T11 e T12 Microrganismos e engenharia genética

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(1)21/10/2011. DNA Recombinante e Biotecnologia. Microrganismos e engenharia genética. 1. O Advento da Tecnologia do DNA Recombinante  1970 a 1980  novas técnicas artificiais para a produção de DNA recombinante  DNA recombinante  qualquer manipulação artificial de genes, seja ela feita dentro de uma espécie p ou entre espécies p diferentes. Prof. Paulo Henrique Grazziotti Microbiologia do Solo.  bactérias recombinantes com genes humanos produzem insulina  levedura recombinante com o gene que produz a proteína do capsídeo do vírus da hepatite B – Vacina  Amplificação do DNA  DNA de poucas células pode ser amplificado e comparado com outros – criminologia.  Engenharia genética ou Tecnologia do DNA recombinante  manipulação gênica feita em ambiente de laboratório  Biotecnologia  inclui todas as aplicações industriais de sistemas ou processos biológicos, e mais recentemente utilizada p para identificar as aplicações industriais da engenharia genética  Surgimento pelo desenvolvimento de novas ferramentas e técnicas:. 2. Procedimentos típicos na Engenharia Genética Eng. Genética e suas aplicações Ex.:  produção de hormônio de crescimento humano (hGH) por E. coli, produto puro e produção rápida baixo custo..  Enzimas de restrição  a mais importante  Vetor ou Vetor de clonagem. 1. Cromossomo bacteriano. Plasmídeo. Um vetor, como um plasmídeo, é isolado. 3 DNA (plasmídeo) recombinante. 2. DNA é clivado em fragmentos por uma enzima.. O gene é inserido no plasmídeo. DNA. Gene de interesse. Eng. Genética e suas aplicações. 4. O plasmídeo é incorporado por uma célula, como a de uma bactéria.. 5 As células com o gene de interesse são clonadas. O objetivo pode ser a produção de cópias do gene. OU. 6a As cópias do. O objetivo pode ser a obtenção do produto protéico do gene A células él l 6b As Plasmídeo RNA Proteína. gene são purificadas.. Gene para resistência a uma praga ou doença é inserido em plantas. Gene altera bactérias, de modo que elas possam fazer a limpeza de resíduos tóxicos. Proteína faz com que a neve congele a uma temperatura mais alta. produzem o produto protéico.. 7. As cópias da proteína são purificadas.. Hormônio de crescimento é utilizado no tratamento de casos de deficiência do crescimento.. 3. Ferramentas e Técnicas Biotecnológicas  materiais pré-preparados e protocolos similares a receitas de bolo  Enzimas de Restrição  enzimas bacterianas que reconhecem e clivam, sempre da mesma maneira, uma determinada seqüência de bases no DNA  tipicamente reconhecem seqüências de 4, 6 ou 8 bases  foram isoladas em 1970  observação na natureza anterior: o DNA dos vírus era destruído quando infectava uma bactéria não hospedeira  clivam as 2 fitas de DNA assimétricamente, permitindo que estes se recombinem facilmente in vitro. 1.

(2) 21/10/2011. Enzima de restrição. Sítios de reconhecimento. A enzima de restrição cliva o DNA de fita 1 dupla nos seus sítios específicos de reconhecimento.. Clivagem. DNA. 2 Produção de. Clivagem. GAATTC. GAATTC. CTTAAG. CTTAAG. extremidades coesivas G. 3 Fragmentos de DNA. G. CTTAA. AATTC. G. DNA de outra origem, talvez um plasmídeo, clivado com a mesma enzima de restrição.  capaz de inserir moléculas de DNA recombinante dentro das células. AATTC. G. Extremidade coesiva. CTTAA. AATTC. G AATTC. G. G. CTTAA G. CTTAA. clivados pela mesma enzima podem se unir por pareamento de base..  Vetores  molécula de DNA utilizada como portadora para transmitir um gene de um organismo para outro. Ex.: palsmídeos (principal) e DNA viral. 4 Os fragmentos. unidos geralmente formam uma molécula linear ou circular.. A enzima DNA 5 ligase uni os DNAs, produzindo uma molécula de DNA recombinante. DNA recombinante. Plasmídio para clonagem de E.coli: vetor com genes marcadores.  Características  auto-replicativa, tamanho pequeno (mais resistentes), preservação (a forma circular fornece proteção) e recombinação rápida no DNA do hospedeiro.  Genes marcadores  importantes para a recuperação dos vetores, são genes de resistência ou para enzimas que realizam reações facilmente identificáveis  Vetores de transporte  plasmídios capazes de existir em várias espécies. Úteis para a modificação genética de plantas e animais. Ex. Resistência a herbicidas  DNA viral  aceita fragmentos de DNA exógeno maiores.  Métodos para a Introdução de DNA Exógeno em Células  determinado em função do tipo de vetor e da célula hospedeira  na natureza os plasmídios são transferidos pelo contato célula-célula, como na conjugação na engenharia genética por transformação. lacZ Região de policlonagem ampR. pUC19. OBS: o DNA exógeno g introduzido numa célula só sobreviverá se estiver presente em um vetor autoreplicativo ou se recombinar com um dos cromossomos da célula a) Transformação  células competentes podem captar DNA do ambiente. ori.  Método para tornar E. coli competente  incubação em solução de cloreto de cálcio por período breve  colocação do DNA é aplicação de um choque térmico. b) Eletroporação  uma corrente elétrica é usada para formar poros microscópicos nas membranas aplicável em todos os tipos de células. Quando da presença de parede celular faz-se necessário produzir protoplastos primeiramente c)) Fusão F ã de d Protoplastos P t l t  a adição di ã de d polietileno-glicol li til li l aumenta a freqüência de fusão de protoplastos em solução. Cromossomo Membrana plasmática Parede celular. Fusão de Protoplastos. 1. Digestão enzimática da parede celular.. Protoplastos. 2. Tratamento com solução de polietileno-glicol 3. Células foliculares. 4.  importante para a manipulação de células vegetais. O protoplastos Os t l t se fundem.. Seguimentos dos cromossomos recombinam.. Célula recombinante 5. Desenvolvimento de uma nova parede celular.. 10 m. 2.

(3) 21/10/2011. d) Disparo direto ou “projeteis”  partículas microscópicas de tungstênio ou ouro cobertas com DNA são arremessadas através das paredes de células vegetais por uma explosão de hélio e) Microinjeção  fura-se a célula pelo uso de uma micropipeta de vidro e o DNA é injetado. Injeção de DNA exógeno. 4. Fontes de DNA  Bancos de Genes ou Bibliotecas Genômicas  coleção de clones contendo diferentes fragmentos de DNA O genoma a ser armazenado é fragmentado com uma enzima de restrição Plasmídeo recombinante. Óvulo fecundado de camundongo. OU. DNA recombinante do fago. Célula hospedeira. Fago vetor de clonagem. Clone bacteriano. Fago clone. Biblioteca de plasmídios. - exons  fragmentos de DNA que codificam proteínas - íntrons  fragmentos intervenientes de DNA que não codificam proteínas. Célula hospedeira. Plasmídio recombinante 4. 3. Gene de interesse OU. DNA recombinante do fago. DNA. ligação de um no máximo possível de fragmentos a cópias de DNA de um vetor plasmidial ou viral 4 introdução dos vetores. recombinantes em células bacterianas. Fago vetor de clonagem 5. Clone bacteriano. 5. Biblioteca de plasmídios. Fago clone. produção de clones da bactéria em culturas puras. Biblioteca de bacteriófagos.  DNA Síntético  síntese in vitro por máquinas de síntese de DNA  um microprocessador controla a síntese de DNA a partir do suprimento de nucleotídeos armazenado e dos demais reagentes necessários.  várias seqüências de aproximadamente 120 nucleotídeos p e unidas para p devem ser sintetizadas separadamente formar a seqüência completa  a seqüência de base deve ser conhecida  a seqüência de base pode ser prevista a partir da seqüência de a.a.. - splicing  remoção do RNA originário dos íntrons por enzimas nucleares para produção do mRNA (Fig. 9.7 Tortora et al., 2000)  Genes com íntrons serão muito grandes e não serão lidos corretamente em uma bactéria Transcriptase revesra  sintetiza DNA complementar (cDNA) a partir de um molde de mRNA  moléculas de mRNA longas podem ter sua transcrição reversa incompleta. DNA de um gene eucariótico. Exon. Extração do DNA. Íntron. 1. Exon. Fragmentação do DNA contendo o gene de interesse com enzimas de restrição. DNA complementar (cDNA para um gene eucariótico Íntron. 2.  Clonagem de células eucarióticas  possuem exons (DNA que codifica proteínas) e íntrons (DNA que não codifica proteínas). Exon. Etapas para a montagem de Bancos de Genes ou Bibliotecas Genômicas. Biblioteca de bacteriófagos. Transcrição do gene 1 pela RNA polimerase. RNA No núcleo, enzimas 2 processadoras removem o RNA derivado dos íntrons e unem o RNA derivado do exons para formar o mRNA. mRNA Isolamento do mRNA 3 da célula e adição de transcriptase reversa a 4 A 1 fita de DNA é sintetizada. Fita de DNA sendo sintetizada. 5 O mRNA é digerido pela trascriptase reversa. 6 Adição de DNA polimerase para sintetizar a 2a fita de DNA. cDNA:DNA do gene sem íntrons. 5. Selecionando um Clone  dentre milhões de células, algumas poucas possuem o gene desejado o vetor deve possuir genes marcadores para que a introdução do DNA exógeno seja determinada. Ex.: plasmídeo E l íd com os genes ampR e lacZ l Z ( galactosidade)  Seleção azul-branca .  pouco usada devido a degeneração do código genético  apropriada para genes pequenos. Ex.: gene da insulina. 3.

(4) 21/10/2011. lacZ ampR. Sítio de restrição. Plasmídeo 1. 2. Sítio de policlonagem. O DNA plasmidial e o DNA exógeno são livados com a mesma enzima de restrição.. O DNA exógeno é inserido no plasmídeo onde inativa o gene. Sítios de restrição Plasmídeo recombinante.  Ainda não se sabe se a bactéria recebeu o fragmento de DNA desejado. Com saber?. lacZ.. 3. O plasmídeo recombinante é introduzido em uma bactéria, que se torna resistente à ampicilina.. 4. Todas as bactérias tratadas são espalhadas em uma placa de ágar nutriente contendo ampicilina e o substrato  -galactosidade e então incubadas.. 5. Bactéria. As colônias brancas que aparecem devem conter DNA exógeno. As colônias azuis não devem conter DNA exógeno.  Hibridização de colônias  são sintetizados sondas de DNA, que aderem ao gene-alvo quando encontram uma seqüência complementar  Sondas de DNA  são segmentos de DNA curto de fita simples complementares ao gene desejado. São marcadas com elemento radioativo ou corante fluorescente. - se o DNA exógeno g no plasmídeo codifica um produto identificável é só cultivar o isolado bacteriano e testá-lo;. - caso não, faz-se necessário identificar o próprio gene. Placa master com colônias bacterianas contendo segmentos de genes exógenos clonados. Identific cação de genes de iinteresses. Seleção de bactérias nantes recombin. lacZ = gene  -galactosidade ampR = gene resistente à ampicilina. Filtro de nitrocelulose. Fitas de DNA bacteriano Sondas marcadas raioativamente. Sonda de DNA ligada. Revelação. Colônias contendo genes de interesse Placa réplica. 6. Aplicações da Engenharia Genética  Produtos da Engenharia Genética para a Terapia Médica. 1. Uma réplica da placa master é feita no filtro de nitrocelulose.. 2. O filtro é tratado com detergente (SDS) para ligar a bactéria.. 3. O filtro é tratado com NaOH para separar as duas fitas do DNA.. 4. As sondas marcadas radioativamente são adicionadas.. Gene de interesse 5 DNA de fita simples 6. 7. A sonda hibridizará com o gene desejado nas células bacterianas. O filtro é lavado para remover a sonda não-ligada e depois exposto a um filme de raio X. O filme revelado é comparado com a réplica da placa master para identificar colônias contendo o gene de interesse..  Obtendo Informações do DNA para a Pesquisa Básica e Aplicações Médicas. Comentário Produto Ativador do plasminogênio Dissolve a fibrina de coágulos sangüíneos; tratamento de ataques tissular cardíacos; Insulina humana. Melhor tolerada que a insulina extraída de animais; produzida por E. coli. Interleucina-2 (IL-2). Possível tratamento para o câncer; estimula o sistema imune; produzida por E. coli. Alfa-interferon. Possível tratamento para o câncer e doenças virais; produzido por E. coli e S. cerevisiae. Fator de necrose tumoral (TNF) Hormônio de crescimento humano (hGH) Pró-uroquinase. Causa a desintegração de células tumorais; produzido por E. coli.  a tecnologia de DNA recombinante produz grande quantidade de um seguimento de DNA que pode funcionar como uma espécie de “gráfica gráfica para imprimir DNA DNA”. Corrige deficiências do crescimento em crianças; produzido por E. coli Anticoagulante; tratamento de ataques cardíacos; produzido por E. coli e S. cerevisiae. Vacina contra a hepatite B Produzida por S. cerevisae que carrega um gene do vírus da hepatite em um plasmídeo Relaxina. Utilizada para facilitar o parto; produzida por E. coli. Fator estimulador de colônia (CSF). Contrapõe efeitos de quimioterapia; melhora a resistência contra doenças infecciosas como a AIDS; tratamento de leucemia; produzido por E. coli e S. cerevisiae. Fator de crescimento epidérmico (EGF). Cura ferimentos, queimaduras e úlceras; produzido por E. coli.  Técnicas analíticas para a “leitura” da informação contida no DNA. 4.

(5) 21/10/2011.  a automação permite que se determine a seqüência de 1.000 bases por dia.  Genoma da E. coli e Genoma Humano - Ex. de utilização do genoma humano  foi identificado e clonado o gene mutante que causa a fibrose cística (bloqueio das vias respiratórias). A seqüência do gene mutado pode ser usada para o diagnóstico pela técnica de hibridização Sauthern blotting. Enzima de restrição. Southerrn blotting.  Seqüenciamento de DNA  é a determinação da seqüência exata de bases nucleotídicas no DNA.. 1. Fragmentos de DNA humano. Gel. Esponja. Gel Filtro de nitrocelulose. As bandas de DNA são transferidas para um filtro de nitrocelulose por absorção. A solução passa através do gel e do filtro para as toalhas de papel.. 4. Sondas marcadas radioativamente. DNA transferido paro o filtro. Isso produz um filtro de nitrocelulose com fragmentos de DNA posicionados exatamente como o gel.. Filme revelado. A Saco plástico que pode ser hermeticament e fechado. 5. O filtro é exposto a uma sonda radiotivamente marcada específica para um gene. A sonda irá parear suas bases (hibridizar) com a seqüência curta presente no gene.. - Varedura genética  utilização do Southern blotting em futuros pais ou fetos para diagnosticar várias doenças genéticas.. 6. Sangue do réu.  1 kb TS. Ex.: forma hereditária do câncer de mama - Terapia gênica  remoção de algumas células com gene defeituoso e transformação com gene normal e retorná-las para o indivíduo.. Os fragmentos são separados de acordo com o tamanho por eletroforese em gel. Cada banda consiste de muitas cópias de um determinado fragmento de DNA. As bandas são visíveis sob luz UV por ação de um corante. Filtro de papel. 2. DNA contendo o gene de interesse é extraído de células humanas e clivado em fragmentos.. Toalhas de papel Solução salina. 3. Gel. Gene de interesse. D. O filtro é exposto a um filme de raios X. O fragmento contendo o gene de interesse é identificado por uma banda no filme revelado.. Sangue das roupas do réu. jeans. Sangue da vitima. 4 g 8 g Camiseta. V.  1 kb. DNA g p fingerprints. Ex. de sucesso: correção do gene para adenosina desaminase, responsável pelo sistema imune funcional - DNA fingerprinting  utilizado na medicina criminal. Possibilita a confirmação do envolvimento de um réu no crime.  técnica essencial para a aplicação do Southern blotting de um material coletado na cena de um crime.  30 ciclos produzirão mais de um bilhão de cópias do DNA-alvo. Incubação do DNA alvo a 94oC por 1 min. Para separar as fitas.. 2. Adição de primers, nucleotídeos (ATP, CTP, GTP, TTP) e DNA polimerase. CTP ATP. primer. TTP DNA polimerase. 3. 4. 5. Ligação dos primers ao DNA de fita simples durante incubação a 60oC por 1 min.. Incubação a 72oC por 1 min.; durante esse tempo, são formadas duas cópias do DNAalvo.. Repetição do ciclo de aquecimento e resfriamento para a produção de mais duas cópias de DNAalvo.. 2o ciclo. Obs.: a DNA polimerase resistente ao aquecimento é obtida de uma bactéria termofílica (Thermus aquaticus). 1. 1o ciclo.  Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)  é a produção de milhões de cópias de um fragmento de DNA a partir de uma única cópia. Reação em cadeia da polimerase - PCR.  tb pode ser usada p/ identificar patógenos bacterianos e virais. 5.

(6) 21/10/2011. Plasmídeo Ti – Vetor para modificação de plantas por engenharia genética.  Aplicações da Tecnologia do DNA Recombinante na Agricultura  a inserção de DNA recombinante em células vegetais pode ser obtida, por ex.. pela fusão e o uso de “projéteis” revestidos de DNA mas o método mais elegante é pelo uso do plasmídeo Ti (Ti é a abreviatura do tumor-inducing, ou indutor de t tumor) ) que ocorre na b bactéria té i Agrobacterium A b t i t tumefaciens f i (Tabela – Alguns produtos da Eng. Genética importantes para a Agropecuária. Agrobacterium tumefaciens. Sítio para clivagem de restrição T-DNA. Plasm. Ti. T-DNA portador do gene exógeno inserido no O plasmídeo é cromossomo 4 reinserido em uma bactéria A bactéria é utilizada para inserir 5 o T-DNA portador do gene exógeno em um cromossomo de As células vegetais uma célula da planta. 6 são multiplicadas em cultura.. O plasmídeo é removido 1 da bactéria e o T-DNA é clivado com uma enzima de restrição.. O DNA exógeno é 3 inserido no T-DNA do plasmídeo plasmídeo. O DNA exógeno é 2 clivado com a mesma enzima.. Tumor de galha em uma noqueira-pecã estimulado pelo plasmídeo Ti. As células vegetais 6 são multiplicadas em cultura. A planta é gerada a 7 partir de um clone de células. Todas as suas células são portadoras do gene exógeno e podem expressá-lo como uma nova característica.. Tabela – Alguns produtos da Eng. Genética importantes para a Agropecuária Produtos para a Agricultura. Comentário. Pseudomonas syringae, bactéria do gelo-menos. Não produz uma proteína que normalmente inicia a formação de gelo nas plantas. P fluorescens. Possui o gene produtor de toxina do patógeno de insetos da bactéria Bacillus thuringiensis; a toxina mata insetos que se alimentam de raízes quando eles ingerem a bactéria. Rhizobium meliloti. Modificada para aumentar a sua capacidade de fixar nitrogênio Cultivares resistentes ao Plantas que possuem o gene mutante da Salmonella produtor glifosato (Round-Up (Round Up®) da enzima necessária para produção de a.a., a a resistente ao herbicida Algodão Bt e milho Bt Plantas que possuem o gene produtor de toxina de B. thurigiensis; a toxina mata insetos que se alimentam das plantas O gene para degradação da pectina é removido para que as Tomate e cenoura frutas tenham uma vida mais longa nas prateleiras FlavrSavr® Produtos para a Pecuária Hormônio do crescimento Aumenta o ganho de peso em suínos; produzido por E. coli suíno (PGH) Hormônio de cresc. Aumenta o ganho de peso e produção de leite em bovinos; bovino (BGH) produzido por E. coli Animais Trangênicos. Para produzirem proteínas de utilidade médica no leite. 6.

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