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MARIANA ROBERTO GAMA SATO
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FASES ESTACIONÁRIAS MONOLÍTICAS BASEADAS EM
METACRILATOS PARA USO EM CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CAPILAR
CAMPINAS
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
MARIANA ROBERTO GAMA SATO
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FASES ESTACIONÁRIAS MONOLÍTICAS BASEADAS EM METACRILATOS PARA USO EM
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CAPILAR
ORIENTADORA: PROFA. DRA. CARLA BEATRIZ GRESPAN BOTTOLI
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM CIÊNCIAS.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR MARIANA ROBERTO GAMA SATO E ORIENTADA
PELA PROFA. DRA. CARLA BEATRIZ GRESPAN BOTTOLI.
___________________________________________
Assinatura da Orientadora
CAMPINAS 2014
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química
Simone Lucas Gonçalves de Oliveira - CRB 8/8144
Sato, Mariana Roberto Gama,
Sa83d SatDesenvolvimento e caracterização de fases estacionárias monolíticas baseadas em metacrilatos para uso em cromatografia líquida capilar / Mariana Roberto Gama Sato. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
SatOrientador: Carla Beatriz Grespan Bottoli.
SatTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Sat1. Cromatografia líquida. 2. Colunas capilares. 3. Fases estacionárias. 4. Monolitos. 5. Polímeros porosos. 6. Metacrilatos. I. Bottoli, Carla Beatriz Grespan. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Development and characterization of monolithic stationary phases based on methacrylates for use in capillary liquid chromatography
Palavras-chave em inglês: Liquid chromatography Capillary columns Stationary phases Monoliths Porous polymers Methacrylates
Área de concentração: Química Analítica Titulação: Doutora em Ciências
Banca examinadora:
Carla Beatriz Grespan Bottoli [Orientador] Marcone Augusto Leal de Oliveira
Jorge Cesar Masini
Isabel Cristina Sales Fontes Jardim Ivo Milton Raimundo Júnior
Data de defesa: 27-08-2014
Programa de Pós-Graduação: Química
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
vii
Dedico esta tese aos meus amados,
Jacqueline, José Alfredo, Guilherme e Marcelo,
meus refúgios nos momentos de tormenta.
ix
AGRADECIMENTOS
A Deus, por guiar meus passos, iluminar meu caminho e me dar forças por
inúmeras vezes.
Aos meus pais, Jacqueline e José Alfredo, e ao meu irmão, Guilherme, por me
darem tanto amor e carinho, por acreditarem sempre nos meus projetos e
apoiá-los a qualquer momento. Mãe, obrigada pela sua paciência especialmente
multiplicada, pelas orações e por todas as velinhas acessas para meu anjo da
guarda...
Ao meu esposo, Marcelo, pelo amor paciente e sereno, pelo apoio
incondicional, pelas palavras de motivação e pelas discussões científicas, com
seus finais em gargalhadas.
À minha família, por compreender minha ausência neste período.
À minha orientadora, Carla, pelo seu papel fundamental e decisivo no meu
processo de amadurecimento pessoal e profissional nestes anos de uma parceria
mais que agradável. Obrigada pela confiança e pela liberdade que você me deu
para que eu conduzisse esse trabalho da melhor maneira possível.
Ao Dr. Milton L. Lee, da Brigham Young University, por abrir seu
laboratório e compartilhar comigo seu conhecimento, assim como fizeram seus
alunos de doutorado, Kun Liu e Pankaj Aggarwal.
Ao meu anjo da guarda, Dra. Maria Zanandrea, pelo afeto e atenção durante
minha temporada em Provo.
x
Às docentes deste Instituto, Carol H. Collins, Isabel C. Sales Fontes Jardim e
Ana Valéria C. Simionato, pela contribuição que me ofereceram no exame de
qualificação.
A todos os meus companheiros de laboratório, sejam “líquidos” ou “gasosos”,
atuais e passados, por anos de amizade e colaboração.
Aos técnicos dos laboratórios de ensino, pelo trabalho conjunto durante os
semestres de estágio docente, e aos supervisores docentes destes estágios, que
me proporcionaram uma experiência fantástica de ensino e aprendizado.
A todos os professores, funcionários e colegas do Instituto de Química que
contribuíram para a realização deste trabalho.
À UNICAMP e ao Instituto de Química, pela estrutura oferecida.
À Capes, pelo apoio financeiro.
Ao CNPq, pela concessão de bolsa de estágio de doutorado no exterior.
A todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para que este trabalho
fosse concretizado.
A todos com os quais aprendi e continuo a aprender.
Our Father, who art in heaven, hallowed be Thy name. Thy kingdom come, Thy will be done, on earth as it is in heaven. Give us this day our daily bread and forgive us our trespasses, as we forgive those who trespass against us. And lead us not into temptation, but deliver us from evil. Amen.
xi
“Só se dedicará a um assunto com toda a seriedade alguém que esteja
envolvido de modo imediato e que dele se ocupe com amor. É sempre de
tais pessoas que vêm as grandes descobertas.”
xiii
CURRICULUM VITAE
DADOS PESSOAIS
Nome: Mariana Roberto Gama Sato
Nome em citações bibliográficas: M.R. Gama Endereço eletrônico: marianaroberto@gmail.com
FORMAÇÃO ACADÊMICA
MESTRADO EM QUÍMICA
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” campus Araraquara, Instituto de Química.
Título da dissertação: “Degradação de hormônios por processos Fenton mediados por ciclodextrina”.
Período: 08/2008 a 06/2010.
Orientação: Prof. Dr. Raquel Fernandes Pupo Nogueira Financiamento: Capes
GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA-BIOQUIMICA
Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto.
Período: 02/2003 a 12/2007. INICIAÇÃO CIENTÍFICA
Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto.
Título do projeto: “Estudos fotofísicos de fármacos antimaláricos em sistemas nanoestruturados”.
Período: 08/2003 a 07/2007.
Orientação: Profa. Dra. Rose Mary Z. Georgetto Naal Financiamento: PIBIC/CNPq
xiv EXPERIÊNCIA ACADÊMICA
PROGRAMA DE ESTÁGIO DOCENTE (PED) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Atividades de prática docente em disciplinas regulares, sob a orientação de um docente responsável.
Períodos:
PED B: março de 2014 a julho de 2014: QA 316, Química Analítica
Instrumental.
PED B: março de 2013 a julho de 2013: QA 112, Química Analítica
Clássica.
PED B: março de 2012 a julho de 2012: QA 213, Química Analítica
Clássica.
PED C: agosto de 2011 a dezembro de 2011: QA 282, Química Analítica
Clássica.
ARTIGOS CIENTÍFICOS
M.R. Gama, R.G.C. Silva, C.H. Collins, C.B.G. Bottoli, Hydrophilic interaction chromatography, Trends in Analytical Chemistry 37, 48-60, 2012. DOI: 10.1016/j.trac.2012.03.009
M.R. Gama, C.H. Collins, C.B.G. Bottoli, Nano-liquid chromatography in pharmaceutical and biomedical research, Journal of Chromatographic
Science 51, 694-703, 2013. DOI: 10.1093/chromsci/bmt023
M.R. Gama, Processos Fenton como alternativa na remoção de interferentes endócrinos e outros micropoluentes ambientais, Revista Virtual de Química 4, 777-787, 2012.
N.G.S. Mogollón, P.F. Lima, M.R. Gama, M.F. Furlan, S.C.G.N. Braga, P.S. Prata, I.C.S.F. Jardim, F. Augusto, O estado da arte da cromatografia líquida
xv
bidimensional: conceitos fundamentais, instrumentação e aplicações, Química
Nova, no prelo, 2014.
CAPÍTULO DE LIVRO
M.R. Gama, C.B.G. Bottoli, "Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) of Small Molecules", in Encyclopedia of Analytical Chemistry. (Eds) R.A. Meyers, John Wiley: Chichester, 2014.
DOI: 10.1002/9780470027318.a9385.
INDICADORES DE PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Artigos publicados em periódicos: 04 Artigos submetidos: 03
Capítulos de livro: 01
Participação em eventos científicos: 25
Resumos publicados em eventos nacionais: 18 Resumos publicados em eventos internacionais: 05
xvii
RESUMO
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FASES
ESTACIONÁRIAS MONOLÍTICAS BASEADAS EM METACRILATOS PARA USO EM CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CAPILAR.
Autora: Mariana Roberto Gama Sato
Orientadora: Profa. Dra. Carla Beatriz Grespan Bottoli
O desenvolvimento da cromatografia líquida capilar (CLC), como uma alternativa à cromatografia líquida de alta eficiência, tem se destacado no âmbito da miniaturização, uma tendência geral em instrumentação analítica para separações cromatográficas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar fases estacionárias monolíticas para uso em CLC, empregando monolitos poliméricos orgânicos baseados em metacrilatos hidrofóbicos e hidrofílico. O preparo das fases estacionárias monolíticas foi realizado in situ, ou seja, o recheio foi moldado no interior das colunas capilares de 150 µm de diâmetro interno. Foram empregados os monômeros butil metacrilato, lauril metacrilato e trimetilolpropano trimetacrilato no preparo de fases estacionárias monolíticas para separações no modo fase reversa; o polietileno glicol dimetacrilato foi empregado no preparo de fases estacionárias para separações no modo HILIC. As condições de preparo das fases estacionárias monolíticas foram comparadas e envolveram a aplicação de diferentes métodos de iniciação da reação de polimerização, como iniciação por radiação UV e iniciação térmica. O simples entrecruzamento de um monômero multifuncional e a polimerização controlada via radical livre também foram aplicados como métodos de preparo dos materiais monolíticos. As fases estacionárias monolíticas foram caracterizadas por técnicas físicas, como microscopia eletrônica de varredura e porosimetria por sorção de nitrogênio; o desempenho cromatográfico das colunas foi avaliado por meio da técnica de CLC. As fases estacionárias monolíticas mostraram eficiência cromatográfica de até 47000
pratos m-1 para a separação de alquilbenzenos no modo fase reversa e de até
xix
ABSTRACT
DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF MONOLITHIC STATIONARY PHASES BASED ON METHACRYLATES FOR USE IN CAPILLARY LIQUID CHROMATOGRAPHY.
Author: Mariana Roberto Gama Sato
Advisor: Prof. Dr. Carla Beatriz Grespan Bottoli
The development of capillary liquid chromatography (CLC), as an alternative to high performance liquid chromatography, has emerged in miniaturization studies, a common trend in analytical instrumentation for chromatographic separations. The goal of this work was to develop and characterize monolithic stationary phases for use in CLC, using organic polymer monoliths based on hydrophobic and hydrophilic methacrylates. Stationary phases were prepared
in situ by molding of the material inside capillary columns having internal
diameters of 150 µm. The monomers butyl methacrylate, lauryl methacrylate and trimethylolpropane trimethacrylate were employed to prepare monolithic stationary phases for separations in the reversed phase; polyethylene glycol dimethacrylate was used to prepare monolithic stationary phases for separations by the HILIC mode. The preparation conditions were compared and involved the application of different initiation methods for polymerization reactions, such as initiation by UV radiation and initiation by heating. The single crosslinking of multifunctional monomer and controlled free-radical polymerization were also applied as preparation methods of monolithic materials. The monolithic stationary phases were characterized by physical techniques such as scanning electronic microscopy and nitrogen sorption porometry; the chromatographic performance of the columns was evaluated by CLC. The stationary phases
showed chromatographic efficiencies up to 47000 plates m-1 for the separation
of alkylbenzenes in reversed phase mode and up to 45000 plates m-1 for the
xxi
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ... xxix
LISTA DE TABELAS ... xxxi
LISTA DE FIGURAS ... xxxv
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Cromatografia líquida capilar ... 1
1.1.1 Breve histórico da cromatografia líquida capilar ... 3
1.1.2 Terminologia em cromatografia líquida capilar ... 5
1.1.3 Aspectos teóricos da cromatografia líquida capilar ... 7
1.1.4 Instrumentação analítica em cromatografia líquida capilar ... 12
1.1.4.1 Bombas ... 12
1.1.4.2 Tubos e conexões ... 14
1.1.4.3 Injetores ... 17
1.1.4.4 Colunas cromatográficas capilares ... 18
1.1.4.5 Detectores ... 20
1.1.4.6 Separações multidimensionais em cromatografia líquida capilar ... 21
1.2 Fases estacionárias para cromatografia líquida capilar ... 23
1.2.1 Fases estacionárias monolíticas ... 25
1.2.2 Monolitos baseados em metacrilatos ... 33
1.3 Caracterização das fases estacionárias monolíticas ... 35
xxii
1.3.1.1 Caracterização da estrutura porosa por técnica de sorção de nitrogênio ... 36 1.3.1.2 Caracterização da estrutura porosa por técnica in situ ... 41 1.3.1.3 Microscopia eletrônica de varredura ... 44 1.3.2 Caracterização cromatográfica ... 45 2 OBJETIVOS ... 55 2.1 Objetivos gerais ... 55 2.2 Objetivos específicos ... 55 3 DESENVOLVIMENTO EXPERIMENTAL ... 57 3.1 Materiais ... 57 3.1.1 Reagentes ... 57 3.1.2 Capilares ... 57 3.2 Equipamentos ... 58 3.3 Pré-tratamento dos capilares ... 58 3.4 Monolitos poliméricos orgânicos baseados em metacrilatos ... 59 3.4.1 Preparo de monolitos baseados em monômeros hidrofóbicos por aquecimento ... 59 3.4.2 Preparo de monolitos baseados em monômeros hidrofóbicos por
living polymerization ... 60
3.4.3 Preparo de monolitos baseados em monômeros hidrofóbicos por radiação ultravioleta ... 62
xxiii
3.4.4 Preparo de monolitos baseados em monômero hidrofóbico por simples entrecruzamento ... 62 3.4.5 Preparo de monolitos baseados em monômeros hidrofílicos por radiação ultravioleta ... 64 3.5 Caracterizações química e física das fases estacionárias ... 65
3.5.1 Análise elementar ... 65 3.5.2 Análise termogravimétrica ... 66 3.5.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho ... 66 3.5.4 Microscopia eletrônica de varredura ... 67 3.5.5 Caracterização porosimétrica por sorção de nitrogênio ... 67 3.5.6 Caracterização porosimétrica in situ por capillary flow
porometry ... 68
3.6 Caracterização cromatográfica das fases estacionárias ... 69 3.6.1 Condicionamento das colunas cromatográficas ... 70 3.6.2 Determinação da vazão ótima de fase móvel ... 70 3.6.3 Avaliação cromatográfica das fases estacionárias ... 71
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 77
Parte I – Monolitos poliméricos orgânicos baseados em butil metacrilato ... 77
4.I.1 Pré-tratamento da parede interna de capilares ... 77 4.I.2 Estudo dos solventes porogênicos no preparo de monolitos baseados em BMA ... 78 4.I.3 Otimização das condições de preparo de monolitos baseados em BMA ... 82
xxiv
4.I.4 Caracterização cromatográfica dos monolitos baseados em BMA ... 88 4.I.4.1 Pressão de trabalho ... 89 4.I.4.2 Determinação da vazão ótima da fase móvel ... 90 4.I.4.3 Avaliação cromatográfica dos monolitos baseados em BMA .... 91 4.I.5 Caracterizações química e física dos monolitos baseados em BMA ... 95
4.I.5.1 Análise elementar ... 95 4.I.5.2 Análise termogravimétrica ... 96 4.I.5.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho ... 97 4.I.5.4 Microscopia eletrônica de varredura ... 99 4.I.5.5 Área superficial ... 102 4.I.5.6 Capillary flow porometry ... 102 4.I.6 Avaliação de diferentes métodos de iniciação no preparo de monolitos baseados em BMA ... 104
4.I.6.1 Preparo das colunas monolíticas e caracterização cromatográfica ... 104 4.I.6.2 Microscopia eletrônica de varredura ... 109 4.I.6.3 Área superficial ... 111 4.I.7 Avaliação de solventes porogênicos utilizados no preparo de monolitos baseados em BMA ... 112
4.I.7.1 Desenvolvimento, preparação e caracterização das colunas monolíticas ... 112 4.I.7.2 Microscopia eletrônica de varredura ... 118
Parte II – Monolitos poliméricos orgânicos baseados em lauril metacrilato ... 121
xxv
4.II.1 Caracterização cromatográfica dos monolitos baseados em LMA ... 121 4.II.1.1 Pressão de trabalho ... 122 4.II.1.2 Determinação da vazão ótima da fase móvel ... 123 4.II.1.3 Avaliação cromatográfica dos monolitos baseados em LMA ... 124 4.II.2 Caracterizações química e física dos monolitos baseados em LMA ... 128 4.II.2.1 Análise elementar ... 128 4.II.2.2 Análise termogravimétrica ... 128 4.II.2.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho ... 130 4.II.2.4 Microscopia eletrônica de varredura ... 131 4.II.2.5 Área superficial ... 133 4.II.2.6 Capillary flow porometry ... 134 4.II.3 Avaliação de diferentes métodos de iniciação no preparo de monolitos baseados em LMA ... 135 4.II.3.1 Preparo dos monolitos e caracterização cromatográfica ... 135 4.II.3.2 Microscopia eletrônica de varredura ... 139 4.II.3.3 Área superficial ... 141
Parte III – Monolitos poliméricos orgânicos baseados em trimetilolpropano trimetacrilato ... 143
4.III.1 Desenvolvimento, preparação e avaliação qualitativa dos monolitos baseados em TMPTMA ... 143 4.III.1.1 Otimização da composição das misturas de polimerização usadas no preparo de monolitos por simples entrecruzamento ... 143
xxvi
4.III.1.2 Preparo de colunas monolíticas de comprimento reduzido ... 146 4.III.2 Caracterização cromatográfica de colunas monolíticas baseadas em TMPTMA ... 149 4.III.3 Caracterização física dos monolitos baseados em TMPTMA ... 153 4.III.3.1 Microscopia eletrônica de varredura ... 153 4.III.3.2 Área superficial ... 155
Parte IV – Monolitos poliméricos orgânicos baseados em polietileno glicol dimetacrilato para separações no modo HILIC ... 157
4.IV.1 Otimização da composição da mistura de polimerização usadas no preparo de monolitos baseados em monômeros hidrofílicos ... 158
4.IV.1.1 Fases estacionárias baseadas em diferentes monômeros hidrofílicos ... 158 4.IV.1.2 Fases estacionárias baseadas em PEGDMA ... 160 4.IV.2 Caracterização cromatográfica de colunas monolíticas baseadas em PEGDMA ... 162 4.IV.2.1 Avaliação do mecanismo HILIC nas colunas baseadas em PEGDMA ... 162 4.IV.2.2 Separação de misturas-teste polares ... 164 4.IV.3 Caracterização física dos monolitos baseados em PEGDMA ... 170
4.IV.3.1 Microscopia eletrônica de varredura ... 170 4.IV.3.2 Área superficial ... 171
xxvii
5 CONCLUSÕES ... 173
6 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 177
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 179
xxix
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ACN acetonitrila
AIBN azoisobisbutironitrila
BMA butil metacrilato
BTeE propionato de 2-etil-2-metil-telúrio
CEA carboxietil acrilato
CEC eletrocromatografia capilar
CFP capillary flow porometry
CH cicloexanol
CLAE cromatografia líquida de alta eficiência
CLC cromatografia líquida capilar
DMF dimetilformamida
DMPA 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona
DTG derivada termogravimétrica
EG etileno glicol
EGDMA etilenoglicol dimetacrilato
EM espectrometria de massas
HEA hidroxietil acrilato
HILIC cromatografia líquida de interações hidrofílicas
hydrophilic interaction liquid chromatography
IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada
IV infravermelho
LMA lauril metacrilato
xxx
MEV microscopia eletrônica de varredura
PEG polietileno glicol
PEGDMA polietileno glicol dimetacrilato
SAXS espalhamento de raios-x a baixo ângulo
small-angle X-ray scattering
TGA análise termogravimétrica
THF tetraidrofurano
TMPTMA trimetilolpropano trimetacrilato
UV ultravioleta
µL microlitro
As10 fator de assimetria de pico a 10% de sua altura
d.i. diâmetro interno
k fator de retenção m/m proporção massa/massa m/v proporção massa/volume N eficiência cromatográfica nL nanolitro nm nanometro Rs resolução cromatográfica
tM tempo de retardamento da fase móvel
tR tempo de retenção
v/v proporção volume/volume
VP volume de pico
wb largura de pico medido na base
xxxi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Terminologia utilizada atualmente em cromatografia líquida (CL).
Adaptado de Chervet et al. [24] ... 7
Tabela 2. Comparação dos volumes de pico (Vp) e concentração relativa de
pico (Crel) em colunas de diferentes diâmetros internos e 25 cm de comprimento.
Adaptado da referência [25] ... 9
Tabela 3. Comprimento máximo de tubos e conexões de diferentes diâmetros
internos (d.i.) para sistemas com colunas de d.i. variados. Considerações: comprimento da coluna = 25 cm, N = 10000 pratos, k = 0. Adaptado da referência [2] ... 16
Tabela 4. Natureza e proporção dos reagentes usados no preparo dos monolitos
baseados em metacrilatos hidrofóbicos ... 60
Tabela 5. Proporção dos reagentes usados no preparo, por simples
entrecruzamento, das colunas monolíticas baseadas em TMPTMA ... 64
Tabela 6. Condições experimentais aplicadas no preparo de monolitos baseados
em BMA ... 83
Tabela 7. Principais parâmetros cromatográficos obtidos para a fase
estacionária baseada em BMA ... 93
Tabela 8. Eficiência cromatográfica de fases estacionárias baseadas em BMA,
obtidas por diferentes meios de iniciação ... 107
Tabela 9. Parâmetros cromatográficos das colunas monolíticas baseadas em
xxxii
Tabela 10. Área superficial de monolitos baseados em BMA, obtidos por
diferentes métodos de iniciação ... 111
Tabela 11. Efeito dos solventes porogênicos nos parâmetros cromatográficos
de fases estacionárias baseadas em BMA, preparadas por iniciação térmica por imersão ... 113
Tabela 12. Efeito dos solventes porogênicos nos parâmetros cromatográficos
de fases estacionárias baseadas em BMA, preparadas por iniciação por radiação UV ... 114
Tabela 13. Eficiência cromatográfica de fases estacionárias baseadas em LMA,
obtidas por diferentes meios de iniciação ... 137
Tabela 14. Parâmetros cromatográficos das colunas monolíticas baseadas em
LMA ... 137
Tabela 15. Área superficial de monolitos baseados em LMA, obtidos por
diferentes métodos de iniciação ... 141
Tabela 16. Proporção dos reagentes usados no preparo de colunas monolíticas
baseados em TMPTMA obtidas por simples entrecruzamento, utilizando 25% de monômero e 0,06% (m/m) de BTeE na composição da mistura de polimerização, e pressão durante a lavagem das colunas, em bar ... 147
Tabela 17. Eficiência cromatográfica das colunas monolíticas baseadas em
TMPTMA ... 152
Tabela 18. Parâmetros cromatográficos das colunas monolíticas baseadas em
TMPTMA ... 153
Tabela 19. Área superficial de monolitos baseados em TMPTMA, obtidos pela
xxxiii
Tabela 20. Monômeros hidrofílicos usados no preparo de monolitos
hidrofílicos e suas características após a reação de polimerização ... 159
Tabela 21. Proporção de monômeros usados no preparo de colunas monolíticas
baseadas em PEGDMA e pressão das colunas de 5,0 cm durante a lavagem ... 161
Tabela 22. Principais parâmetros cromatográficos obtidos para a fase
estacionária baseada em PEGDMA ... 169
xxxv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fotomicrografias eletrônicas de varredura, mostrando a estrutura
porosa tridimensional de monolitos baseados em (A) sílica e (B) polímeros orgânicos, sob diferentes aumentos. Adaptado das referências [73] e [74] ... 27
Figura 2. Comparativo entre curvas de van Deemter usando (A) coluna
comercial particulada e (B) coluna comercial monolítica. Adaptado da referência [77] ... 29
Figura 3. Tipos de isoterma de sorção em sólidos, propostos pela IUPAC. O
ramo da adsorção é representado pela seta ascendente, enquanto que o ramo da dessorção é representado pela seta descendente. Adaptado da referência [114] ... 39
Figura 4. Cromatograma hipotético da separação de dois analitos, mostrando
as medidas empregadas na determinação dos parâmetros cromatográficos. Adaptado da referência [129] ... 46
Figura 5. Medida relacionada ao cálculo do fator de assimetria. Adaptado da
referência [129] ... 49
Figura 6. Curva de van Deemter hipotética. Adaptado da referência [133] ... 53
Figura 7. Estrutura química do promotor radicalar BTeE ... 61
Figura 8. Estrutura química do monômero TMPTMA ... 63
Figura 9. Representação esquemática do dispositivo usado na análise
porosimétrica por CFP, mostrando o deslocamento do líquido no interior da pipeta causado pela passagem de gás nitrogênio ... 68
xxxvi
Figura 10. Fórmulas estruturais dos alquilbenzenos usados na avaliação
cromatográfica de fases estacionárias monolíticas no modo reverso ... 72
Figura 11. Fórmulas estruturais das moléculas de (A) orto-terfenil e (B)
trifenileno, usadas na avaliação estérica de fases estacionárias monolítica ... 73
Figura 12. Fórmulas estruturais das bases nitrogenadas aplicadas na avaliação
cromatográfica de fases estacionárias monolíticas usadas no modo HILIC: (A) adenina, (B) guanina, (C) timina, (D) citosina, (E) uracila ... 74
Figura 13. Fórmulas estruturais das amidas polares aplicadas na avaliação
cromatográfica de fases estacionárias monolíticas usadas no modo HILIC: (A) acrilamida, (B) hidroximetil acrilamida, (C) metacrilamida, (D) N,N-dimetil acrilamida ... 74
Figura 14. Representação esquemática da reação, sob aquecimento,
envolvendo os grupos silanoatos da parede interna do capilar. Adaptado da referência [138] ... 77
Figura 15. Isotermas de sorção de nitrogênio para monolitos baseados em BMA
preparados com (A) n-propanol e (B) isopropanol ... 80
Figura 16. Reação de decomposição do AIBN sob aquecimento ... 82
Figura 17. Fotomicrografias eletrônicas de varredura dos monolitos baseados
em BMA, sob diferentes condições de preparo, de acordo com a Tabela 6. Aumentos de 10000 vezes ... 85
Figura 18. Perfil da pressão frente à vazão de metanol (-►-) e de acetonitrila (-●-) como fase móvel, para uma coluna cromatográfica baseada em BMA, de dimensões 20 cm de comprimento e 100 µm de diâmetro interno ... 89
xxxvii
Figura 19. Curva de van Deemter obtida de coluna monolítica baseada em
BMA, calculada para o pico do pentilbenzeno ... 90
Figura 20. Cromatograma obtido na separação de alquilbenzenos em coluna
monolítica baseada em BMA. Condições cromatográficas: fase móvel com
eluição por gradiente 0-20 min ACN:H2O 40:60 a 50:50 (v/v), e depois
ACN:H2O 50:50 (v/v); vazão 1,25 µL min-1; temperatura do forno da coluna 40
°C; volume de injeção 0,1 µL; pressão de trabalho máxima 50 bar. Detecção UV em 254 nm. Analitos: (1) uracila, (2) benzeno, (3) tolueno, (4) etilbenzeno, (5) propilbenzeno, (6) butilbenzeno e (7) pentilbenzeno ... 92
Figura 21. Cromatograma obtido na separação de orto-terfenil e trifenileno em
coluna baseada em BMA. Condições cromatográficas: fase móvel ACN:H2O
50:50 (v/v); vazão 1,25 µL min-1; temperatura do forno da coluna 40 °C; volume
de injeção 0,1 µL. Detecção UV em 254 nm. Analitos: (1) uracila, (2) orto-terfenil e (3) trifenileno ... 94
Figura 22. Curvas de TGA (sólida) e DTG (pontilhada) obtidas para o monolito
baseado em BMA ... 96
Figura 23. Espectro de absorção na região do infravermelho do monolito
polimérico orgânico baseado em BMA ... 97
Figura 24. Fotomicrografias eletrônicas de varredura de dois segmentos de
coluna monolítica baseada em BMA. Aumentos de (A) e (C) 250x, e (B) e (D) 850x (B) ... 100
Figura 25. Fotomicrografias de diferentes regiões de uma mesma coluna
monolítica baseada em BMA. Aumentos de 10000 vezes ... 101
Figura 26. Curvas de distribuição de macroporos obtidas de duas diferentes
regiões de uma mesma coluna capilar baseada em BMA, preenchida com uma única mistura de polimerização ... 103
xxxviii
Figura 27. Cromatogramas obtidos na separação de alquilbenzenos em colunas
monolíticas baseadas em BMA, preparadas por diferentes tipos de iniciação. (A) Iniciação térmica, por aquecimento por imersão. (B) Living polymerization. (C) Iniciação por radiação UV. Condições cromatográficas: fase móvel
ACN:H2O 70:30 (v/v); vazão 0,3 µL min-1; volume de injeção 30 nL; pressão
de trabalho máxima 15 bar. Detecção UV em 214 nm Analitos: (1) uracila, (2) tolueno, (3) etilbenzeno, (4) propilbenzeno, (5) butilbenzeno e (6) pentilbenzeno ... 106
Figura 28. Fotomicrografias de colunas monolíticas baseadas em BMA,
obtidas por diferentes métodos de iniciação. (A) Iniciação térmica, por aquecimento por imersão. (B) Living polymerization. (C) Iniciação por radiação UV. Aumentos de 1200 vezes ... 110
Figura 29. Cromatogramas obtidos na separação de alquilbenzenos em colunas
monolíticas baseadas em BMA, preparadas com diferentes misturas de solventes porogênicos e por diferentes métodos de iniciação. (A) PEG e metanol, iniciação térmica; (B) PEG e metanol, iniciação por UV; (C) isobutanol e 1,4-butanodiol, iniciação térmica; (D) isobutanol e 1,4-butanodiol, iniciação por UV; (E) EG e metanol, iniciação térmica; (F) EG e metanol, iniciação por UV. Condições cromatográficas: eluição isocrática, fase móvel
ACN:H2O 70:30 (v/v); vazão 0,3 µL min-1; volume de injeção 30 nL; pressão
de trabalho máxima 150 bar. Detecção UV em 214 nm. Analitos: (1) uracila, (2) tolueno, (3) etilbenzeno, (4) propilbenzeno, (5) butilbenzeno e (6) pentilbenzeno ... 117
Figura 30. Fotomicrografias de colunas monolíticas baseadas em BMA,
preparadas com diferentes misturas de solventes porogênicos e por diferentes métodos de iniciação. (A) PEG e metanol, iniciação térmica; (B) PEG e metanol, iniciação por UV; (C) isobutanol e 1,4-butanodiol, iniciação térmica; (D) isobutanol e 1,4-butanodiol, iniciação por UV; (E) EG e metanol, iniciação térmica; (F) EG e metanol, iniciação por UV. Aumentos de 3000x ... 119
xxxix
Figura 31. Perfil da pressão frente à vazão de metanol (-▲-) e de acetonitrila
(-●-) como fase móvel, para uma coluna cromatográfica baseada em LMA de 20 cm de comprimento e 100 µm de diâmetro interno ... 122
Figura 32. Curva de van Deemter obtida de coluna monolítica baseada em
LMA, calculada para o pico do pentilbenzeno ... 124
Figura 33. Cromatograma obtido na separação de alquilbenzenos em coluna
monolítica baseada em LMA. Condições cromatográficas: fase móvel ACN:H2O
65:35 (v/v); vazão 1,25 µL min-1; temperatura do forno da coluna 40 °C; volume
de injeção 0,1 µL; pressão de trabalho máxima 50 bar. Detecção UV em 254 nm. Analitos: (1) uracila, (2) benzeno, (3) tolueno, (4) etilbenzeno, (5) propilbenzeno, (6) butilbenzeno e (7) pentilbenzeno ... 125
Figura 34. Cromatograma obtido na separação de orto-terfenil e trifenileno em
coluna baseada em LMA. Condições cromatográficas: fase móvel 65% ACN
(v/v). Vazão 1,25 µL min-1; temperatura do forno da coluna 40 °C; volume de
injeção 0,1 µL. Detecção UV em 254 nm. Analitos: (1) uracila, (2) orto-terfenil e (3) trifenileno ... 127
Figura 35. Curvas de TGA (sólida) e DTG (pontilhada) obtidas para o monolito
baseado em LMA ... 129
Figura 36. Espectro de absorção na região do infravermelho do monolito
polimérico orgânico baseado em LMA ... 130
Figura 37. Fotomicrografias eletrônicas de varredura de dois segmentos de
coluna monolítica baseada em LMA. Aumentos de (A) e (C) 250x, e (B) e (D) 850 x ... 132
xl
Figura 38. Curvas de distribuição de macroporos obtidas de duas diferentes
regiões de uma mesma coluna capilar, preenchida com uma única mistura de polimerização, baseada em LMA ... 134
Figura 39. Cromatogramas obtidos na separação de alquilbenzenos em colunas
monolíticas baseadas em LMA, preparadas por diferentes tipos de iniciação. (A) Iniciação térmica, por aquecimento por imersão. (B) Living polymerization. (C) Iniciação por radiação UV. Condições cromatográficas: fase móvel
ACN:H2O 65:35 (v/v); vazão 0,3 µL min-1; volume de injeção 30 nL; pressão
de trabalho máxima 15 bar. Detecção UV em 214 nm. Analitos: (1) uracila, (2) tolueno, (3) etilbenzeno, (4) propilbenzeno, (5) butilbenzeno e (6) pentilbenzeno ... 136
Figura 40. Fotomicrografias de colunas monolíticas baseadas em LMA, obtidas
por meio de diferentes métodos de iniciação. (A) Iniciação térmica, por aquecimento por imersão. (B) Living polymerization. (C) Iniciação por radiação UV. Aumentos de 1200 vezes ... 139
Figura 41. Cromatogramas obtidos na separação de alquilbenzenos em colunas
monolíticas baseadas em TMPTMA (25%, m/m), obtidas por living
polymerization. Solventes porogênicos: (A) 57% de DMF e 18% de EG; (B)
57% de CH e 18% de EG; (C) 50% de CH e 25% de EG. Condições
cromatográficas: fase móvel ACN:H2O 70:30(v/v); vazão 0,3 µL min-1; volume
de injeção 30 nL; pressão de trabalho máxima entre 15 e 20 bar. Detecção UV em 214 nm. Analitos: (1) uracila, (2) tolueno, (3) etilbenzeno, (4) propilbenzeno, (5) butilbenzeno e (6) pentilbenzeno ... 150
xli
Figura 42. Cromatograma obtido na separação de alquilbenzenos em coluna
monolítica baseada em TMPTMA, preparada com 30% de monômero, 46,6% de CH e 23,3% de EG (% m/m) obtida por living polimerization. Condições
cromatográficas: fase móvel ACN:H2O 70:30(v/v); vazão 0,3 µL min-1; volume
de injeção 30 nL; pressão de trabalho máxima 25 bar. Detecção UV em 214 nm. Analitos: (1) uracila, (2) tolueno, (3) etilbenzeno, (4) propilbenzeno, (5) butilbenzeno e (6) pentilbenzeno ... 151
Figura 43. Fotomicrografias eletrônicas de varredura de colunas monolíticas
baseadas em TMPTMA, preparadas com 25% de monômero (m/m), de acordo com a Tabela 17. Aumentos de 650 x (A1, B1, C1) e 8000 x (A2, B2, C2) ... 154
Figura 44. Perfil de retenção da uracila em colunas (A) HEA-PEGDMA e (B)
CEA-PEGDMA, operando no modo de separação HILIC. Condições
cromatográficas: tolueno como marcador de tM, fase móvel ACN e água, vazão
0,3 µL min-1, volume de injeção 30 nL, pressão máxima de trabalho 50 bar
... 163
Figura 45. Cromatograma obtido na separação de nucleosídeos em coluna
monolítica baseada em PEGDMA (20%, m/m). Condições cromatográficas:
fase móvel ACN:H2O 90:10 (v/v), vazão 0,3 µL min-1; volume de injeção 30
nL; pressão máxima de trabalho 30 bar. Detecção UV em 214 nm. Analitos: (1) tolueno, (2) citosina, (3) timina, (4) uracila, (5) adenina, (6) guanina ... 165
Figura 46. Cromatograma obtido na separação de nucleosídeos em coluna
monolítica baseada em PEGDMA (10%, m/m). Condições cromatográficas:
fase móvel ACN:H2O 90:10 (v/v), vazão 0,3 µL min-1; volume de injeção 30
nL; pressão máxima de trabalho 20 bar. Detecção UV em 214 nm. Analitos: (1) tolueno, (2) citosina, (3) timina, (4) uracila, (5) adenina, (6) guanina ... 166
xlii
Figura 47. Cromatograma obtido na separação de amidas polares em coluna
monolítica baseada em PEGDMA. Condições cromatográficas: fase móvel
ACN:H2O 85:15 (v/v); vazão 0,3 µL min-1; volume de injeção 30 nL, pressão
máxima de trabalho 25 bar. Detecção em 214 nm. Analitos: (1) tolueno, (2)
N,N-dimetil acrilamida, (3) metacrilamida, (4) hidroxi acrilamida
... 168
Figura 48. Fotomicrografias eletrônicas de varredura de coluna monolítica
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Cromatografia líquida capilar
O processo de desenvolvimento da cromatografia tem sido observado desde a sua introdução, por Tswett, no começo do século XX [1]. Entretanto, sua ampla utilização não foi observada até a década de 1930.
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) convencional tem experimentado uma constante evolução desde a sua introdução, nos anos 1970, até os dias atuais, especialmente no que diz respeito à miniaturização dos sistemas cromatográficos, seguindo um direcionamento recente no âmbito científico, que trata da miniaturização de sistemas analíticos instrumentais.
Neste sentido, a cromatografia líquida capilar (CLC) é um método instrumental de separação no qual o diâmetro interno das colunas cromatográficas foi reduzido para dimensões da ordem de micrômetros. O redimensionamento de toda instrumentação analítica foi igualmente promovido, reduzindo-se as dimensões dos componentes instrumentais presentes nos equipamentos utilizados [2].
Os aspectos econômicos e ambientais da CLC são conhecidamente vantajosos, especialmente no que diz respeito à redução do consumo de solventes; esta vantagem é importante quando solventes de custo elevado ou tóxicos são utilizados como componentes da fase móvel. Além disso, separações mais eficientes, decorrentes da redução na dispersão das bandas cromatográficas, melhor detectabilidade de analitos, maior velocidade de separação, e excelente acoplamento com a detecção por espectrometria de
2
massas (EM) também são listadas como vantagens da técnica [2-4]. No entanto, algumas limitações da CLC são frequentemente descritas, como dificuldades no enchimento de colunas capilares e problemas na instrumentação analítica, tais como o dimensionamento adequado e a montagem dos componentes de sistemas de separação [4].
Em CLC, os mecanismos de separação são os mesmos da CLAE, já que as características químicas das fases móveis e estacionárias empregadas, bem como dos analitos separados, são as mesmas em ambas as técnicas. Assim, as separações em CLC podem ser desenvolvidas no modo normal, modo reverso, por troca iônica, exclusão por tamanho e até no modo de interações hidrofílicas (HILIC, do inglês Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography), ou qualquer outro modo de separação utilizado em CLAE.
Da mesma maneira, qualquer analito separado por CLAE pode ser separado por CLC, e vice-versa, pois a principal diferença entre as técnicas está relacionada ao dimensionamento do sistema e não à capacidade de separação de uma mistura [5].
Ainda que CLC seja uma alternativa útil e interessante frente à CLAE, Majors [6] recentemente mostrou que menos de 10% dos usuários regulares de cromatografia possuem um equipamento de CLC, frequentemente desenvolvido e construído pelo próprio grupo de pesquisa. Comparados aos números em CLAE, no qual cada grupo de pesquisa possui, em média, três equipamentos, o autor mostrou que a CLC ainda precisa atingir um número maior de usuários para que se torne amplamente difundida.
3
1.1.1 Breve histórico da cromatografia líquida capilar
Embora a CLC seja uma técnica cujo desenvolvimento é recente, a miniaturização de sistemas não é um conceito novo na área de separações e remete a algumas décadas.
Em 1958, Golay [7] revolucionou as análises por cromatografia gasosa por meio da introdução das colunas capilares para esta técnica. Desde então, o uso de capilares em cromatografia gasosa se mostrou altamente viável e poucos avanços relacionados ao desenvolvimento de colunas cromatográficas foram observados para esta técnica [2].
As primeiras sugestões de uso de colunas capilares em cromatografia líquida surgiram na primeira metade da década de 1960, quando Giddings [8] propôs a utilização destas colunas em cromatografia líquida, já que estas vinham sendo utilizadas com sucesso em cromatografia gasosa.
Os primeiros relatos das colunas capilares em cromatografia líquida fizeram uso de colunas tubulares abertas [9], em que somente a parede do tubo capilar é revestida com fase estacionária, enquanto o interior do tubo capilar permanece vazio, em comparação às colunas recheadas, em que todo o capilar é preenchido com fase estacionária, aplicadas tardiamente com diâmetros reduzidos.
No final dos anos 1960, Horváth et al. [10,11] propuseram o uso de colunas miniaturizadas em cromatografia líquida. Nestes trabalhos, tidos como o marco inicial da CLC, os autores estudaram o efeito da dispersão de um pico cromatográfico com a diminuição dos diâmetros internos das colunas, de 0,3 e 1,0 mm.
4
Mais tarde, em 1977, Ishii et al. [12] também relataram o uso de colunas cromatográficas com diâmetro interno menor que 1,0 mm. Neste trabalho, os autores mostraram a viabilidade do uso de colunas tubulares abertas de 0,5 mm de diâmetro interno em separações por cromatografia líquida.
Em seguida, Kucera et al. [13,14] publicaram os primeiros relatos de separações altamente eficientes utilizando colunas recheadas de 1,0 mm de diâmetro interno. Nestes trabalhos, os autores relataram o uso de equipamentos comerciais adaptados à redução do diâmetro interno da coluna, viabilizando a aplicação de colunas recheadas e a economia de solvente em separações de alto desempenho.
Entre os anos de 1978 e 1979, o grupo de pesquisa liderado por Novotny [15-17] publicou uma série de trabalhos em que se empregaram colunas com diâmetro interno entre 30 e 200 µm. Estes trabalhos, junto à publicação de Yang [18], são considerados o grande impulso para o uso de colunas capilares em cromatografia líquida.
Embora promissor, o uso de colunas de diâmetro interno reduzido foi abandonado, pois colunas recheadas de 1,0 mm de diâmetro interno não mostraram significativos ganhos de eficiência cromatográfica em relação às colunas convencionais de 4,6 mm de diâmetro, exceto pela redução no consumo de fase móvel [9].
Apesar dos importantes avanços em CLC entre as décadas de 1960 e 1980, a miniaturização dos sistemas em cromatografia líquida só voltou a ser estudado recentemente. A busca por alternativas à CLAE impulsionou este interesse, seja no âmbito da pesquisa de componentes instrumentais dos sistemas de separação, ou na aplicabilidade das técnicas cromatográficas aos mais diferentes analitos e matrizes.
5
Além disso, o amplo uso da detecção por EM, em especial nas últimas décadas, contribuiu para o avanço da CLC. Esta técnica de separação apresenta excelente acoplamento com a EM, cujas principais vantagens incluem alta detectabilidade, fácil eliminação da fase móvel previamente ao processo de ionização, não exigência de derivatização dos analitos e detecção de um maior número de analitos, quando comparada a outros métodos de detecção. Assim, a CLC-EM é uma ferramenta potente em diferentes campos de pesquisa, o que permite a sua utilização em diferentes áreas e o avanço desta técnica de separação.
1.1.2 Terminologia em cromatografia líquida capilar
Mesmo nos dias atuais, não existe um consenso acerca da terminologia usada em cromatografia líquida em microescala. Diversos sistemas de nomenclatura foram propostos na literatura nas últimas décadas, em relação às colunas e ao nome dado à técnica, mas a adoção de uma terminologia em detrimento a outra depende do autor [19].
Em relação à técnica, termos como nano cromatografia, micro cromatografia e cromatografia capilar são denominações dadas à cromatografia líquida em microescala. Já os termos microbore, microcoluna e coluna capilar se referem à terminologia utilizada para as colunas cromatográficas e são usados como sinônimos para colunas de diâmetro interno reduzido [20].
Deste modo, diversas tentativas de padronização da terminologia utilizada em CLC foram realizadas desde a década de 1980.
6
Ishii [21] propôs a divisão das colunas miniaturizadas em grupos, de acordo com o diâmetro interno; entretanto, estas denominações não foram amplamente adotadas:
4,6 mm: uso em CLAE convencional;
1,5 mm: uso em CLAE semimicro;
0,46 mm: uso em micro-CLAE;
0,15 mm: uso em ultramicro-CLAE;
0,05 a 0,2 mm: para colunas microcapilares recheadas;
0,01 a 0,06 mm: para colunas capilares tubulares abertas.
Verzele e Dewaele [22] sugeriram uma divisão que levou em consideração colunas tubulares abertas, entretanto esta terminologia também não foi amplamente adotada em CLC.
Barth et al. [23] utilizaram uma terminologia simplificada para descrever colunas de diâmetro interno menor que as convencionais:
0,5 a 2,0 mm: colunas microbore;
< 0,5 mm: colunas micro-CL.
Mais recentemente, Chervet et al. [24], seguido por Vissers et al. [20], propuseram a classificação das técnicas de cromatografia líquida de acordo com a vazão de fase móvel utilizada durante o processo cromatográfico, como mostrado na Tabela 1.
7
Tabela 1. Terminologia utilizada atualmente em cromatografia líquida (CL).
Adaptado de Chervet et al. [24].
Diâmetro interno da coluna Vazão da fase móvel Denominação
3,2 - 4,6 mm 0,5 - 2,0 mL min-1 CLAE convencional
1,5 - 3,2 mm 100 - 500 µL min-1 CLAE microbore
0,5 - 1,5 mm 10 - 100 µL min-1 Micro-CL
150 - 500 µm 1 - 10 µL min-1 CLC
10 - 150 µm 10 - 1000 nL min-1 Nano-CL
Esta terminologia foi adotada nas classificações atuais e nela o termo “coluna capilar” se refere a colunas com diâmetro interno entre 150 e 500 µm; entretanto, o mesmo termo é frequentemente usado para colunas de diâmetro interno entre 50 e 300 µm. A terminologia CLC foi adotada neste trabalho por ser a mais coerente, especialmente porque a vazão da fase móvel utilizada se encontra na faixa de classificação dada por Chervet et al. [24].
1.1.3 Aspectos teóricos da cromatografia líquida capilar
O processo de miniaturização de um sistema de separação deve ser considerado na melhoria do desempenho cromatográfico; assim, os aspectos teóricos devem receber atenção, pois eles influenciam a eficiência da separação. Kucera [25] discutiu um número significativo de aspectos teóricos importantes na CLC e estes aspectos serão abordados a seguir.
8
O volume de pico (Vp) é o fator mais importante a ser considerado em
um sistema de CLC, pois este parâmetro determina as características instrumentais do equipamento que será utilizado.
Assumindo-se que a concentração de um soluto segue uma distribuição
Gaussiana, o volume Vp de um pico, que está eluindo de uma coluna
cromatográfica de número de pratos N, corresponde a quatro vezes o desvio padrão da curva de distribuição do soluto e é expresso pela Equação 1 como:
𝑉𝑝 = 4𝜎 = 4 𝑉0(1 + 𝑘)
√𝑁 (1)
onde Vo é o volume de retenção de um composto não retido, k é o fator de
retenção do soluto e N é o número de pratos da coluna em que a separação está sendo realizada.
Rearranjando-se a Equação 1 tem-se a Equação 2, que descreve o
volume de pico Vp em função do diâmetro interno da coluna:
𝑉𝑝 = 4𝜎 = 𝜋 𝑑𝑐2 𝜀 𝐿 (1 + 𝑘)
√𝑁 (2)
onde dc é o diâmetro interno da coluna, ε é a porosidade total da coluna, L é o
9
Portanto, Vp é proporcional ao quadrado do diâmetro interno e ao
comprimento da coluna, e inversamente proporcional à raiz quadrada do número de pratos desta coluna cromatográfica.
A Tabela 2 compara os volumes de pico de um analito não retido em uma coluna convencional e em colunas de diâmetro interno reduzido. Nota-se que para colunas de mesmo comprimento e eficiência cromatográfica, a redução do diâmetro interno leva a redução no volume de pico.
Tabela 2. Comparação dos volumes de pico (Vp) e concentração relativa de
pico (Crel) em colunas de diferentes diâmetros internos e 25 cm de comprimento.
Adaptado da referência [25].
Diâmetro interno (mm) Número de pratos (N) Vp (µL)
4,6 10000 100
1,5 10000 10
0,5 10000 1
Como Vp também corresponde à largura de base do pico cromatográfico,
pois 4σ é igual a wb, a redução na largura da base mostra que o alargamento do
pico é menor. Uma vez que o alargamento é menor, o pico está mais concentrado, o que é refletido no aumento da concentração relativa deste analito no sistema. Assim, em teoria, as separações cromatográficas desenvolvidas por CLC são mais eficientes do que aquelas desenvolvidas em colunas convencionais, já que os picos dos analitos estão mais concentrados e com larguras de base reduzidas, o que aumenta a eficiência cromatográfica [25].
10
Durante qualquer processo cromatográfico, os analitos injetados podem sofrer diluição no interior da coluna, provocando a dispersão de bandas cromatográficas e alterações na eficiência da separação cromatográfica. Este fenômeno de dispersão, chamado diluição cromatográfica (D), pode ser expresso por meio da Equação 3 [26]:
𝐷 = 𝐶𝑜
𝐶𝑚𝑎𝑥 =
𝜋 𝑑𝑐2 𝜀 (1 + 𝑘)√2 𝐿 𝐻 𝜋
4 𝑉𝑖𝑛𝑗 (3)
onde Co e Cmax são as concentrações inicial e final do analito, quando do início
e ao término do processo cromatográfico, respectivamente, Vinj corresponde ao
volume de analito injetado e k e H são os parâmetros cromatográficos fator de retenção e altura de um prato, respectivamente.
Assim, de acordo com a Equação 3, a diluição cromatográfica diminui proporcionalmente à redução do quadrado do diâmetro interno da coluna cromatográfica.
Quando comparada à CLAE convencional, a redução no diâmetro interno das colunas em CLC leva à redução na diluição cromatográfica e à minimização da dispersão da banda cromatográfica, traduzindo-se em maior detectabilidade do analito ao final da separação [26].
A vazão da fase móvel é um dos mais importantes fatores a ser considerados na CLC, já que pequenas alterações nos valores de vazão provocam efeitos mais significativos quando diâmetros internos reduzidos estão sendo utilizados. Em uma determinada separação, a vazão da fase móvel em uma coluna cromatográfica (F) é dada pela Equação 4 [21]:
11
𝐹 = 𝜇 𝜋 𝑑𝑐2 𝜀
4 (4)
onde µ é a velocidade linear da fase móvel. Os outros símbolos foram anteriormente mostrados na Equação 3.
Assim, para que a mesma velocidade linear da fase móvel µ seja usada em colunas de diferentes diâmetros internos, a vazão F deve ser reduzida na proporção do quadrado do diâmetro interno destas colunas.
Além disso, nas separações por CLC, a redução no diâmetro interno da
coluna, dc, leva a uma grande redução na vazão da fase móvel utilizada na
separação cromatográfica e, consequentemente, à redução no consumo de solvente e na produção de resíduos [26].
Em teoria, a miniaturização de sistemas em cromatografia líquida é enormemente vantajosa quando os mesmos são comparados aos convencionais. No entanto, os aspectos práticos em CLC não podem ser esquecidos, uma vez que suas contribuições podem levar a perdas significativas na eficiência de separação.
Umas das principais limitações às vantagens teóricas da CLC são os volumes extra-coluna, que provocam o alargamento de banda cromatográfica e prejudicam o processo cromatográfico. Os volumes extra-coluna são dados por tubos e conexões e outras partes que compõem o sistema de separação, mas que não participam efetivamente do processo cromatográfico [21]. Desta maneira, o entendimento da instrumentação analítica usada em CLC deve ser completo,
12
de modo a prever e minimizar o efeito destes componentes instrumentais na eficiência cromatográfica.
1.1.4 Instrumentação analítica em cromatografia líquida capilar
Em CLC, toda a instrumentação convencional é miniaturizada para cumprir os requisitos do sistema de separação. Componentes instrumentais como bombas, tubos e conexões, colunas, injetor e celas de detecção são dimensionados para pequenos volumes e baixas pressões de trabalho. Como mencionado anteriormente, estes parâmetros podem influenciar a eficiência cromatográfica nas separações por CLC e precisam ser cuidadosamente controlados para uma separação bem-sucedida.
Cada componente instrumental apresenta uma função específica no sistema de separação e, com isso, um efeito específico na eficiência cromatográfica. O detalhamento de cada componente instrumental de um equipamento de CLC é descrito a seguir.
1.1.4.1 Bombas
A redução no diâmetro interno da coluna requer sistemas de bombeamento peculiares, em geral, sistemas que operam em pressões máximas de 400 bar – assim como os sistemas convencionais – mas que possuem um controle rígido da vazão, para que não haja grandes variações durante o processo cromatográfico. Deste modo, bombas para CLC precisam apresentar vazões estáveis durante a separação cromatográfica e permitir a utilização de eluição por gradiente em escalas de sub-microlitros por minuto. Rozing et al.
13
[27] descreveram os requisitos para o funcionamento ideal de uma bomba para CLC.
Dois diferentes sistemas podem ser usados em CLC: bombas split e bombas splitless, ambas comercialmente disponíveis. Sistemas split dividem
fluxos elevados, da ordem de mL min-1, reduzindo-os até a ordem de µL min-1;
para tanto, estes sistemas utilizam um controlador de vazão entre a bomba de CLAE convencional e a coluna miniaturizada. Deste modo, estes sistemas permitem a utilização das bombas de CLAE habituais apenas adaptadas com um restritor de vazão, os quais podem ser facilmente construídos [28].
Entretanto, por estarem conectados a sensores de vazão sujeitos a pressão do sistema, variações na pressão nos sistemas split podem levar a divisão variável e baixa reprodutibilidade do microfluxo, diminuindo a repetibilidade da separação [29]. Outra limitação conhecida é que gradientes de eluição são difíceis de serem conseguidos em sistemas split, especialmente com dispositivos de separação construídos em laboratório: as diferentes viscosidades das misturas de solventes podem provocar oscilações de pressão, limitando o uso do modo de eluição por gradiente [28,29].
Takeuchi et al. [30] avaliaram o uso de um sistema split em separações em fase reversa, usando colunas capilares de 100 µm de diâmetro interno. Os autores descreveram que a redução constante da vazão da fase móvel por meio do uso do redutor de fluxo levou a uma redução constante na pressão de trabalho da coluna, o que foi vantajoso, já que foi possível relacionar diretamente a vazão de separação com a pressão de trabalho; no entanto, a redução na eficiência cromatográfica da separação, calculada para o analito naftaleno, não pôde ser diretamente relacionada à redução da vazão de fase móvel, uma vez que
14
variações da composição e da vazão da fase móvel foram observadas pelos autores.
Os sistemas splitless são amplamente utilizados em CLC nos dias atuais. Estas bombas reduzem as excessivas perdas de solventes, comuns nos sistemas de divisão de fluxo. Exemplos de sistemas sem divisão de fluxo são bombas-seringa e bombas miniaturizadas de duplo pistão.
As bombas-seringa, com um único reservatório de volume limitado, são melhores do que os sistemas split, por oferecerem vazão estável e com reprodutibilidade, mas frequentemente o sistema deve ser parado para que o reservatório deste tipo de bomba seja preenchido, o que pode ser visto como uma desvantagem da bomba-seringa no caso de reservatórios pequenos ou de grandes volumes de lavagem de colunas.
As bombas de fluxo contínuo, semelhante a bombas de CLAE convencionais, mas com dois micropistões por canal, são os modelos de bomba mais usados em CLC nos dias atuais. Bombas de fluxo contínuo podem ser utilizadas em eluições isocrática e por gradiente sob microfluxo. No entanto, estas bombas podem apresentar flutuações de pressão e problemas de confiabilidade especialmente quando são usadas vazões muito baixas, como 0,1
µL min-1, o que pode comprometer a qualidade da separação [20].
1.1.4.2 Tubos e conexões
O alargamento de pico cromatográfico é uma limitação significativa ao desenvolvimento da CLC. A dispersão de uma banda cromatográfica no interior de uma coluna é descrita em função do diâmetro interno e do comprimento desta coluna, como mostrado anteriormente pela Equação 3.
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Assim, quanto menores o diâmetro interno e o comprimento da coluna, menor é a contribuição da dispersão da banda cromatográfica [31].
Volumes-mortos pré e pós-coluna, que consistem nos volumes extra-coluna decorrentes do uso de tubos e conexões entre injetor e extra-coluna, e entre coluna e detector, podem levar a um significativo alargamento da banda cromatográfica, o que é crítico quando uma coluna com diâmetro interno
reduzido é utilizada. Como o VP é muito pequeno em separações em
microescala, volumes extra-coluna excessivos exercem um efeito negativo na separação, provocado pelo alargamento de banda, que reduz a eficiência cromatográfica.
Tubos e conexões inadequados aumentam o volume extra-coluna, o que faz com que o uso de tubos de menor comprimento possível ou até conexões diretas da coluna para o injetor e para o detector sejam preferidos, a fim de reduzir a contribuição no alargamento da banda e prevenir perdas em resolução [31].
A Tabela 3 mostra o comprimento máximo de tubos e conexões de diferentes diâmetros internos em um sistema a serem utilizados, de acordo com o diâmetro interno da coluna, de modo a reduzir ao máximo a dispersão de uma banda cromatográfica. Os comprimentos das tubulações foram calculados para um composto não retido.
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Tabela 3. Comprimento máximo de tubos e conexões de diferentes diâmetros
internos (d.i.) para sistemas com colunas de d.i. variados. Considerações: comprimento da coluna = 25 cm, N = 10000 pratos, k = 0. Adaptado da referência [2].
Comprimento máximo de tubos e conexões (cm) d.i. da coluna (mm) 0,25 mm 0,1 mm 0,05 mm 4,6 14 535 8568 1,0 0,7 25 408 0,3 0,06 2 36 0,1 0,007 0,25 4 0,05 0,002 0,07 1
Como esperado, a Tabela 3 mostra que quanto maior o diâmetro interno de tubos e conexões, menor o comprimento máximo que estes componentes instrumentais podem apresentar, de modo a minimizar o alargamento de bandas. Observa-se, adicionalmente, que sistemas que utilizam colunas com diâmetros internos iguais ou menores que 100 µm deveriam ser conectadas diretamente ao detector ou possuir uma janela de detecção ao fim de seu enchimento, uma vez que os comprimentos máximos de tubos e conexões são extremamente pequenos nestes casos.
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1.1.4.3 Injetores
Os volumes máximos de injeção para colunas capilares podem ser expressos como uma função do comprimento da coluna e seu número de pratos, fator de retenção dos analitos e, geralmente, são da ordem de nL para colunas de diâmetro interno reduzido [24].
Os pequenos volumes injetados constituem um grande problema em CLC, pois causam prejuízos na detectabilidade; contudo, maiores volumes injetados em sistemas em microescala produzem o efeito de alargamento de banda, o que reduz a eficiência de separação, especialmente para os compostos fracamente retidos [32].
Segundo Szumksi e Buszeswki [2], a introdução da amostra em uma coluna capilar pode ser feita de diferentes modos, que envolvem a utilização de sistemas adaptados ou comercialmente disponíveis. Os autores descreveram que o modo de injeção mais utilizado é o split, embora a perda de amostra neste tipo de injeção seja significativa, pois as razões de split utilizadas variam entre 1:10 e 1:2000.
Héron et al. [33] revisaram inúmeros efeitos da injeção no desempenho cromatográfico de colunas de diâmetro interno reduzido. Dentre as informações apresentadas, os autores mostraram que, quando solventes fracos foram utilizados para a diluição da amostra injetada, foi observado um efeito de focalização da banda cromatográfica, provocado pela fase móvel de maior força cromatográfica usada na separação, o que levou à pré-concentração do analito e consequente ganho em eficiência.
Injetores automáticos comercialmente disponíveis para cromatografia convencional, que trabalham geralmente na faixa de µL, requerem um ajuste
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instrumental para utilização na faixa de nL. Isto pode ser alcançado pela utilização de uma válvula de divisão entre o injetor e a coluna, embora esta alternativa leve à significativa perda de amostra, o que é indesejado no caso de baixa disponibilidade de amostras [34]. A perda de amostra pode ser reduzida com a utilização de válvulas de injeção miniaturizadas, também comercialmente disponíveis, as quais operam com volumes de injeção entre 10 e 20 nL [34].
1.1.4.4 Colunas cromatográficas capilares
Embora colunas capilares cromatográficas de até 10 µm de diâmetro interno possam ser empregadas em separações cromatográficas em microescala, colunas capilares de 75 µm são as mais frequentemente usadas. Este diâmetro fornece o melhor compromisso entre detectabilidade, capacidade de amostra e robustez em separações por CLC [28].
Em geral, o material usado na confecção de colunas para CLC é a sílica fundida, em uma grande variedade de diâmetros internos, revestida
externamente com polímeros como poliimida ou politetrafluoretileno (Teflon®),
que conferem flexibilidade e alta resistência mecânica à sílica fundida.
O uso de capilares de sílica fundida na confecção das colunas cromatográficas traz algumas vantagens especiais: a parede interna do capilar é quimicamente inerte e esta característica pode minimizar as interações indesejadas entre a parede do capilar e alguns solutos, especialmente aqueles de caráter básico [25]. Além disso, a constituição do capilar favorece a formação de ligações químicas entre sua parede e o monolito moldado, o que evita a expulsão do material de enchimento durante a separação cromatográfica. A boa
