1.3 Caracterização das fases estacionárias monolíticas
1.3.1 Caracterização física
1.3.1.1 Caracterização da estrutura porosa por técnica de sorção de nitrogênio
O conhecimento da estrutura porosa de materiais monolíticos usados em cromatografia é fundamental, uma vez que a eficiência de separação dos analitos depende fortemente das propriedades porosimétricas destes materiais, como área superficial e volume de poros.
Alguns métodos experimentais estão disponíveis para a caracterização da estrutura porosa de materiais, tais como espalhamento de raios-x a baixo ângulo (SAXS, do inglês small angle x-ray scattering), porosimetria de extrusão de mercúrio, microscopias eletrônicas de varredura e de transmissão, termoporometria, métodos baseados em ressonância magnética nuclear e sorção de gás [107]. Cada método apresenta uma limitação associada ao tamanho de poros do material avaliado, além de vantagens e desvantagens relacionadas à execução e ao custo da técnica [107].
O método mais comumente empregado na caracterização de um sólido poroso consiste nas medidas de sorção de um gás na superfície de seus poros. Este método permite a caracterização de um material com ampla faixa de
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tamanho de poros, entre 0,35 nm a 100 nm, que abrange a região de micro e mesoporos, além de alguns macroporos.
Segundo a IUPAC [108], os poros podem ser classificados de acordo com seu tamanho. A nomenclatura preconizada pela IUPAC afirma que poros com largura maior que 50 nm são denominados macroporos, enquanto que poros que apresentam largura entre 2 e 50 nm são chamados mesoporos e largura menor que 2 nm são denominados microporos.
Svec [87] afirma que a nomenclatura dada pela IUPAC está desatualizada e gera confusões, tendo em vista que o prefixo micro, utilizado para os poros de menor tamanho, implica tamanhos da ordem de micrômetros quando, na verdade, diz respeito a tamanho da ordem de nanômetros. Portanto, segundo o autor, aos termos mesoporos e macroporos deveriam estar associados um prefixo independente do tamanho da unidade, tais como miniporos ou algo semelhante, para que a nomenclatura fosse mais apropriada. Alternativamente, um termo como nanoporos também seria mais apropriado aos poros de menor tamanho.
A estrutura de uma fase estacionária para cromatografia geralmente é formada por pequenos mesoporos e grandes macroporos; esta característica faz com que o leito cromatográfico seja apto para a separação de pequenas e de grandes moléculas.
Os mesoporos dão origem às grandes áreas superficiais requeridas para a retenção de solutos e, consequentemente, para a resolução cromatográfica. Por outro lado, a distribuição e o tamanho dos macroporos controlam a eficiência da coluna e a resistência à passagem da fase móvel através do leito cromatográfico [109].
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Os poros podem, ainda, ser classificados de acordo com seu formato e disposição no material poroso, podendo ser fechados ou abertos [110]. Poros fechados são isolados e não estabelecem comunicação com o meio externo. Já os poros abertos se comunicam com o meio externo e mantém contato com a superfície externa. Devido a esta comunicação, os poros abertos são responsáveis pelo estabelecimento de interações com o analito quando o sólido poroso é uma fase estacionária contida em uma coluna de separação cromatográfica [111].
Como mencionado, a caracterização dos poros presentes em um sólido poroso pode ser realizada por meio da adsorção física de gases, como, por exemplo, nitrogênio, argônio ou criptônio. Este tipo de adsorção envolve interações intermoleculares que se estabelecem na interface entre o sólido e a fase gasosa, em um processo reversível [112].
Quando se controla o volume de gás adsorvido nos poros da superfície do sólido, de acordo com o aumento de pressão a uma dada temperatura, obtém- se uma curva que é chamada de isoterma, a qual apresenta dois ramos distintos, os ramos da adsorção e da dessorção. O ramo da adsorção corresponde ao aumento da pressão do gás até o instante em que, teoricamente, todos os poros do material estão preenchidos; uma vez preenchidos, inicia-se o processo de saída das moléculas de gás do interior dos poros, promovendo uma redução gradativa da pressão e obtendo-se o ramo da dessorção [113].
O eixo horizontal da isoterma representa a pressão relativa (p/p0), que
consiste na razão entre a pressão de equilíbrio do gás (p) que se adsorve na
interface sólido-gás e a pressão de saturação do vapor (p0); a p/p0 pode variar
entre 0 e 1 e, quando é igual a 1, significa que a adsorção do gás na superfície do sólido foi completa, pois a pressão de equilíbrio atingiu a pressão de
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saturação. O eixo vertical corresponde ao volume de gás sorvido em função de
uma dada massa do sólido, expressa como mL g-1 [108].
A Figura 3 indica a classificação das isotermas de adsorção, definida pela IUPAC [114]. O tipo de isoterma é determinado pelo tamanho de poro e pelas características superficiais do material.
Figura 3. Tipos de isoterma de sorção em sólidos, propostos pela IUPAC. O ramo da
adsorção é representado pela seta ascendente, enquanto que o ramo da dessorção é representado pela seta descendente. Adaptado da referência [114].
A isoterma do tipo I é característica de materiais microporosos, em que o aumento de pressão é acompanhado por um aumento no volume do gás adsorvido, até que este volume se torne constante, indicando a formação de uma monocamada de gás [113]. O aumento do volume a baixas pressões se deve ao preenchimento gradual dos microporos conforme se aumenta a pressão no
Pressão relativa (P/P0) V ol ume de g ás ad so rv id o
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sistema. Este tipo de isoterma também é conhecida como isoterma de Langmuir [114].
Isotermas do tipo II são observadas em materiais não porosos ou macroporosos. Isotermas tipo III são características de moléculas de gás cuja interação entre si é maior que a interação entre o gás e a superfície do sólido, e com esse tipo de isoterma, não se analisa área superficial nem porosidade [112,114].
As isotermas do tipo IV e V são as únicas que apresentam histerese e que o máximo de adsorção ocorre a uma pressão menor que a pressão de saturação do gás. Isotermas do tipo V são mais difíceis de ocorrerem e podem caracterizar materiais mesoporosos, ocorrendo quando as interações adsorbato-adsorvente são fracas [114].
Vansant et al. [114] afirmaram que isotermas tipo IV são características de materiais predominantemente mesoporosos, que geralmente apresentam um distinto loop de histerese a altas pressões, já que o ramo correspondente a dessorção não segue o ramo da adsorção. Segundo Teixeira et al. [116], a histerese será tanto maior quanto maior for a dispersão de tamanhos de poro.
Uma vez que a isoterma de um sólido poroso é obtida, modelos e cálculos podem ser aplicados a diferentes regiões da curva para obter informações sobre a área superficial específica, o volume de micro e mesoporos, assim como a distribuição de tamanho de poros deste sólido.
Sabe-se que quanto maior a área de superfície do poro ou da partícula, menor será o tamanho dos poros ou das partículas, ou seja, uma relação inversamente proporcional é a que existe entre a área superficial e o tamanho do poro [115].
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Em uma fase estacionária, a ampla distribuição de diferentes tamanhos de macroporos oferece alta permeabilidade à coluna, porém à custa da perda da eficiência da coluna, uma vez que uma ampla distribuição de tamanho de macroporos leva ao aumento da difusão turbilhonar, o termo A na equação de van Deemter [117]. Assim, deve ser cuidadosa a otimização da estrutura do leito cromatográfico visando a otimização dos parâmetros cromatográficos, como alta eficiência e alta permeabilidade, uma vez que estas características estão inversamente relacionadas.
1.3.1.2 Caracterização da estrutura porosa por técnica in situ
As principais técnicas de caracterização de materiais monolíticos poliméricos orgânicos estão baseadas em métodos considerados especulativos por especialistas, pois tratam do material que não está contido na coluna cromatográfica capilar e, portanto, não refletem necessariamente as características dos materiais empregados nas separações analíticas [118].
Atualmente, as técnicas disponíveis se concentram nestes aspectos, sendo necessário buscar alternativas mais apropriadas para a caracterização dos materiais preparados.
Especialmente no que diz respeito à distribuição de poros de um material, as técnicas hoje empregadas envolvem a caracterização do bulk, ou seja, o material que não está confinado na coluna cromatográfica, mas que é uma simulação deste. Como mencionado anteriormente, as medidas de sorção de nitrogênio e porosimetria por intrusão de mercúrio são comumente usadas na caracterização porosimétrica de materiais monolíticos poliméricos. Entretanto, a relevância destes resultados na comparação com a eficiência cromatográfica
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é muito especulativa, já que não se trata exatamente do material empregado na separação testada.
Além disso, algumas técnicas de caracterização porosimétrica distorcem o material testado, informando resultados muito diferentes dos reais e iniciais, especialmente para aqueles métodos que exigem o pré-tratamento da amostra [118]. Assim, o desafio da caracterização de materiais porosos está, principalmente, na confiabilidade dos resultados obtidos.
Medidas in situ da porosidade de um material têm sido estudadas como substitutivas aos métodos de análise do bulk polimérico como, por exemplo,
capillary flow porometry (CFP), sem tradução para o português. Esta técnica é
útil na caracterização completa dos monolitos e informa o tamanho de poros do material polimérico. Outra grande vantagem é que a técnica de CFP é considerada não destrutiva ao material, o que é especialmente importante na caracterização in situ de materiais cromatográficos [119].
A CFP é uma técnica de extrusão que detecta a porosidade de um material quando um fluxo de gás que passa através do monolito desloca um líquido, antes confinado nos poros do material, sob uma pressão específica. Neste tipo de análise, o tamanho de poros da amostra é calculado a partir da relação entre a pressão e o fluxo de gás. Outras informações do material poroso como distribuição de tamanho de macroporos, tamanho médio de macroporos e permeabilidade a gás também são fornecidas após tratamento estatístico de resultados [120].
O fator-chave na técnica de CFP é a escolha do líquido que irá umedecer o material a ser testado, o chamado wetting liquid. Um bom wetting liquid é capaz de umedecer espontaneamente a superfície do material poroso e possui tensão superficial relativamente baixa. O wetting liquid deve preencher
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completamente os poros, mas não deve fluir ao longo da superfície do material: o escoamento do líquido deve ser limitado pela sua tensão superficial [120].
Na remoção do wetting liquid dos poros, a pressão do gás aplicada (P) está relacionada ao diâmetro de poros, de acordo com a Equação 5 [121]:
𝑃 =
4 𝛾 (𝑐𝑜𝑠𝜃)𝑑(5)
onde θ é o ângulo de contato entre o wetting liquid e a superfície do material, γ é a tensão superficial e d é o diâmetro de poros.
Para wetting liquids com baixa tensão superficial, θ pode ser considerado igual a zero. Deste modo, a Equação 5 mostra que poros maiores serão purgados sob menores pressões, enquanto que poros menores requerem pressões mais altas de purga do líquido contido em seus interiores.
Em geral, o tamanho de poros é expresso como o diâmetro de poros, mas nem sempre poros circulares são encontrados exclusivamente em um monolito, o que poderia distorcer resultados obtidos. Uma peculiaridade da técnica de CFP é que o gás se move apenas quando a pressão é suficientemente elevada para deslocar o wetting liquid da parte mais estreita do poro. Consequentemente, o diâmetro calculado é o diâmetro do poro em sua região mais estreita. Assim, a CFP não dimensiona somente os poros regularmente circulares, mas contempla todos os formatos de macroporos encontrados em uma amostra [119].
Como os dados obtidos são baseados na passagem de um gás, a caracterização de uma fase estacionária confinada em uma coluna
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cromatográfica pode ser facilmente realizada, o que torna a CFP uma técnica aplicável, especialmente no caso de colunas capilares. Estas aproximações informam características dos materiais mais próximas o possível das reais, o que torna a caracterização muito mais confiável.
1.3.1.3. Microscopia eletrônica de varredura
A morfologia é uma das propriedades mais importantes de um material. O controle da morfologia altera as propriedades deste material e, no caso de materiais para fins cromatográficos, estas propriedades são fundamentalmente importantes para o sucesso da separação.
As técnicas de microscopia são especialmente úteis na determinação das propriedades morfológicas de um material monolítico, como os domínios formados pelo esqueleto polimérico. As mais comuns incluem difração de raios- X [122], microscopia eletrônica de transmissão [123], microscopia de força atômica [124] e microscopia eletrônica de varredura.
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) tem sido utilizada com sucesso na caracterização da morfologia de polímeros para fins cromatográficos [125,126]. A técnica de MEV é capaz de oferecer informações sobre as propriedades morfológicas da estrutura monolítica, o que é de grande importância para monolitos poliméricos orgânicos, nos quais o formato e a organização da estrutura globular podem dar informações sobre a qualidade de separações cromatográficas obtidas no material em questão.
Aggarwal et al. [127] aprimoraram o uso da técnica de MEV na caracterização da estrutura tridimensional e da morfologia de monolitos poliméricos orgânicos, utilizando um procedimento de análise visual de
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inúmeras fatias do material bombardeadas por um feixe especial de elétrons. As imagens recolhidas de cada fatia foram agrupadas para reconstruir o volume da amostra e ofereceram informações adicionais como comprimento do esqueleto polimérico, tamanhos de poros, homogeneidade radial e porosidade. Os conjuntos de dados tridimensionais ainda foram utilizados para calcular a tortuosidade em todas as três direções espaciais, já que a tortuosidade contribui para a heterogeneidade do leito monolítico.
Os resultados das previsões computacionais obtidos pelo 3D-MEV foram confirmados utilizando técnicas experimentais com base na medição das propriedades de transporte de um eletrólito usado no preenchimento dos poros.
Assim, os autores mostraram que a técnica de MEV pode ser aprimorada para oferecer medidas quantitativas de diferenças morfológicas entre colunas cromatográficas, bem como de áreas em diferentes locais dentro de uma mesma coluna capilar, auxiliado na identificação dos fatores que afetam o desempenho cromatográfico dessas colunas.
1.3.2 Caracterização cromatográfica
As colunas cromatográficas usadas em CLC podem ser avaliadas qualitativa e quantitativamente por meio da análise de parâmetros calculados a partir de medidas obtidas nos cromatograma, do mesmo modo que são avaliadas colunas convencionais [128]. Para tanto, misturas de compostos previamente selecionados são avaliadas e o cromatograma, após o seu desenvolvimento, fornece as informações necessárias para a caracterização da coluna.
Um cromatograma típico obtido na separação de uma mistura de dois componentes é mostrado na Figura 4.
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Figura 4. Cromatograma hipotético da separação de dois analitos, mostrando as
medidas empregadas na determinação dos parâmetros cromatográficos. Adaptado da referência [129].
Na Figura 4, a linha de base representa a passagem somente da fase móvel através do detector. Quando os componentes da mistura eluem e passam pelo detector, os picos cromatográficos são registrados e seus perfis são proporcionais às suas concentrações.
O tempo de retenção de um composto não retido pela fase estacionária
ou tempo de retardamento da fase móvel (tM) é o tempo gasto por um composto
não retido pela fase estacionária para percorrer o sistema cromatográfico desde
a injeção até a chegada no detector. O tM também corresponde ao tempo que as
moléculas da fase móvel levam para percorrer todo o sistema cromatográfico.
O tempo de retenção do soluto (tR) é o tempo gasto desde o momento da
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de retenção engloba todo o tempo em que o soluto fica no sistema cromatográfico, quer na fase estacionária, quer na fase móvel.
Sendo assim, o tempo em que o soluto fica retido somente na fase
estacionária é calculado pelo tempo de retenção ajustado (t’R), que é calculado
por meio da Equação 6:
𝑡𝑅´ = 𝑡𝑅 − 𝑡𝑀 (6)
O fator de retenção (k) é calculado pela razão entre os tempos em que o soluto fica retido na fase estacionária e caminhando junto à fase móvel, e é característico de um analito. O fator de retenção pode ser determinado pela Equação 7:
𝑘 = 𝑡𝑅 − 𝑡𝑀
𝑡𝑀 (7)
Os valores ideais para k variam entre 1,0 e 10,0, embora a literatura aceite valores entre 0,5 e 20,0 [130]. Valores muito baixos indicam pouca interação
entre o analito e a fase estacionária, e possível eluição próxima ao tM, enquanto
valores de k altos indicam interação muito forte entre o analito e a fase estacionária, resultando em longos tempos de análise.
A separação entre dois compostos adjacentes pode ser medida por meio
da resolução (RS) e pode ser calculada pela Equação 8, que relaciona tempo de
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𝑅𝑆 = 2 (𝑡𝑅2− 𝑡𝑅1)
(𝑤𝑏1+ 𝑤𝑏2) =
1,177 (𝑡𝑅2− 𝑡𝑅1)
(𝑤ℎ1 + 𝑤ℎ2) (8)
onde tR1 e tR2 correspondem aos tempos de retenção de dois picos adjacentes,
wb1 e wb2 são as larguras dos picos na base, e wh1 e wh2 correspondem às larguras
dos picos a meia altura.
O parâmetro resolução entre picos (RS) indica a qualidade da separação
entre dois picos adjacentes: valores de RS iguais a 1,00 indicam coeluição dos
compostos, valores de RS maiores ou iguais a 1,25 indicam a separação dos
compostos e tais valores são suficientes para cálculos quantitativos, enquanto
que valores de Rs acima de 1,50 indicam a separação completa dos compostos
na linha de base e são altamente desejáveis [130].
A eficiência cromatográfica é medida em termos de número de pratos (N) gerados durante uma separação. Um prato equivale a uma etapa de equilíbrio do soluto entre a fase estacionária e a fase móvel. Quanto maior o número de pratos, mais equilíbrios entre ambas as fases existirão, maior será a eficiência e, portanto, melhor a separação cromatográfica.
Na prática, o número de pratos é uma medida do alargamento do pico que ocorre quando o analito passa através do sistema cromatográfico e pode ser calculado pela Equação 9:
𝑁 = 16 (𝑡𝑅 𝑤𝑏) 2 = 5,545 (𝑡𝑅 𝑤ℎ) 2 (9)
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Como existem colunas com diferentes tamanhos, a comparação entre elas é usualmente expressa como eficiência em pratos por metro (N/m), como mostra a Equação 10:
𝑁/𝑚 =𝑁
𝐿 (10)
onde L é o comprimento da coluna em metros.
Qualitativamente, a eficiência pode ser avaliada pelo formato do pico cromatográfico. Quanto mais estreito for o pico, maior é a eficiência da coluna na separação do soluto a que o pico se refere.
O fator de assimetria do pico a 10% da sua altura (As10) é uma medida da
proporção entre as duas partes de um pico cromatográfico no sentido horizontal a 10% da sua altura.
Este parâmetro mede a simetria do pico e possíveis distorções frontais ou caudais, que podem levar à superposição de picos em um cromatograma. A
literatura indica que As10 deve ter valores de 0,9 a 1,2. Embora menos
desejáveis, valores entre 0,8 e 1,6 são admitidos [130].
A Figura 5 mostra como o fator de assimetria de um pico hipotético é calculado.
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Figura 5. Medida relacionada ao cálculo do fator de assimetria. Adaptado da
referência [129].
A eficiência de uma coluna também pode ser expressa por meio da equação clássica de van Deemter, em função da altura de prato (H), como mostra a Equação 11:
𝐻 = 𝐴 + 𝐵
𝜇 + 𝐶 𝜇 (11)
onde A é o coeficiente de difusão turbilhonar, B é o coeficiente de difusão longitudinal, C é o coeficiente de resistência à transferência de massa,e µ é a velocidade linear da fase móvel, dada pela razão entre o comprimento da coluna e o tempo de retardamento da fase móvel.
Na Equação 11, o termo A é o responsável pelo alargamento dos picos devido aos diferentes caminhos percorridos pelas moléculas do soluto no
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interior da coluna cromatográfica. Uma forma de minimizar da difusão turbilhonar é utilizar colunas de diâmetro interno reduzido ou partículas pequenas e uniformes. Outra possibilidade é o uso de monolitos como fase estacionária, pois estes materiais podem oferecer uma distribuição de poros mais regular e o caminho percorrido pelas moléculas tende a ser menos tortuoso. A difusão longitudinal, dada pelo termo B da equação de van Deemter, está relacionada à difusão molecular do soluto na fase móvel. O termo B pode ser minimizado empregando-se maiores velocidades lineares de fase móvel, o que reduz o alargamento da banda cromatográfica e melhora a eficiência da separação.
O termo C equivale à transferência de massa e corresponde ao alargamento da banda devido à dificuldade de transferência de massa do soluto
entre a FM e a FE. O termo C está subdividido em CM e CS, que correspondem
às transferências de massa na fase móvel e na fase estacionária, respectivamente.
O termo C na equação de van Deemter depende intimamente da porosidade da fase estacionária. Isso acontece principalmente devido ao fato de que a fase móvel no interior dos poros é estagnada, e as moléculas do soluto se movem através da fase móvel estagnada até alcançar a superfície do material de enchimento, onde as interações irão ocorrer [99].
Os solutos podem não entrar nos poros do material, entrar superficialmente, ou ainda, penetrar profundamente nos poros. Assim, estes solutos podem apresentar diferentes tempos de residência no interior dos poros da fase estacionária, causando variações no tempo de eluição e alargamento de banda cromatográfica [131].
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Para minimizar o termo C, o ideal é reduzir o diâmetro das partículas do material de enchimento, para que os poros sejam pouco profundos, ou que a espessura da fase estacionária que recobre o suporte seja a menor possível. A diminuição da velocidade linear da fase móvel também pode minimizar os