UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
ISADORA VITTI VIEIRA BORGES
APLICAÇÃO DE MULTILOCUS SEQUENCE ANALYSIS (MLSA) PARA IDENTIFICAÇÃO DE LINHAGENS DE Chromobacterium sp.
“APLLICATION OF MULTILOCUS SEQUENCE ANALYSIS (MLSA) FOR LINEAGES IDENTIFICATION OF Chromobacterium sp.”
CAMPINAS 2018
ISADORA VITTI VIEIRA BORGES
“APLICAÇÃO DE MULTILOCUS SEQUENCE ANALYSIS (MLSA) PARA IDENTIFICAÇÃO DE LINHAGENS DE Chromobacterium sp.” “APLLICATION OF MULTILOCUS SEQUENCE ANALYSIS (MLSA) FOR
LINEAGES IDENTIFICATION OF Chromobacterium sp.”
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na área de Microbiologia.
Dissertation presented to the Biology Institute of the University of Campinas in partial fulfill of the requirements for the Degree of Master in Genetics and Molecular Biology, Microbiology area.
Orientadora: Fabiana Fantinatti Garboggini
CAMPINAS 2018 ESTE ARQUIVO DIGITAL
CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR ISADORA VITTI VIEIRA BORGES E ORIENTADA POR FABIANA FANTINATTI GARBOGGINI
COMISSÃO EXAMINADORA
Drª. Fabiana Fantinatti Garboggini (Orientadora)
Prof. Drª. Suzan Pantaroto de Vasconcellos
Prof. Drª. Suzete Aparecida Lanza Destéfano
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
“O que faz andar a estrada? É o sonho. Enquanto a gente sonhar a estrada permanecerá viva. É para isso que servem os caminhos, para nos fazerem parentes do futuro.”
À Profa. Dra. Fabiana Fantinantti Garboggini, pela orientação, confiança e ensinamentos.
À toda equipe da Divisão de Recursos Microbianos, aos mais próximos e mais distantes, por toda ajuda, motivação, conselho e companhia durante estes anos.
À René e ao Gabriel, pela ajuda crucial em experimentos e no desenvolvimento do trabalho.
Às amigas Ludmila e Déborah, pela companhia e entusiasmo fora do laboratório. Aos meus amigos de Brasília, que mesmo distantes estão perto.
Aos meus amigos de graduação e antigos professores. Em especial à Ingrid pela parceria e companherismo.
Aos meus primeiros orientadores, que também contribuíram para minha aprendizagem.
À minha mãe e ao senhorzinho meu pai, pelo incentivo e torcida. À toda minha família.
Ao programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Genética e à agência financiadora Programa de Excelência Acadêmica (PROEX), processo PROEX0230081.
A taxonomia microbiana evoluiu simultaneamente à Ciência, sobretudo após o surgimento da Biologia Molecular. Apesar do gene RNA ribossomal 16S permitir a obtenção de informações genotípicas acuradas, é necessário o uso de metodologias que possibilitem análises mais profundas de micro-organismos intimamente relacionados. Assim, o presente estudo teve por objetivo classificar a um nível específico 15 linhagens do gênero Chromobacterium isoladas do Rio Negro (Manaus, Brasil) e do Rio Doce (Minas-Gerais, Brasil) e 7 linhagens Tipo descritas na literatura: C. violaceum (ATCC 12472T), C. pseudoviolaceum (LMG 3953T), C. haemolyticum (DSM 19852T), C. vaccinii (DSM 25150T), C. piscinae (LMG 3947T), C. subtsugae (PRAA4-1T) e C. amazonense (DSM 26508T), utilizando a metodologia de MLSA. Os primers para os genes estruturais atpD, rpoA e rpoB foram desenhados a partir do genoma total de C. violaceum (ATCC 12472T). A partir do sequenciamento dos genes housekeeping foi possível a construção de árvores filogenéticas parciais e árvores filogenéticas com os genes concatenados na seguinte ordem: RNA ribossomal 16S e atpD; RNA ribossomal 16S, atpD e rpoA; RNA ribossomal 16S, atpD e rpoB e RNA ribossomal 16S, atpD, rpoA e rpoB. As filogenias resultantes de diferentes metodologias (Neighboor Joining –Kimura 2 parâmetros, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Minimum Evolution e UPGMA) com 1000 repetições de bootstrap apresentaram topologias similares. Conforme a análise por MLSA as cepas CBMAI 301, CBMAI 302, CBMAI 303, CBMAI 304, CBMAI 306, CBMAI 307, CBMAI 308 e CBMAI 309 pertencem a espécie C. violaceum; as linhagens CBMAI 589, CBMAI 590 e CBMAI 592 representam uma provável nova espécie relativamente próxima de C. vaccinii. As linhagens CBMAI 593 e CBMAI 595 formaram um clado separado de todas as espécies descritas, e a linhagem CBMAI 594 não agrupou com nenhuma das espécies do gênero. A partir desse trabalho foi possível concluir que a abordagem por MLSA é promissora para a resolução filogenética de espécies intimamente relacionadas e que os genes conservados atpD e rpoA constituem bons marcadores moleculares para o gênero Chromobacterium.
The Microbial Taxonomy evolved simultaneously to Science, especially after the appearance of Molecular Biology. Although the 16S ribosomal RNA gene allows obtaining accurate genotype information, it is necessary to use methodologies that allow deeper analyzes of closely related microorganisms. In this context, the Multilocus Sequence Analysis (MLSA) approach provides a greater genetic accuracy, since it uses housekeeping genes for inference of kinship. Thus, the present study aimed to classify at a specific level 15 strains of the genus Chromobacterium isolated from Rio Negro (Manaus, Brazil) and Rio Doce (Minas Gerais, Brazil) and 7 Type strains described in the literature: C. violaceum (ATCC 12472T), C. pseudoviolaceum (LMG 3953T), C. haemolyticum (DSM 19852T), C. vaccinii (DSM 25150T), C. piscinae (LMG 3947T), C. subtsugae (PRAA4-1T) and C. amazonense (DSM 26508T), using MLSA methodology. Primer design for the structural genes atpD, rpoA and rpoB were made from the total genome of C. violaceum (ATCC 12472T). The sequencing resulted in concatenated phylogenetic trees with the genes concatenated in this order: 16S ribosomal RNA and atpD; 16S ribosomal RNA, atpD and rpoA; 16S ribosomal RNA, atpD and rpoB and 16S ribosomal RNA, atpD, rpoA and rpoB. The phylogenies were acquired from different methodologies (Neighboor Joining -Kimura 2 parameters, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Minimum Evolution and UPGMA) with 1000 replicates of bootstrap presenting similar topologies. According to the MLSA analysis the strains CBMAI 301, CBMAI 302, CBMAI 303, CBMAI 304, CBMAI 306, CBMAI 307, CBMAI 308 and CBMAI 309 belong to the species C. violaceum; CBMAI 589, CBMAI 590 and CBMAI 592 strains represent a probable new species relatively close to C. vaccinii. The strains CBMAI 593 and CBMAI 595 form a clade separate from all described species and the line CBMAI 594 constitutes a third new species, however, further analysis are required for confirmation. There are indications that the lineage CBMAI 594 did not group with any of the species of the genus. For last, we conclude from this study that the approach by MLSA was promising for the phylogenetic resolution of closely related species and that the conserved genes atpD and rpoA were good molecular markers for the Chromobacterium genus.
Figura 1. Características genotípicas e metodologias que complementam e corroboram os resultados obtidos a partir das análises fenotípicas das linhagens. Fonte: Vandamme, P. et al. Polyphasic Taxonomy, a Consensus Approach to Bacterial Systematics. V. 60, 410, 1996 ...19
Figura 2. Exemplos de características quimiotaxonômicas e fisiológicas utilizadas na taxonomia microbiana como marcadores fenotípicos, os quais complementam análises genotípicas na identificação de diferentes taxa. Fonte: VANDAMME, P. et al. Polyphasic Taxonomy, a Consensus Approach to Bacterial Systematics. V. 60, 410, 1996 ...23
Figura 3. Estrutura secundária do RNA ribossomal 16S de Escherihia coli. Em vermelho, o fragmento R1 inclui as regiões V1 e V2; em laranja, fragmento R2, incluindo a região V3; em amarelo, fragmento R3 incluindo região V4; em verde, fragmento R4 incluindo as regiões V5 e V6; em azul, fragmento R5 incluindo regiões V7 e V8; e em roxo, fragmento R6, incluindo a região V9. Fonte: Modelo reproduzido a partir de Yarza et.al, (2008) ...25
Figura 4. Estrutura química da violaceína. Fonte: DURÁN, N.; MENCK, C. F. M. (2001).
Chromobacterium violaceum: a review of pharmacological and industrial perspectives. Crit.
Rev.Microbiol. 27, p. 201 – 222 ...42
Figura 5. Linhagem de Chromobacterium amazonense (DSM 26508T) em meio sólido de NA após incubação de 48h a 30 ºC...57
Figura 6. Árvore filogenética obtida a partir das sequências do gene RNA ribossomal 16S de 26 linhagens do gênero Chromobacterium sp., incluindo as linhagens Burkholderia cepacia DWS 37UF10B-2 e ATCC 2541T como outgroups. O alinhamento múltiplo foi realizado pelo CLUSTAL W (Bioedit v. 7) e a filogenia obtida a partir da análise de 734 bases nucleotídicas segundo o método de Neighboor Joining – Kimura 2 parâmetros...60
Figura 7. Árvore filogenética obtida a partir de 22 sequências dos genes RNA ribossomal 16S e atpD concatenados, incluindo as linhagens Burkholderia cepacia DWS 37UF10B-2 como outgroup. O alinhamento múltiplo foi realizado pelo CLUSTAL W (Bioedit v. 7) e a filogenia obtida a partir da análise de 1547 bases nucleotídicas segundo o método de Neighboor Joining – Kimura 2 parâmetros...66
Figura 8. Árvore filogenética obtida a partir de 22 sequências dos genes RNA ribossomal 16S, atpD e rpoA concatenados nesta ordem, incluindo a linhagen Burkholderia cepacia DWS 37UF10B-2 como outgroup. O alinhamento múltiplo foi realizado pelo CLUSTAL W (Bioedit v. 7) e filogenia obtida a partir da análise de 2273 bases nucleotídicas segundo método de Neighboor Joining –Kimura 2 parâmetros...70
Figura 9. Árvore filogenética obtida a partir de 21 sequências dos genes RNA ribossomal 16S, atpD e rpoB concatenados nesta ordem, incluindo a linhagen Burkholderia cepacia DWS 37UF10B-2 como outgroup. O alinhamento múltiplo foi realizado pelo CLUSTAL W (Bioedit v. 7) e a filogenia obtida a partir da análise de 1573 bases nucleotídicas segundo o método de Neighboor Joining – Kimura 2 parâmetros...74
Figura 10. Árvore filogenética obtida a partir de 20 sequências dos genes RNA ribossomal 16S, atpD, rpoA e rpoB concatenados nesta ordem, incluindo a linhagem Burkholderia cepacia DWS 37UF10B-2 como outgroup. O alinhamento múltiplo foi realizado pelo CLUSTAL W (Bioedit v. 7) e a filogenia obtida a partir da análise de 2878 bases nucleotídicas segundo o método de Neighboor Joining – Kimura 2 parâmetros...77
Tabela 1. Linhagens de Chromobacterium sp., risco biológico, meio e condições de cultivo...49
Tabela 2. Linhagens Tipo das diferentes espécies de Chromobacterium sp. adquiridas da coleção de micro-organismos alemã, DSMZ...50
Tabela 3. Sequência dos primers utilizados nas amplificações por PCR e no sequenciamento dos diferentes genes ...53
Tabela 4. Programas de amplificação utilizados nos experimentos de PCR...54
Tabela 5. Valores de divergência de sequências a partir da árvore filogenética e matriz de similaridade do gene RNA ribossomal 16S das linhagens de Chromobacterium sp. ...61
Tabela 6. Valores de similaridade de sequências a partir da árvore filogenética e matriz de similaridade dos genes RNA ribossomal 16S e atpD concatenados das linhagens do gênero Chromobacterium sp. ...67
Tabela 7. Valores de divergência de sequências a partir da árvore filogenética e matriz de similaridade dos genes RNA ribossomal 16S, atpD e rpoA concatenados das linhagens de Chromobacterium sp. ...71
Tabela 8. Valores de divergência de sequências a partir da árvore filogenética e matriz de similaridade dos genes RNA ribossomal 16S, atpD e rpoB concatenados das linhagens do gênero Chromobacterium sp. ...75
matriz de similaridade dos genes RNA ribossomal 16S, atpD, rpoA e rpoB concatenados das linhagens do gênero Chromobacterium sp. ...81
16S RNA ribossomal em procariotos ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosina trifosfato
atpD Gene codificante da cadeia da ATP sintase
CBMAI Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria CGD Doença crônica granulomatosa
CPQBA Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
dnaK Gene codificante da proteína chaperona dnaK dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfato
DNAr Ácido desoxirribonucléico ribossomal DRM Divisão de Recursos Microbianos
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zelkulture EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
fyuA Gene codificante da proteína de receptor de membrana tonB-dependente
groEL Gene codificante da proteína Chaperonina de 60 KDa gyrA Gene codificante da subunidade da DNA girase gyrB Gene codificante da subunidade da DNA girase
hsp Gene estrutural da subunidade menor da Heatshock Protein
hemo Gene da hemolisina
MLSA Multi Locus Sequencing Analysis MLST Multi Locus Sequencing Typing NaCl Cloreto de sódio
NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth
NCBI National Center of Biotechnology Information
NGS Next Generation Sequencing
PCR Polymerase Chain Reaction
RDP Ribosomal Database Project
RNAr Ácido Ribonucléico Ribossomal RNA Ácido Ribonucléico
rpoA Gene codificante da subunidade da RNA polimerase rpoB Gene codificante da subunidade da RNA polimerase rpoD Gene codificante da subunidade sigma da RNA polimerase SDS Dodecil Sulfato de Sódio
TE Tris – EDTA
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
trpB Gene codificante da subunidade β da triptofano sintase TSA Trypticase Soy Agar
TSB Trypticase Soy Broth
U Unidade
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
ºC graus Celsius
ºC/min graus Celsius por minuto
h horas Kb kilobase Min minutos mL mililitros mM milimolar pb pares de bases rpm rotação por minuto
s segundos
µg micrograma µL microlitro
V Volts
1. INTRODUÇÃO ... 18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 21
2.1 O conceito de espécie na classificação de micro-organismos... 21
2.2 Taxonomia clássica e caracterização morfológica e bioquímica ... 22
2.3 Taxonomia moderna e caracterização molecular ... 25
2.4 Espécies do gênero Chomobacterium ... 31
2.4.1 Chromobacterium violaceum ... 32
2.4.2 Chromobacterium subtsugae ... 32
2.4.3 Chromobacterium aquaticum ... 33
2.4.4 Chromobacterium haemolyticum ... 33
2.4.5 Chromobacterium pisciane e C. pseudoviolaceum ... 34
2.4.6 Chromobacterium vaccinii ... 35
2.4.7 Chromobacterium amazonense ... 36
2.4.8 Chromobacterium alkanivorans ... 37
2.4.9 Chromobacterium rhizoryzae ... 38
2.4.10 Chromobacterium sphagni ... 38
2.5 Patogenicidade do gênero Chomobacterium ... 39
2.6 Relevância biotecnológica do gênero Chomobacterium ... 42
2.6.1 Aplicabilidades farmacológicas ... 43 2.6.2 Aplicabilidades industriais ... 44 2. OBJETIVOS ... 46 2.1. Objetivo geral ... 47 2.2. Objetivos específicos ... 47 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 47 3.1. Linhagens de Chromobacterium ... 47 3.2. Caracerização molecular ... 51
3.2.1. Extração de DNA genômico ... 51
3.2.2. Seleção dos genes housekeeping e desenho oligonucleotídeos ... 52
3.2.3. Amplificação por PCR dos diferentes genes ... 54
3.2.4. Reação de sequenciamento ... 55
3.2.5. Análises das sequências ... 55
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 57
4.1. Análise filogenética do gene RNA ribossomal 16S... 57
subunidade beta ... 64
4.2.2. Análise concatenada incluindo os genes RNA ribossomal 16S, atpD sintase subunidade beta e rpoA RNA polimerase subunidade alfa ... 68
4.2.3. Análise concatenada incluindo os genes RNA ribossomal 16S, atpD sintase, subunidade beta e rpoB RNA polimerase subunidade beta ... 72
4.2.4. Análise concatenada incluindo os genes RNA ribossomal 16S, atpD sintase subunidade beta, rpoA RNA polimerase subunidade alfa e rpoB RNA polimerase subnunidade beta ... 76
6. CONCLUSÕES ... 84
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 85
8. APÊNDICES ... 94
9. ANEXOS ... 118
Anexc 1. Termo de Bioética ... 118
1. INTRODUÇÃO
Um dos maiores desafios no que diz respeito ao estudo da diversidade biológica consiste em compreender como os seres estão relacionados uns aos outros. Esta relação tem sido estudada desde o século XVIII, inicialmente por Carl Linneaus, que foi pioneiro no desenvolvimento de um sistema taxonômico binominal visando a compreensão da biodiversidade como um todo. Em 1987, Woese definiu a existência de três grandes domínios taxonômicos – Eucarya, Bacteria e Archaea- os quais abrangem a totalidade da vida na Terra. Os três domínios mencionados anteriormente abrangem por volta de 15 milhões de espécies; contraditoriamente a este dado, estima-se a existência de no mínimo 12 milhões de espécies distintas apenas dentro do domínio Bacteria. Uma justificativa que explica a discrepância entre as aproximações quantitativas da biodiversidade atual é a dificuldade na obtenção dos espécimes bacterianos. Muitos deles exigem meios nutricionais complexos, além de condições abióticas específicas, o que torna difícil a reprodução de seus hábitats naturais em ambiente laboratorial. Além disto, sabe-se que a grande maioria de bactérias é não cultivável, o que faz com que a previsão da biodiversidade bacteriana total existente seja extremamente defasada e subestimada em relação à diversidade real (LIMA- BITTENCOURT, 2007; CONNON; GIOVANNONI, 2012).
Uma vez que o parentesco filogenético e taxônomico entre as diferentes espécies, gêneros, famílias e reinos seja compreendido, organizar e classificar cada um destes seres vivos torna-se uma tarefa muito mais fácil de ser realizada (WAYNE et al., 1987). Desta forma, o principal objetivo da sistemática é compreender corretamente a diversidade biológica e pode-se dizer que suas principais linhas de estudo sejam dividas em quatro principais etapas: (I) descrever a diversidade em estudo, (II) encontrar uma ordem inerente à diversidade em questão, (III) entender como originou-se esta diversidade em termos evolutivos e, por fim (IV) apresentar um sistema geral que represente adequadamente a diversidade analisada (WAYNE et al.,1987).
A taxonomia microbiana segue o mesmo raciocínio que rege toda a taxonomia aplicada aos mais diversos seres e situações. A principal diferença, contudo, são as características utilizadas para a classificação de seus indivíduos. As
classificações baseadas apenas em observações morfológicas amplamente utilizadas em seres superiores eucariontes não são consideradas suficientemente acuradas para identificar um micro-organismo, seja ele uma bactéria, um fungo ou uma arqueia. Espécies de micro-organismos intimamente relacionadas que apresentam diferenças mínimas entre si necessitam de uma abordagem que considere caracteres distintos para a sua classificação. Além do uso de marcadores moleculares, tais como o gene do RNA ribossomal 16S, os genes ITS (internal transcribed spacer), região entre os genes 16 e 23S, os genes de tRNA, presentes nas regiões ITS, hibridação DNA-DNA, perfis fenotípicos, bioquímicos e quimiotaxonômicos também são essenciais para a classificação de isolados em um novo taxon. Esta abordagem constituída por diversos fatores genotípicos e fenotípicos vem sendo denominada taxonomia polifásica (Figura 1) (WAYNE et al., 1987; LIMA- BITTENCOURT, 2007; CHUN; RAINEY, 2014).
Figura 1. Características genotípicas e metodologias que complementam e corroboram os resultados obtidos a partir das análises fenotípicas das linhagens. Fonte: Vandamme, P. et al. Polyphasic Taxonomy, a Consensus Approach to Bacterial Systematics. V. 60, 410, 1996.
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O conceito de espécie na classificação de micro-organismos
Devido às características inerentes aos seres microscópicos, unicelulares, muitas vezes anucleados, sendo consideravelmente mais simples do que outros seres acima na árvore evolutiva, Stackebrandt e Goebel (1994) sugeriram que o conceito de espécie utilizado na zoologia não fosse utilizado para a classificação e estudo sistemático de bactérias. De acordo com os pesquisadores, na zoologia uma espécie pode ser definida como um “grupo capaz de se reproduzir quando em populações naturais e que, concomitantemente, seja reprodutivamente isolado de outros grupos”. Contudo, uma vez que a transferência gênica é um evento relativamente comum entre linhagens bacterianas (BOONSILP et al., 2013; THEETHAKAEW et al., 2013; DOROGHAZI; BUCKLEY, 2014), este conceito normalmente utilizado por zoólogos não pode ser utilizado para micro-organismos (STACKEBRANDT; GOEBEL,1994).
O primeiro conceito de espécies microbianas foi definido como um conjunto ou população de cepas obtidas a partir de uma variedade de fontes, que contenha estirpes isoladas recentemente e estirpes estocadas in vitro por diferentes períodos de tempo, e suas variantes. As cepas devem possuir em comum um padrão de propriedades estáveis e correlacionadas, as quais separem um determinado grupo de outros grupos de cepas (GORDON; PHILL, 1998). Segundo Bittencourt (2011), outro conceito de espécie muito aceito é o filo-fenético. Neste, denomina-se de espécie uma categoria que circunscreva um grupo de indivíduos o qual possua uma coerência genotípica entre si e apresente grande similaridade relacionada a outros caracteres (ROSELLO-MORA; AMANN, 2001).
Com o surgimento de numerosas análises fenéticas e técnicas moleculares na taxonomia bacteriana, o parentesco intra e inter-específico torna-se possível de ser determinado de forma objetiva. Especialmente no que diz respeito aos estudos de pareamento de ácidos nucléicos de genomas inteiros ou de genes selecionados, têm-se confirmado o pressuposto previamente expresso de que a entidade “espécie” não pode ser reconhecida como um grupo de cepas geneticamente isoladas de seus
vizinhos filogenéticos (STACKEBRANDT; GOEBEL, 1994). Assim, a taxonomia de bactérias, que começou como um processo em grande parte intuitivo, tornou-se cada vez mais objetivo com o surgimento da taxonomia numérica e técnicas que permitem medir a divergência evolutiva na estrutura de semântides a partir de grandes moléculas portadoras de informação, como ácidos nucléicos e proteínas (WAYNE et al., 1987).
O conceito de espécies em procariontes tem sido discutido por taxonomistas, entretanto, não há um consenso estabelecido, uma vez que diferentes modelos evolutivos baseados na seleção natural e na transferência horizontal de genes têm sido propostos para a definição conceitual (NASER et al., 2005). Ainda, essas discussões sugerem a aplicação de novas metodologias para superar as limitações das atuais técncias utilizadas como: hibridação DNA-DNA, análises do gene RNA ribossomal 16S, características fenotípicas e fingerprints, assim, a técnica de Multi Locus Sequence Analysis (MLSA), cuja metodologia é fortemente indicada como nova alternativa para a identificação de espécies dentro da microbiologia (NASER et al., 2005). Esta técnica vem de encontro à sugestão de pesquisadores em que a definição de espécie seja baseada em sequências de genes (NASER et al., 2005; LA SCOLA et al., 2003), devido as características de baixo custo dos ensaios, a facilidade de construção de bases de dados de acesso público, a incorporação de novos dados e os recursos de análise computacional existentes (NASER et al., 2005).
2.2 Taxonomia clássica e caracterização morfológica e bioquímica
A taxonomia clássica, a qual utiliza características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas para a classificação de um indivíduo em diferente espécie, ainda é utilizada por muitos taxonomistas, seja em função do grupo taxonômico em questão ou devido a infra-estrutura. Os testes fenotípicos tradicionais são utilizados em esquemas de identificação na maioria dos laboratórios de microbiologia clínica. Eles constituem a base para a identificação formal dos taxa, desde os níveis de sub-espécie e sub-espécie até os níveis de gênero e família. Enquanto que dados genotípicos são utilizados para alocar os clados nas árvores filogenéticas e para delinear as principais fronteiras dos sistemas de classificação, a consistência
fenotípica é necessária para gerar sistemas de classificação úteis, também podendo influenciar a profundidade de uma linha hierárquica. De forma oposta, a ausência destas características pode causar problemas na descrição e diferenciação de taxa específicos (WAYNE et al., 1987).
São considerados métodos fenotípicos todos aqueles que não estejam diretamente relacionados às moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucléido (RNA), incluindo as técnicas quimiotaxonômicas. O termo quimiotaxonomia pode ser compreendido como um estudo analítico que coleta informações a respeito dos diferentes constituintes químicos que compõe uma célula com a finalidade de classificá-la. Porém, a fenotipagem de micro-organismos endossimbiontes e não cultiváveis in vitro não pode ser realizada por meio destes métodos (Vandamme et al., 1996).
As características fenotípicas de bactérias abrangem sua morfologia, fisiologia e composição bioquímica (Figura 2). Apesar de individualmente possuírem pouco valor como parâmetro de parentesco genético, quando analisadas em conjunto são capazes de fornecer importantes informações descritivas para o reconhecimento de novos taxa (Vandamme et al., 1996).
Figura 2. Exemplos de características quimiotaxonômicas e fisiológicas utilizadas na taxonomia microbiana como marcadores fenotípicos, os quais complementam análises genotípicas na identificação de diferentes taxa. Fonte: VANDAMME, P. et al. Polyphasic Taxonomy, a Consensus Approach to Bacterial Systematics. V. 60, 410, 1996.
A morfologia de bactérias inclui características do crescimento celular: forma, presença ou ausência de endósporo e corpos de inclusão, coloração de Gram; e características da colônia: cor, dimensão e forma. A fisiologia bacteriana inclui
características expressas frente aos diferentes meios de cultura, às condições e tempo de crescimento em diferentes temperaturas, valores de pH, concentração de sal e condições atmosféricas. A determinação da composição da parede celular é uma importante característica quimiotaxonômica principalmente para bactérias Gram positivas, cuja parede celular pode conter muitos tipos diferentes de peptidioglicanos, os quais são frequentemente específicos tanto para gêneros como para espécies de bactérias (SCHLEIFER, KANDLER; 1972). Os ácidos teicóicos ligados à membrana também são importantes; porém apenas para a análise de determinadas espécies Gram positivas (KNOX; WICKEN; 1973), sendo facilmente extraídos, purificados e analisados por cromatografia gasosa-líquida (FISCHER et al., 1980).
A presença de lipídeos nas células bacterianas é uma característica quimiotaxonômica trivial e amplamente utilizada na taxonomia bacteriana. A membrana plasmática que envolve todas as células do grupo é constituída majoritariamente por uma bicamada de lipídeos polares, a qual é estudada de forma extensa para fins de classificação e identificação. Outros tipos de lipídeos como os esfingofosfolipídeos são restritos a determinados taxa, o que os torna úteis para a identificação dos mesmos (JONES; KRIEG, 1984; VANDAMME, 1996). Ácidos graxos são os principais constituintes de lipídeos e lipopolisacarídeos. A variação no comprimento da cadeia de carbonos, a posição das ligações duplas e dos grupos substituintes resultam em mais de 300 estruturas diferentes o que faz com que o perfil de ácidos graxos de uma célula constitua uma boa ferramenta quimiotípica dentro da taxonomia microbiana (GOODFELLOW; O’DONNELL et al., 1993; VANDAMME,1996).
O conteúdo de proteínas na célula também possui relevância no processo de identificação e na classificação microbiana. Em vários sub-ramos, a interpretação numérica do perfil protéico total bacteriano permite agrupar linhagens fenotipicamente relacionadas. Após o resultado de hibridação DNA-DNA entre as mesmas, também se comprova a existência de uma relação genotípica, a qual corrobora o resultado obtido a partir da análise do perfil protéico. Vários grupos taxonônomicos têm sido classificados desta maneira, o que torna esta análise uma metodologia adicional que inicialmente indica e, em um segundo momento, confirma os parentescos filogenéticos sugeridos pela hibridação do gene RNA ribossomal
entre determinadas linhagens (FOX et al., 1980; COSTAS, 1992; VANDAMME, 1996).
2.3 Taxonomia moderna e caracterização molecular
O surgimento da biologia molecular, a descoberta da molécula de DNA e sua posterior elucidação foi crucial para a identificação de linhagens microbianas a partir de caracteres genotípicos (TINDALL et al., 2010; BUERMANS; DUNNEN, 2014).
Atualmente, a classificação bacteriana engloba técnicas para determinar tanto características fenotípicas como características genotípicas, o que constitui uma abordagem polifásica de investigação e classificação. Dentre os métodos genotípicos, o sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S e a hibridação DNA-DNA são consideradas técnicas “padrão” para a classificação de espécies de bactérias (MARTENS et al., 2008).
O uso da menor subunidade do gene RNA ribossomal 16S (SS-rRNA) para inferência filogenética foi reconhecido por WOESE e colaboradores em 1987 e seu uso como um possível marcador molecular em estudos genéticos tem sido bem-sucedido desde então (FOX et al., 1980; LANE et al., 1985; STACKEBRANDT; GOEBEL, 1994; GRUBER e BRYANT, 1997; NASER et al., 2005; PACE, 2009; TINDALL et al., 2010; GUO et al., 2008; GRUBER et al., 2011; GLAESER e KÄMPFER 2015).
A estrutura secundária da molécula do RNA ribossomal 16S possui pareamentos diferentes do proposto por Watson-Crick (A-U e C-G) os quais são obtidos a partir do pareamento intra-cadeia entre várias hélices oriundas do pareamento que são numeradas a partir da extremidade 5' da molécula (WOESE et al., 1983). O número total de hélices e suas localizações são características usadas para separar grupos filogenéticos (DAMS et al., 1988). A molécula de DNA ribossomal possui 9 regiões variáveis, alternadas com regiões conservadas, denominadas de V1 a V9 (Figura 3). Estas regiões podem, juntamente com as regiões das hélices, serem utilizadas para determinação de filogenias (WOESE et al., 1983 e DAMS et al., 1988). As áreas variáveis podem ser usadas para estudar as relações evolutivas entre dois organismos muito próximos e as áreas conservadas podem ser usadas para revelar relações antigas entre duas moléculas.
Figura 3. Estrutura secundária do RNA ribossomal 16S de Escherihia coli. Em vermelho, o fragmento R1 inclui as regiões V1 e V2; em laranja, fragmento R2, incluindo a região V3; em amarelo, fragmento R3 incluindo região V4; em verde, fragmento R4 incluindo as regiões V5 e V6; em azul, fragmento R5 incluindo regiões V7 e V8; e em roxo, fragmento R6, incluindo a região V9. Fonte: Modelo reproduzido a partir de Yarza et.al, (2008).
A inferência filogenética baseada no gene RNA ribossomal 16S, consiste em realizar uma análise comparativa da sequência deste gene proveniente de cepas distintas, das quais se deseja obter informações referentes ao seu parentesco filogenético. Essa técnica tem sido amplamente utilizada em estudos evolutivos, taxonômicos e ecológicos, não somente para a definição de taxon, mas também para caracterização da presença de determinado taxon (FOX et al., 1992). De acordo com resultados de numerosos estudos encontrados na literatura, a maioria das espécies reconhecidas até o momento e que foram analisadas em suas sequências do RNA ribossomal 16S diferem de espécies afins do mesmo gênero em pelo menos 1,5% das posições das bases na análise comparativa da sequência total do gene RNA ribossomal 16S. De fato, a existência de uma identidade de 100% entre duas sequências de RNA ribossomal 16S de duas cepas diferentes certamente resultará como ambas pertencendo a mesma espécie de acordo com o critério de hibridação DNA-DNA. Um problema surge somente quando um pequeno número de diferenças é encontrado entre as sequências, nestes casos, não se pode afirmar que a hibridação DNA-DNA consiga realizar uma distinção significativa entre as estirpes, podendo ou não caracterizar a existência de identidade entre as espécies. Claramente, em um alto nível de identidade entre as sequências (aproximadamente 99%) a acurácia da técnica de comparação entre o gene RNA ribossomal 16S está sujeita a erros inerentes, o que não significa que pequenas diferenças não devem, necessariamente, ser consideradas significantes (FOX et al., 1992).
A hibridação par a par de moléculas de DNA foi inicialmente a metodologia molecular mais aceita para identificação e caracterização de micro-organismos em um nível intra-específico. De tal forma que é atualmente reconhecida como a técnica “padrão ouro” ou “gold standart” da taxonomia moderna de procariotos (STACKEBRANDT, GOEBEL, 1994; MARTENS et al., 2008; KIM et al., 2014).
A hibridação envolve uma comparação total das bases nucleotídicas de dois genomas distintos, revelando a similaridade de ambas sequências de forma relativamente acurada e eficaz (MARTENS et al., 2008). A desnaturação da fita dupla de DNA de ambos micro-organismos ocorre sob temperatura específica e sua posterior incubação em condições apropriadas permite a formação de uma molécula híbrida. O nível de similaridade entre ambas sequências pode então ser obtido a partir da similaridade do dúplex formado (YAMAMOTO et al., 1999).
Essa abordagem determina, em partes, o conceito filogenético microbiano como um grupo de linhagens cuja similiradade mínima entre seus genomas totais seja o resultado de 70% ou mais de hibridação entre suas moléculas de DNA, assim como um ΔTm de incubação menor ou igual a 5°C (WAYNE et al., 1987, MARTENS
et al., 2008, KIM et al., 2014). Esta técnica é utilizada de forma abrangente não somente em estudos taxonômicos, evolutivos e ecológicos, como também para caracterizar a presença de diferentes organismos dentro de grupos específicos (FOX et al., 1992).
Contudo, apesar de seu frequente uso, a hibridação de duas moléculas distintas de DNA é uma técnica que apresenta certas restrições. Suas principais dificuldades consistem em duas principais razões: (I) a necessidade de grande quantidade de DNA cromossomal puro de todas as linhagens que se deseja analisar e (II) a condução da hibridação entre todas as linhagens Tipo e as linhagens do estudo (YAMAMOTO, et al., 1999; MARTENS et al., 2008). Desta forma a abordagem contradiz um dos principais objetivos da pesquisa biológica o qual reside na reprodutibilidade de um experimento a partir de protocolos bem definidos.
Devido ao surgimento de tecnologias de sequenciamento de nova geração (Next Generation Technologies - NGS) a quantidade de dados obtidos a partir do sequenciamento genômico total e parcial sofreu um considerável aumento. A obtenção destas sequências permite acessar uma variedade de fenômenos biológicos, como por exemplo: variações genéticas, expressão de RNA, interações
entre proteínas e mudanças na conformação de cromossomos (SHENDURE, JI 2008; CHUN, 2014). A viabilidade dessa informação tem influenciado diretamente a inferência taxonômica, especialmente no que diz respeito aos micro-organismos. Muitos estudos enfatizam que uma das vantagens em utilizar ácidos nucléicos como fonte de dados consiste na sua capacidade de gerar informações mais precisas, e passíveis de compartilhamento entre diferentes laboratórios, do que as obtidas por meio de análises morfológicas. Além disso, ser capaz de gerar uma maior quantidade de dados genotípicos a respeito do relacionamento evolutivo do que uma análise fenotípica é também uma vantagem oferecida pelo uso de abordagens moleculares para o estudo na área (GRUBER, BRYANT, 1997; WOESE, 1987).
O comitê de re-avaliação para a definição de espécies na bacteriologia (ad hoc committee), dentre outras realizações, analisou o uso de novas técnicas emergentes para o estudo da taxonomia em bactérias. A primeira abordagem citada foi Multilocus Sequence Analysis (Multilocus de Sequências Nucleotídicas) ou simplesmente MLSA (STACKEBRANDT et al., 2002, MARTIN et al., 2002). A metodologia de MLSA é uma variação da técnica de MLST (Multilocus Sequence Typing) suficientemente sensível para diferenciar linhagens pertencentes à mesma espécie e linhagens de diferentes espécies que possuem diferenças mínimas entre suas sequências (PAPKE et al., 2011).
A técnica de MLSA vem sendo empregada para a identificação de espécies de micro-organsimsos. Nesta técnica, as sequências dos diferentes genes housekeeping são concatenados e utilizados na construção de árvores filogenéticas e matrizes de similaridade, sendo mais adequada para a separação de espécies dentro de um determinado gênero (CHRISTENSEN et al., 2007; NASER et al., 2005). Mais recentemente, a abordagem de MLSA provê uma introspecção maior sobre a dinâmica da especiação e da evolução das espécies, caracterizando-se por ser um método rápido, altamente sensível e confiável (PAPKE et al., 2011). O ad hoc Comittee of Re-evaluation of the Species Definition in Bacteriology definiu em 2002 um mínimo de cinco genes necessários para a análise por MLSA (STACKEBRANDT et al., 2002; DE LA HABA et al., 2012). Estes genes devem codificar proteínas com funções metabólicas conhecidas como “housekeeping genes” (genes estruturais), estar presentes em diferentes loci cromossômicos e amplamente distribuídos entre os grupos taxonômicos. A quantidade de informação
obtida é diretamente dependente do nível da diversidade genética presente dentro de um determinado grupo taxonômico e do número de genes utilizados no estudo, portanto, o número absoluto das sequências a serem analisadas deve ser definido de acordo com a robustez dos clados, o que é obtido a partir de uma análise da variedade filogenética (STACKEBRANDT et al., 2002). Genes estruturais ou housekeeping são considerados importantes marcadores moleculares para inferência do curso da evolução genômica por serem genes de cópia única, altamente conservados e com uma taxa de transferência lateral extremamente baixa (SOLER et at., 2004). Vários genes que codificam proteínas em procariotos, tais como recA, groEL, rpoA, rpoB, rpoD e gyrB têm sido úteis para a classificação de bactérias a um nível intra-genérico (YAMAMOTO et al., 1999).
2.4 Espécies do gênero Chomobacterium
Chromobacterium compreende um gênero de bactérias livres, Gram-negativas, oficialmente agrupadas dentro da classe das β-proteobactéria (LIMA et al., 2012), família Neisseriaceae (MENEZES et al., 2015). O gênero é constituído atualmente por 10 espécies: C. violaceum (BERGONZINI, 1881), C. subtsugae (MARTIN et al., 2007), C. aquaticum (YOUNG et al., 2008), C. haemolyticum (HAN et al., 2008), C. pseudoviolaceum (KÄMPFER et al., 2009), C. piscinae (KÄMPFER et al., 2009), C. vaccinii (SOBY et al., 2013), C. amazonense (MENEZES et al., 2015), C. rhizoryzae (ZHOU et al., 2016), C. alkanivorans (BAJAJ et al., 2016) e C. sphagni (BLACKBURN et al., 2017).
Moss e colaboradores (1978) isolaram a linhagem de Chromobacterium fluviatile a partir de amostras do River Wey, Surrey, Reino Unido. Apesar do fenótipo apresentado pela linhagem C. fluviatile ser semelhante ao fenótipo do gênero Chromobacterium (SNEATH, 1974), a porcentagem de 50-52 mol % do conteúdo de GC é muito inferior à porcentagem apresentada pelo gênero Chromobacterium (63-72 mol %) (MOSS et al., 1978; MOSS, BRYANT, 1981). A hibridação realizada entre as fitas híbridas e homólogas de DNA: rRNA de C. fluviatile e C. violaceum e a baixa porcentagem do híbrido obtido indicou ser necessário remover a espécie C. fluviatile do gênero Chromobacterium (FOX et al., 1980; MOSS, BRYANT, 1981).
Segundo Logan (1989) a habilidade de uma linhagem sintetizar um mesmo pigmento, como a violaceína, não deve possuir um peso maior do que nenhuma outra característica taxonômica. A presença da violaceína não indica, desta forma, a existência de um relacionamento próximo entre isolados distintos. As linhagens estudadas e pertencentes ao grupo C. violaceum e inicialmente descritas por Gauthier (FOX et al., 1980) apresentavam uma considerável discrepância em relação à porcentagem de composição de bases em seu DNA. Enquanto que cepas de Chromobacterium apresentam de 63 a 72% de G+C, a linhagem em estudo supostamente pertencente ao mesmo grupo apresentava conteúdo de 41% de G+C. Desta forma definiu-se a reclassificação das cepas do grupo Chromobacterium fluviatile para o grupo Iodobacter fluviatilis (LOGAN, 1989).
2.4.1 Chromobacterium violaceum
A espécie Chromobacterium violaceum foi a primeira descrita e suas características definiram o gênero. É comumente encontrada em solos e ambientes aquáticos de regiões tropicais e subtropicais; pode apresentar respiração aeróbia e anaeróbia facultativa e fermentativa (HUNGRIA et al., 2004). A espécie possui formato de bastonete e grande flexibilidade metabólica, a qual permite sua sobrevivência nos mais variados ambientes (MENEZES et al., 2015). No Brasil, além da região Amazônica, é encontrada também na região centro-oeste, em ecossistemas de cerrado; na região sudeste, na Mata Atlântica e no estado de Minas Gerais, em amostras de solo (HUNGRIA et al., 2004.). Devido a sua importância biotecnológica, a linhagem de C. violaceum ATCC 12472T teve seu genoma sequenciado pela Rede Nacional de Sequenciamento de DNA (CAREPO et al., 2004; 2012; LIMA D., 2012). A C. violaceum é capaz de produzir um pigmento de cor roxa denominado violaceína o qual tem sido estudado desde os anos 70 devido as suas propriedades terapêuticas. (MENEZES et al., 2015).
2.4.2 Chromobacterium subtsugae
Martin e colaboradores (2007) isolaram do solo de uma região montanhosa em Maryland, U.S.A. uma linhagem de bactéria de coloração roxa que aprensentou toxicidade a larvas de besouro de batatas do Colorado. Após a caracterização bioquímica e morfológica foi sugerido o parentesco da bactéria com a espécie C. violaceum (ATCC 12472T). A cepa ficou definida como Chromobacterium subtsugae após a verificação do conteúdo de GC, a análise filogenética do gene RNA ribossomal 16S e a hibridação DNA-DNA. C. subtsugae é uma betaproteobactéria Gram negativa, facultativamente aeróbia e móvel, com a presença de um flagelo polar. Suas colônias são inicialmente de cor creme e após 24 h de incubação tornam-se gradativamente roxas devido à síntese de violaceína. Também sintetiza lecitinase e hidrolisa caseína em níveis semelhantes aos apresentados pela linhagem Tipo C. violaceum. Sua porcentagem de G+C é de 64,51 mol% enquanto que C. violaceum possui 64,83 mol% de G+C e outras linhagens caracterizadas como pertencentes ao gênero Chromobacterium apresentam entre 64-68 mol% de
G+C. A análise da sequência de RNA ribossomal 16S resultou em similaridade de 97,4% com a linhagem Tipo ATCC 12472T sugerindo a formação de um clado monofilético com taxon ancestral mais próximo sendo Vogesella indigofera (MARTIN et al., 2007).
2.4.3 Chromobacterium aquaticum
Young e colaboradores (2008) isolaram a cepa CC-SEYA-1T de águas de nascente na montanha de Yang-Ming, Taiwan. Após testes bioquímicos e análises moleculares, a espécie foi caracterizada como pertencente ao gênero Chromobacterium. A análise taxonômica por meio da comparação com o gene RNA ribossomal 16S da cepa em estudo com a espécie Tipo Chromobacterium violaceum resultou na maior similaridade existente dentro do gênero: 96,8%. Também ficou clara a similaridade da nova espécie com Chromobacterium subtsugae (96,5%).
A linhagem foi então definida como Chromobacterium aquaticum, uma classe de bactérias aeróbicas que possui células Gram negativas com formato de bastonete e móvel, apresentando um flagelo polar. Possui uma cor bege escura, e suas colônias são convexas e com aspecto liso, regular e brilhante. A ausência da pigmentação roxa característica da produção da molécula de violaceína não foi suficiente para propor a classificação da linhagem em outro gênero (YOUNG et al., 2009). Testes bioquímicos demonstraram a existência de atividade hemolítica (5% em meio com sangue de carneiro), produção de lecitinase, lipase, oxidase, gelatinase e aesculinase. Testes com antibióticos mostraram sensibilidade a cotrimoxazole, tetraciclina, minociclina, não quinonas 2G, levofloxacina e nitrofurantonina. Além disto, apresentou resistência a penicilina, gentamicina, eritromicina, clindamicina, vancomicina, teicoplanina, rifampicina, ácido fusídico, coagoxacilina e oxacilina (YOUNG et al., 2009).
2.4.4 Chromobacterium haemolyticum
Han e colaboradores (2008) por meio de análise taxonômica polifásica identificaram uma nova espécie pertencente ao gênero Chromobacterium, a qual foi denominada Chromobacterium haemolyticum (DSM 19852T). A comparação das
cepas C. violaceum e C. haemolyticum mostrou que ambas crescem rapidamente em placas de ágar, com algumas diferenças no que diz respeito à morfologia da colônia, pigmentação e hemólise. A C. haemolyticum é constituída por bacilos Gram negativos com habilidade de crescer em placas com meio de TSB (BBL), Agar Sangue, Agar Chocolate e Extrato de levedura com carvão ativado (HAN et al., 2008). As colônias de C. haemolyticum são cinzas, redondas e elevadas, podendo atingir até 2 mm após 24 h de incubação. Não produzem o pigmento violaceína e sua característica mais relevante é sua grande capacidade hemolítica. Acredita-se que devido à grande capacidade hemolítica apresentada pela espécie, esta seja responsável por diversas infecções oportunistas, em alguns casos podendo evoluir, causando sepse e morte (LEE et al., 1999; KIM et al., 2015, TEOH et al., 2006). C. haemolyticum possui similaridade de 96,1%- 96,3% em relação às cepas C. violaceum (ATCC 12472T) e C. subtsugae (PRAA4-1T). Em relação ao gene gyrA, a sequência de C. haemolyticum (DSM 19852T) possui 92% de similaridade com a C. violaceum, tanto no nível nucleotídico como no nível de aminoácidos (HAN et al., 2008).
2.4.5 Chromobacterium pisciane e C. pseudoviolaceum
Kämpfer, Busse e Scholz (2009) estudaram com detalhes duas cepas caracterizadas como pertencentes ao gênero Chromobacterium sp. devido as posições taxonômicas obtidas por ambas linhagens após inferências por meio de RFLP, utilizando-se o gene recA (SCHOLZ et al., 2005). A cepa LMG 3947 foi isolada em 1972 na Malásia, da água de uma lagoa e a cepa LMG 3953 possui origem desconhecida, apesar de ter sido incluída em estudos de Gilman (1953). A análise de similaridade de sequências entre ambas cepas LMG 3947 e LMG 3953 em relação à Chromobacterium violaceum (ATCC 12472T) resultou em 99,9% e 98,9% respecitvamente. Porcentagens menores de similaridade entre sequências (98,5%) quando comparadas à outras espécies de Chromobacterium foram obtidas. A análise pelo gene recA (860 nt) resultou em similaridades na faixa de 95-96%, aproximadamente 40 nucleotídeos distintos, em relação à sequência gênica da espécie Tipo. Similaridades menores (84%) foram obtidas em relação aos gêneros Ralstonia, Bordetella e Burkholderia (KÄMPFER et al., 2009).
A cepa LMG 3947, denominada C. piscinae, apresenta crescimento floculento, o que impede medição confiável por meio de densidade óptica. Sua célula é Gram negativa, aeróbica e móvel. Apresenta produção de oxidase e catalase e reduz nitrato a nitrito. A cepa LMG3953, denominada C. pseudoviolaceum, apresenta características semelhantes como célula Gram negativa, aeróbica, móvel e em forma de bastão. Sintetiza catalase e oxidase e também reduz nitrato a nitrito. Características relevantes de ambas espécies são a ausência de um fosfolipídeo comum a Janthinobacterium lividum e Jantinobacterium agaricidamnosum. Em relação à espécie Tipo C. violaceum DSM 30191T possuem grande quantidade de 1,3-diaminopropano. Até o presente momento esta molécula não foi encontrada em quantidade comparável em nenhuma outra espécie presente ao grupo de β-proteobacteria (KÄMPFER et al., 2009).
2.4.6 Chromobacterium vaccinii
Soby e colaboradores (2013) isolaram linhagens bacterianas de filosferas e rizosferas de árvores de cranberry selvagens e cultivadas, assim como da flora a elas associada. Dentre as bactérias isoladas haviam cepas que produziam o pigmento roxo violaceína, sendo, no entanto, fisiologicamente e geneticamente distintas das espécies até então descritas do gênero Chromobacterium.
A linhagem posteriormente definida como Chromobacterium vaccinii (DSM 25150T) possui células Gram negativas, com formato oval, móveis, possuindo um único flagelo polar relativamente pequeno. Apesar de não apresentar fluorescência a nenhum comprimento de luz UV, produz grandes quantidades de moléculas de violaceína e desoxiviolaceína, assim como, um pigmento de cor marrom desconhecido. Suas colônias possuem coloração inicial creme e após 48 h de incubação vão adiquirindo coloração roxa, de forma gradual, do centro da colônia para as extremidades.
C. vaccinii (DSM 25150T) cresce regularmente em meios KMB e LB, produz oxidase, catalase, indol, arginina diidrolase e β-galactosidase. A produção de violaceína inicia-se somente 16 h após incubação e, apesar deste ser um pigmento que não é exportado para fora da célula, na C. vaccinii (DSM 25150T), durante crescimento planctônico da célula em meio KMB, pode ser detectado no meio antes
de ser detectado no precipitado de células, indicando um sistema de transporte ativo para a exportação deste pigmento pelo micro-organismo (SOBY et al., 2013).
No que diz respeito às análises genéticas e moleculares, C. Vaccinii (DSM 25150T) apresenta similaridade em relação ao gene RNA ribossomal 16S de 44,2% com C. violaceum (ATCC 12472T) e de 28,0% com C. subtsugae (PRAA4-1T).
2.4.7 Chromobacterium amazonense
Menezes e colaboradores (2015) descreveram uma nova espécie de Chromobacterium isolada da água do Rio Negro, no município de Rio Preto da Eva no Amazonas, Brasil. A linhagem Chromobacterium amazonense (CBMAI 310T) possui célula Gram negativa, móvel, com metabolismo aeróbico e formato de bastonete. Cresce bem em meio NB (OxoidTM), LB (InvitrogenTM) e TSB (Difco), produz a molécula pigmentada violaceína e, dentre as características em comum compartilhadas com as outras espécies do mesmo gênero, estão: fermentação de glicose, produção de arginina diidrolase, hidrólise de gelatina e assimilação de glicose, N-acetilglicosamina, gluconato de potássio e ácido málico. Todas as linhagens são também negativas para a produção de indol, β-galactosidase e urease. Além destas características, a cepa também é capaz de crescer em meio de D-glicose e N-acetil-D-glicosamina, ácido cítrico e D-manose como únicas fontes de carbono. É a única espécie dentro do gênero Chromobacterium capaz de produzir ácido ciclo-heptadecanóico.
Em relação às análises moleculares e genéticas, C. amazonense possui similaridade na sua sequência gênica de RNA ribossomal 16S de 98,6% com a espécie C. vaccinii (DSM 25150T), valor este que corresponde a 21 nucleotídeos diferentes. Com a espécie C. piscinae (LMG 3947T) a similaridade em relação ao mesmo gene é de 98,5% e com C. subtsugae DSM (17043T) é de 98,3%. O resulado da hibridação DNA-DNA entre C. amazonense (DSM 26508T), C. vaccinii (DSM 25150T), C piscinae (LMG 3947T) e C. subtsugae (DSM 17043T) foi de 58,5%, 59,0%, 57,0% e 68,7% respectivamente (MENEZES et al., 2015).
2.4.8 Chromobacterium alkanivorans
Bajaj e colaboradores (2016) isolaram a linhagem IITR71T do solo do distrito industrial Eloor, localizado na região de Cochin, sul da Índia. A linhagem obtida foi caracterizada como pertencente ao grupo β-Proteobacteria, mais especificamente como membro do gênero Chromobacterium.
Análises morfológicas e fisiológicas indicam que a nova espécie denominada Chromobacterium alkanivorans (IITR71T) possua células Gram negativas, facultativamente anaeróbias, com formato arredondado e móveis. Suas colônias apresentam-se circulares e convexas com uma coloração creme forte. Ao contrário de todas as espécies de Chromobacterium até o momento conhecidas, a linhagem IITR71T é capaz de utilizar três diferentes compostos clorados como fonte de carbono: declorinato 1-clorobutano, 1-cloropropano e 1,2-dicloroetano em meio de sal mineral suplementado com 0,01% de extrato de levedura. As porcentagens de diminuição dos compostos acima citados sob condições experimentais foram de 83,19%, 79,64% e 37,09% respectivamente. Também é capaz de produzir ácidos a partir de diferentes fontes de carboidrato, possui sensibilidade aos antibióticos, hidrolisa caseína, reduz nitrato, produz sulforeto de hidrogênio e assimila/oxida diferentes fontes de carbono (BAJAJ et al., 2016).
Análises moleculares atestam a similaridade da sequência do gene RNA ribossomal 16S de IITR-71T: 99,3% em relação à sequência do mesmo gene para C. aquaticum (MTCC 11259T), de 98,6% para C. haemolyticum (MTCC 11261T) e 97,1% para C. piscinae (MTCC 11258T). A porcentagem de semelhança desse gene em relação às restantes espécies conhecidas do mesmo gênero resultou em menos de 97.1%. A análise por meio de hibridação DNA-DNA sugere uma semelhança genômica total de 60,2% com C. aquaticum (MTCC 11259T), 43,5% com C. haemolyticum (MTCC 11261T) e 30,5% com C. piscinae (MTCC 11258T). O conteúdo de G+C para C. alkanivorans (IITR71T) é de 61,2 mol%. A análise da espécie por espectometria de massa em MALDI-TOF gerou um perfil de espectro de massa (MSP) que ratificou o parentesco filogenético de IITR-71T com as linhagens MTCC 11259T, MTCC 11261T e MTCC 11258T (BAJAJ et al., 2016).
2.4.9 Chromobacterium rhizoryzae
Zhou e colaboradores (2016) isolaram a linhagem de Chromobacterium rhizoryzae (LAM1188T) a partir de raízes de arroz (Oryza sativa). Após análise por abordagem polifásica a cepa acima mencionada foi caracterizada como uma nova espécie pertencente ao gênero Chromobacterium.
A célula de Chromobacterium rhizoryzae é Gram negativa, anaeróbia facultativa, possui formato alongado com extremidades redondas, é móvel com a presença de um flagelo polar e não produz oxidase e catalase. As colônias possuem coloração creme escura e textura macia, crescem em meio TSA (BD/Difco 236950), NA (BD/Difco 212000), MacConkey (Oxoid) e R2A (Oxoid). Possui atividade hemolítica em agar sangue 5% (Difco), e produz lecitinase e lipase. Não apresenta fluorescência. Além disto, uma interessante característica é de que, apesar de não requerer NaCl para seu crescimento, é capaz de tolerar até 3,5% de NaCl (w/v) tanto em meio mineral como em TSB (BD/Difco 211825). Em relação ao teste de sensibilidade a antibióticos, LAM1188T é sensível a diversos deles, como: polimixina B, canamicina, tetraciclina, cloromicetina, estreptomicina, gentamicina, neomicina, tetraciclina, dentre outros (ZHOU et al., 2016).
No que diz respeito às análises moleculares, C. rhizoryzae (LAM1188T) compartilha similaridade em relação à sequência do gene RNA ribossomal 16S nas seguintes porcentagens: 98,7% com C. haemolyticum (MDA0585T), 97,3% com C. aquaticum (CC-SEYA- 1T), 96,5% com C. piscinae (CCM 3329T), 96,3% com C. pseudoviolaceum (CCM 2076T), 96,2% com C. subtsugae (PRAA4-1T), 96,1% com C. vaccinii (MWU205T), 96,0% com C. amazonense (CBMAI 310T) e 95,2% com C. violaceum (ATCC 12472T). O conteúdo de G+C para LAM1188T é de 64,1 mol%. A hibridação DNA-DNA entre o genoma total de C. rhizoryzae e C. haemolyticum (JCM 14163T) é de 54,0 ± 2,1 % enquanto que a porcentagem de hibridação com o genoma de C. aquaticum (CCUG 55175T) é de 44,0 ± 1,2% (ZHOU et al., 2016).
2.4.10 Chromobacterium sphagni
Blackburn e colaboradores (2017) isolaram a linhagem de Chromobacterium sphagni (IIBBL 14B-1T) de áreas alagadas conhecidas como o sphagnum mog em
West Virginia e Maine, Estados Unidos. Análises por meio da identidade média nucleotídica (Average Nucleotide Identity) obtidas a partir de duas das linhagens isoladas e comparações dessas com sequências do genoma completo de espécies Tipo já descritas dentro do gênero Chromobacterium resultam na confirmação da nova espécie descrita como Chromobacterium sphagni (IIBBL 14B-1T).
A célula de Chromobacterium sphagni (IIBBL 14B-1T) é Gram negativa, possui formato de bastonete, forma colônias convexas e de textura macia, com bordas regulares e coloração violeta. As colônias não são fluorescentes e as células possuem um flagelo polar com um número variável de flagelos laterais. C. sphagni (IIBBL 14B-1T) cresce em meios de cultura entre 15 ºC e 40 ºC, em uma faixa de pH de 4,5 a 9,0 e com 2,0% de NaCl. É capaz de reduzir nitrato a nitrito, arginina dihidrolase, lipase e protease, além de poder assimilar glicose, N-acetilglicosamina e glucanato de potássio. Os principais lipídeos polares são fosfatidiletanolamina e difosfatidilglicerol. Em relação a resistência a antibióticos, é positiva para peninicilina, streptomicina, neomicina e aminoglicosídeos. A porcentagem de similaridade genômica entre a espécie C. sphagni (IIBBL 14B-1T) e as demais espécies do gênero Chromobacterium sp. não ultrapassa 88%, sendo o conteúdo de G+C calculado em 63,4%. A nova espécie descrita apresenta interessante toxicidade a certas larvas de lepdópteros (BACKBURN et al., 2017).
2.5 Patogenicidade do gênero Chomobacterium
Existem atualmente vários relatos na literatura a respeito de infecções causadas por espécies de Chromobacterium. Por ser causada por um bacilo Gram negativo e saprófito facultativo, a doença é relativamente rara e negligenciada, constituindo um problema a respeito de um tratamento eficaz e conclusivo (CHATTOPADHYAY et al., 2002). Segundo Martinez e Mattar (2007), até 2007 havia registro de apenas quatro casos de infecções causadas pela bactéria na América do Sul, sendo um na Argentina e três no Brasil.
Devido à ubiquidade e grande capacidade de adaptação da bactéria, o que permite que seja encontrada em diferentes locais, tratamentos eficazes possuem trivial importância sendo, contudo, difíceis de alcançar (MARTINEZ et al., 2000; CHATTOPADHYAY et al., 2002; MARTINEZ; MATTAR, 2007; LIN et al., 2016). Até
2002, a maioria dos relatos de casos causados por C. violaceum eram provenientes do sudeste da Ásia e dos Estados Unidos, porém atualmente há relatos da doença em diversos países ao redor do mundo, os quais frequentemente evoluem para uma septicemia, comumentemente levando o paciente a óbito (CHATTOPADHYAY et al., 2002; MARTINEZ e MATTAR, 2007).
As espécies relacionadas aos casos clínicos (C.violaceum e C. haemolyticum) são oportunistas e, portanto, a infecção causada pelo micro-organismo geralmente ocorre devido à presença de feridas na pele e ao contato destas com água e solo contaminados. Macher e colaboradores (1982) sugerem uma possível correlação entre a predisposição à doença com a doença crônica granulomatosa (CGD) (MACHER et al., 1982; DESJARDINS et al., 1999). Apesar disto, há estudos que contestem a existência de qualquer fator de predisposição às infecções por C. violaceum. (MCGOWAN, JR. J. E.; STEINBERG, J. P., 1995).
Mais recentemente, Meher-Homji et al. (2017) reportaram um caso de um paciente portador da CGD que contraiu infecção por C. violaceum. Os sintomas apresentados pelo paciente foram trombose da veia jugular interna esquerda, a qual estendeu-se desde o nível da cartilagem tireóidea até a base superior do crânio. Este foi o primeiro registro de trombose causada por infecção de C. violaceum. (MEHER-HOMJI et al., 2017).
Os sintomas que normalmente precedem a doença bacteriana causada por C. violaceum incluem infecções na pele e em tecidos moles, abscessos na pele, os quais muitas vezes evoluem para abscessos metastáticos, nas vísceras, nos pulmões, baço, linfonodos e fígado, dor de garganta, celulite, febre, dores abdominais e no pescoço (DESJARDINS et al., 1999; MARTINEZ et al., 2000; UMADEVI et al., 2013; MEHER- HOMJI et al., 2017). Pacientes imunossuprimidos e com histórico de infecções bacterianas e fúngicas são mais sucetíveis à infecção, a qual pode evoluir à septicemia e levar o indivíduo à óbito (MEHER- HOMJI et al., 2017). Em contraste com estudos apresentados por Homji e colaboradores (2017) indicando taxa de mortalidade de 93% em pacientes infectados por C. violaceum e que não possuem CGD, especula-se que o índice de mortalidade da doença seja sub-estimado devido à ausência de exames prévios ao óbito. Outros relatos também sugerem taxas de mortalidade da doença entre 60-80%, não correlacionando a infecção com a CGD (UMADEVI et al., 2013). Devido à grande incidência de óbitos
ocasionados pela enfermidade, com ressalva de um caso reportado recentemente e ocorrido na Austrália, o qual apresentou índice de 7% de mortalidade (LIN et al., 2016), recomenda-se uma profilaxia de longa duração (MEHER- HOMJI et al., 2017). Uma das principais dificuldades para o tratamento de infecções causadas por C. violaceum reside na realização de um diagnóstico correto da doença. Muitas vezes a mesma é identificada erroneamente ou associada a contaminações, o que retarda o seu tratamento. Por exemplo, infecções causadas por uma cepa de Chromobacterium não pigmentada são extremamente difíceis de distinguir de infecções causadas pela espécie Aeromonas (DESJARDINS et al., 1999). Os bacilos geralmente são resistentes a penicilinas e cefalosporinas, sendo normalmente tratados com fluoroquinonas, cotrimoxazole, aminoglicosídeos, cloranfenicol e carbapenos. Devido à reincidência da doença ser extremamente comum, recomenda-se que o tratamento seja realizado da forma mais rápida possível (UMADEVI et al., 2013).
Um estudo recente a respeito dos mecanismos moleculares relacionados à patogenicidade do grupo revela que o principal fator de virulência é o fator de secreção do tipo III (T3SS), o qual consiste em um complexo multiproteico que permite a introdução do material bacteriano nas células do organismo infectado (GALÁN et al., 2014). Os dados obtidos do genoma de C. violaceum (ATCC 12472T) revelam que o gênero Chromobacterium possui dois sistemas de virulência T3SSs, os quais foram caracterizados em duas ilhas de patogenicidade: Cpi-1 e Cpi-2, porém, enquanto que os genes de Cpi-2 estão agrupados juntos, alguns genes do Cpi-1 que codificam proteínas do complexo de virulência estão distantes, sendo agrupadas no sub-complexo Cpi-1a (VASCONCELOS et al., 2003, BETTS et al., 2004).
Segundo Batista e Neto (2017) o complexo Cpi-1/1a T3SS está presente em quase todo gênero, com exceção apenas de C. piscinae, enquanto que o complexo Cpi-2 possui uma distribuição estreita, sendo restrito a C. piscinae e C. vaccinii, o que suscita a hipótese de que Cpi-1 tenha surgido antes de Cpi-2 dentro do grupo. Além disso, o fato dos clusters gênicos T3SS não serem exclusivamente associados à virulência, também sendo encontrados em genomas de bactérias não patogênicas e estando relacionados à interação destas com outros micro-organismos (NAZIR et
