UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
JOSÉ LUÍS FACHI
EFEITO DOS ÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA CURTA E SEU RECEPTOR
(GPR43) EM MODELO MURINO DE INFECÇÃO POR Clostridium difficile.
EFFECT OF SHORT-CHAIN FATTY ACIDS AND ITS RECEPTOR (GPR43)
IN MURINE MODEL OF INFECTION BY Clostridium difficile.
CAMPINAS
2017
JOSÉ LUÍS FACHI
EFEITO DOS ÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA CURTA E SEU RECEPTOR (GPR43) EM MODELO MURINO DE INFECÇÃO POR Clostridium difficile.
EFFECT OF SHORT-CHAIN FATTY ACIDS AND ITS RECEPTOR (GPR43) IN MURINE MODEL OF INFECTION BY Clostridium difficile.
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular, na Àrea de Imunologia.
Dissertation presented to the Biology Institute of the State University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master's Degree in Genetics and Molecular Biology in the Immunology Area.
Este arquivo digital exemplar corresponde a versão final da dissertação defendida pelo aluno JOSÉ LUÍS FACHI e orientada pelo PROF.
DR. MARCO AURÉLIO RAMIREZ
VINOLO.
ORIENTADOR: Prof. Dr. MARCO AURÉLIO RAMIREZ VINOLO.
CAMPINAS 2017
Campinas, 28 de junho de 2017.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marco Aurélio Ramirez Vinolo Prof. Dr. José Luiz Proença Módena Profª. Dra. Danielle da Glória de Souza
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu marido Fabio Alexandre Ximenes, pela compreensão dos momentos ausentes e pela colaboração constante nas profícuas opiniões.
Dedico esse trabalho aos meus pais, Sirlei e José Carlos Fachi, meus maiores incentivadores e batalhadores pela realização de meus sonhos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao professor Dr. Marco Aurélio Ramirez Vinolo por toda a sua disponibilidade, empenho, incentivo, apoio e partilha de ideias ao longo destes trabalho.
Agradeço aos meus amigos e família, pelo apoio e motivação, bem como a todas as pessoas que participaram, contribuindo direta ou indiretamente para realização deste trabalho.
Agradeço à Universidade Estadual de Campinas, ao programa de pós-graduação em Genética e Biologia Molecular e ao Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes por toda a infraestrutura e disponibilidade dadas ao longo desta trajetória.
Por fim, agradeço às agências de fomento envolvidas no financiamento deste trabalho: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação de Desenvolvimento da Unicamp (FUNCAMP).
“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos.”
RESUMO
Em condições fisiológicas, a colonização pelo Clostridium difficile, bacilo resistente a agentes antimicrobianos, é restringida pelas bactérias comensais intestinais. Com o uso de antibióticos, há um desequilíbrio da microbiota e há a proliferação do mesmo, provocando quadros patológicos diversos, desde benignos à casos graves fulminantes. Desta forma, considerando os efeitos imunomodulatórios dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) e que a microbiota, responsável por sua síntese, protege o organismo de infecções no trato gastrointestinal, nossa proposta é a de investigar se estes compostos, produzidos endogenamente ou administrados, afetam o desenvolvimento e intensidade da infecção causada por C.difficile. Para tanto, foi induzida a doença em camundongos C57BL/6 machos adultos com 8 semanas de idade infectados por gavagem com 108 UFC de bactérias. Estes animais foram previamente tratados por via oral com acetato, butirato ou placebo e, no dia seguinte, uma mistura de antibióticos foi administrada na água de beber por quatro dias. Após este período, foi administrada uma dose única de clindamicina intraperitoneal aos animais e, sucessivamente, foram infectados no dia seguinte com 108 UFCs Clostridium difficile cepa VPI 10463 por gavagem. Observamos que, além da redução da perda de peso e menor comprometimento clínico, a administração oral de acetato ou butirato aumentou significativamente a taxa de sobrevivência dos animais infectados (de 20% para 60% e 70%, respectivamente). Entretanto, estes compostos não apresentaram efeitos in vivo na redução do crescimento da C.difficile ou produção de suas toxinas TcdA e TcdB, bem como não modularam o dano tecidual e migração de neutrófilos e macrófagos para a lâmina própria intestinal. No entanto, notamos que os AGCCs, em especial o butirato, modularam a expressão de diversos genes e induziram, de modo geral, um perfil anti-inflamatório mediado por células Treg no cólon. Além disso, os AGCCs reduziram a permeabilidade epitelial intestinal, diminuindo a translocação do conteúdo luminal para os órgãos periféricos e promovendo, assim, maior sobrevida dos camundongos infectados e cessação da doença associada ao C. difficile. Estes efeitos clínicos dos AGCCs não foram observados em animais deficientes para o receptor GPR43 (FFAR2), mostrando uma possível participação do mesmo na resistência à doença. Desta forma, concluímos que o tratamento oral com ácidos graxos de cadeia curta possui um efeito protetor significativo no modelo murino de colite aguda por Clostridium difficile, o que pode ser direcionado para a clínica, na prevenção e tratamento da doença, devido a sua praticidade.
ABSTRACT
The intestinal colonization by pathogens is restricted by componentes of the commensal microbiota. Oral antibiotic therapy causes an imbalance in gut that predisposes the organism to infection by Clostridium difficile, a toxigenic bacterium that is associated with many pathological conditions. Given the immunomodulatory effects of the short chain fatty acids (SCFAs) derived from the gut microbiota, the aim of this study was to investigate whether these compounds, endogenously produced or administered, affects the development and intensity of C.difficile infection. For that, we used male 8 weeks old C57BL/6 mice treated with SCFAs (acetate or butyrate) in the drinking water one week before the infection and kept until the end of the protocol. A mix of antibiotics was administered orally for four days to deplete the gut microbiota and a single intraperitoneal dose of clindamycin was given in the next day. The infection was induced by gavage with 108 CFUs of C. difficile VPI 10463 strain 24 hours after clindamycin administration. We noticed that, in addition to reducing of weight loss and lower clinical impairment, oral administration of acetate or butyrate significantly increased the survival rate of infected animals (from 20% to 60% and 70%, respectively). Indeed, these compounds had no in vivo effect on reducing C.difficile growth or production of its toxins TcdA and TcdB, nor did they modulate the tissue damage and migration of leukocytes to the intestinal lamina propria. However, we noted that AGCCs, especially butyrate, modulated the expression of several genes and generally induced a Treg cell-mediated anti-inflammatory profile in the colon. In addition, SCFAs reduced intestinal epithelial permeability by decreasing the translocation of luminal contents to peripheral organs and thereby promoting longer survival of infected mice and cessation of C.difficile-associated disease. These clinical effects of the AGCCs were not observed in animals deficient for the GPR43 receptor (FFAR2), showing a possible participation of the same in the resistance to the disease. Therefore, we conclude that oral treatment with short chain fatty acids has a significant protective effect on the murine model of acute colitis by Clostridium difficile, which may be directed to the clinic, in the prevention and treatment of the disease, due to its practicality.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Clostridium difficile. pg. 18.
Figura 2. Defesas mediadas pela microbiota contra a Clostridium difficile. pg. 21. Figura 3. Regulação das toxinas de Clostridium difficile. pg. 22.
Figura 4. Estrutura e função das toxinas A e B da Clostridium difficile. pg. 23. Figura 5. Histopatológico da infecção por Clostridium difficile. pg. 27.
Figura 6. Produção dos ácidos graxos de cadeia curta. pg. 30. Figura 7. Vias de atuação dos ácidos graxos de cadeia curta. pg. 32. Figura 8. Modelo de indução da CDI. pg. 37.
Figura 9. Painel de análises das populações leucocitárias por citometria de fluxo. pg. 45. Figura 10. Carga bacteriana fecal. pg. 48.
Figura 11. Efeito clínico dos AGCCs, endógeno e exógeno, durante a CDI. pg. 49.
Figura 12. Efeitos dos AGCCs no crescimento e produção de toxinas da C.difficile. pg. 51. Figura 13. AGCCs não previne o dano tecidual e não recrutam fagócitos na CDI. pg. 52. Figura 14. Modulação da inflamação pelos AGCCs. pg. 54.
Figura 15. Efeito dos AGCCs na geração de células T reguladoras. pg. 56. Figura 16. Efeitos dos AGCCs sob o epitélio intestinal. pg. 59.
Figura 17. Efeitos dos AGCCs sobre a carga bacteriana em animais SPF infectados e o desenvolvimento da doença em animais germ-free infectados ou não. pg. 61.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição das dietas. pg. 38.
Tabela 2. Score clínico de 0 a 15 utilizado para quantificar os sinais e sintomas da CDI. pg. 39. Tabela 3. Score de 0 a 9 utilizado para as análises histológicas do cólon corado por H&E. pg. 42. Tabela 4. Sequências sense e anti-sense dos primers. pg. 43.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
TcdA: toxina A da Costridium difficile. TcdB: toxina B da Costridium difficile. EUA: Estados Unidos da América. AGCCs: ácidos graxos de cadeia curta. IgG: imunoglobulina do tipo G.
IgA: imunoglobulina do tipo A. IECs: células epiteliais intestinais. IELs: linfócitos intraepiteliais.
GTPases: enzimas guanosinas-trifosfatases.
IL-(nº): interleucinas-nº (ex.: IL-10, interleucina-10). INF-γ: intérferon gama.
PAF: fator de ativação plaquetário.
TNF-α: fator de necrose tumoral do tipo alfa. NO: óxido nítrico.
PLS: proteínas S-layer.
TLR: receptor do tipo Toll (do inglês, Toll like receptor). MDDCs: células dendríticas derivadas de monócitos. Th: linfócitos T auxiliares (do inglês, helper).
CDI: infecção por Clostridium difficile. mM: mili-Molar.
CO2: dióxido de carbono ou gás carbônico. MCT-1: transportadores de monocarboxilato. SMCT-1: monocarboxilato dependente de sódio. GPCRs: receptores acoplados à proteína G. HDAC: enzimas histona-desacetilases. HAT: enzimas histona-acetiltransferases. HIF-1: fator induzido por hipóxia do tipo 1.
FFAR3: receptor GPR41 (do inglês, free fatty acid receptor 3). Olfr8: do inglês, olfatory receptor 8.
PI3Ks: fosfatidilinositol 3-cinases. TNBS: ácido trinitrobenzeno sulfônico.
CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais.
CEMIB: Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica.
ICB/USP: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. UFCs: Unidades formadoras de colônicas.
HFD: dieta rica em fibras solúveis (do inglês, high fiber diet).
LFD: dieta com baixo teor de fibras solúveis (do inglês, low fiber diet). DNA: ácido desoxirribonucleico.
RNA: ácido ribonucleico.
PCR: reação em cadeia da polimerase.
qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa.
RT-qPCR: transcriptase reversa da reação em cadeia da polimerase quantitativa. ELISA: ensaio de imunoabsorção enzimática (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). CCFA: ágar Cicloserina-Cefotoxina-Frutose.
BHI: infusão de cérebro e coração de gado (do inglês, brain heart infusion). PBS: tampão fosfato-salino (do inglês, phosphate buffered saline).
SBF: soro bovino fetal.
HBSS: Hank's Balanced Salt Solution.
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês, ethylenediamine tetraacetic acid). FSC: dispersão frontal de luz (do inglês, forward scatter).
SSC: dispersção lateral de luz (do inglês, side scatter).
BSA: albumina sérica bovina (do inglês, bovine serum albumin). d.p.i.: dia pós-infecção.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 16
Clostridium difficile ... 17 Epidemiologia ... 19 Patogênese ... 20 Toxinas ... 22 Colite pseudomembranosa ... 25 Tratamento ... 27Ácidos graxos de cadeia curta ... 29
Produção e absorção dos AGCCs ... 30
Mecanismo de ação e efeitos dos AGCCs ... 31
Receptor GPR43 ... 33
JUSTIFICATIVA ... 34
OBJETIVO GERAL ... 35
Objetivos específicos ... 35MATERIAL E MÉTODOS ... 36
Animais ... 36 Bactéria ... 36 Modelo de infecção ... 37Tratamento dos animais ... 37
Escore clínico ... 39
Determinação da carga bacteriana fecal ... 39
Quantificação dos ácidos graxos de cadeia curta ... 40
Quantificação de C. difficile nas fezes ... 40
Cultivo in vitro de C. difficile na presença dos AGCCs ... 41
Quantificação das Toxinas A/B produzidas pela C. difficile ... 41
Análise histológica do cólon ... 42
Análise da expressão gênica ... 42
Quantificação dos mediadores inflamatórios no cólon ... 44
Análise da população leucocitária ... 44
Análise da translocação bacteriana ... 46
Análise da permeabilidade intestinal com FITC-Dextran ... 46
Análise da junção epitelial por imunofluorescência ... 46
RESULTADOS ... 48
Tratamento com antibióticos reduz a carga bacteriana intestinal. ... 48
Os AGCCs, endógeno ou exógeno, protegem contra a colite aguda por C.difficile. ... 49
Os AGCCs não mostraram inibir diretamente o crescimento da C. difficile ou afetar a produção de suas toxinas A/B. ... 50
Os AGCCs atenuam a inflamação no cólon de camundongos infectados. ... 53
Butirato aumenta o número de células T reguladoras na lâmina própria do cólon. ... 55
Os AGCCs reduzem a permeabilidade intestinal durante a CDI. ... 57
Proteção observada é independente da microbiota intestinal. ... 60
O efeito protetor dos AGCCs na infecção por C. difficile envolve a ativação do receptor GPR43 (FFAR2). ... 62
DISCUSSÃO ... 64
CONCLUSÃO ... 69
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 70
ANEXO 1 - Figuras suplementares ... 76
ANEXO 2 – Aprovação pelo Comissão de Ética no Uso de Animais ... 79
INTRODUÇÃO
O intestino é o segmento do sistema digestório responsável pela absorção de água e nutrientes e que se estende a partir do estômago, precisamente do esfíncter do piloro, ao ânus e, em seres humanos e outros mamíferos, constituído por dois segmentos: o intestino delgado e o grosso. Nos seres humanos, o intestino delgado é subdividido em duodeno, jejuno e íleo; enquanto o intestino grosso é subdividido em ceco e cólon. Este órgão contém o maior número de células imunes de qualquer tecido do corpo e é continuamente exposto a uma ampla gama de antígenos e potenciais estímulos imunológicos. Há uma consciência crescente de como os conteúdos do intestino, tais como as bactérias comensais e constituintes dietéticos, influenciam os processos fisiológicos e patológicos em todo o nosso organismo (Mowat & Agace, 2014).
Estima-se que, somente no intestino grosso, um humano adulto contém cerca de 1014 bactérias de mais de mil espécies diferentes (Eckburg et al, 2005). No entanto, estas quantidades e a diversidade microbiana podem variar muito entre indivíduos, bem como os seus metabólitos, devido a vários fatores incluindo, principalmente, idade do hospedeiro, dieta e seu estado de saúde (Hooper et al, 2002). Estudos mostraram que a microbiota intestinal normal contém bactérias de diferentes filos incluindo Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia, Cyanobacteria e Spirocheates (Eckburg et al, 2005; Rajilic-Stojanovic et al, 2007; Wang et al, 2005). Interações entre o hospedeiro e a microbiota comensal intestinal, composta predominantemente por Firmicutes e Bacteroidetes, traz benefícios mútuos e auxilia na resistência à colonização por agentes patogênicos, constituindo assim um mecanismo de defesa biológico exógeno (Backhed et al, 2005; Ley et
al, 2008; Rodriguez et al., 2015; Brestoff et al., 2013; Stecher et al., 2008). Esta resistência à
colonização fornecida pela microbiota está relacionada a diferentes fatores incluindo a limitação global de nutrientes, estabilização da barreira intestinal e motilidade, estimulação de secreção de mucina e produção de peptídeos antimicrobianos pelo hospedeiro, transformação do ácido biliar, competição física com patógenos por receptores de adesão e produção de moléculas antimicrobianas pelas próprias bactérias da microbiota, como bacteriocinas e, possivelmente, ácidos graxos de cadeia curta (Stecher et al., 2008).
Além disto, a população de microrganismos comensal é de extrema importância para a manutenção da homeostase do hospedeiro, pois ao longo de toda a vida, molda e auxilia diversas funções fisiológicas como a absorção de nutrientes, metabolismo e o desenvolvimento do sistema imunológico (Hooper et al., 2012; Maynard et al., 2012; Purchiaroni et al., 2013; Brestoff et al., 2013; Sommer et al., 2013). Sendo assim, não é estranho o fato de que alterações
quanti- ou qualitativas na composição desta microbiota, quadro denominado por disbiose, estão associadas ao desenvolvimento de patologias, tais como a doença inflamatória intestinal, artrite reumatoide, asma, obesidade, entre outras (Trompette et al., 2014; Ferreira et al., 2014; Srinivasan et al., 2012; Theriot et al., 2013).
Em condições fisiológicas, a colonização por diversos microrganismos patogênicos e oportunistas no trato gastrointestinal é restringida pela microbiota comensal. Com o uso de antibióticos e outros agentes antimicrobianos, há um desequilíbrio da população de bactérias presentes no lúmen intestinal, podendo haver o crescimento exponencial de microrganismos resistentes às drogas, os quais proliferam e provocam quadros patológicos diversos, tais como a infeção por Clostridium difficile, ou outras doenças inflamatórias do intestino (Johanesen et
al., 2015; Theriot et al., 2013). Especificamente, a bactéria C. difficile, a qual é encontrada
como componente da microbiota intestinal de indivíduos adultos saudáveis (0-17% dos indivíduos), prolifera e passa a produzir toxinas no cólon após a antibioticoterapia, sendo considerada o principal patógeno responsável por colites associadas ao uso de antibióticos (Rodriguez et al., 2015; Johanesen et al., 2015; Theriot et al., 2013; Chen et al., 2008; Rea et
al., 2011).
Clostridium difficile
O Clostridium é um gênero de bactérias Gram-positivas pertencente ao filo de Firmicutes e encontradas amplamente na natureza, tanto no solo como em hospedeiros saudáveis (Eckburg et al, 2005; Wang et al, 2005). É o maior entre os géneros de bactérias anaeróbias formadoras de esporos e possui mais de 120 espécies, dentre as quais, algumas benéficas envolvidas em vias metabólicas e outras patogênicas, responsáveis por uma ampla gama de doenças (Bruggemann e Gottschalk, 2008). Dentre as bactérias patogênicas está a
Clostridium difficile, a qual é considerada um membro da microbiota intestinal normal e tem o
seu crescimento suprimido por organismos anaeróbios mais dominantes (Theriot et al., 2013). Uma de suas característica mais evidentes é a sua resistência a diversos agentes antimicrobianos, tais como clindamicina, ampicilina e cefalosporinas de 3ª geração, o que lhe confere uma vantagem seletiva frente aos demais microrganismos intestinais (Theriot et al., 2013; Johanesen et al., 2015; Rea et al., 2011).
A C. difficile existe tanto na forma vegetativa, a mais comum, como na forma de esporo. Os esporos são resistentes à temperatura e a ambientes adversos, tais como o ácido gástrico e alguns desinfetantes comerciais, sobrevivendo estes em hospitais, ambiente doméstico e no solo. A transmissão da C. difficile entre os indivíduos ocorre direta (fecal-oral)
ou indiretamente através de contato com superfícies contendo os seus esporos (Hookman et al, 2009). Curiosamente, foi descoberta como um suposto organismo comensal na microbiota fecal de recém-nascidos saudáveis, em 1935 por Hall e O`Toole (Lamont, 2004). Recebeu a denominação de “difficile” devido ao fato de crescer muito lentamente na cultura e levado, aproximadamente, um ano para ser isolada completamente. Mantida em obscuridade até 1978, quando foi identificada como fonte das toxinas presentes em fezes de pacientes com colite pseudomembranosa, doença associada ao uso intenso de antibióticos (Lamont, 2004).
Figura 1. Clostridium difficile. A) Imagem típica de colônias de C.difficile em uma placa de ágar de sangue. B)
Imagem de microscopia de contraste de fase de uma cultura de C.difficile com células vegetativas (hastes alongadas), esporos de fase-escuro (pontos escuros subterminais) e esporos de fase brilhante (elipsóides brilhantes). C) Microscopia eletrônica de varredura de esporos de C.difficile. D) Figura endoscópica da colite pseudomembranosa causada por C.difficile. O tecido do cólon saudável é rosa, as pseudomembranas resultantes da infecção por C.difficile são amarelas. Imagem publicada por SMITS et al., Nature Reviews Disease Primers, v. 2, p. 16020, 2016.
Algumas cepas patogênicas são produtoras de exotoxinas proteicas, tais como a toxina TcdA (enterotoxina) e a toxina TcdB (citotoxina), as quais são causadoras de danos celulares irreversíveis e estão diretamente envolvidas no desenvolvimento de manifestações
clínicas intestinais, causando desde diarreia ligeira e benigna a quadros severos como a colite (Voth et al., 2005; Dobson et al, 2003). Apesar destas cepas toxigênicas serem consideradas patogênicas, o aparecimento de sinais e sintomas clínicos da doença não é suficiente somente pela sua produção de toxinas, uma vez que o indivíduo pode estar colonizado e permanecer assintomático por tempo indeterminado. Ambas, as cepas toxigênicas e não toxigênicas, existem naturalmente e podem colonizar indivíduos saudáveis (Calfee, 2008; Cloud & Kelly, 2007). A taxa de colonização no intestino humano varia de acordo com a idade, sendo mais alta na infância e diminuindo com a idade. É comum que recém-nascidos sejam portadores assintomáticos de C. difficile, com taxas que ultrapassam os 50% nos 6 primeiros meses de vida, no entanto, a doença não é evidenciada nesta população devido ao baixo reconhecimento das toxinas oriundas da C. difficile pelas células epiteliais intestinais (Smits et al., 2016; Sunenshine & McDonald, 2006).
Epidemiologia
Vários estudos epidemiológicos, realizados na última década, documentam um aumento preocupante da incidência, da gravidade e das taxas de recorrência da doença associada ao C. difficile em diversos países (Kelly e Lamont, 2008; Warry et al, 2005; McDonald et al, 2006). Este aumento associa-se tanto a melhoria dos métodos de detecção da doença e da bactéria, nomeadamente, a disponibilização de ensaios simples, mais sensíveis e específicos, quanto por fatores atribuíveis ao agente, salientando a emergência de cepas mais virulentas, como B1/NAP1/027 (Kelly e Lamont, 2008; Loo et al, 2011; Voth e Ballard, 2005; Warry et al, 2005). Ainda, pode ser considerado reflexo do uso indiscriminado de antibióticos e altos índices de ocupação nos hospitais, bem como maior número de indivíduos imunossuprimidos e idosos. O desenvolvimento da doença nestes indivíduos é particularmente mais grave e comum, uma vez que estes são hospitalizadas com maior frequência e por períodos mais longos, favorecendo também a disseminação dos esporos da bactéria (Elseviers et al., 2015; Akerlund et al., 2006).
Estima-se que mais de 30% das pessoas internadas atualmente nos hospitais dos Estados Unidos da América estejam infectadas, tornando a colite associada ao C. difficile uma das infecções nosocomiais mais frequentes (Napolitano & Edmiston, 2017; Elseviers et al., 2015). Os quadros clínicos podem variar desde o portador assintomático (maior prevalência) à colite pseudomembranosa grave, cuja mortalidade se situa entre 6-30% (Bibbò et al., 2014; Rupnik et al., 2009; Chen et al., 2008). Nos pacientes com diarreia leve e autolimitada, a mortalidade é considerada quase nula e a grande maioria se recupera; no entanto, as recorrências
são comuns nestes indivíduos. Além disso, a mortalidade anteriormente atribuída a este grupo, entre 0,6 e 1,5%, alcançou os 6,9% em surtos recentes, aumentando de forma progressiva (Freeman, 2010).
Estima-se também que somente nos EUA, cerca de 10-12 milhões de adultos são infectados a cada ano; destes, cerca de um terço torna-se sintomática, gerando um custo que lhe é atribuído entre US$ 2.470,00 a US$ 3.669 por episódio (Dubberke et al., 2008). Ainda, observa-se um aumento de casos mais grave da doença, com mortalidade e taxa de reincidência mais elevada, bem como maior resistência ao tratamento, o que aumenta ainda mais os gastos com a saúde pública (Rodríguez-Varón et al., 2017; Akerlund et al., 2006). Contudo, vemos a necessidade de maiores estudos e o desenvolvimento de novas medidas terapêuticas contra a doença associada à infecção por Clostridium difficile.
Patogênese
A patogênese da infeção por Clostridium difficile começa com a ingestão da bactéria, geralmente na forma de esporos, estrutura não vegetativa e resistente que persistem no ambiente por longos períodos e de difícil erradicação. Após a ingestão destes esporos, os mesmos sobrevivem à acidez gástrica, com pH próximo a 2, e são, então, estimulados por sais biliares (como, por exemplo, o taurocolato) a germinar no duodeno. Ao assumir a sua forma vegetativa, é capaz de colonizar a superfície da mucosa, principalmente a do cólon, e mantêm um estado de equilíbrio com as demais bactérias comensais (figura 2) (Sunenshine & McDonald, 2006).
A doença associada ao C. difficile somente irá se iniciar após a perturbação da microbiota intestinal, sendo esta geralmente causada pela antibioticoterapia (Elliott et al, 2007; Janoir et al, 2007). Os antibióticos agem desestabilizando a população microbiana normal, permitindo o estabelecimento e proliferação exacerbada da C. difficile. Cepas toxigênicas secretam citotoxinas que iniciam uma série de fenômenos celulares, culminando com a perda da função de barreira das células epiteliais, o aparecimento de diarreia e a formação de pseudomembranas na parede intestinal (Yam & Smith, 2005).
Figura 2. Defesas mediadas pela microbiota contra a Clostridium difficile. A) a microbiota intacta converte os
ácidos biliares primários em ácidos biliares secundários, cujos derivados inibem o crescimento da C.difficile através da toxicidade induzida (pela bile) a bacilos vegetativos. Bactérias comensais que expressam sialidases, enzima envolvida no metabolismo microbiano, clivam carboidratos complexos que estão ligados à superfície das células epiteliais e produzem o ácido siálico no lúmen intestinal, importante fonte energética para o crescimento bacteriano. As espécies bacterianas comensais também convertem os carboidratos em ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), tais como o ácido succínico. As populações bacterianas comensais presentes podem consumir estes metabólitos como fontes de energia. B) a depleção da microbiota mediada por antibióticos diminui os conversores primários de ácidos biliares, o que possibilita a esporulação e o crescimento exponencial de C.difficile. Antibióticos também podem esgotar os consumidores concorrentes de ácidos siálico e succínico, aumentando os nutrientes disponível para a C.difficile. Imagem publicada por Abt et al., Nature Reviews Microbiology, 2016.
Fatores relacionados ao hospedeiro, nomeadamente parâmetros imunes, grau de perturbação da microbiota normal do hospedeiro e grau de virulência do microrganismo também estão envolvidos na agressividade e patogênese da infeção (Blondeau, 2009). É de extrema importância o nível de resposta imune em termos de circulação de anticorpos IgG (séricos) ou IgA (luminal/fecal) contra as toxinas na resistência do hospedeiro frente à evolução da doença. Níveis significativamente mais baixos de anticorpos relacionam-se a pacientes com sintomas severos, ao passo que níveis mais elevados se relacionam a pacientes com sintomas leves ou moderados. Além disso, anticorpos séricos IgG contra a toxina TcdA durante um episódio inicial de diarreia está associado à proteção contra recorrências, sendo mais frequentes em indivíduos assintomáticos (Kyne et al, 2000; Kyne et al, 2001).
O epitélio do cólon é o principal alvo das toxinas, levando a ruptura da barreira epitelial e abrindo as junções paracelulares das células epiteliais intestinais (IECs) com consequente aumento da permeabilidade intestinal e diarreia aquosa (Abt et al., 2016). Essa
última condição é caracterizada por uma inflamação intensa com formação de múltiplas placas amareladas aderentes à superfície da mucosa colônica (figura 1d) (Rupnik et al., 2009). Cada placa compreende uma pseudomembrana composta de fibrina, muco, células epiteliais necrosadas e leucócitos (Bibbò et al., 2014). Os sinais e sintomas mais comuns incluem diarreia, febre e dor abdominal. Complicações graves como desidratação, hipoalbuminemia, hipotensão e hipovolemia, insuficiência renal, megacólon tóxico, perfuração intestinal, síndrome da resposta inflamatória sistêmica, sepse e morte também podem ocorrer (Johanesen et al., 2015).
Toxinas
Todas as cepas toxigênicas de C.difficile apresentam um locus de patogenicidade (PaLoc) que mede 19,6 Kb. Este locus é constituído por 5 genes (tcdA, tcdB, tcdC, tcdE, tcdR). As toxinas TcdA e TcdB são codificadas pelos genes tcdA e tcdB, sendo responsáveis pela patogenicidade da C.difficile. O gene tcdC atua como regulador negativo, evitando a expressão do locus PaLoc, enquanto que o gene tcdR atua como um regulador positivo da expressão de
tcdA e tcdB. Quanto ao gene tcdE, este codifica uma porina com a função de fazer poros na
membrana citoplasmática que permite a libertação das toxinas (Carroll & Bartlett, 2011).
Figura 3. Regulação das toxinas de Clostridium difficile. Representação esquemática do locus de patogenicidade
(PaLoc) e das regiões flanqueadoras com interações regulatórias de Clostridium difficile. Caixas indicam genes com as setas mostrando a direção da transcrição. Os genes das toxinas TcdA e TcdB estão em azul, os genes reguladores estão em laranja (positivo) e verde (negativo); TcdE está em amarelo e as setas tracejadas indicam a produção de proteína a partir de um transcrito de gene. A proteína TcdR está envolvida no início da produção de toxina A (TcdA) e B (TcdB). Imagem modificada de Smits et al., Nature Reviews Disease Primers, 2016.
Estas toxinas possuem atividade glicosiltransferase, causando a quebra das fibras de actina do citoesqueleto. Após o seu reconhecimento por receptores presentes na membrana de células epiteliais colônicas e endocitose pelas mesmas, sofrem quebra autoproteolítica dentro do endossoma, em meio ácido, e liberam a região N-terminal (com o domínio catalítico) no
citoplasma destas células. Aparentemente, este último incorpora glicose em determinadas guanosinas-trifosfatases (GTPases), como as proteínas Rho e Rac, entre outras. Como as GTPases regulam, entre outras funções, processos implicados na manutenção da barreira epitelial e formação do citoesqueleto (interações intercelulares), a glicosilação destas leva à degradação das fibras de actina, resultando na diminuição da resistência transepitelial, aumento da permeabilidade da membrana, acúmulo de líquido e a destruição do epitélio intestinal com perda da função de barreira e necrose celular (Aktories, 2016; Smits et al., 2016; Ferreira, 2013; Rocha et al., 1999).
Figura 4. Estrutura e função das toxinas A e B da Clostridium difficile. Também conhecidas como TcdA e
TcdB, as toxinas são compostas de ao menos quatro domínios (ver a figura, partes a). A região amino-terminal alberga o domínio GTD de glucosiltransferase biologicamente ativo (vermelho); enquanto que o domínio CROPS de ligação carboxi-terminal (verde) está envolvido na ligação a um receptor de superfície celular. Um domínio APD (azul) de protease de cisteína ("corte") está localizado a jusante do domínio GTD. Entre os domínios APD e CROPS, o domínio "Delivery" (amarelo) está envolvido na translocação da toxina para o citoplasma da célula do hospedeiro. A toxina liga-se com o seu terminal CROPS ao receptor da superfície celular, resultando na endocitose do complexo toxina-receptor (ver a figura, parte b). Em presença do pH ácido dos endossomas, ocorre numa
alteração estrutural na toxina, permitindo a sua inserção na membrana. Uma parte do domínio Delivery está envolvida na formação de poros. Após a translocação dos domínios da glucosiltransferase e da protease para o citosol, o domínio da protease cisteína é ativado por ligação ao hexacisfosfato de inositol (InsP6). O domínio protease cliva autocataliticamente a toxina e libera o domínio da glucosiltransferase para o citosol, onde as proteínas da família RHO são então glicosiladas. Imagem modificada de Aktories, Nature Reviews Microbiology, 2011; Smits et al., Nature Reviews Disease Primers, 2016.
Além disso, as toxinas TcdA e TcdB do C.difficile também ativam a fosfolipase A2, família de proteínas estruturalmente relacionadas, capazes de hidrolisar os fosfoglicerídeos de membrana, liberando ácido araquidônico, o substrato para biosíntese de muitos mediadores envolvidos na inflamação, a qual, por sua vez, leva à produção de prostaglandinas e leucotrienos (Abt et al., 2016; Smits et al., 2016). Dessa forma, são capazes de induzir a migração de células do sistema imune para a lâmina própria intestinal e estão envolvidas em processos inflamatórios que danificam os tecidos por iniciação da resposta imune maciça, bem como a regulação positiva e produção de citocinas como interleucina (IL)-8, IL-6, IL-1β e INF-γ. Adicionalmente, estas toxinas induzem são capazes de induzir a degranulação de mastócitos, o que também estimula a infiltração acentuada de neutrófilos, responsáveis por intermediar o processo inflamatório e o dano tecidual (Pothoulakis & Lamont, 2001; Linevsky et al., 1997).
Por sua vez, a toxina TcdA liga-se a receptores glicídicos específicos na superfície das células epiteliais (toxin A-receptor) e promove necrose celular com ativação posterior de monócitos/macrófagos. Estas células ativadas, presentes na lâmina própria, produzem potentes mediadores químicos pró-inflamatórios e quimiotáticos, como histamina, prostaglandinas, leucotrienos, fator de ativação plaquetária (PAF) e de necrose tumoral (TNF-α), IL-1, IL-8 e óxido nítrico, que induzem o aumento da permeabilidade capilar da mucosa, secreção de fluídos e grande influxo de neutrófilos, promovendo a liberação de grânulos citotóxicos que causam danos às microvilosidades intestinais e erosões na mucosa, caracterizando o início da inflamação (Ferreira, 2013; Rocha et al., 1999; Kyne et al., 2000, Surawicz & McFarland, 1999; Pothoulakis1 & Lamont, 2001).
A toxina TcdB é extremamente citotóxica e liga-se às células que não são cobertas por matriz glicídica, induzindo alterações eletrofisiológicas e morfológicas na mucosa colônica (Rocha et al., 1999; Ferreira, 2013). Além disto, as toxinas provocam alterações celulares, geralmente irreversíveis, que podem levar a ruptura da barreira epitelial e abertura das junções intercelulares, consequentemente, afetando a integridade da mucosa e promovendo a perda de líquidos. Estas toxinas também podem atravessar o epitélio e induzir a produção de citocinas por linfócitos e mastócitos teciduais, aumentando ainda mais o influxo de neutrófilo e formação
de microabcessos que, em conjunto, compõem a pseudomembrana, caracterizando a doença como “colite pseudomembranosa” (Surawicz & McFarland, 1999; Rocha et al., 1999; Kelly et
al., 1994; Ferreira, 2013; Linevsky et al., 1997).
Curiosamente, também foi identificado uma terceira toxina, a toxina binária do
C.difficile, que pode estar presente em cerca de 6 a 10% das cepas virulentas, cuja função é
independente dos elementos regulatórios associados ao PaLoc (Arteaga et al, 2009; Barbut et
al, 2005). Estas cepas têm um aumento na produção das toxinas TcdA e TcdB de 16 a 20 vezes
superior às outras, isto devido a uma deleção no gene regulador de toxinas tcdC. Outra diferença muito evidente é que secretam suas toxinas fundamentalmente na fase de crescimento logarítmica, enquanto que normalmente as demais cepas sem esta deleção secretam na fase estacionária (Barbut et al, 2007; Spigaglia & Mastrantonio, 2002). Estas cepas hipervirulentas que possuem a toxina binária apareceram em surtos notificados na América do Norte e Europa e tem sido em grande parte responsável pelo aumento da incidência e da gravidade da infeção por C.difficile (Arteaga et al, 2009).
Além das toxinas, outras moléculas produzidas pelas bactérias atuam como fatores de virulência e são importantes na patogênese e na ativação da resposta inflamatória, como a flagelina e os componentes da parede celular bacteriana. Além disso, as proteínas S-layer (PLSs), componentes da superfície do bacilo C.difficile, possuem efeitos imunomoduladores importantes. Essas moléculas são capazes de induzir a liberação de quantidades elevadas tanto de mediadores pró-inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-12 e IL-23, quanto anti-inflamatórios, como IL-10 (Ausiello et al., 2006). Efeito esse que tem sido atribuído à ativação do receptor de superfície TLR4 (Bianco et al., 2011, Ryan et al., 2011). Outras ações dessas moléculas incluindo regulação da proliferação e maturação de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC), além da polarização mista de linfócitos TCD4+ em Th1/Th2 também têm sido demonstradas (Ausiello et al., 2006). Assim, as PLSs podem contribuir com a patogenicidade do microrganismo por perturbar o equilíbrio de citocinas e seus efeitos sobre a maturação e função efetora de leucócitos.
Colite pseudomembranosa
A colite pseudomembranosa foi descrita pela primeira vez em 1893 por Finney, sendo a principal doença intestinal associada ao uso intenso de antibióticos e tendo como agente etiológico a bactéria Clostridium difficile (Aktories, 2016). As toxinas TcdA e TcdB estimulam a inflamação da mucosa colônica, induzindo alterações do citoesqueleto que comprometem a barreira epitelial e a produção de citocinas inflamatórias. Além disso, a perda das junções
celulares permite que as toxinas atravessem o epitélio, induzindo ainda mais a produção de citocinas por células presentes na lâmina própria, como linfócitos e mastócitos. Em conjunto, as toxinas levam a uma resposta inflamatória intensa devido ao influxo de neutrófilos e podem levar ao início da colite pseudomembranosa (Shen, 2012).
Em seus aspectos clínicos, a colite é bem definida histopatologicamente e invariavelmente restrita ao cólon e reto. Com o progresso da doença, a mucosa torna-se necrótica e com a formação, em casos fulminantes, de uma membrana exsudativa sobre o epitélio. Estas, em conjunto, apresentam-se como múltiplas placas esbranquiçadas, medindo de alguns milímetros a 1 ou 2 centímetros, aderidas na parede intestinal luminal. Por sua vez, a mucosa pode parecer normal ou edemaciada, com aspecto granular, de acordo com a evolução da doença. Microscopicamente, a pseudomembrana é vista como um exsudado fibrinoso contendo fibrina, leucócitos necróticos, muco e restos celulares epiteliais. A submucosa intestinal subjacente mostra um grau variável de necrose e de reação inflamatória, encontrando-se infiltrada por neutrófilos. Nos primeiros estágios da doença, pequenas erosões superficiais podem ser encontradas (Borriello, 1998; Shen, 2012).
Clinicamente, além da diarreia (90 a 95%) e sinais de desidratação, os principais sinais e sintomas da colite pseudomembranosa são: febre (até 80% dos casos), leucocitose (até 80% dos casos) e dor abdominal (80 a 90% dos casos) (Trudel, 2007). Mais raramente, o paciente pode evoluir com quadros de colite sem diarreia, com apresentação do megacólon tóxico, forma aguda da inflamação intestinal caracterizada por uma dilatação anormal do intestino grosso (Dobson et al., 2003). Recorrências da doença podem ocorrer em até 50% dos casos, sendo mais evidente se o indivíduo continuar hospitalizado. Raramente surgem lesões fora do intestino, já tendo sido descritos casos de bacteremias concomitantes por componentes da microbiota intestinal, abcesso esplênico e osteomielite (ou mesmo artrite e/ou tenossinovite reacional) pelo Clostridium difficile. Perfuração do cólon e enteropatias com grande perda de proteínas são duas das complicações que podem ocorrer em casos severos (Beaugerie et al, 2003; McFarland, 2009; Dobson et al., 2003).
Figura 5. Histopatológico da infecção por Clostridium difficile. A) início da colite pseudomembranosa em
resposta a infecção por C.difficile com formação de placas amareladas característica da doença, compostas por exsudado fibrinoso contendo fibrina, leucócitos necróticos, muco, toxinas e restos celulares epiteliais. B) Análise histológica de fragmentos do ceco e do cólon corados com eosina e hematoxilina durante a colite pseudomembranosa ativa, mostrando a presença de edema de mucosa com infiltrado leucocitário e destruição do epitélio intestinal. Imagens obtidas do Google Imagens, 2017.
Tratamento
O tratamento de todos os pacientes com infeção por C.difficile não é simples e se direciona principalmente na resolução dos sinais e sintomas clínicos da doença, incluindo a reposição adequada de líquidos e eletrólitos perdidos durante os quadros diarreicos. (Eckert e Barbut, 2010). Como a doença está associada ao uso de antibióticos, quase sempre inicia-se durante o tratamento de alguma outra moléstia. Desta forma, o antibiótico em uso pelo paciente com início da colite deve ser interrompido sempre que possível (Eckert e Barbut, 2010; Gerding
et al, 2008). Esta medida simples pode ser suficiente para a resolução de uma infeção ligeira,
mas, na presença de sinais e sintomas mais significativos ou persistentes, ou se o antibiótico não pode ser interrompido, torna-se necessária a antibioticoterapia contra a infecção por
Por ser sensível in vitro ao metronidazol e à vancomicina, estes antibióticos foram eleitos para o tratamento oral da infecção (CDI) (Freeman et al, 2010). O metronidazol é a escolha para episódios iniciais, com diarreia leve ou moderada (500 mg por via oral 3 vezes por dia durante 10 ou 14 dias, de acordo com o quadro). Por sua vez, a vancomicina é a escolha para episódios mais graves de CDI, sendo iniciais ou não (125 mg por via oral 4 vezes por 10 - 14 dias). A combinação destes dois, seja com a vancomicina administrada oralmente ou por reto e com metronidazol administrado por via intravenosa é o tratamento escolhido para quadros graves e complicados (Rodriguez et al., 2015). No entanto, qualquer agente antimicrobiano pode estar envolvido com o desenvolvimento da doença, sendo que uma única dose pode ser suficiente para desencadear o início dos sintomas (Bartlett, 2006; Hurley e Nguyen, 2002; Surawicz, 2007). Além disso, o tratamento com antibióticos durante a CDI não é muito efetivo, uma vez que altas taxas de recorrência são comuns, bem como maior probabilidade de aumentar a severidade a cada novo episódio e elevados custos com saúde pública (Bartlett, 2010).
Além disso, em alguns casos mais severos da infecção por C.difficile, entre 5% dos pacientes, é necessário a intervenção cirúrgica (Freeman, 2010). Esta medida terapêutica é reservada para complicações da doença, tais como a colite fulminante, a não resposta ao tratamento médico, megacólon tóxico ou mesmo a perfuração intestinal com risco de sepse. O procedimento de escolha é a colectomia subtotal com ileostomia final; procedimentos menores como colectomia segmentar, laparotomia para diagnóstico (também conhecida como celiotomia, que compreende uma incisão para acesso à cavidade abdominal) ou cecostomia também são comuns (Trudel, 2007). Em geral, de 65 a 100% dos doentes com quadros fulminantes requerem cirurgia, sendo uma decisão crítica pois pode salvar vidas, mas também está associada a uma alta mortalidade, entre 25 e 75% dos casos (Jaber et al, 2008).
Contudo, não são muito simples e eficientes as medidas terapêuticas existentes para o tratamento da CDI. A recorrência após a interrupção do tratamento com antibióticos ocorre em 20% e 30% dos pacientes, levando a outras intervenções, como o transplante de microbiota fecal. Foi descrito que a bacterioterapia fecal é capaz de restaurar a microbiota e promover a resistência à colonização (Rodriguez et al., 2015). Evidenciando a importância da proteção do organismo por bactérias da microbiota e seu papel na infecção causada por C. difficile, Van Nood e colaboradores (2013) demonstraram que a infusão de fezes de doadores saudáveis a pacientes com infecção recorrente por C. difficile foi significativamente mais eficaz no tratamento da patologia do que o uso de vancomicina e lavagens intestinais, procedimentos esses que são frequentemente empregados nos hospitais. Foi relatado que 94% dos pacientes progrediram para a cura quando tratados com o transplante de microbiota fecal, diferente dos
que receberam somente vancomicina (31%) ou a administração deste antibiótico associada com lavagens intestinais (23%). Da mesma forma, Lawley et al. (2012) mostrou que o transplante de microbiota fecal resolveu relapsos de infecções por C. difficile em camundongos. A administração de bactérias fecais é realizada através de sonda nasogástrica, colonoscópio, ou enema, com o principal objetivo de reconstituir a microbiota intestinal dos pacientes. Apesar desses estudos evidenciarem a importância da microbiota na proteção contra infecções intestinais, os mesmos não fornecem informações referentes ao mecanismo pelo qual as bactérias promovem esta defesa durante as doenças. Portanto, uma nova preocupação de vários estudos tem sido a identificação das comunidades microbianas implicadas na infecção e o seu mecanismo de ação por trás de tal efeito protetor.
Ácidos graxos de cadeia curta
Sabemos que os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) são importantes produtos metabólicos oriundos, mas não exclusivamente, da microbiota e capazes de modular a absorção de água e eletrólitos no trato gastrointestinal, bem como envolvidos em parte dos efeitos sobre a função imunológica intestinal, além de potencialmente atuarem na prevenção de patologias, como alguns tipos de câncer e diabetes (Vinolo et al., 2011; Tan et al., 2013). Estes compostos são ácidos carboxílicos pequenos, com 1 a 6 carbonos em sua estrutura, e encontrados em altas concentrações no trato gastrointestinal, uma vez que já era esperado devido à elevada carga microbiana (Wong et al., 2006). No cólon proximal, suas concentrações variam de 70 a 140 mM, enquanto que no cólon distal foram descritas concentrações menores (20-70 mM). Além disso, esses metabólitos também estão presentes em altas concentrações na cavidade oral (6-38 mM de acetato, 1-13 mM de propionato e 0-5 mM de butirato) e no trato genital feminino (acetato podem chegar a 120 mM), onde desempenham também um importante papel na homeostase tecidual, particularmente nas interações imunes com as bactérias e frente às infecções (Wong et al., 2006).
Por sua vez, os AGCCs são produzidos através da fermentação de fibras alimentares e carboidratos resistentes ou componentes do hospedeiro, como muco, células mortas, etc., por bactérias anaeróbias, incluindo Bacteroidetes e Firmicutes, nos tecidos hospedeiros, como ocorre no trato gastrointestinal. Os mais abundantes em nosso organismo são: acetato, propionato e butirato (apresentados em sua forma iônica neste trabalho), dos quais têm, respectivamente, dois, três e quatro carbonos na sua estrutura química (Wong et al., 2006). Após ser produzido no intestino, o butirato é rapidamente utilizado pelos colonócitos como fonte energética, enquanto que o acetato e o propionato são direcionados ao fígado via sistema
porta hepático. Propionato é utilizado principalmente pelos hepatócitos, enquanto o acetato chega em altas concentrações na corrente sanguínea, sendo utilizado e metabolizado pelas células dos tecidos periféricos (Pomare et al., 1985). Sabe-se que os AGCCs modificam vários processos celulares incluindo a expressão de genes, quimiotaxia, diferenciação, proliferação e apoptose (revisado por Correia et al., 2016).
Figura 6. Produção dos ácidos graxos de cadeia curta. Os AGCCs são produzidos pela microbiota através da
fermentação de mono-polissacarídeos não digeridos por enzimas próprias do hospedeiro e pela metabolização de muco e aminoácidos de proteínas endógenas ou alimentares. Dentre eles, os mais evidentes no organismo humano são: acetato (2 carbonos), propionato (3 carbonos) e butirato (4 carbonos). Estes são usados pelas células epiteliais intestinais ou são transportados através da circulação sanguínea aos tecidos periféricos. Sua concentração no trato gastrointestinal aumenta paralelamente com o aumento da carga bacteriana gastrointestinal.
Produção e absorção dos AGCCs
Dependendo das espécies de bactérias e dos fatores ambientais, incluindo o tipo e a disponibilidade de substrato (fibras, alguns aminoácidos específicos e carboidratos resistentes), pH e tensão de oxigênio, a via metabólica envolvida na produção dos AGCCs pode ser diferente, afetando a quantidade e as proporções destes compostos (Louis et al., 2014). Em geral, as principais vias envolvidas nessa produção são as camadas de Embden-Meyerhof-Parnas (glicólise) e as vias das pentoses (oxidação das moléculas de glicose) (Miller e Wolen, 1996; Tan et al., 2014). O piruvato produzido nestes processos é em parte convertido em acetil-CoA, que pode ser hidrolisado, gerando acetato. Adicionalmente, o acetato pode ainda ser produzido na via Wood-Ljungdahl a partir de CO2 e hidrogênio ou ácido fórmico. O propionato é produzido principalmente na via do ácido succínico, mas outras vias, que usam lactato ou
desoxihexose como substrato (propanodiol e caminhos de acrilato), também contribuem para a geração desta molécula. O butirato é produzido a partir de duas moléculas de acetil-CoA, que são convertidas em butiril-CoA. Esta última molécula é convertida por butirato quinase ou via butiril-CoA (Pryde et al., 2002; Louis et al., 2014).
Além da sua utilização por outras bactérias, os AGCCs produzidos no lúmen intestinal atravessam as células epiteliais tanto passiva- (forma não ionizada) quanto ativamente (forma ionizada). Neste último caso, há o envolvimento de canais presentes na membrana plasmática das células epiteliais intestinais, tais como os transportadores de monocarboxilato MCT-1 (Slc16a1) e o de monocarboxilato dependente de sódio SMCT-1 (Slc5a8), alcançando assim a circulação sanguínea (Den Besten et al., 2013). Conforme já mencionado, uma pequena fração dos AGCCs absorvidos no intestino entra na circulação sistêmica, uma vez que parte deles é metabolizada pelas células periféricas e no fígado (Den Besten et al., 2013). De facto, as concentrações plasmáticas destes metabolitos são muito mais baixas do que as intestinais: a concentração sérica de acetato tem sido referida como sendo entre 60 e 150 uM, enquanto que o propionato e o butirato são encontrados em concentrações ainda mais baixas, respectivamente, 3-7 uM e 1-4 uM (Vogt et al., 2004; Wolever et al., 1997; Wolever et al., 2002).
Mecanismo de ação e efeitos dos AGCCs
Os AGCCs ativam diferentes respostas biológicas dependendo principalmente das suas concentrações, do tecido alvo e do mecanismo de ação ativado. As vias de sinalização, tais como ativação de receptores acoplados à proteína G (GPCRs), inibição das histona-desacetilases (HDAC) e estimulação da atividade da histona acetiltransferase (HAT), entre outras vias, incluindo a recentemente descrita estabilização do fator induzido por hipóxia 1 (HIF-1), estão implicadas em seus efeitos sobre as células do hospedeiro. Contudo, estes compostos atuam através de dois principais mecanismos de ação (figura 7). O primeiro se dá pela ligação desses metabólitos com receptores acoplados à proteína G (GPCRs), dentre os quais podemos citar o FFAR2 (free fatty acid receptor 2, ou também chamado de GPR43), FFAR3 (free fatty acid receptor 3, ou GPR41), GPR109a (ou HCA2) e Olfr8 (olfatory receptor 8). Tais receptores são encontrados em diferentes tipos celulares (células epiteliais, células mielóides, linfócitos, adipócitos, entre outros), além de possuírem afinidades distintas pelos AGCCs: FFAR2 (acetato = propionato > butirato); FFAR3 (propionato = butirato > acetato); GPR109a (butirato) e Olfr8 (propionato = acetato) (Brown et al., 2003). Uma vez ativados, os receptores desencadeiam diversas vias de sinalizações intracelulares responsáveis por exercer
suas funções tais como quimiotaxia, produção de mediadores inflamatórios e diferenciação de células T (Kim et al., 2013; Smith et al., 2013).
O segundo mecanismo de ação dos AGCCs se dá pela inibição direta das histonas deacetilases (HDACs) e/ou ativação das histonas acetil-transferases (HATs). As HDACs são divididas em quatro classes (revisado por Vinolo et al., 2011 e Tan et al., 2014): classe 1 (HDACs 1, 2, 3 e 8), classe 2a (HDACs 4, 5, 7 e 9) e 2b (HDACs 6 e 10), classe 3 (SIRT 1, 2 e 3) e classe 4 (HDAC11), sendo elas as responsáveis por remover grupos acetil dos resíduos de lisinas das histonas e proteínas não histonas. As HATs, por outro lado, têm função inversa, adicionando grupos acetil a esses mesmos resíduos. O balanço da atividade entre HDACs e HATs controla o perfil de acetilação das histonas, o que modula a transcrição de diversos genes. Os ácidos graxos de cadeia curta inibem as histonas deacetilases, principalmente as das classes 1 e 2, com diferentes potências, sendo butirato > propionato > acetato, e com isso, regulam diversos mecanismos como a ativação e diferenciação de células dendríticas, estimulação de células T, bem como na produção de citocinas e quimiocinas de neutrófilos e macrófagos (Wang et al., 2009; Vinolo et al., 2011; Smith et al., 2013).
Figura 7. Vias de atuação dos ácidos graxos de cadeia curta. Estes metabolitos ativam receptores de membrana
chamados receptores acoplados a proteína G (GPCRs, como GPR43 (ou FFAR2), GPR41 (ou FFAR3), GPR109a e Olfr78). Além disso, estes compostos também são capazes de atingir o citoplasma das células através de transportadores (Slc16a1 e Slc5a8) ou difusão passiva através da membrana plasmática (principalmente, a forma não ionizada) e modular a atividade de várias enzimas e fatores de transcrição, incluindo o de induzido por hipóxia (HIF), histona desacetilases (HDAC) e histona acetiltransferase (HAT). Modificam vários processos celulares, incluindo expressão de genes, quimiotaxia, diferenciação, proliferação e apoptose (Correa et al., 2016).
Os AGCCs possuem diversos efeitos benéficos relevantes tanto no trato gastrointestinal como sistemicamente, incluindo redução da permeabilidade intestinal (Mathewson et al., 2015; Zhang et al., 2007), aumento da produção de mucina e substâncias antimicrobianas (Sarker et al., 2014; Sunkara et al., 2012; Schauber et al., 2003), modulação da produção de citocinas, quimiocinas (Kim et al., 2013; Cox et al., 2009; Park et al., 2005; Park
et al., 2007) e da quimiotaxia de neutrófilos (Simeoli et al., 2016; Vinolo et al., 2011), bem
como geração de células reguladoras na lâmina própria intestinal (Smith et al. 2013; Furusawa
et al. 2013; Arpaia et al. 2013). Adicionalmente, foi descrito recentemente que estes compostos
são capazes de induzir uma proteção contra colites em diferentes modelos experimentais por agirem diretamente sobre o metabolismo e proliferação/apoptose de células epiteliais intestinais (IECs) (Donohoe et al. 2012; Kaiko et al., 2016) e modularem a resposta imune inflamatória (revisado por Corrêa, et al., 2016).
Receptor GPR43
Recentemente, estudos acerca da ativação dos receptores acoplados à proteína G pelos ácidos graxos de cadeia curta estão sendo desenvolvidos e publicados (Brown et al., 2013; Park et al., 2015; Smith et al., 2013; Vinolo et al., 2011b). Estes receptores constituem uma família caracterizada por possuir sete domínios transmembrana que são ativados por inúmeros ligantes, dentre os quais possuem afinidades distintas pelos AGCCs, em geral: acetato = propionato > butirato, e são expressos em diferentes tipos celulares, tais como células epiteliais, mielóides, linfócitos, adipócitos, entre outros (Brown et al., 2003). Após interagirem com seus ligantes, estes receptores sofrem alterações conformacionais e ativam proteínas heterotrimétricas intracelulares, formadas por GDP e outras três sub-unidades: α, β e γ, que são liberadas e, através da interação com outras proteínas, podem aumentar ou reduzir a atividade de enzimas citoplasmáticas efetoras, tais como adenilato e guanilato ciclases, fosfolipases (PLCs A2 e C), fosfatidilinositol 3-cinases (PI3Ks) e canais iónicos (maiores detalhes: Katritch
et al., 2013).
A ligação dos AGCCs com os receptores acoplados à proteína G (GPCRs), dentre os quais podemos citar o FFAR2 (free fatty acid receptor 2, ou também chamado de GPR43), desencadeiam diversas vias de sinalizações intracelulares responsáveis por exercer funções importantes para as células, tais como produção de mediadores inflamatórios, quimiotaxia e diferenciação de células T (revisado por Tan et al., 2014). Adicionalmente, com o intuito de explorar estas vias de sinalização, Kim et al. (2013) demonstrou que os AGCCs ativam os
receptores GPR41 e GPR43 em células epiteliais do intestino delgado, levando a sinalização celular por quinases mitogênicas e rápida produção de mediadores inflamatórios, em resposta a inflamação intestinal pela administração de etanol, ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) ou infecção por Citrobacter rodentium. Estes mediadores foram responsáveis pela ativação de células T efetoras e pela resposta imunológica tecidual protetora. Além disto, Kim et al. (2013) notou-se que os animais nocautes para a proteína GPR43 apresentaram menor produção de mediadores, menor ativação de neutrófilos e de células TCD4+, bem como maior perda de peso e persistência da inflamação e de C.rodentium nos tecidos, indicando que esse receptor é importante no efeito protetor dos AGCCs frente à infecção.
JUSTIFICATIVA
A compreensão do papel dos AGCCs na infecção por C.difficile é importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. A colite pseudomembranosa, conforme anteriormente descrito, afeta um grande número de pessoas, principalmente no ambiente hospitalar, e está associada a altas taxas de mortalidade. Nos últimos anos, novas possibilidades como a transferência de microbiota têm sido apontadas como forma de tratamento para esse tipo de infecção. Contudo, o risco associado à transferência de microrganismos patogênicos nesse procedimento limita o seu uso. Sabemos que os AGCCs são produzidos pela microbiota intestinal e que estes possuem efeitos celulares e imunomodulatórios descritos na literatura. Dentro desse contexto, o presente trabalho teve como perspectiva avaliar se os AGCCs podem proteger ou ao menos atenuar os efeitos deletérios causados pela C.difficile no organismo.
OBJETIVO GERAL
Tendo em vista que o uso de antibióticos altera a microbiota e a sua produção de ácidos graxos de cadeia, o que está relacionado com a suceptibilidade à infecções intestinais causadas por microrganismos patogênicos, tivemos como objetivo neste trabalho investigar se a administração oral destes compostos, os AGCCs, afeta o desenvolvimento da infecção associada por Clostridium difficile.
Objetivos específicos
Avaliar o efeito da administração oral de AGCCs (acetato ou butirato) sobre a mortalidade de animais tratados com antibióticos e infectados com 1x108 UCF de
Clostridium difficile;
Analisar o efeito da administração oral de AGCCs (acetato ou butirato) sobre sinais clínicos, imunológicos e histopatológicos do cólon em animais tratados com antibióticos e infectados com 1x108 UCF de C.difficile;
Avaliar o efeito direto sobre o crescimento e produção de toxinas A/B da
C.difficile tratada in vitro e in vivo (animais germ-free) com AGCCs;
Analisar o perfil de expressão gênica no cólon e as populações leucocitárias presentes na lâminca própria e nos linfonodos mesentéricos de animais infectados por C.difficile tratados ou não com os AGCCs;
Avaliar a translocação bacteriana e integridade epitelial do cólon em animais infectados por C.difficile tratados ou não com AGCCs (acetato ou butirato);
Avaliar a mortalidade e o desenvolvimento da doença em animais nocautes para a citocina anti-inflamatória IL-10 tratados com antibióticos e infectados com 1x108 UCF de Clostridium difficile;
Investigar a participação da microbiota e do receptor GPR43 nos efeitos dos AGCCs usando o modelo de infecção por C.difficile em animais germ-free ou nocautes para essa proteína.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Todos os procedimentos com animais descritos foram submetidos à Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas sob parecer número 3742-1 (Anexo 2), 3230-1 e 4117-1 e aprovação pela CEUA/UNICAMP para utilização de animais geneticamente modificados (Nº protocolo CIBio: 2013/02). Foram utilizados camundongos isogênicos C57BL/6 e livres de germes patogênicos específico (SPF, do inglês Specific Pathogen Free) provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB – UNICAMP). Além disso, animais C57BL/6 com deficiência da expressão de GPR43 (FFAR2-/-) foram produzidos conforme descrito por Maslowski et al., 2009. Foram utilizados também animais C57BL/6 transgênicos que expressam a proteína de fluorescência verde (GFP, do ingles green fluorescent protein) ligada ao fator de transcrição Foxp3, fornecidos pelo Prof. Dr. Alessandro Farias (IB, UNICAMP) e nocautes para a citocina IL-10 (IL-10 KO ou IL10-/-) obtidos junto ao Biotério de matrizes do ICB/USP. Todos os animais foram mantidos no Biotério de Animais SPF do Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas. Também foram realizados experimentos com camundongos swiss livre de germes (GF, do inglês germ-free) fornecidos pelo Prof. Dr. Flaviano Santos Martins, do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais. Todos os animais SPF foram mantidos em gaiolas com filtro no topo e os GF em isoladores autoclavados, ambos com livre acesso a ração e água esterilizadas. Neste estudo, usamos somente camundongos machos de 6-8 semanas de idade.
Bactéria
Bactérias Clostridium difficile cepa VPI 10463 fornecidas pelo Laboratório de Anaeróbios coordenado pelo Prof. Mário Júlio Ávila Campos (ICB/USP), foram cultivadas em meio ágar sangue BHI suplementado com hemina (5 μg/mL) e menadiona (1 μg/mL) a 37° C em anaerobiose. Para os ensaios, as bactérias foram ressuspensas a partir da placa na escala 4 de McFarland (concentração de 1,2x109 bactérias/mL) em PBS estéril (pH=7,3), centrifugadas a 12.000 rpm por 5 minutos e lavadas duas vezes com solução salina estéril. Ao final das lavagens, a concentração de bactérias foi ajustada e calculou-se o volume correspondente a concentração desejada de 1x108 UFC.
Modelo de infecção
Neste estudo foi utilizado e adaptado o modelo de infecção murina descrito por Chen et al. em 2008. Brevemente, foi adicionado uma mistura de antibióticos (Sigma Aldrich, EUA) na água de beber, composta por canamicina (0,4 mg/mL), gentamicina (0,035 mg/mL), colistina (0,035 mg/mL), metronidazol (0,215 mg/mL) e vancomicina (0,045 mg/mL), e administrada aos animais por quatro dias. Após 24 horas da remoção dos antibióticos, os animais receberam uma dose única de clindamicina (10 mg/kg) (Sigma Aldrich, EUA) por via intraperitoneal. Um dia depois, os mesmos foram infectados por gavagem com 108 UFCs de
C.difficile e monitorados diariamente por aproximadamente 7 dias, para mortalidade,
surgimento dos sinais e sintomas clínicos e variação da perda de peso (figura 8).
Figura 8. Modelo de indução da CDI. Esquema modificado e adaptado de CHEN et al. (2008) para a indução
da colite associada ao Clostridium difficile em modelo murino de infecção após a antibioticoterapia. Foram usados camundongos machos adultos com 8 semanas de idade tratados ou não com acetato ou butirato a 150mM na água de beber. Estes receberam previamente uma mistura de antibióticos suplementados oralmente e uma dose única via intraperitoneal de clindamicina e, então, inoculados com 1x108 UFCs de C.difficile. A doença foi monitorada
por aproximadamente 7 dias após a infecção.
Tratamento dos animais
Inicialmente, com o intuito de avaliar os efeitos da produção endógena de AGCCs pela microbiota através da fermentação de fibras, os camundongos foram tratados com dietas contendo diferentes quantidades de fibras solúveis em sua composição: uma com baixo teor (LFD, do inglês low fiber diet), baseada nas recomendações AIN93 com 5% de celulose (fibra insolúvel); e outra com alto teor de fibras solúveis (HFD, do inglês high fiber diet), baseada nas recomendações AIN93 suplementada com 5% de celulose e 10% de pectina (tabela 1). Para tal
