Defesa antiviral em Litopenaeus vannamei contra o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV), induzida via RNA de interferência, e sua influência na expressão de alguns genes imunológicos

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA. DEFESA ANTIVIRAL EM Litopenaeus vannamei CONTRA O VÍRUS DA SÍNDROME DA MANCHA BRANCA (WSSV), INDUZIDA VIA RNA DE INTERFERÊNCIA, E SUA INFLUÊNCIA NA EXPRESSÃO DE ALGUNS GENES IMUNOLÓGICOS. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Aquicultura.. Orientadora: Margherita Anna Antônia Maria Barracco Co-orientadora: Luciane Maria Perazzolo. CRISTHIANE GUERTLER. Florianópolis/SC 2010.

(2) Catalogação na fonte pela Biblioteca Universitária da Universidade Federal de Santa Catarina. G935d. Guertler, Cristhiane Defesa antiviral em Litopenaeus vannamei contra o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV), induzida via RNA de interferência, e sua influência na expressão de alguns genes imunológicos [dissertação] / Cristhiane Guertler ; orientadora, Margherita Anna Antônia Maria Barracco. – Florianópolis, SC, 2010. 103 p.: 6 figs., 2 tabs. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Aquicultura. Inclui referências 1. Aquicultura. 2. Litopenaeus vannamei. 3. Crustáceos - Imunologia. 4. Vírus da síndrome da mancha branca. 5. RNA de interferência. 6. Expressão gênica. I. Barracco, Margherita Anna Antonia Maria. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Aquicultura. III. Título. CDU 639.3.

(3) Defesa antiviral em Litopenaeus vannamei contra o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV), induzida via RNA de interferência, e sua influência na expressão de alguns genes imunológicos. Por CRISTHIANE GUERTLER Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de MESTRE EM AQÜICULTURA e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura.. _____________________________________ Prof. Cláudio Manoel Rodrigues de Melo, Dr. Coordenador do Curso. Banca Examinadora: __________________________________________________ Dra. Margherita Anna Antônia Maria Barracco – Orientadora __________________________________________________ Dr. Cláudio Humberto Mejía Ruiz __________________________________________________ Dr. Walter Quadros Seiffert.

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(5) Aos meus pais, Henrique e Anajara, com gratidão e amor..

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(7) AGRADECIMENTOS Inicialmente, quero agradecer a Deus por ter me dado a vida e a oportunidade de desfrutá-la junto às pessoas especiais que conheci e que ainda conhecerei. Aos meus pais, Henrique e Anajara, pelo amor incondicional e apoio absoluto durante toda minha vida. Vocês são para mim o exemplo de amor, bondade e perseverança. Obrigada por terem criado as condições para que eu pudesse sempre realizar meus sonhos. Amo vocês. À minha irmã Ágatha, que também foi responsável pela minha conquista, já que além do incentivo também se privou de muita coisa para que eu pudesse chegar até aqui. Ao meu irmão Gustavo, e a mais nova componente da família, minha sobrinha Marina, que já chegou ao mundo lutando e que com certeza apareceu em novas vidas para torná-las mais leves e felizes. Ao Clênio, meu amigo e amor, que aguentou bravamente minhas inúmeras oscilações de humor durante o mestrado e ainda assim continuou sendo meu maior incentivador. Obrigada pelo amor, companheirismo e amizade durante todos esses anos. Você é muito importante na minha vida. Às minhas queridas amigas Bárbara, Manoela, Giselle e Liane. Gurias, obrigada pela amizade verdadeira. Vocês são demais! Amo muito todas vocês. À professora Luciane, pela orientação, respeito e amizade. Com certeza, seus esforços para a realização deste projeto serviram de motivação para que eu fizesse um bom trabalho. Obrigada principalmente, pela oportunidade inicial e por acreditar em minha capacidade confiando a mim um projeto relativamente distante de minhas atribuições profissionais e que encarei como um desafio profissional. À professora Margherita, por ajudar a moldar minha formação profissional, já que é para mim um exemplo de dedicação e ética profissional. Mais uma vez obrigada por responder àquele e-mail, pois devido a isso fui apresentada ao mundo da pesquisa, que tanto me encantou e também iludiu, mas que graças a isso pude encontrar meu verdadeiro lugar dentro da minha profissão. Aos colegas e amigos do Laboratório de Imunologia Aplicada à Aquicultura: Paulinha (brava companheira de trabalho durante feriados e finais de semana), Mirian, Pri, Liege, Dani, Pedro, Mirella, Gabi, Érik, Tailin, Douglas e Scheila. Um agradecimento especial à Mirian pelo.

(8) apoio técnico que tanto facilitou meu trabalho, e à Priscila pela ajuda durante a reta final dos experimentos. Ao professor Maurício Lehmann, pela amizade e por todo apoio durante a fase de infecção experimental em Araquari. Ao professor Claudio Humberto Mejía-Ruíz, pelo auxílio no preparo do dsRNA e por pacientemente sempre estar disposto a esclarecer minhas dúvidas. Ao sempre prestativo Felipe Vieira, pelo fornecimento dos animais utilizados no experimento. Ao Carlito e ao professor Cláudio Mello, pela dedicação intensa aos alunos e ao programa de pós-graduação. Vocês deveriam servir de exemplo para muitos funcionários públicos. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de mestrado. À Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), pela concessão dos recursos destinados a aquisição de equipamentos e reagentes..

(9) RESUMO A proteção antiviral específica contra o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) induzida via RNA de interferência (RNAi) e sua influência na expressão de alguns genes imunológicos foram avaliados em Litopenaeus vannamei. Os animais foram injetados com dsRNA de sequência específica (vp28 do envelope viral), e posteriormente desafiados com o WSSV. Camarões tratados com dsRNA vp28 tiveram a infecção viral limitada, uma alta taxa de sobrevivência (73%) e ausência do vírus em 80% dos sobreviventes, confirmando a ativação do mecanismo antiviral específico via RNAi. Animais desafiados e não tratados com dsRNA vp28 tiveram uma queda significativa no hemograma (85%) e depleção gênica da argonauta, caspase-3, fator antilipopolissacarídeo (ALF), pró-fenoloxidase (proPO) e transglutaminase (TGase). Uma superexpressão gênica da proteína que reconhece LPS e β-1,3-glicanas (LGBP) e do inibidor de proteases α2macroglobulina (α2M) foi verificada nesses animais, indicando o envolvimento destas proteínas na fase aguda da infecção por WSSV. O tratamento com dsRNA vp28 limitou a infecção e restabeleceu as condições imunológicas gerais dos animais através do aumento do hemograma e da modulação positiva dos genes argonauta, ALF, proPO e TGase, sugerindo a participação destas proteínas na defesa do organismo contra o WSSV. Os resultados deste estudo apontam para uma potencial utilização do dsRNA vp28 como agente terapêutico antiWSSV e confirmam que a técnica de RNAi é uma abordagem preventiva promissora e efetiva para o controle das viroses de crustáceos. Palavras chave: Litopenaeus vannamei, imunologia de crustáceos, WSSV, RNA de interferência, dsRNA vp28, expressão gênica..

(10) ABSTRACT The main purpose of this study was to evaluate the specific antiviral protection induced by the RNA-interference (RNAi) phenomenon in the shrimp Litopenaeus vannamei during an experimental infection with the white spot syndrome virus (WSSV) and the expression of several immune genes through semi-quantitative RT-PCR. Shrimp were injected with a dsRNA-specific sequence (vp28 protein from viral envelope), and then challenged with the virus. In animals treated with sequence-specific dsRNA the progress of viral infection was limited and their survival (73%) and viral clearance (80%) were much higher than in experimentally infected shrimp. These results confirmed that RNAi mechanism is effectively capable to trigger a specific antiviral protection in shrimp. Experimentally infected shrimps, not treated with dsRNA exhibited a strong reduction on their haemocyte numbers (85%). Also, the expression of different genes such as argonaute, caspase-3, antilipopolysaccharide factor (ALF), prophenoloxidase (proPO) and transglutaminase (TGase) was markedly down-regulated in these animals. Interestingly, there was an overexpression of the lipopolysaccharide and β-1,3-glucans binding protein (LGBP) and the protease inhibitor α2-macroglobulin (α2M) genes in these infected animals suggesting the involvement of these proteins in acute phase WSSV-infection. The treatment with vp28-dsRNA was able to limit viral infection and to restore the normal immunological conditions of the animals. The treated animals maintained the number of their hemocytes (immunocompetent cells) and the expression of several immune protein genes (argonaute, ALF, proPO and TGase) at their normal levels. These results suggest that vp28-dsRNA can serve as a potential therapeutic tool to combat WSSV and that RNAi phenomenon is effectively a promising and effective approach to control viral diseases in crustaceans.. Key words: Litopenaeus vannamei, crustacean immune system, WSSV, RNA interference, dsRNA vp28, gene expression..

(11) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema explicativo do desenho experimental. No período de pré-infecção, os animais foram injetados com tampão (G1 e G2) ou com dsRNA vp28 (G3) e, após 48h, infectados (G2 e G3) ou não (G1) com WSSV. As coletas de hemolinfa ocorreram 6h após injeção com dsRNA vp28 (G3); e 0, 3, 6, 24, 48 e 72h após a infecção com WSSV negativo (G1) ou positivo (G2)......46 Figura 2. Contagem total de hemócitos (CTH) em L. vannamei imediatamente antes das injeções (0h); 6h após injeção com dsRNA vp28 (G3); e 3, 6, 24, 48 e 72h pós-infecção com inóculo negativo (G1) ou positivo (G2 e G3) para o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV). Letras maiúsculas representam diferenças significativas (p<0,05) na CTH dentro de um mesmo grupo nos diferentes períodos analisados. Letras minúsculas representam diferenças significativas (p<0,05) na CTH entre os grupos dentro de um mesmo período...... ...................52 Figura 3. Análise semiquantitativa por RT-PCR dos genes argonauta, caspase-3, alfa 2-macroglobulina (α2M), fator antilipopolissacarídeo (ALF), proteína que se liga a LPS e β-1,3glicanas (LGBP), pró-fenoloxidase (proPO) e transglutaminase (TGase) nos hemócitos de L. vannamei. As análises foram feitas antes do início das injeções (0h- expressão gênica basal); 6h após injeção de dsRNA vp28 (G3) e 3, 6, 24, 48 e 72h após a infecção com inóculo negativo (G1) ou positivo (G2 e G3) para o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV). Os valores correspondem à razão entre a densidade de cada banda do gene de interesse pela banda actina nos diferentes tempos. A expressão relativa basal (0h) foi arbitrariamente estabelecida com o valor 1 A densitometria das bandas foi realizada utilizando-se o programa Scion Image®..................... ......................58 Figura 4. Expressão em relação ao controle dos genes: argonauta (A), caspase-3 (B), alfa 2-macroglobulina (C), fator antilipopolissacarídeo (D), proteína que se liga a LPS e β-1,3glicanas (E), pró-fenoloxidase (F) e transglutaminase (G) nos hemócitos de L. vannamei antes do início das injeções (0h) e 3, 6, 24, 48 e 72h após a infecção com o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) nos grupos G2 (tampão/WSSV+) e G3 (dsRNA/WSSV+)......................... ....................................................59.

(12) Figura 5. Porcentagem da mortalidade cumulativa dos animais em cada tratamento durante 30 dias..... ..................................................60 Figura 6. Eletroforese em gel de agarose (1%) representando os produtos amplificados por PCR em Tempo Real, com amostras de DNA genômico de animais infectados com WSSV e previamente tratados com dsRNA vp28 (linhas 1 a 18). A análise foi feita 30 dias após a infecção, utilizando-se iniciadores VP19 (fragmento de 375 pb). M: marcador de peso molecular (100pb); CN: Controle Negativo (sem adição de DNA); I: Inóculo Positivo para WSSV. Linhas 7 a 10: animais WSSV positivos............................................................................................61.

(13) LISTA DE TABELAS Tabela 1. Pares de iniciadores utilizados para as análises de RTPCR de sete genes relacionados ao sistema imune em Litopenaeus vannamei. Os iniciadores argonauta e proPO referem-se à sequências de P. monodon e F. chinensis....... .......... 50 Tabela 2. Detecção de WSSV nos animais G1: tampão/WSSV-, G2: tampão/WSSV+ e G3: dsRNA/WSSV+, por PCR convencional, em um (+) ou dois passos (nested-PCR) (++). As análises em cada período foram feitas com DNA genômico extraído de um pool de 3 animais/grupo......................................... 61.

(14) LISTA DE ABREVIATURAS α2M – α2- macroglobulina A260/280nm – Razão da absorbância 260/280 nm ALF – Fator antilipopolissacarídeo CTH – Contagem total de hemócitos dsRNA – double-stranded RNA (RNA dupla fita) EDTA – Ácido diamino tetracético HG – Hemócitos granulares HGG – Hemócitos com grânulos grandes HGP – Hemócitos com grânulos pequenos HH – Hemócitos hialinos IAP – Inhibitor of Apoptosis Proteins (Proteínas inibidoras de apoptose) IFN – Interferon IHHNV – Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (Vírus da Necrose Hipodérmica e Hematopoietica) IMNV – Infectious Myonecrosis Virus (Vírus da Mionecrose Infecciosa Muscular) LBP – Proteína que se liga a LPS LGBP – Proteína que se liga a ambos β-glicanas e LPS LPS – Lipopolissacarídeos MAS – Solução anticoagulante Alsever modificada NaCl – Cloreto de sódio NaOH – Hidróxido de sódio p – Nível de probabilidade PAM – Peptídeos antimicrobianos PAMPs – Padrões moleculares associados aos patógenos pb – Pares de base PCR - Reação em cadeia da polimerase PG – Peptidoglicanas proPO – Pró-fenoloxidase PRPs – Proteínas de reconhecimento de padrão RISC - RNA-induced silencing complex RNA (complexo multiproteico de silenciamento induzido por RNA) RNAi – RNA de interferência RT-PCR – PCR em Tempo Real SDS – Sodium dodecyl sulfate TGase – Transglutaminase TSV – Taura Syndrome Virus (Vírus da Síndrome de Taura) WSS – White Spot Syndrome (Síndrome da Mancha Branca) WSSV – White Spot Syndrome Virus (Vírus da Síndrome da Mancha Branca) YHV – Yellow Head Virus (Vírus da Cabeça Amarela).

(15) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................ 17 Sistema imune dos crustáceos ............................................................... 23 Respostas antivirais em crustáceos........................................................ 28 OBJETIVOS ......................................................................................... 37 Objetivo Geral....................................................................................... 37 Objetivos Específicos............................................................................ 37 1. INTRODUÇÃO ................................................................................ 39 2. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................. 43 2.1. Animais .......................................................................................... 43 2.2. Preparo do inóculo viral ................................................................. 43 2.3. Síntese do dsRNA vp28 ................................................................. 44 2.4. Ativação do sistema de RNA de interferência em L. vannamei injeção com dsRNA vp28 e infecção experimental com WSSV........... 44 2.5. Detecção da infecção dos camarões por WSSV............................. 46 2.6. Extração de hemolinfa.................................................................... 47 2.7. Contagem total de hemócitos (CTH).............................................. 48 2.8. Extração dos RNA totais e síntese do cDNA ................................. 48 2.9. Análise da expressão gênica semiquantitativa de algumas proteínas imunológicas de L. vannamei ................................................ 48 3. ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................... 51 4. RESULTADOS................................................................................. 51 4.1. Contagem Total de Hemócitos (CTH) ........................................... 51 4.2. Expressão gênica ............................................................................ 52 4.2.1. Argonauta: a proteína slicer do RISC do sistema RNAi.............. 53 4.2.2. Caspase-3: uma protease executora da via apoptótica ............... 53 4.2.3. Alfa 2-macroglobulina (α2M): um inibidor de proteases de amplo espectro ...................................................................................... 54 4.2.4. Fator antilipopolissacarídeo (ALF): um peptídeo antimicrobiano com atividade antiviral ................................................ 54 4.2.5. Proteína que se liga a LPS e β-1,3-glicanas (LGBP): uma proteína de reconhecimento padrão...................................................... 55 4.2.6. Pró-fenoloxidase: um zimógeno do sistema de ativação da proPO.................................................................................................... 56 4.2.7. Transglutaminase (TGase): a enzima-chave no processo de coagulação da hemolinfa ...................................................................... 56 4.3. Mortalidade dos animais ................................................................ 60 4.4. Detecção do DNA viral (WSSV) nos tecidos dos animais............. 60 5. DISCUSSÃO..................................................................................... 62 6. REFERÊNCIAS................................................................................ 74 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO ................ 86.

(16) 16.

(17) 17. 1. INTRODUÇÃO Atualmente, devido à crescente estagnação da pesca e à procura comercial na indústria alimentícia, a aquicultura vem constituindo uma grande alternativa para o suprimento da demanda por proteína de origem animal, apresentando elevado crescimento dentre os setores produtores de alimento. Segundo a FAO (2006), em 1996 a pesca de captura representava 73% da produção mundial de pescados, enquanto a aquicultura participava com a pequena parcela de 27%. No entanto, apenas 10 anos depois, em 2006, a pesca participava com 58% da produção mundial de pescados, enquanto a aquicultura aumentou sua contribuição em 42%. A exploração indiscriminada dos estoques pesqueiros juntamente com a crescente diferença entre a oferta de pescado capturado e a demanda de consumo acabaram por tornar a aquicultura a alternativa mais viável no mundo para produção de alimento de elevado valor proteico (CAMARGO e POUEY, 2005). Dentro da maricultura, o cultivo de camarões marinhos, tem se expandido de forma bastante acelerada em diversos países ao redor do mundo, sendo responsável pela maior parte do volume financeiro envolvido no comércio internacional de frutos do mar (SEIFFERT et al., 2006). A carcinicultura é uma atividade fundamental na pauta de exportações de países em desenvolvimento, sendo responsável pela geração de milhões de empregos. Atualmente, a China e a Tailândia são os principais produtores mundiais, e, na América Latina, os principais produtores são México, Equador e Brasil, sendo que as espécies mais cultivadas no mundo atualmente são Litopenaeus vannamei e Penaeus monodon (FAO, 2006). O cultivo de camarões marinhos teve sua origem no Sudeste da Ásia, onde por séculos, pescadores da região despescavam viveiros abastecidos por marés. No entanto, a carcinicultura em seus moldes atuais surgiu na década de 30 do século XX, quando cientistas japoneses iniciaram os trabalhos de larvicultura com Marsupenaeus japonicus (ROSEMBERRY, 1992). No Brasil, a atividade teve início durante a década de 80 com a introdução do peneídeo M. japonicus no Nordeste. Entretanto, apesar desta espécie, na ocasião, ser a mais cultivada na Ásia, ela não se adaptou bem às condições brasileiras, principalmente em função das baixas salinidades nas zonas de produção (BARBIERI e OSTRENSKY, 2002). Seguiram-se então tentativas para a domesticação das espécies nativas Litopenaeus schmitti (OSTRENSKY, 1997) e Farfantepenaeus.

(18) 18. paulensis (WASIELESKY, 2000) nas regiões Sul e Sudeste, e Farfantepenaeus subtilis no Norte e Nordeste (TAVARES e SANTOS, 2006). No entanto, a baixa produtividade e lucratividade destas espécies levaram à desativação das fazendas. Ainda na década de 80, a espécie L. vannamei foi introduzida no país primeiramente na região Nordeste. Em Santa Catarina a espécie foi inicialmente utilizada em 1998 pela UFSC (Universidade Federal de Santa Catarina) e EPAGRI (Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural do Estado de Santa Catarina) com o intuito de viabilizar a atividade no Estado. Conhecido como camarão branco do Pacífico, L. vannamei possui uma distribuição natural que vai desde as águas do Oceano Pacífico, na província de Sonora (México), até o sul de Tumbes, no Peru (PÉREZFARFANTE e KENSLE, 1997). Esta espécie possui excelentes características zootécnicas, como rusticidade no manejo, boa conversão alimentar, rápido crescimento, facilidades na reprodução em cativeiro, além de poder ser cultivada em águas oligohalinas crescendo em ambientes com salinidade variando de 0,5 a 40 ppt (NUNES, 2001). O seu cultivo em águas interiores, sem influência de águas marinhas, já foi implantado com sucesso em países como o Equador, México, Panamá, Tailândia e Estados Unidos, sendo que no Brasil é encontrado também nos estados do Ceará, Paraíba e Piauí (FIGUEIREDO et al., 2004). Além disso, em função de sua típica coloração esbranquiçada esta espécie apresenta uma alta aceitação no mercado americano (NUNES, 2001). No Brasil, este peneídeo se adaptou às condições climáticas e ambientais encontradas no Nordeste brasileiro, sendo que nesta região são obtidas até 2,5 safras por ano. Em 2005, a produção brasileira de L. vannamei chegou a 65 mil toneladas cultivadas em 15 mil hectares de viveiros, sendo o Nordeste brasileiro a região que contribui com 95% do total de cultivo (IDEMA, 2006). Com relação à Santa Catarina os dados do setor mostraram um crescimento vigoroso da produção, com um volume triplicado no período de 1999 e 2002, sendo que no último ano desse período, houve um incremento de 97% no setor. A produtividade cresceu de forma bastante acentuada, como resultado de uma melhora no desempenho dos recursos tecnológicos em uso nos cultivos, e também do desenvolvimento da indústria de alimento animal no país, corroborando para o incremento do segmento de camarão cultivado (BUGLIONE NETO, 2009). Desta forma, a atividade veio nos últimos anos experimentando uma rápida evolução, no sentido de intensificação dos sistemas e das.

(19) 19. técnicas de produção, visando um aumento da lucratividade e eficiência nos cultivos. No entanto, a intensificação dos cultivos na maioria das vezes não leva em conta os aspectos ecológicos e fisiológicos dos animais (BACHÈRE, 2000), tendo como consequência o surgimento de enfermidades entre os animais e a degradação ambiental (BORGHETTI; OSTRENSKY; BORGHETTI, 2003). Sabe-se também que, fatores ambientais potencialmente estressores, como alterações nos parâmetros físico-químicos da água, a presença de metais pesados, pesticidas agrícolas e poluentes no ambiente, podem alterar o sistema imune dos camarões, debilitando-os e propiciando a instalação de doenças (LE MOULLAC e HAFFNER, 2000; CHANG; LEE; LIU, 2006). Além disso, a água dos cultivos abriga naturalmente inúmeros microorganismos potencialmente patogênicos, e uma vez instalada a doença, a transmissão entre os animais é rapidamente veiculada (BOYD, 1979). Os camarões podem ser suscetíveis a diferentes patógenos (parasitas, fungos, bactérias e vírus) que geram enfermidades, muitas delas endêmicas e/ou pandêmicas, que causam sérias perdas econômicas advindas da diminuição na produção. No entanto, atualmente as infecções virais são as principais responsáveis por perdas econômicas catastróficas na carcinicultura a nível mundial, especialmente no cultivo de L. vannamei. Dentre elas destacam-se àquelas causadas pelos vírus da necrose hipodérmica e hematopoiética (IHHNV), vírus da síndrome de Taura (TSV), o vírus da cabeça amarela (YHV) e o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) (LIGHTNER, 2003). Assim como em outros países, a carcinicultura no Brasil também encontrou limitações ao seu desenvolvimento. Em 2004, com o advento da ação antidumping imposta pelos Estados Unidos, associado a fatores como a desvalorização do dólar, o setor camaroneiro perdeu competitividade nas exportações (ROCHA, 2007). Somado a isso, duas viroses causaram sérios prejuízos à carcinicultura nacional: a Mionecrose Infecciosa (NIM) nos cultivos da Região Nordeste, causada pelo vírus da mionecrose infecciosa (IMNV), e a Síndrome da Mancha Branca (WSS) em Santa Catarina, causada pelo vírus da síndrome da mancha branca (WSSV). Juntas, estas duas viroses rebaixaram o posto brasileiro de líder americano na produção de camarão, obtido em 2003 graças as suas 94.000 toneladas de produção, para um pouco atrativo terceiro lugar, precedido pelo México e Equador. Além disso, o Brasil perdeu a liderança mundial em termos de produtividade com perdas na produção na ordem de 40 mil toneladas entre o período de 2003 a 2005 (SEIFFERT et al., 2006)..

(20) 20. A síndrome da mancha branca é considerada a enfermidade viral mais devastadora para a indústria camaroneira registrada até o momento, sendo que o WSSV vem dizimando populações inteiras de cultivo (LIGTHNER, 2003; FLEGEL, 2006). Segundo a OIE (2006) as perdas na produção devido ao WSSV passam de 10 bilhões de dólares desde 1993 em todo o mundo. Mortalidades massivas podem ocorrer em um período muito curto, sendo que em casos mais severos podem chegar a 100% entre 2 a 7 dias após a detecção dos sinais clínicos (CHOU et al., 1995; CHANG et al., 1999). Este vírus foi detectado pela primeira vez em Taiwan, em 1992, de onde se espalhou rapidamente para a maioria dos países produtores (CAI et al., 1995; FLEGEL, 1997; ROSEMBERRY, 2002). Muito recentemente, a ocorrência deste vírus foi também detectada de forma natural em espécies nativas de crustáceos na Argentina (MARTORELLI; OVERSTREET; JOVONOVICH, 2010). No caso do Brasil, os primeiros surtos da WSS foram detectados em cultivos de Santa Catarina, em 2004, onde apenas 200 dos 1.600 hectares de viveiros em produção não foram afetados pela enfermidade, resultando assim em prejuízos na ordem de R$ 6 milhões (SEIFFERT et al., 2006). Em termos de produção, em 2004 a carcicicultura catarinense estava em franca expansão comercializando 4.189 t do crustáceo, enquanto que em 2007 essa cifra caiu para apenas 300 t (EPAGRI/CEDAP, 2008). A WSS geralmente se manifesta quando ocorre um desequilíbrio no cultivo, advindo, por exemplo, de altas densidades populacionais, má preparação do solo, baixa qualidade de água, excesso de matéria orgânica no solo e mudanças bruscas na temperatura da água (PEREIRA; LEGAT; LEGAT, 2006; BUCHELI e GARCIA, 2005; SEIFFERT; WINCLER; MAGGIONI, 2005). Os principais sinais clínicos da enfermidade são o surgimento de calcificações brancas arredondadas na parte interna do exoesqueleto do rostro, atividade errática do camarão na periferia do viveiro, redução rápida no consumo de alimento, atividade metabólica reduzida dos animais e coloração avermelhada no corpo (BUCHELI e GARCIA, 2005). As manchas brancas, cuja presença confere denominação à enfermidade, são decorrentes de depósitos de sais de cálcio na epiderme cuticular dos camarões infectados. No entanto, o mecanismo de formação destas manchas ainda é pouco conhecido, mas sabe-se que a infecção por WSSV pode provocar uma disfunção do epitélio subcuticular do animal, resultando assim no acúmulo dos sais de cálcio (WANG et al., 1999). Em L. vannamei estas manchas nem sempre são.

(21) 21. observadas, ocorrendo apenas em estágios mais avançados da enfermidade (NUNES e MARTINS, 2002). Além disso, os pontos brancos na cutícula, nem sempre constituem um sinal clínico desta síndrome, podendo ser causada por doenças de origem bacteriana, ou até por condições ambientais, como alta alcalinidade da água (WANG et al., 2002). O WSSV é um vírus envelopado, baciliforme e pertence ao gênero Whispovirus e à família Nimaviridae (vide revisões de ESCOBEDO-BONILLA et al., 2008; BONAMI, 2008). Seu material genético é composto por uma molécula de DNA dupla fita, circular e longa, com tamanho variável entre 293 kpb a 307 kbp (van HULTEN et al., 2001; YANG et al., 2001; CHEN et al., 2002), sendo encontradas várias linhagens de vírus que são extremamente virulentas e patogênicas para várias espécies de peneídeos e outros crustáceos (DURAND et al., 1997). O WSSV infecta especialmente as células de origem ectodermal e mesodermal, incluindo células da epiderme, brânquias, intestino (CHANG et al., 1996), órgão linfoide (DURAND et al, 1996; CHANG et al, 1998), músculo, coração (KOU et al., 1998), gônadas (LO et al., 1997), hemócitos e células associadas ao sistema nervoso central (RAJENDRAN et al., 1999; WANG et al., 1999). Atualmente, muitos estudos têm sido realizados com o objetivo de caracterizar e analisar a função de proteínas do WSSV, especialmente àquelas do envelope viral que estão diretamente associadas à adesão e entrada do vírus na célula hospedeira, sendo elas: vp19, vp26, vp28, vp68, vp281 e vp466 (van HULTEN; GOLDBACH; VLAK, 2000; YI et al., 2004; WU et al., 2005). A confecção de vacinas, no termo clássico da palavra, é inviável para invertebrados, como os crustáceos, devido ao fato do organismo destes animais não estar apto a produzir anticorpos antígeno-específicos e células de memória, não produzindo, portanto, uma memória imunológica a longo prazo (vide revisão BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2008). Desta forma, camarões não podem ser imunizados da mesma forma que os peixes. No entanto, atualmente, muitos estudos têm relatado uma proteção a médio prazo contra mortalidades ocasionadas por vírus, como o WSSV, por meio de técnicas de “vacinação” que utilizam como agentes terapêuticos proteínas virais purificadas ou recombinantes, vírus inativados ou “vacinas” de DNA (YI et al., 2004; WU et al., 2005; WITTEVELDT; VLAK; van HULTEN, 2004; SYEDMUSTHAQ et al., 2009). As proteínas do envelope viral, especialmente aquelas associadas à adesão e entrada do vírus na célula hospedeira, são as mais visadas.

(22) 22. para produção destas “vacinas”. Dentre elas, a vp28 é considerada uma das proteínas mais eficazes, sendo capaz de conferir os melhores níveis de proteção em crustáceos contra o WSSV (vide revisão de JOHNSON; van HULTEN; BARNES, 2008; KUMAR et al., 2008). Esta proteína é a mais abundante no envelope viral e além de estar envolvida na adesão do WSSV às células do hospedeiro (YI et al., 2004), a vp28 interage com proteínas intracelulares do hospedeiro, tais como a Rab7GTPase (SRITUNYALUCKSANA et al., 2006), a proteína de choque térmico HSP70 (XU et al., 2009) e o transdutor de sinal e ativador de transcrição STAT (LIU et al., 2007). Quando utilizada como “vacina”, o mecanismo de ação da vp28 é o de funcionar como um “bloqueador físico” dos receptores celulares para o vírus, impedindo a ligação posterior e entrada do mesmo na célula hospedeira e limitando, por consequência, o processo infeccioso. (JOHNSON; van HULTEN; BARNES, 2008). No entanto, na ausência de uma expressão continuada das proteínas virais no organismo, como ocorre habitualmente, a reciclagem dos receptores/proteínas ligantes nas células do hospedeiro leva ao retorno da “suscetibilidade” do animal ao vírus em um curto período de tempo (PERAZZOLO; BARRACCO; ROSA, 2010). Sendo assim os métodos de “vacinação” disponíveis para crustáceos conferem, no máximo, uma imunoproteção a médio prazo (vide revisão de PERAZZOLO; BARRACCO; ROSA, 2010). O estudo do mecanismo de resistência de camarões frente a infecções causadas por vírus é ainda pouco compreendido, sendo assim, como descrito anteriormente, as infecções virais o principal fator realmente limitante para o sucesso da carcinicultura, na atualidade. No entanto, é importante salientar que a presença de enfermidades não inviabiliza a atividade, exigindo, porém adaptações à nova realidade. Todos os países produtores de camarão já tiveram problemas com enfermidades, e ainda assim a carcinicultura é considerada uma atividade lucrativa (PEREIRA; LEGAT; LEGAT, 2006). Porém, no que diz respeito ao controle e prevenção de doenças nos cultivos, métodos convencionais de tratamento, como o uso de drogas químicas, não apresentam eficácia contra viroses. Atualmente, a profilaxia e o controle de enfermidades em cultivos estão basicamente relacionados à tentativa de reduzir as condições de estresse dos animais através do uso de práticas adequadas de manejo. Convém lembrar que, além de infectar diferentes tecidos do camarão, o WSSV compromete seriamente o sistema imunológico dos animais, uma vez que as suas células imunocompetentes ou hemócitos são as principais células-alvo para a sua replicação (WANG et al.,.

(23) 23. 2002). Neste contexto, a mais ansiada e urgente contribuição para a carcinicultura na atualidade é indiscutivelmente o controle das infecções virais (PERAZZOLO; BARRACCO; ROSA, 2010). Desta forma, tornase cada vez mais importante a busca de terapias eficazes embasadas no conhecimento prévio do sistema imunológico desses animais, uma vez que estudos dessa natureza poderão auxiliar na compreensão dos mecanismos envolvidos nas respostas antivirais, na interação entre patógeno e hospedeiro e na relação suscetibilidade/resistência desses animais frente a esses parasitas.. Sistema imune dos crustáceos Assim como mencionado anteriormente, os crustáceos possuem apenas um sistema imune inato ou natural, portanto, não possuem a imensa gama de anticorpos específicos e células de memória, que compõem o sistema imune adaptativo dos vertebrados. Devido a esta característica, é importante ressaltar, mais uma vez, que não é possível o desenvolvimento de vacinas que os proteja a longo prazo contra infecções reincidentes (vide revisão de PERAZZOLO; BARRACCO; ROSA, 2010). No entanto, devemos salientar que a ideia de que os crustáceos, assim como outros invertebrados, contam apenas com um sistema de defesa desprovido de especificidade e memória imunológica vem sendo recentemente contestada, frente às novas descobertas que apontam para a potencial presença de uma “imunidade adaptativa alternativa” (vide revisões de KURTZ e FRANZ, 2003; KURTZ e ARMITAGE, 2006; JOHNSON; van HULTEN; BARNES, 2008). O sistema circulatório dos crustáceos é do tipo aberto ou semiaberto, por onde transita um tecido fluido denominado hemolinfa, que corresponde ao sangue dos vertebrados. Sendo assim, o sistema imune dos crustáceos está relacionado à sua hemolinfa, que é composta por uma fração celular (hemócitos) e uma fração líquida (plasma), onde estão dissolvidos os fatores humorais. Os hemócitos e os fatores humorais atuam de maneira integrada na proteção do organismo contra invasões e infecções por patógenos, garantindo assim sua sobrevivência (vide revisão de BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2008). Os hemócitos são as células imunocompetentes, responsáveis pelas respostas celulares de defesa, e respondem à invasão de microorganismos e parasitas destruindo-os por fagocitose ou isolando-os em agregados hemocíticos através da formação de nódulos e cápsulas.

(24) 24. (MILLAR e RATCLIFFE, 1994). Os mecanismos de lise e morte dos patógenos são ainda auxiliados pela atuação de moléculas microbicidas e/ou citotóxicas, exocitadas pelos hemócitos no sítio de infecção, ou resultantes da clivagem proteolítica de proteínas de sistemas de defesa auxiliares (LEE e SÖDERHÄLL, 2002). Segundo suas características morfofisiológicas, os hemócitos são classificados em: hemócitos hialinos (HH), hemócitos com grânulos pequenos (HGP) e hemócitos com grânulos grandes (HGG) (SÖDERHÄLL e SMITH, 1983), sendo que a proporção na hemolinfa de cada tipo celular em animais sadios pode variar drasticamente conforme a espécie (GARGIONI e BARRACCO, 1998; HOLMBLAD e SÖDERHÄLL, 1999). De uma maneira geral, os HHs de crustáceos são descritos como os menores hemócitos, com uma alta relação núcleo citoplasmática e contendo de nenhum a poucos grânulos (vide revisão de BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2008). Para alguns autores, esse tipo de hemócito pertence a uma linhagem celular distinta daquela dos hemócitos granulares e está essencialmente relacionado aos mecanismos de coagulação (HOSE; MARTIN; GERARD, 1990). Outros autores afirmam que os HHs são as principais células fagocíticas (JOHANSSON et al., 2000) e correspondem a uma forma intermediária da linhagem de hemócitos granulares (van de BRAAK et al., 2002). Os hemócitos granulares (HGPs e HGGs) são descritos como células de citoplasma mais abundantes e ricas em grânulos de diversos tamanhos e conteúdos (BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2008), estando especialmente envolvidos na fagocitose de micro-organismos, na formação de cápsulas e nódulos, na produção de moléculas citotóxicas e microbicidas capazes de lisar e/ou degradar os patógenos invasores e a maioria das proteínas envolvidas, direta ou indiretamente, com o sistema imune dos crustáceos (HOSE; MARTIN; GERARD, 1990; GARGIONI e BARRACCO, 1998; DESTOUMIEUX et al., 2000; van de BRAAK et al., 2002). A primeira etapa de defesa dos crustáceos envolve o reconhecimento dos agentes infecciosos por proteínas/receptores de reconhecimento de padrões (PRPs, do inglês pattern recognition proteins), situados na membrana dos hemócitos ou dissolvidos no plasma e que reconhecem padrões moleculares expressos especificamente nos patógenos (PAMPs, do inglês pathogen-associated molecular patterns), e que estão ausentes no hospedeiro. As principais PRPs caracterizadas em crustáceos reconhecem os seguintes PAMPs: lipopolissacarídeos (LPS) da superfície de bactérias Gram-negativas, peptidoglicanas de parede de bactérias Gram-positivas, β-glicanas da.

(25) 25. parede de fungos e o RNA dupla fita (dsRNA, do inglês doublestranded RNA), produzido por vários vírus durante a sua replicação no hospedeiro (LEE e SÖDERHÄLL, 2002). Os vírus são endoparasitas intracelulares extremamente simples formados por um capsídeo proteico que abriga um ácido nucleico (DNA ou RNA, na forma de fita simples ou dupla) e que em alguns casos pode estar envolvido por uma capa lipídica, derivada da membrana celular do hospedeiro. A estrutura viral é desprovida dos PAMPs comumente encontrados em bactérias e fungos (carboidratos: LPS/peptidoglicanas/β-1,3-glicanas). Dentre as PRPs encontradas nos crustáceos destacam-se as lectinas, que reconhecem açúcares específicos da superfície de diferentes micro-organismos, as LBP e Mas-like que reconhecem lipopolissacarídeos (LPS) da parede de bactérias Gram-negativas, as βGBP e GBP que reconhecem β-1,3-glicanas da parede de fungos e a LGBP que reconhece ambos LPS e β-1,3-glicanas (vide revisão de JIRAVANICHPAISAL; LEE; SÖDERHÄLL, 2006). Uma vez dentro do hospedeiro, os padrões moleculares do patógeno são reconhecidos e ligados às suas respectivas PRPs e, no caso dos crustáceos, iniciam a ativação dos hemócitos, desencadeando uma resposta imune celular através da produção/liberação de uma série de moléculas imunoefetoras/imunoreguladoras, bem como a modulação da expressão de genes imunológicos específicos (vide revisão de BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2008). No caso da LGBP, esta proteína já foi identificada em crustáceos e insetos, sendo que em crustáceos são proteínas pequenas (36-46 kDa) produzidas pelos hemócitos e/ou no hepatopâncreas (vide revisão de BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2008). Em peneídeos, existem três relatos sobre a clonagem do gene da LGBP: Litopenaeus stylirostris (ROUX et al., 2002), L. vannamei (CHENG et al., 2005) e Fenneropenaeus chinensis (DU; ZHAO; WANG, 2007), sendo que análises da expressão diferencial demonstraram que ocorre uma modulação evidente deste gene nos animais durante a fase aguda de infecção pelo WSSV (ROUX et al., 2002; DHAR et al., 2003; YEH et al., 2009). O reconhecimento do agente invasor desencadeia a ativação dos hemócitos que podem migrar para os sítios de infecção, onde realizam a fagocitose e/ou a formação de agregados celulares densos em torno das partículas invasoras (nódulos e/ou cápsulas). Os patógenos podem, então, ser neutralizados ou destruídos através de diferentes mecanismos, incluindo: a liberação de enzimas degradativas, a ativação dos componentes do sistema pró-fenoloxidase (proPO) e a produção de.

(26) 26. compostos citotóxicos, como as espécies reativas de oxigênio (ROIs) e nitrogênio (RNIs). Além disso, os hemócitos de crustáceos produzem diferentes proteínas e/ou peptídeos antimicrobianos (PAM), que apresentam uma atividade microbicida rápida e potente contra um amplo espectro de micro-organismos, incluindo bactérias, fungos filamentosos, leveduras, e em alguns casos também contra vírus e protozoários (BACHÈRE et al., 2004; REDDY; YEDERY; ARANHA, 2004). Em camarões, os PAMs são produzidos constitutivamente pelos hemócitos, sendo armazenados em seus grânulos, e seu mecanismo de ação normalmente se dá a nível da membrana do micro-organismo. Os PAMs podem apresentar uma atividade detergente sobre a membrana do micro-organismo, uma vez que sendo eles na maioria moléculas catiônicas interagem por atração eletrostática com os fosfolipídeos aniônicos da membrana das bactérias, por exemplo, formando grandes poros e gerando um influxo descontrolado de solutos e um extravasamento do conteúdo citoplasmático, resultando na morte do micro-organismo (BACHÈRE et al., 2004; BULET; STÖCKLIN; MENIN, 2004). Os principais peptídeos antimicrobianos de crustáceos são as peneidinas (DESTOUMIEUX et al., 1997), as crustinas (GROSS et al., 2001; BARTLETT et al., 2002) e os fatores antilipopolissacarídeos (ALFs) (GROSS et al., 2001; SUPUNGUL et al., 2002). Os ALFs já foram encontrados em vários peneídeos, dentre os quais Litopenaeus setiferus (GROSS et al., 2001), P. monodon (SUPUNGUL et al., 2002), F. chinensis (LIU et al., 2005), M. japonicus (NAGOSHI et al., 2006) L. vannamei (de la VEGA et al., 2008), F. paulensis e L. schmitti (ROSA; STOCO; BARRACCO, 2008) sendo ativos contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, e contra fungos filamentosos (SOMBOONWIWAT et al., 2005; NAGOSHI et al., 2006). Além disso, estudos recentes têm apontado para a relevância deste PAM na limitação das infecções por WSSV em crustáceos (LIU et al., 2006; THARNTADA et al., 2009). Outra importante molécula, que é exocitada durante a ativação do hemócito, é a enzima transglutaminase (TGase) que induz o processo de coagulação da hemolinfa nos crustáceos. TGases são enzimas Ca2+ dependentes, usualmente compartimentalizadas dentro dos hemócitos (LORAND et al., 1979; GREENBERG; BRICKBICHLER; RICE, 1991), e que promovem ligações covalentes γ-glutamil-ε-lisina entre moléculas da proteína de coagulação (CP) (LORAND e CONRAD, 1984), formando assim, coágulos estáveis no local do ferimento. A.

(27) 27. coagulação da hemolinfa é um mecanismo imunológico essencial para a sobrevivência de invertebrados que possuem um sistema circulatório aberto, como é o caso dos crustáceos, pois previne a perda da hemolinfa e a disseminação dos patógenos pela cavidade corpórea do animal, por ocasião de uma injúria no organismo (vide revisão BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2008). Além disso, a coagulação é muito importante durante o processo de muda, fase esta em que o animal torna-se potencialmente mais exposto às injúrias e ataques microbianos. Conforme dito anteriormente, durante as infecções, LPS e peptidoglicanas de bactérias, e β-1,3-glicanas de fungos se ligam diretamente a receptores hemocitários ou através de PRPs plasmáticas ligadas aos respectivos PAMPs, induzindo uma degranulação ou exocitose regulada, com liberação de várias moléculas imunoefetoras, dentre as quais as moléculas do sistema de ativação da pró-fenoloxidase (proPO). O sistema proPO consiste em uma cascata proteolítica composta por vários zimógenos de proteases, pela proPO, além das PRPs e moléculas associadas (vide revisões de LEE e SÖDERHÄLL, 2002; JIRAVANICHPAISAL; LEE; SÖDERHÄLL, 2006), e cujo produto final é a melanina. Em relação ao papel imunológico do sistema proPO, sabe-se que esta via gera transitoriamente moléculas altamente citotóxicas, como as quinonas, hemiquinonas e radicais livres como as ROIs, uma vez que ocorre o consumo de oxigênio molecular que leva à destruição dos patógenos invasores, sendo que alguns estudos relatam uma modulação na expressão gênica da proPO, em camarões infectados por WSSV (ROUX et al., 2002; AI et al., 2008; YEH et al., 2009). Contudo, a ativação do sistema proPO deve ser estritamente regulada para evitar uma ativação indesejada ou generalizada no organismo do crustáceo. Para isso, os animais possuem inibidores plasmáticos de proteases, como a pacifastina (LIANG; SOTTRUP-JENSEN; SÖDERHÄLL, 1997), os inibidores da família Kazal (JOHANSSON; KEYSER; SÖDERHÄLL, 1994; JIMÉNEZ-VEGA e VARGAS-ALBORES, 2005), a serpina (LIANG e SÖDERHÄLL, 1995) e a α2-macroglobulina (α2M) (HERGENHAHN; HALL; SÖDERHÄLL, 1988). A α2M é uma glicoproteína plasmática constitutivamente sintetizada pelos hemócitos (GROSS et al., 2001; RATTANACHAI et al., 2004) que atua como um inibidor de proteases de amplo espectro (serino, aspartato, cisteína e metalo-proteases), inibindo tanto as proteases endógenas do hospedeiro, como aquelas exógenas produzidas pelo patógeno durante o processo infeccioso (vide revisão de ARMSTRONG, 2006). O papel imunomodulador da α2M nos.

(28) 28. crustáceos ainda não está bem estabelecido. No entanto, sabe-se que ela inibe parcialmente serino-proteases ativadoras do sistema proPO do lagostim Pacifastacus leniusculus (HERGENHAHN; HALL; SÖDERHÄLL, 1988; ASPÁN; HALL; SÖDERHÄLL, 1990) e proteases produzidas pelo fungo Aphanomyces spp, um patógeno conhecido para lagostins (DIEGUEZ-URIBEONDO e CERENIUS, 1998). Além disso, foi relatado que ocorre um aumento na expressão da α2M em P. monodon infectados pelo WSSV (TONGANUNT et al., 2005).. Respostas antivirais em crustáceos Além dos processos acima descritos, os crustáceos possuem ainda respostas antivirais, que, comparadas às respostas antimicrobianas, são ainda muito pouco conhecidas (vide revisão de LIU; SÖDERHÄLL; JIRAVANICHPAISAL, 2009). Atualmente, são reconhecidos pelo menos três mecanismos antivirais nos crustáceos: a apoptose celular, o sistema de RNA de interferência (RNAi) e um mecanismo semelhante ao sistema interferon (IFN) dos vertebrados (vide revisões de ROBALINO et al., 2007; LIU; SÖDERHÄLL; JIRAVANICHPAISAL, 2009; PERAZZOLO; BARRACCO; ROSA, 2010). A apoptose ou morte celular programada é um processo fisiológico controlado geneticamente e que está envolvido na regulação da homeostase do organismo, atuando tanto no desenvolvimento embrionário, como no controle dos tecidos e também nas respostas imunológicas contra vírus. A indução do processo apoptótico inicia-se em resposta a uma variedade de estímulos, incluindo infecções virais, e envolve várias alterações morfológicas celulares, como a condensação da cromatina, a fragmentação do núcleo, o encolhimento celular e a lobulação da membrana (vide revisões de ROULSTON; MARCELLUS; BRANTON, 1999; CHOWDHURY; THARAKAN; BHAT, 2008). Por fim, ocorre a fragmentação da célula em pequenas vesículas revestidas por membrana, denominadas de corpos apoptóticos, que em geral são rapidamente fagocitados pelas células vizinhas ou por macrófagos, sem haver qualquer liberação intracelular de seu conteúdo, como no caso de uma necrose, que desencadeia um processo inflamatório. Uma célula que sofre apoptose morre de forma “silenciosa”, sem alertar as células circunvizinhas e sem gerar um processo inflamatório (vide revisão de.

(29) 29. ROULSTON; MARCELLUS; BRANTON, 1999; CHOWDHURY; THARAKAN; BHAT, 2008). Muitas proteínas e componentes virais perturbam a fisiologia celular e fornecem sinais celulares que induzem a apoptose. Em mamíferos, alguns componentes das vias pró-apoptóticas (a proteína quinase R, a RNase L, o fator regulatório 3 do IFN e a quinase Nterminal c-Jun), podem ser ativados pelo dsRNA viral (GANTIER e WILLIAMS, 2007). Logo, durante uma infecção viral, o dsRNA estaria envolvido tanto na sinalização intracelular ativando os sistemas de RNAi e interferon, como também induzindo a apoptose celular. A maquinaria intracelular responsável pela apoptose parece ser semelhante em todas as células animais e é mediada por enzimas nucleases e proteases da família das caspases, que desencadeiam a morte celular através da clivagem de proteínas específicas do núcleo e citoplasma (vide revisão de CHOWDHURY; THARAKAN; BHAT, 2008). As caspases existem nas células como precursores inativos (prócaspases) que são normalmente ativados por clivagem de outras caspases, resultando em uma cascata de amplificação proteolítica. Estas proteases podem ser classificadas de acordo com seu pró-domínio e seu papel na apoptose: caspases iniciadoras possuem pró-domínios longos e estão envolvidas na iniciação da cascata proteolítica, enquanto as caspases efetoras apresentam pró-domínios curtos ou inexistentes, e são responsáveis pela clivagem de substratos celulares (RUPNARAIN et al., 2004). Desta forma, a ativação inicial de um pequeno número de caspases iniciadoras pode levar, através de uma cascata, à ativação de um grande número de caspases executoras, que por sua vez, clivam proteínas-chave na célula, incluindo proteínas citosólicas e das lâminas nucleares (vide revisão de CHOWDHURY; THARAKAN; BHAT, 2008). Até agora, 14 diferentes caspases já foram identificadas em mamíferos, sendo que as caspases 2, 8, 9 e 10 são classificadas como iniciadoras e as caspases 3, 6 e 7 como efetoras ou executoras (vide revisão de GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007; HUNTER; LACASSE; KORNELUK, 2007). Em camarões, genes codificantes tanto para caspases efetoras em Penaeus merguiensis (PHONGDARA; WANNA; CHOTIGEAT, 2006), P. monodon (WONGPRASERT; SANGSURIYA; PHONGDARA, 2007) e L. vannamei (RIJIRAVANICH; BROWDY; WITHYACHUMNARNKUL, 2008), quanto para uma caspase iniciadora em M. japonicus (WANG et al., 2008) já foram identificados e clonados, sendo que em todos esses peneídeos as caspases são induzidas pelas infecções com WSSV..

(30) 30. Um fato relevante a ser considerado é que a apoptose mostra-se apenas efetiva como resposta antiviral quando acionada em estágio precoce da infecção. Neste caso, ela pode limitar a produção de partículas virais e reduzir ou eliminar a propagação da progênie viral para outros tecidos. No entanto, muitos vírus conseguem retardar o processo apoptótico, matando as células apenas no final do ciclo infeccioso (vide revisão de ROULSTON; MARCELLUS; BRANTON, 1999). Este processo tardio é altamente indesejável, uma vez que vírus empacotados em corpos apoptóticos não são detectados pelo sistema imune do hospedeiro e acabam sendo fagocitados pelas células vizinhas, propagando assim a infecção viral em seu organismo (BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2008). Assim, muitos vírus desenvolveram este mecanismo, ao longo da evolução como forma de se evadir imunologicamente e garantir a sua replicação e patogenicidade no hospedeiro. Como exemplo desse fato, é comum os vírus produzirem proteínas antiapoptóticas de diferentes classes. No caso do WSSV, um gene codificante para uma proteína antiapoptótica denominada WSSV449 (ou ORF 390) já foi identificado em seu genoma, sendo considerada uma nova classe de genes de inibidores de apoptose (WANG et al., 2004). Em estudo posterior, LEU et al. (2008) mostraram que a WSSV449 recombinante era capaz de se ligar in vitro a uma caspase executora de P. monodon, inibindo a sua atividade pró-apoptótica e confirmando, assim, a atividade antiapoptótica dessa proteína viral. Sendo assim, estas proteínas virais antiapoptóticas conseguem retardar o processo apoptótico na célula infectada, em tempo hábil para impedir a progressão da infecção viral no hospedeiro. Por outro lado, o próprio hospedeiro possui reguladores intracelulares de apoptose, como os da família de proteínas IAP (do inglês, inhibitor of apoptosis proteins), em um processo natural para a regulação da apoptose celular. As IAPs são as únicas proteínas endógenas conhecidas capazes de regular tanto caspases ativas iniciadoras (caspase 9), quanto efetoras (caspases 3 e 7), inibindo assim a apoptose (LISTON; FONG; KORNELUK, 2003; HUNTER; LACASSE; KORNELUK, 2007). As primeiras IAPs foram originalmente descobertas como proteínas produzidas por alguns vírus de insetos, sendo hoje detectadas em diversas espécies de invertebrados e vertebrados (LISTON; FONG; KORNELUK, 2003). No caso dos crustáceos, muito recentemente foi identificado e clonado o gene codificante para uma IAP no camarão P. monodon (LEU et al., 2008)..

(31) 31. Outro mecanismo antiviral importante dos vertebrados é o sistema interferon (IFN). Os interferons (IFNs) são citocinas que interferem na replicação viral e induzem um estado antiviral inespecífico no hospedeiro. Em mamíferos, as infecções virais induzem à produção de interferons que estimula a expressão de diversos genes implicados nas respostas antivirais inespecíficas. Um potente indutor do sistema IFN de vertebrados é o dsRNA, que como dito anteriormente, é produzido pela maioria dos vírus durante seu ciclo de replicação dentro do hospedeiro sendo, portanto, uma molécula diretamente associada às infecções virais (JACOBS e LANGLAND, 1996). Nos invertebrados, mais especificamente nos crustáceos, nenhuma molécula ou gene com homologia estrutural aos IFNs de mamíferos foi, até o momento, encontrada (ROSA e BARRACCO, 2008). Apesar disso, relatos recentes indicam a presença nestes animais de moléculas análogas, porém não homólogas aos IFNs de vertebrados, participando da defesa antiviral inespecífica dos crustáceos (vide revisões ROBALINO et al., 2007; LIU; SÖDERHÄLL; JIRAVANICHPAISAL, 2009). Robalino et al. (2004) demonstraram um estado antiviral inespecífico em L. vannamei injetados com um dsRNA de sequência inespecífica, sendo observado um aumento na sua resistência contra infecções posteriores por dois vírus não relacionados, o TSV e o WSSV, ou seja, muito semelhante ao estado antiviral induzido pelos IFNs dos mamíferos. Nesse estudo, camarões foram injetados com um oligonucleotídeo sintético denominado poly (C:G) (polycytidylicpolyguanylic acid), que mimetiza um dsRNA viral e desencadeia respostas antivirais inespecíficas. Os animais tratados tiveram um aumento significativo na sua resistência a infecções posteriores tanto por TSV, como por WSSV. Durante as infecções por vírus, as células dos mamíferos reconhecem dsRNA viral através de receptores celulares específicos do tipo TLRs (do inglês, Toll-like proteins), como o Toll-like 3 (TLR3) (ALEXOPOULOU et al., 2001) e os RLRs (do inglês, Retinoic acid – inducible gene (RIG)-I- like receptors) (SAITO e GALE Jr., 2008). A presença de receptores Toll em peneídeos já foi verificada nos hemócitos de L. vannamei (YANG et al., 2007), P. monodon (ARTS et al., 2007), M. japonicus (MEKATA et al., 2008), e F. chinensis (YANG et al., 2008). Aparentemente, os receptores Toll até agora identificados em camarões estão relacionados a respostas antibacterianas, uma vez que alguns autores observaram um aumento na expressão gênica destes receptores após injeção dos animais com peptidoglicanas (MEKATA et al., 2008), Vibrio anguillarum (YANG et al., 2008) e Vibrio harveyi.

(32) 32. (WANG et al., 2010). Sendo assim, até o momento ainda não foi demonstrado um envolvimento de TLRs na resposta antiviral de camarões (ARTS et al., 2007; MEKATA et al., 2008; LABREUCHE et al., 2009; WANG et al., 2010). Apesar disto, pode-se supor que devam existir outras famílias de receptores Toll ainda não detectadas nos peneídeos (LABREUCHE et al., 2009) e que se relacionem às respostas antivirais. Além de induzir o sistema IFN e a apoptose em vertebrados, o padrão molecular dsRNA viral é também capaz de ativar o mecanismo de silenciamento pós-transcricional de genes, conhecido por RNA de interferência (RNAi) (HANNON, 2002; ROBALINO et al., 2007). Neste processo, o dsRNA desencadeia a destruição do RNA mensageiro (RNAm) homólogo à sua própria sequência. O RNAi representa um mecanismo de defesa natural contra vírus e transposons presentes nos mais diferentes seres vivos, desde plantas até mamíferos (vide revisões de HANNON, 2002; ALIYARI e DING, 2009). Muitos transposons e vírus produzem RNA de dupla fita (dsRNA), pelo menos transitoriamente em seus ciclos celulares, e o RNAi auxilia a manter sob controle esses invasores potencialmente perigosos. Este sistema foi inicialmente observado em plantas (NAPOLI; LEMIEUX; JORGENSEN, 1990; VAN DER KROL et al., 1990) e a primeira descrição em animais ocorreu em 1998 no nematódeo Caenorhabditis elegans (FIRE et al., 1998), sendo posteriormente identificado em uma ampla variedade de organismos. A ativação deste sistema inicia-se pelo processamento de precursores longos de dsRNA em RNAs pequenos (21-25 pb), chamados small interference RNAs ou siRNAs, pela ação de um complexo proteico contendo a enzima DICER, que são endoribonucleases do tipo II que clivam especificamente dsRNA ou regiões de grampo de RNAs de fita simples (vide revisão de ALIYARI e DING, 2009). Os siRNAs resultantes são então incorporados a um complexo multiproteico de silenciamento induzido por RNA (RISC do inglês, RNA-induced silencing complex), que conduzirá à degradação específica ou à repressão da tradução de RNAm com regiões complementares à sequência do dsRNA desencadeante (vide revisão de ROBALINO et al., 2007). De forma resumida, após a associação dos siRNAs ao RISC, as fitas de siRNA são separadas, e a fita antisenso é então utilizada como molde pelo RISC para encontrar e degradar os RNAms alvos, que possuem sequências de nucleotídeos complementares. Em última análise, a degradação do RNAm impossibilita que a proteína correspondente seja traduzida (GELEY e.

(33) 33. MULLER, 2004; WADHWA et al., 2004). Desta forma, o mecanismo RNAi é atualmente utilizado como ferramenta em estudos que visem desativar a expressão pós-transcricional de genes específicos, como àqueles codificantes para proteínas virais em camarões, limitando ou impedindo assim o processo infeccioso (ROBALINO et al., 2005; TIRASOPHON; ROSHORM; PANYIM, 2005; YODMUANG et al., 2006; KIM et al., 2007; TIRASOPHON et al., 2007; ASSAVALAPSAKUL; CHINNIRUNVONG; PANYIM, 2009). Diferentemente do sistema IFN que é induzido por qualquer sequência de dsRNA, ou seja, de maneira sequência-inespecífica, a proteção antiviral baseada no sistema RNAi é sequência-específica. Interessantemente, destruindo grande parte do RNA alvo contido na célula e, interrompendo temporariamente a síntese proteica correspondente, a célula do hospedeiro inibe a replicação viral sem matar a si mesma, o que é altamente vantajoso para o hospedeiro. Dentre as proteínas-chave do sistema do RNAi destaca-se a família das argonautas que são componentes fundamentais do complexo de silenciamento multiproteico induzido por RNA ou RISC (HAMMOND et al., 2001). A estrutura destas proteínas é constituída por um domínio N-terminal PAZ, que participa do reconhecimento dos siRNA, e um domínio C-terminal PIWI, com atividade de RNase e que a caracteriza como uma proteína slicer do RISC (vide revisão PARKER e BARFORD, 2006). Todos os complexos RISC caracterizados até o momento possuem pelo menos uma proteína da família argonauta, como componente (HAMMOND et al., 2001; HUTVAGNER e ZAMORE, 2002; MARTINEZ et al., 2002; MOURELATOS et al., 2002; VERDEL et al., 2004). Em Drosophila, cinco genes codificantes para argonauta foram identificados e classificados em duas subfamílas: AGO e PIWI (vide revisão KIM; HAN; SIOMI, 2009). Em camarões, as principais proteínas envolvidas na via de RNAi, como a DICER (SU et al., 2008) e a argonauta, já foram identificadas em P. monodon (UNAJAK; BOONSAENG; JITRAPAKDEE, 2006; DECHKLAR; UDOMKIT; PANYIM, 2008). No caso da argonauta, devido às características altamente conservadas dos domínios PAZ e PIWI, os autores sugerem que esta proteína seja da subfamília AGO (AGO1), estando envolvida no mecanismo de RNAi em camarões (UNAJAK; BOONSAENG; JITRAPAKDEE, 2006; DECHKLAR; UDOMKIT; PANYIM, 2008). Um mecanismo antiviral específico induzido via RNAi foi demonstrado em L. vannamei, a partir de injeções prévias nos animais com sequências de dsRNA correspondentes a proteínas estruturais de.

(34) 34. WSSV ou TSV (ROBALINO et al., 2005), onde a infecção subsequente dos animais pelos respectivos vírus foi grandemente limitada. Após esse primeiro relato, outros trabalhos se seguiram utilizando a técnica de RNAi como uma terapia alternativa contra infecções virais em camarões. Em P. monodon, sequências específicas de dsRNA foram também capazes de suprimir a replicação in vivo do YHV (YODMUANG et al., 2006), como in vitro (cultura primária de células) (TIRASOPHON; ROSHORM; PANYIM, 2005). Ainda no caso do WSSV, a replicação pôde ser eficientemente limitada em F. chinensis por injeções com dsRNA correspondentes aos genes das proteínas virais vp28, vp281 e proteína quinase (KIM et al., 2007). Alguns estudos também indicam que pequenos RNAi (siRNA) também sejam capazes de induzir a proteção antiviral contra o WSSV em P. monodon (WESTENBERG et al., 2005), L. vannamei (WU et al., 2007) e M. japonicus (XU; HAN; ZHANG, 2007). No entanto, os resultados obtidos em camarões utilizando siRNA de genes virais parecem não ser tão efetivos quanto aqueles com dsRNA, que possui uma sequência longa. Aparentemente, esse fato está associado a diferenças nos genes virais e aos fragmentos gênicos selecionados para a sua síntese (vide revisão de SHEKHAR e LU, 2009). No caso do dsRNA de sequência específica, além de atuar na prevenção contra a infecção por vírus, um efeito terapêutico do mesmo já foi demonstrado com sucesso em L. vannamei (ASSAVALAPSAKUL; CHINNIRUNVONG; PANYIM, 2009), e P. monodon (TIRASOPHON et al., 2007). Em ambos os trabalhos, os animais primeiramente desafiados com YHV e posteriormente injetados com um dsRNA sequencia específica, mostraram uma forte inibição da replicação viral, e consequentemente, elevadas taxas de sobrevivência. Estes trabalhos indicam que a técnica do RNAi pode ser utilizada tanto para fins profiláticos, prevenindo uma infecção viral, quanto para fins terapêuticos, reduzindo/eliminando a infecção em animais já infectados. Dessa forma, a utilização da técnica de RNAi vem despontando no cenário científico internacional como uma ferramenta promissora e efetiva para o controle de viroses em camarões cultivados (LIU; SÖDERHÄLL; JIRAVANICHPAISAL, 2009), e constitui atualmente uma das áreas de estudo mais ativas da biologia (ZERBINI, ALFENAS; ANDRADE, 2005). No caso de humanos, o uso da técnica do RNAi para inibir a replicação de alguns vírus patogênicos já está bem documentada, como para o vírus da pólio (GITLIN; KARELSKY; ANDINO, 2002), vírus da imunodeficiência adquirida HIV-1 (NOVINA et al., 2002), vírus da hepatite C (RANDALL; GRAKOUI; RICE, 2003).