figura 3A). A população de macrófagos (células F4/80+) foi
numericamente semelhante entre os grupos PBS e EGS, mas apresentou-se aumentada no grupo inoculado com tioglicolato (p ≤ 0,001 – Figura 3B). Linfócitos T (células CD3+) estiveram significativamente aumentados tanto no grupo EGS quanto
no grupo tioglicolato, quanto comparados com o grupo PBS (p ≤ 0,01 – Figura 3C), enquanto linfócitos B (células CD19+) aumentaram somente no grupo EGS
(p ≤ 0,01), permanecendo semelhantes entre o grupo PBS e tioglicolato (Figura 3D). O recrutamento de eosinófilos (contados em lâminas de citocentrífuga) ocorreu
somente no grupo tioglicolato (p ≤ 0,05), enquanto nos grupos PBS e EGS a presença dessas células foi semelhante e quase indetectável (Figura 3E). E finalmente, apesar do aumento de mais de 700% nos neutrófilos do grupo EGS em comparação ao grupo controle (também contados em lâminas de citocentrífuga), essa diferença não foi estatisticamente significativa, provavelmente pela variação entre os animais experimentais. Esse aumento foi de mais de 4000% no grupo tioglicolato em comparação com o grupo controle (p ≤ 0,001 – Figura 3F).
Células totais PBS µg EGS 10 Tiog licol ato 0 500 1000 1500 2000 * # C él u la s / C av id ad e (x 10 4) Linfócitos T PBS µg EGS 10 Tiog licol ato 0 20 40 60 80 100 * * C él u la s / C av id ad e (x 10 4) Linfócitos B PBS µg EGS 10 Tiog licol ato 0 200 400 600 800 1000 * # C él u la s / C av id ad e (x 10 4) Macrófagos PBS µg EGS 10 Tiog licol ato 0 200 400 600 800 1000 * # C él u la s / C av id ad e (x 10 4) Neutrófilos PBS µg EGS 10 Tiog licol ato 0 200 400 600 800 1000 * # C él u la s / C av id ad e (x 10 4) Eosinófilos PBS EGS 10 m g Tiog licol ato 0 200 400 600 800 1000 * # C él u la s / C av id ad e (x 10 4)
A
B
C
D
E
F
Figura 3. Migração de células totais (A), macrófagos (células F4/80+ - B), linfócitos T (células CD3+ -
C), linfócitos B (células CD19+ - D), eosinófilos (E) e neutrófilos (F) para a cavidade peritoneal de
camundongos BALB/c. Os animais foram inoculados com PBS somente, 10 µg de EGS de A. aegypti
e com tioglicolato 3%. Após 12 h, o LCP foi coletado e as células foram contadas conforme descrito
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os dados apresentados nesse estudo de uma forma geral indicam que o EGS de Aedes aegypti induz recrutamento celular, principalmente de células mononucleares e neutrófilos, para a cavidade peritoneal de camundongos BALB/c.
Podemos concluir também que a inflamação causada pelo EGS de A.
aegypti é bem menos robusta do que a induzida por tioglicolato, ao mesmo tempo
em que é composta por tipos celulares distintos.
8. FONTES CONSULTADAS
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