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SARAH DE MARCHI LOURENÇO
MEMBRANAS DE POLI(ÁLCOOL VINÍLICO)
FUNCIONALIZADAS PARA LIBERAÇÃO TÉRMICA E
FOTOQUÍMICA DE ÓXIDO NÍTRICO
CAMPINAS 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
SARAH DE MARCHI LOURENÇO
MEMBRANAS DE POLI(ÁLCOOL VINÍLICO) FUNCIONALIZADAS PARA LIBERAÇÃO TÉRMICA E FOTOQUÍMICA DE ÓXIDO NÍTRICO
ORIENTADOR: PROF. DR. MARCELO GANZAROLLI DE OLIVERIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRA EM QUÍMICA NA ÁREA DE FÍSICO QUÍMICA.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR SARAH DE MARCHI LOURENÇO, ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCELO GANZAROLLI DE OLIVEIRA.
______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2015
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À minha mãe Mara
“Há mais pessoas que desistem que pessoas que fracassam”
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Marcelo Ganzarolli de Oliveira pela orientação e pelo conhecimento transmitido.
À CAPES pela bolsa de mestrado e auxílios concedidos.
Aos funcionários das oficinas do IQ e da CPG, em especial à Bel e ao Miguel, que diretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
Ao pessoal dos laboratórios de análises: Fabi pelas análises de TGA e ajuda com o DSC, Daniel pelas imagens de microscopia, Renata pelas análises de DRX e Sônia pela ajuda com as análises de IV.
Ao Victor Baldim pela ajuda em várias etapas deste trabalho, principalmente com o NOA.
Aos colegas do laboratório: Ana Maria Percebom, Ana Paula Bodemeier, Bia Mansano, Bruno Giordano, César Brinatti, Eduardo Creatto, Fernanda Lima, Fernanda Dias, Guilherme Ferreira, Henrique Piva, Karen Slis, Karl Clinckspoor, Lia Beraldo, Nathalia Carneiro, Nathan Castro, Patrícia Taladriz, Rafael Pires, Rafael Ungarato, Scheila Alves, Thati Marini, Thiago Ito e Vicente Gomes. Pela agradável convivência diária, cafés, risadas e amizade.
A todos os amigos de Campinas e de Leme pela amizade e apoio.
À minha família, em especial às minhas irmãs Patrícia e Rebeca e aos meus pais Ângelo e Mara, pelo amor que dedicam à mim.
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SÚMULA CURRICULAR
Sarah De Marchi Lourenço
Email: sarahdml@gmail.com
Lattes: http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4457156Y6
Formação acadêmica
Mestrado em Química Início: Agosto/2013
Instituição: Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP
Bacharelado em Química Tecnológica Fev/2008 – Dez/2012 Instituição: Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP
Atividades acadêmicas
Programa de Estágio Docente (PED-C) Ago/2014 – Dez/2014 Instituição: Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP
Disciplina: Físico-Química Experimental I – QF 632
Idiomas
Inglês: Avançado Espanhol: Básico
Trabalhos apresentados em congressos científicos
Lourenço, S. M.; de Oliveira, M. G.; “S-nitrosated crosslinked poly(vinyl alcohol) membranes for local nitric oxide release”. XIV Latin American
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Symposium on Polymers and XII Ibero American Congress on Polymers, 2014, Porto de Galinhas, PE, Brazil.
Taladriz Blanco, P.; Baldim, V.; Lourenço, S. M.; Santos, K. S. R.; de Oliveira, M. G.; “Increasing dermal blood flow with photochemical NO release from topical formulations”. Nitric Oxide – Nitrite/Nitrate Conference, 2014, Cleveland, USA.
Lourenço, S. M.; Fostier, A. H.; Morais, L. S. R.; “Comparação de métodos analíticos para avaliação da sorção de Tiabendazol em diferentes tipos de solos”. 34ª Reunião Anual Da Sociedade Brasileira De Química, 2011, Florianópolis, SC, Brazil.
Vieira, A. P.; Ferreira, M. G.; Lourenço, S. M.; Fostier, A. H.; "Sorção do Mebendazol e Tiabendazol em solos típicos do estado de São Paulo". 34ª Reunião Anual Da Sociedade Brasileira De Química, 2011, Florianópolis, SC, Brazil.
Lourenço, S. M.; Fostier, A. H.; “Sorção de Tiabendazol em solos do Estado de São Paulo”. XVIII Congresso Interno de Iniciação Científica da Unicamp, 2010, Campinas, SP, Brazil.
Lourenço, S. M.; Fostier, A. H.; “Sorção de Tiabendazol em solos”. V ENQAmb: Encontro Nacional de Química Ambiental, 2010, São Pedro, SP, Brazil.
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RESUMO
MEMBRANAS DE POLI(ÁLCOOL VINÍLICO) FUNCIONALIZADAS PARA LIBERAÇÃO TÉRMICA E FOTOQUÍMICA DE ÓXIDO NÍTRICO O Óxido nítrico (NO) é uma espécie radicalar endógena que desempenha papéis importantes em diversos processos fisiológicos, incluindo controle do tônus vascular. Desordens microcirculatórias associadas à depleção da produção endógena de NO são as principais causas de doenças isquêmicas e têm demandado o desenvolvimento de biomateriais capazes de liberarem NO localmente em tecidos. O poli(álcool vinílico), PVA, é um polímero hidroxilado biocompatível já utilizado para propósitos médicos que permite modificações químicas através de reações de condensação com ácidos carboxílicos. Neste trabalho, utilizamos o ácido mercaptosuccínico (AMS) para preparar membranas de PVA reticuladas quimicamente contendo grupos –SH (PVA-SH), capazes de serem posteriormente S-nitrosadas e liberarem NO localmente por vias térmica e fotoquímica. O PVA foi esterificado com AMS em meio acidificado com HCl. As membranas foram moldadas por precipitação da solução polimérica através de imersão em acetona, secas por liofilização e, subsequentemente, S-nitrosadas com ácido nitroso. As membranas de PVS-SH apresentaram cristalinidade reduzida e graus de intumescimento maiores que 600% em água. Medidas por quimiluminescência em tempo real mostraram que as membranas S-nitrosadas são capazes de liberar NO termicamente e que a sua irradiação com luz visível aumenta significativamente a taxa de liberação de NO. Foi demonstrado que estas propriedades de liberação de NO levam à vasodilatação após a aplicação tópica das membranas no antebraço de voluntários saudáveis, mostrando sua potencial aplicabilidade para o tratamento tópico de doenças isquêmicas da pele.
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ABSTRACT
FUNCTIONALIZED POLY(VINYL ALCOHOL) MEMBRANES FOR THERMAL AND PHOTOCHEMICAL NITRIC OXIDE RELEASE Nitric oxide (NO) is an endogenous radical species, which plays important roles in many physiological processes, including the control of vascular tone. Microcirculatory disorders associated with the depletion of endogenous NO production are the main causes of ischemic diseases and have demanded biomaterials capable of delivering NO locally to tissues. Poly(vinyl alcohol), PVA, is a biocompatible hydroxylated polymer already used for medical purposes that allows chemical modification through condensation reactions with carboxylic acids. In this work, we used mercaptosuccinic acid (MSA) to prepare SH-containing crosslinked PVA membranes (PVA-SH) capable of being further S-nitrosated to release NO locally through thermal and photochemical pathways. PVA was esterified with MSA in aqueous HCl-acidified medium. The membranes were cast by precipitation of the polymeric solutions, through their immersion in acetone, dried by lyophilization and subsequently S-nitrosated with nitrous acid. The PVA-SH membranes displayed a reduced crystallinity and swelling degrees in water higher than 600%. Real time chemiluminescence measurements showed that the S-nitrosated membranes are capable of releasing NO thermally and that their irradiation with visible light increases significantly the rate of NO release. These NO-release properties promoted local vasodilation after topical application of the membranes on the forearm of health volunteers, showing their potential applicability for the topical treatment of ischemic skin diseases.
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SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ... xix
LISTA DE TABELAS ... xxi
LISTA DE FIGURAS ... xxiii
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1. Biomateriais ... 1
1.2. Poli(álcool vinílico) ... 2
1.3. Obtenção de membranas porosas por inversão de fases ... 5
1.4. Óxido Nítrico ... 7
1.5. S-nitrosotióis ... 9
2. OBJETIVOS ... 15
3. EXPERIMENTAL ... 17
3.1. Materiais ... 17
3.2. Preparação das membranas de PVA-SH ... 17
3.3. Caracterização das membranas de PVA-SH ... 18
3.3.1 Espectroscopia no Infravermelho por Refletância Total Atenuada (ATR) ... 18
3.3.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 18
3.3.3 Coeficiente de Intumescimento ... 19
3.3.4 Análises Térmicas ... 19
3.3.5 Difratometria de Raios-X (DRX) ... 20
3.4 S-nitrosação e estudo do perfil de liberação térmica e fotoquímica de NO ... 21
3.5 Quantificação de NO nas membranas de PVA-SNO ... 24
3.5.1 Método do ascorbato ... 24
3.5.2 Método fotoquímico ... 25
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3.7 Estudo da estabilidade do NO nas membranas de PVA-SNO ... 28
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 29
5. CONCLUSÕES ... 65
6. REFERÊNCIAS ... 67
7. MATERIAL SUPLEMENTAR ... 75
xix
LISTA DE ABREVIATURAS
NO Óxido nítrico
PVA Poli(álcool vinílico) AMS Ácido mercaptosuccínico -SH Sulfidrila
-OH Hidroxila
HCl Ácido clorídrico
sGC Guanilato ciclase solúvel cGMP Guanosina monofosfato cíclica RSNO S-nitrosotiol
GSNO S-nitrosoglutationa
ATR Refletância Total Atenuada
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura CI Coeficiente de Intumescimento PBS Tampão fosfato salino
TGA Análise termogravimétrica
DSC Calorimetria exploratória diferencial DRX Difração de Raios-X
NaNO2 Nitrito de sódio
NOA Analisador de Óxido Nítrico TFM Tubo Fotomultiplicador LED Light-Emitting Diode
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Temperatura de transição vítrea (Tg), temperatura de fusão (Tf), entalpia
de fusão (H) e grau de cristalinidade (c) das membranas de PVA e PVA-SH e
PVA nativo. ... 45 Tabela 2. Atribuição dos picos de difração do PVA observados nos difratogramas da Figura 21. ... 48
xxiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura molecular do PVA. ... 2 Figura 2. Estrutura molecular do ácido mercaptosuccínico. ... 3 Figura 3. Reação de esterificação do PVA com ácido mercaptosuccínico formando PVA-SH... 4 Figura 4. Perfis de concentração do não-solvente (precipitante) na solução polimérica em vários tempos (t) durante a formação de membranas assimétricas. Reproduzida com permissão de: Strathmann, H.; Kock, K. The Formation Mechanism of Phase Inversion Membranes. Desalination 1977, 21, 241–255. Copyright 1977 Elsevier. ... 6 Figura 5. Representação das estruturas eletrônicas de ressonância de S-nitrosotióis. S = estrutura convencional, D = estrutura zwiteriônica, I = estrutura iônica e estrutura tridimensional de um S-nitrosotiol. Reproduzida com permissão de: Timerghazin, Q. K. Et al. Resonance Description of S-Nitrosothiols : Insights into Reactivity. Org. Lett. 2007, 9, 3049–3052. Copyright 2007 American Chemical Society. ... 10 Figura 6. Estrutura da S-nitrosoglutationa. Um dos S-nitrosotióis já incorporados em matrizes poliméricas para promover a liberação tópica de NO. ... 11 Figura 7. Aplicação tópica de um poliéster não-nitrosado I e de um poliéster nitrosado (PNPE II) na pele do antebraço. (A) Poliéster não-nitrosado aplicado como controle. (B) Controle (gota da esquerda) e PNPE II (gota da direita) imediatamente após a aplicação do PNPE II. (C) Eritema detectado após a remoção da gota de PNPE II, o qual permaneceu na pele por 7 min. (D) Aparência das áreas de aplicação 3 min após a remoção das gotas do controle e de PNPE II, mostrando o desaparecimento do eritema detectado na Figura C. As linhas pretas são marcas de referência desenhadas na pele com uma caneta. Reproduzida com permissão de:
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Simões, M. M. D. S. G.; de Oliveira, M. G. Poly(vinyl Alcohol) Films for Topical Delivery of S-Nitrosoglutathione: Effect of Freezing-Thawing on the Diffusion Properties. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 2010, 93, 416–424. Copyright 2007 John Wiley and Sons. ... 13 Figura 8. Esquema representando o analisador de NO (NOA) e seus componentes. TFM = tubo fotomultiplicador. Reproduzida com permissão de: Bates, J. N., Nitric oxide measurement by chemiluminescence detection, Neuroprotocols: A companion to methods in neurosciences, 1992, 1, 141-149. Copyright 1992 Elsevier. ... 22 Figura 9. Fotografia do NOA e seus componentes utilizado neste trabalho. ... 23 Figura 10. Vista lateral do frasco de reação do NOA com as duas fibras ópticas ajustadas horizontalmente em relação à amostra. ... 24 Figura 11. Representação do corte transversal da pele mostrando um feixe de laser sendo incidido sobre a pele, atingindo capilares dérmicos e sendo refletido e coletado pela fibra óptica coletora. ... 27 Figura 12. Espectros na região do infravermelho da membrana de PVA, do ácido mercaptosuccínico (AMS) e da membrana de PVA-SH. O aparecimento da banda em 1720 cm-1 referente ao estiramento C=O de ésteres confirma a reação de
funcionalização do PVA com AMS. ... 30 Figura 13. Esquema representando (A) as interações de hidrogênio no PVA puro e (B) a diminuição das interações de hidrogênio do PVA-SH nas proximidades dos pontos de reticulação, devido ao afastamento entre as cadeias de PVA causado pela esterificação com AMS. ... 32 Figura 14. Esquema representando a vista lateral da membrana de PVA mostrando as camadas superior e inferior e as regiões onde foram obtidas as imagens de MEV. ... 33
xxv
Figura 15. Micrografias das membranas de PVA mostrando (A, B) a face de cima da camada superior em duas ampliações diferentes, evidenciando a inexistência de poros nesta camada, (C, D) a face de cima da camada inferior em duas ampliações diferentes, mostrando poros circulares interconectados em toda superfície, (E, F) a face de baixo da camada inferior em duas ampliações diferentes, mostrando uma superfície irregular e sem poros e (G - J) a seção transversal em quatro ampliações diferentes, mostrando toda a extensão da membrana, inclusive com a camada superior, contendo poros circulares interconectados. As dimensões indicadas na parte superior das imagens se referem às dimensões das barras de escala. ... 35 Figura 16. Esquema representando a vista lateral da membrana de PVA-SH mostrando uma única camada e as regiões onde foram obtidas as imagens de MEV. ... 36 Figura 17. Micrografias das membranas de PVA-SH mostrando (A, B) a face de cima em duas regiões distintas na mesma ampliação, mostrando regiões fechadas sem poros e regiões abertas com aspectos de fios, (C, D) a face de baixo em duas regiões distintas na mesma ampliação, mostrando uma morfologia semelhante à da face de cima e (E - F) a seção transversal em quatro ampliações diferentes, mostrando poros alongados com eixos principais orientados horizontalmente de paredes não porosas e superfícies rugosas. A Figura 17F mostra um zoom de uma região da Figura 17E, e a Figura 17H mostra um zoom de uma região da Figura 17G. As dimensões indicadas na parte superior das imagens se referem às dimensões das barras de escala. ... 38 Figura 18. Coeficiente de intumescimento das membranas de PVA e PVA-SH em H2O e PBS a 37°C. A membrana de PVA atingiu o platô em 450% após 1 h e a
membrana de PVA-SH atingiu o platô em 650% após 5 h. Não houve diferença significativa no intumescimento das duas membranas variando-se o meio de H2O
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Figura 19. (A) Curvas termogravimétricas (TG) e (B) Curvas termogravimétricas derivadas, DrTG, das membranas de PVA e PVA-SH. Observam-se dois processos de degradação diferentes em ambas as membranas que ocorrem na faixa de 365 - 380°C e 435 - 455°C ... 43 Figura 20. Termogramas de DSC das membranas de PVA e PVA-SH e do PVA nativo. Gráfico de barras à direita mostra o grau de cristalinidade calculado das membranas de PVA e PVA-SH e do PVA nativo. ... 45 Figura 21. Difratogramas de Raios-X das membranas de PVA-SH e de PVA puro, e de amostras de PVA nativo com graus de hidrólise de 99 e 80%. ... 46 Figura 22. Representação das cadeias poliméricas do PVA-SH antes e depois da nitrosação do grupos sulfidrila com ácido nitroso e após a desnitrosação térmica ou fotoquímica, formando-se ligações de dissulfeto e liberando NO. ... 49 Figura 23. Curvas cinéticas representativas de liberação térmica. As curvas da esquerda mostram o aumento brusco inicial no sinal de NO que se dá no início da reação, seguido por um decaimento exponencial. As curvas da direita representam a quantidade total de NO que chega ao detector em função tempo. ... 51 Figura 24. Curvas cinéticas representativas durante a liberação fotoquímica. As curvas da esquerda mostram o aumento brusco inicial no sinal de NO que se dá no início da reação, seguido por um decaimento exponencial. As curvas da direita representam a quantidade total de NO que chega ao detector em função tempo. ... 53 Figura 25. Curva cinética de liberação térmica de NO. Quando a lâmpada é acesa (momentos indicados pelas setas “ON”), observa-se um aumento instantâneo na quantidade de NO liberado. Ao desligar a lâmpada (momentos indicados pelas setas “OFF”), a quantidade de NO liberado diminui. ... 54 Figura 26. Curvas cinéticas de liberação (A) térmica e (B) fotoquímica. As curvas vermelhas representam ajustes de equações exponenciais de primeira ordem. ... 56
xxvii
Figura 27. Curvas preliminares de fluxo sanguíneo microcirculatório medido por fluxometria por laser Doppler na pele do antebraço, após a aplicação tópica da membrana PVA-SNO com e sem irradiação com luz visível por 4 min. ... 57 Figura 28. Aplicação tópica da membrana de PVA-SNO na pele do antebraço de um voluntário saudável. (A) Duas amostras da membrana de PVA-SNO aplicadas na pele. (B) Uma das amostras é protegida da luz, enquanto a outra é irradiada com luz visível por 10 min. (C) Eritemas formados após os 10 minutos de aplicação. O eritema correspondente à amostra irradiada aparece mais intenso que o da amostra não irradiada. (D) O eritema da amostra irradiada ainda permanece evidente na pele 5 min após a retirada das membranas. ... 59 Figura 29. Carga de NO presente nas membranas de PVA-SNO preparadas em dias diferentes (Lote 1 e Lote 2) determinadas por quimiluminescência utilizando-se o método do ascorbato. O gráfico à direita mostra os valores médios de carga de NO determinados em cada lote de amostra. ... 61 Figura 30. Carga de NO presente em amostras das membranas de PVA-SNO do Lote 2 determinadas por quimiluminescência utilizando-se o método do ascorbato e o método fotoquímico. O gráfico à direita mostra os valores médios de carga de NO determinados em cada método. ... 63 Figura 31. Dados preliminares sobre a estabilidade das membranas de PVA-SNO após a secagem por liofilização e armazenamento em dessecador protegido da luz durante 46 dias. Círculo = 1 medida, triângulo = duplicata, quadrado = triplicata. Linha tracejada passa pelo valor médio igual a 25 6 nmols NO/mg membrana. . 64 Figura S-1. Termogramas de DSC das membranas de PVA e PVA-SH e do PVA nativo mostrando as curvas do primeiro resfriamento...75 Figura S-2. Curvas do sinal de NO gerado pelo NOA nos experimentos de estabilidade, mostrando que o sinal das amostras após a secagem e armazenamento se manteve significativo em relação ao ruído em todas as medidas realizadas...76
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Biomateriais
O termo biomaterial é utilizado para designar uma classe importante de materiais desenvolvidos para agir como interface entre sistemas biológicos visando o tratamento ou substituição de tecidos e órgãos do corpo1. Os
biomateriais se dividem em três principais subclasses: os cerâmicos, os metálicos e os poliméricos. Dependendo da aplicação desejada, busca-se aquele com propriedades mais adequadas, dentre as quais a baixa ou nenhuma toxicidade, não trombogenicidade, não mutagenicidade, não imunogenicidade e estabilidade2. Este conjunto de propriedades estabelece o conceito de
biocompatibilidade, que se refere à “habilidade do material de realizar sua
função com uma resposta apropriada do hospedeiro em uma aplicação
específica”3.
A subclasse dos biomateriais poliméricos se destaca devido à sua grande versatilidade, uma vez que a natureza química dos polímeros permite a fabricação de materiais com componentes e composições diversas através da modulação de suas propriedades, seja pela modificação de sua superfície e
bulk, ou pelo preparo de blendas e compósitos3. A escolha do polímero varia
de acordo com a aplicação, podendo este ser de origem natural ou sintética, ou uma mistura de ambos. Dentre alguns dos polímeros mais utilizados como biomateriais estão: colágeno4, quitosana5, poli(cloreto de vinila)6, poliuretanas7, poliacrilatos8, poli(álcool vinílico)9,10,11 e muitos outros.
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1.2. Poli(álcool vinílico)
O polímero utilizado neste trabalho foi o poli(álcool vinílico), PVA, cuja estrutura molecular está representada na Figura 1.
Figura 1. Estrutura molecular do PVA.
O PVA é um polímero sintético produzido a partir da hidrólise do poli(acetato de vinila) e pertence ao grupo dos polímeros extensamente utilizados como biomateriais. Dentre suas principais características estão a alta solubilidade em água, hidrofilicidade, biocompatibilidade, biodegradabilidade, não toxicidade, baixa adsorção de proteínas, propriedades de intumescimento e de bioadesão12. Diversas propostas de utilização de PVA como biomaterial são descritas na literatura, tais como no desenvolvimento de hidrogéis e membranas para aplicações como curativos13 e lentes de contato14,
dispositivos médicos implantáveis para reposição de cartilagem12,
revestimento de cateteres15, matrizes para liberação de fármaco (drug
delivery)16 e engenharia de tecidos11. Kita et. al.14 prepararam um hidrogel de
PVA por precipitação e compararam suas propriedades físicas em vários solventes, com as de lentes de contato comerciais produzidas com outros polímeros. Eles observaram que o hidrogel de PVA apresentou grau de intumescimento e permeabilidade ao oxigênio semelhantes aos dos materiais
3
comparados e menor adesão de proteínas e propriedades mecânicas superiores às de alguns dos produtos. Além disso, após aplicações in vivo em ratos durante 12 semanas, não foram observadas anormalidades, indicando que o PVA possui potencial de uso para a confecção de lentes de contato.
Devido à sua alta solubilidade em água, é necessário que o PVA seja reticulado quimicamente e/ou fisicamente a fim de manter o material estruturalmente estável após intumescimento em água ou em meio fisiológico. Diversos agentes reticulantes como glutaraldeído, formaldeído e outros monoaldeídos são relatados na literatura como eficazes na reticulação química do PVA17. Entretanto, para aplicações médicas e farmacêuticas, tais agentes
não são aceitáveis devido à permanência de resíduos tóxicos no material que podem ser posteriormente liberados, gerando efeitos danosos à saúde do paciente. Outras técnicas de reticulação química apresentam-se como alternativas mais interessantes para aplicações biomédicas, como a fotoreticulação e a funcionalização do PVA com moléculas não tóxicas18,19. A
estratégia utilizada neste trabalho foi a funcionalização dos grupos hidroxila do PVA com um ácido dicarboxílico, o ácido mercaptosuccínico (AMS), cuja estrutura molecular aparece representada na Figura 2, através da formação de ligações éster.
4
Espera-se que as duas extremidades do ácido se liguem covalentemente neste caso, via ligações éster, a diferentes cadeias de PVA, reticulando parcialmente o polímero, conforme a reação representada na Figura 3.
Figura 3. Reação de esterificação do PVA com ácido mercaptosuccínico formando PVA-SH.
A reticulação física, por sua vez, dispensa o uso de agentes reticulantes. Métodos eficazes de reticulação de PVA incluem, por exemplo, a realização de ciclos sucessivos de congelamento/descongelamento (freezing/thawing) da solução polimérica16,20 e a precipitação do polímero em um não-solvente a partir da solução concentrada21. A reticulação física se dá devido à formação
de cristalitos entre as cadeias de polímero. O PVA cristaliza seguindo o modelo da cadeia dobrada, através de ligações de hidrogênio inter e intramoleculares. Para a cristalização ocorrer, as cadeias devem ter mobilidade suficiente para se alinhar e dobrar formando lamelas. Vários fatores podem influenciar a formação de cristalitos no PVA, tais como o grau de hidrólise, massa molar e estereoregularidade17.
5
1.3. Obtenção de membranas porosas por inversão de fases
A preparação de membranas através da precipitação de uma solução polimérica homogênea em um não-solvente é uma estratégia utilizada para a obtenção de estruturas porosas22. No processo de separação de fases, uma solução homogênea é transformada em um sistema de duas fases: uma fase sólida rica em polímero, que forma a estrutura da membrana, e uma fase líquida pobre em polímero, que forma os poros 23. Duas técnicas principais são
reportadas na literatura para a preparação de membranas: a precipitação do polímero em um ambiente saturado de não-solvente na fase vapor24, e a precipitação por imersão em um recipiente contendo não-solvente na fase líquida25. Neste trabalho, utilizou-se a técnica de imersão, que leva à formação
de uma estrutura contendo uma camada superior densa e uma camada inferior contendo poros. Tais membranas recebem o nome de membranas assimétricas e podem ser produzidas a partir de diversos sistemas polímero/solvente/não-solvente26.
A formação desta camada superior densa na técnica de imersão pode ser explicada em termos do gradiente de concentração dos componentes do sistema, formado na interface solução polimérica/não-solvente no momento da imersão. A Figura 4 apresenta um esquema elaborado por Strathmann, H. et.
al.23 e mostra o perfil de concentração do não-solvente (indicado na figura
como “precipitant”) durante a precipitação. Ao imergir a solução polimérica no não-solvente, o solvente sai e o não-solvente entra, levando a um aumento rápido da concentração de polímero e à consequente separação de fases. No interior da solução polimérica, entretanto, a concentração ainda é menor que a necessária para promover separação, de modo que o polímero na superfície
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precipita primeiro, formando a camada densa. Esta camada age como uma barreira e dificulta a difusão do não-solvente para o interior da solução, fazendo com que o perfil de concentração do precipitante seja menos acentuado.
Figura 4. Perfis de concentração do não-solvente (precipitante) na solução polimérica em vários tempos (t) durante a formação de membranas assimétricas. Reproduzida com permissão de: Strathmann, H.; Kock, K. The Formation Mechanism of Phase Inversion Membranes. Desalination 1977, 21, 241–255. Copyright 1977 Elsevier.
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De acordo com o proposto por Wijmans, J. G. et. al.21 e Broens, L. et.
al.27, em um sistema contendo um polímero, um solvente e um não-solvente, a
separação de fases pode ser do tipo líquido-líquido ou por cristalização. Na separação líquido-líquido, a solução diminui sua energia livre ao se separar em duas fases líquidas de composições diferentes. O caminho para isto pode ser por nucleação e crescimento da segunda fase ou por separação spinodal. Em soluções concentradas, entretanto, apenas a separação por nucleação e crescimento é esperada. Na cristalização, as moléculas de polímero diminuem a energia livre da solução através da formação de estruturas ordenadas. Em soluções poliméricas concentradas, os cristalitos formados agem reticulando fisicamente as cadeias de polímero. Os autores acima sugerem que a camada densa se forma por cristalização, e a camada inferior porosa, por separação líquido-líquido. O fator determinante para o tipo de separação, isto é, separação líquido-líquido ou cristalização, é a concentração de polímero local no momento da precipitação. No exato instante da imersão, a depleção de solvente é rápida e a penetração de não-solvente é pequena, de modo que a concentração de polímero na interface aumenta rapidamente e a cristalização ocorre. Abaixo desta camada densa, a separação se dá a uma concentração de polímero mais baixa, sendo do tipo líquido-líquido. Neste tipo de separação, os núcleos são formados pela fase pobre em polímero e resultarão nos poros da estrutura final da membrana.
1.4. Óxido Nítrico
O óxido nítrico, NO, é um radical livre sintetizado endogenamente no organismo através da oxidação do aminoácido L-arginina catalisada por
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enzimas chamadas de NO sintases28. Seu pequeno volume molecular e a
ausência de carga lhe conferem grande facilidade de difusão, enquanto que sua natureza radicalar lhe confere uma alta reatividade frente a alguns substratos específicos. Isso resulta em sua ação como mensageiro intracelular através da transmissão de sinais que levam à ativação ou desativação de enzimas29,30.
Até meados da década de 80 esta molécula era conhecida apenas como um dos principais poluentes atmosféricos, mas foi após a descoberta de que o NO era sintetizado in vivo e estava associado a importantes processos fisiológicos31,32,33 que começaram a surgir diversos trabalhos de pesquisa nesta
área. Um reflexo destas importantes descobertas foi a concessão do Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1998 aos três cientistas responsáveis pelos trabalhos com o NO. Eles propuseram que as células endoteliais produziam uma molécula sinalizadora, nomeada de fator relaxante derivado do endotélio, difusível e de tempo de vida curto, capaz de fazer a musculatura lisa vascular relaxar. Este fator foi posteriormente identificado como sendo o NO34. Cada vez mais, o estudo de suas propriedades de atuação em processos
fisiológicos despertam o interesse de pesquisadores de áreas multidisciplinares.
Os principais processos biológicos em que o NO tem papel fundamental incluem neurotransmissão35, inflamação36, cicatrização37 e vasodilatação28. A
inibição da produção de NO na vasculatura está associada a doenças cardiovasculares, tais como, hipertensão, isquemia e trombose38, e a doenças
vasculares periféricas, como a Síndrome de Raynaud39. No processo de
vasodilatação, o NO atua mantendo o fluxo e a pressão sanguínea em níveis ideais através da regulação do tônus vascular. Ao ser gerado, o NO difunde para as células musculares lisas localizadas abaixo do endotélio vascular e reage com o ferro da enzima guanilato ciclase solúvel (sGC), causando sua
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ativação. Esta ativação resulta na formação da guanosina monofosfato cíclica (cGMP), a qual, através da ativação de outros processos, induz a relaxação das células musculares e a dilatação dos vasos. Em casos em que a produção de NO é inibida ou insuficiente, propõem-se a administração exógena de NO como agente terapêutico em diversas aplicações biomédicas29,30.
1.5. S-nitrosotióis
O NO é liberado tanto in vivo como in vitro por compostos capazes de transportá-lo e prolongar seu tempo de vida. Estes compostos compreendem, por exemplo, os nitratos orgânicos e inorgânicos, NONOatos, complexos inorgânicos nitrosilados e S-nitrosotióis (RSNOs)40. Os S-nitrosotióis, que são
o foco deste trabalho, são moléculas que contêm um ou mais grupos –SNO em sua estrutura molecular e liberam NO via mecanismos enzimáticos e não-enzimáticos. Diversos RSNOs, tais como derivados de S-nitrosoalbuminas e S-nitrosocisteínas, são encontrados endogenamente e transportam NO por todo o corpo41.
A estrutura eletrônica dos RSNOs pode ser representada por três estruturas de ressonância (Figura 5): a convencional (S), com a dupla ligação entre os átomos de nitrogênio e oxigênio, a zwiteriônica (Z), com a dupla ligação entre os átomos de enxofre e nitrogênio, e a iônica (I), que representa um RSNO como um par iônico RS–/NO+. O conhecimento destas estruturas é
de fundamental importância, pois permite entender e predizer propriedades estruturais e conformacionais de RSNOs, sua interação com ácidos de Lewis, e sua reatividade química em geral42.
10
Figura 5. Representação das estruturas eletrônicas de ressonância de S-nitrosotióis. S = estrutura convencional, D = estrutura zwiteriônica, I = estrutura iônica e estrutura tridimensional de um S-nitrosotiol. Reproduzida com permissão de: Timerghazin, Q. K. Et al. Resonance Description of S-Nitrosothiols : Insights into Reactivity. Org. Lett. 2007, 9, 3049–3052. Copyright 2007 American Chemical Society.
Tais moléculas podem ser incorporadas em matrizes poliméricas ou podem se ligar covalentemente a polímeros através dos outros grupos funcionais presentes em suas estruturas43. Trabalhos anteriores do grupo, de
colaboradores, e de outros grupos de pesquisa, reportam a utilização de S-nitrosotióis em matrizes poliméricas para a liberação de NO para fins biomédicos. Bohl et. al.44 incorporaram covalentemente diferentes doadores
de NO, incluindo um S-nitrosotiol, em um hidrogel de polietilenoglicol. Eles verificaram a eficiência na redução de agregação plaquetária e proliferação de células musculares lisas in vitro devido à liberação de NO. Georgii et. al.45 incorporaram S-nitrosoglutationa (GSNO) (Figura 6) em um hidrogel do copolímero comercial Pluronic F-127 para avaliar o efeito da aplicação tópica
11
de um doador de NO em feridas isquêmicas. Eles observaram um aumento na contração e reepitelização da ferida, diminuição de células inflamatórias, entre outros fatores, que indicaram a eficácia da aplicação de GSNO no tratamento de feridas isquêmicas. Simões et. al.16 prepararam filmes de PVA reticulados fisicamente através da técnica de freezing/thawing e avaliaram a influência do número de ciclos realizados na difusão in vitro da GSNO incorporada e sua propriedade de promover vasodilatação dérmica. Eles observaram que os filmes submetidos a 1, 3 e 5 ciclos de freezing/thawing apresentaram aumento na cristalinidade. O coeficiente de difusão da GSNO diminuiu de 5,7 x 10-7
cm2 s-1 nos filmes de PVA sem nenhum ciclo, para 2,0 x 10-7 cm2 s-1 e 2,5 x
10-7 cm2 s-1 nos filmes com 1 e 3 ciclos, respectivamente. O filme com 5 ciclos
apresentou um aumento anômalo no coeficiente de difusão (5,0 x 10-7 cm2 s-1).
A aplicação tópica dos filmes na pele saudável de voluntários levou a um aumento da vasodilatação dérmica local. Um maior aumento foi observado para o filme com 5 ciclos, enquanto que o filme com 1 ciclo levou ao menor aumento. Estes resultados indicaram que o tratamento com ciclos de
freezing/thawing pode ser utilizado para modular as propriedades de difusão e
vasodilatação dérmica de filmes de PVA contendo GSNO incorporada.
Figura 6. Estrutura da S-nitrosoglutationa. Um dos S-nitrosotióis já incorporados em matrizes poliméricas para promover a liberação tópica de NO.
12
A incorporação de GSNO no PVA, entretanto, pode ser desvantajosa do ponto de vista de sua estabilidade no biomaterial. A GSNO é instável em solução e se decompõe rapidamente dependendo da concentração. Durante o processo de incorporação, tanto o polímero quanto a GSNO devem estar em solução e durante a secagem, pode ocorrer decomposição da GSNO, levando a um material com uma carga de NO inferior à desejada. Uma alternativa para este problema é o preparo de S-nitrosotióis através da S-nitrosação de moléculas que contenham grupos sulfidrila (–SH) covalentemente ligados em sua estrutura, inclusive polímeros, no momento da aplicação do material. A reação de S-nitrosação consiste na ligação covalente do NO ao átomo enxofre do grupo –SH com liberação de água46. Seabra et. al.15 prepararam uma blenda
de um poliéster polinitrosado e poli(metacrilato de metila) (PNPE/PMMA) e a utilizaram para revestir cateteres intravasculares - dispositivos médicos que ficam em contato direto com o sangue e estão sujeitos a agregação de plaquetas e colonização de bactérias. Foi observado que o NO liberado dos filmes exerceu ação antimicrobiana contra as bactérias Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. Em um outro trabalho, Seabra et. al.47 prepararam um poliéster polisulfidrilado e posteriormente fizeram a S-nitrosação do material com uma mistura gasosa de NO/O2. Gotas deste material foram
aplicadas e mantidas na pele saudável do antebraço de voluntários durante 7 min. Após a remoção, foram observados eritemas nas regiões onde o material foi aplicado, devido à vasodilatação causada pelo NO liberado no local (Figura 7).
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Figura 7. Aplicação tópica de um poliéster não-nitrosado I e de um poliéster nitrosado (PNPE II) na pele do antebraço. (A) Poliéster não-nitrosado aplicado como controle. (B) Controle (gota da esquerda) e PNPE II (gota da direita) imediatamente após a aplicação do PNPE II. (C) Eritema detectado após a remoção da gota de PNPE II, o qual permaneceu na pele por 7 min. (D) Aparência das áreas de aplicação 3 min após a remoção das gotas do controle e de PNPE II, mostrando o desaparecimento do eritema detectado na Figura C. As linhas pretas são marcas de referência desenhadas na pele com uma caneta. Reproduzida com permissão de: Simões, M. M. D. S. G.; de Oliveira, M. G. Poly(vinyl Alcohol) Films for Topical Delivery of S-Nitrosoglutathione: Effect of Freezing-Thawing on the Diffusion Properties. J. Biomed. Mater.
Res. B. Appl. Biomater. 2010, 93, 416–424. Copyright 2007 John Wiley and
14
O mesmo foi observado para PVA funcionalizado com grupos –SNO. Marcilli et. al.48 prepararam filmes de PVA esterificados com ácido
mercaptosuccínico (AMS) através da técnica de evaporação de solvente (casting), levando a um material reticulado quimicamente e funcionalizado com grupos sulfidrila. Estes filmes foram S-nitrosados via reação com ácido nitroso e mostraram efeito vasodilatador após aplicação tópica em pele saudável. Devido à esterificação dos grupos hidroxilas com AMS, a cristalização do PVA nestes filmes foi totalmente suprimida e os filmes apresentaram coeficiente de intumescimento igual a 110%, uma morfologia sem poros e um aspecto quebradiço. Inspirando-se neste material, buscou-se neste trabalho uma nova abordagem no preparo de um biomaterial de PVA funcionalizado com diferentes propriedades físico-químicas e de liberação de NO. Um material de morfologia porosa e alta hidrofilicidade favorecem um alto grau de intumescimento, propriedade importante em algumas aplicações de biomateriais, como por exemplo, curativos de lesões de difícil cicatrização que produzem grandes quantidades de exsudato49. Além disso, a maleabilidade
e a elasticidade de filmes de PVA doadores de NO preparados na forma de membranas porosas flexíveis pode oferecer maior conforto durante a aplicação.
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2. OBJETIVOS
O principal objetivo deste trabalho foi a preparação e a caracterização de membranas porosas de PVA funcionalizadas com grupos sulfidrila, passíveis de serem S-nitrosadas e liberarem NO térmica e fotoquimicamente.
Os objetivos específicos deste trabalho foram:
- Estabelecer um protocolo de preparo das membranas por inversão de fases para a obtenção de um material maleável, poroso, com alta capacidade de intumescimento e funcionalizado com grupos sulfidrila.
- S-nitrosar as membranas e estudar as cinéticas de liberação térmica e fotoquímica de NO, além de determinar a carga total e a estabilidade das membranas S-nitrosadas.
- Avaliar o feito vasodilatador das membranas S-nitrosadas após aplicação tópica na pele.
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3. EXPERIMENTAL
3.1. Materiais
Poli (álcool vinílico) (MW 89,000–98,000; 99+% hidrolisado), ácido mercaptosuccínico 97%, hidrogenofosfato de potássio e hidróxido de sódio (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), ácido clorídrico 37% (Tedia Company, Inc, Fairfield, OH, USA), ácido ascórbico e acetona (Labsynth Produtos para Laboratórios Ltda, Diadema, SP, BR) e nitrito de sódio 99,7% (Fischer Scientific, New Jersey, NY, USA), foram utilizados sem purificação prévia. Água ultrapura (resistividade 18,2 MΩ.cm) foi obtida através de um sistema de purificação milli-Q e utilizada em todos os experimentos.
3.2. Preparação das membranas de PVA-SH
As membranas de PVA-SH foram preparadas aquecendo-se uma solução aquosa de PVA (10% m/m) e AMS em uma razão molar de aproximadamente 1:1 (mols OH: mols COOH) em meio ácido (HCl 0,04 mol L-1) sob agitação e refluxo por 3 h a 100°C. Metade do conteúdo de água da
solução resultante foi removido sob aquecimento em um frasco aberto e então a solução viscosa resultante foi transferida para moldes de Nylon ( 3 cm), os quais foram imersos e mantidos em acetona durante aproximadamente 18 h. As membranas formadas a partir da precipitação do polímero foram retiradas dos moldes e lavadas com água e acetona a fim de remover o excesso de reagentes residuais. A lavagem consistiu em mantê-las primeiramente sob agitação em um béquer contendo 500 mL água e, posteriormente, transferi-las
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para placas de Petri contendo 20 mL de acetona. Este procedimento de lavagem foi repetido 6 vezes e a completa remoção do excesso de reagentes foi avaliada através da análise da água de lavagem por espectrofotometria UV-vis utilizando o Método de Ellman50, teste colorimétrico que determina a presença de grupos sulfidrila em solução. Finalmente, as membranas foram congeladas em freezer durante 1 h e, posteriormente, secas por liofilização durante 72 h e estocadas em um dessecador com sílica ativada. Uma membrana de PVA puro foi preparada de maneira similar à descrita acima, exceto pela adição de AMS e HCl e usada como controle.
3.3. Caracterização das membranas de PVA-SH
3.3.1 Espectroscopia no Infravermelho por Refletância Total
Atenuada (ATR)
Os espectros infravermelhos do AMS e das membranas de PVA e de PVA-SH foram obtidos em um espectrômetro Cary 630 FITR (Agilent, USA), utilizando-se o acessório de ATR. Foram acumulados 128 espectros na faixa de 4000 a 400 cm-1 com uma resolução de 4 cm-1.
3.3.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As morfologias das faces superior e inferior e da seção transversal, obtida por fratura criogênica das membranas, foram analisadas utilizando-se
19
um microscópio eletrônico Jeol JSM 6360 LV (Tóquio, Japão) operando a 10kV. As amostras foram montadas em um suporte metálico e revestidas com uma liga ouro/paládio (tempo de revestimento de 180 s, corrente 11,3 A) utilizando um Sistema de Revestimento Modular de Alto Vácuo (Bal-Tec MED 020).
3.3.3 Coeficiente de Intumescimento
O coeficiente de intumescimento (CI) das membranas de PVA e PVA-SH foi determinado por gravimetria. Amostras secas do material foram imersas em água e em PBS pH 7,4, a 37°C, e pesadas em diferentes intervalos de tempo. Antes de cada pesagem, o excesso de água da superfície do material foi removido gentilmente com um lenço de papel. O coeficiente de intumescimento foi calculado através da Eq. 1:
(1)
onde ms é a massa da membrana seca e mi é a massa da membrana
intumescida.
3.3.4 Análises Térmicas
A estabilidade térmica das membranas de PVA e PVA-SH foi avaliada por termogravimetria utilizando-se um termoanalisador 2050 TGA (TA
20
Instruments, EUA). As amostras com massas entre 6 e 9 mg foram aquecidas de 25 a 700°C a uma taxa de 10°C min –1 sob atmosfera inerte de argônio.
As temperaturas de fusão (Tf) e o grau de cristalinidade das membranas
e de uma amostra do PVA nativo (amostra original do frasco) foram determinados pela técnica de calorimetria exploratória diferencial (DSC) utilizando-se um calorímetro Q100 (TA Instruments, EUA). As amostras foram pesadas em porta amostras fechados e submetidas a ciclos de aquecimento/resfriamento sob atmosfera de argônio na faixa de -10 a 250°C a uma taxa de aquecimento de 10°C min–1. O grau de cristalinidade (c) foi
calculado dividindo-se a entalpia de fusão da amostra (H), obtida integrando-se a área sob o pico de fusão nos termogramas, pela entalpia teórica necessária para fundir uma amostra de PVA 100% cristalino (HPVA100% = 138.6 J g–1)51.
Foram utilizados os termogramas do segundo aquecimento nas análises.
3.3.5 Difratometria de Raios-X (DRX)
A cristalinidade das membranas de PVA nativo foi avaliada utilizando-se um difratômetro de Raios-X XRD7000 (Shimadzu, Japão) operado a 40 keV com radiação de Cu Kα (λ= 0.154 nm), variando-se o ângulo 2 na faixa de 5°– 50°.
21
3.4 S-nitrosação e estudo do perfil de liberação térmica e
fotoquímica de NO
Amostras intumescidas das membranas de PVA-SH pesando de 3 a 5 mg com dimensão de 0,5 x 0,5 cm foram fixadas na ponta de um fio de Nylon ( 1 mm) de 10 cm de comprimento. As amostras foram S-nitrosadas por imersão em uma solução ácida de nitrito de sódio (NaNO2 0,054 mol L-1
em HCl 0,024 mol L-1) em um tubo Falcon tampado, agitado manualmente por
inversão do tubo por 2 min. Após a S-nitrosação, as amostras foram removidas do tubo Falcon através do fio de Nylon e mergulhadas em um outro tubo Falcon contendo 30 mL de água para remoção do ácido nitroso em excesso absorvido pela amostra. As amostras foram agitadas vigorosamente no tubo Falcon durante 3 min e, em seguida, transferidas para o frasco de reação do analisador de óxido nítrico.
As cinéticas de liberação térmica e fotoquímica de NO das membranas de PVA-SH recém nitrosadas (PVA-SNO) foram avaliadas através da detecção do NO liberado em tempo real utilizando-se um analisador de NO (NOA - Sievers 280i, Boulder, CO, EUA), operando com uma pressão de O2
de 6.0 psig e pressão de N2 de 7.0 torr. Este método se baseia na reação
quimiluminescente do NO com o ozônio produzido in situ. Após a inserção da amostra, o NO gerado é arrastado por um fluxo de N2 para dentro de uma
câmara onde é produzido ozônio. Ao reagirem, estas duas espécies formam dióxido de nitrogênio no estado excitado (NO2*), que decai ao estado
fundamental com emissão de radiação com comprimento de onda entre 600 e 875 nm (Eq. 2 e 3) 52,53.
22
NO + O3 NO2* (2)
NO2* NO2 + h (3)
A luz emitida é amplificada em um tubo fotomultiplicador e a intensidade do sinal luminoso é diretamente proporcional à concentração de NO. O esquema da Figura 8 mostra todos componentes do equipamento. A Figura 9 mostra uma fotografia do equipamento e seus componentes utilizados neste trabalho.
Figura 8. Esquema representando o analisador de NO (NOA) e seus componentes. TFM = tubo fotomultiplicador. Reproduzida com permissão de: Bates, J. N., Nitric oxide measurement by chemiluminescence detection, Neuroprotocols: A companion to methods in neurosciences, 1992, 1, 141-149. Copyright 1992 Elsevier.
Dentro do frasco de reação do NOA adicionou-se 5 mL de água e borbulhou-se N2 para obtenção de um ambiente livre de oxigênio antes da
23
inserção da amostra recém nitrosada. O frasco de reação manteve-se termostatizado a 37°C durante todo experimento. Nos experimentos de liberação térmica este vaso foi protegido da luz e nos experimentos de liberação fotoquímica incidiu-se luz visível sobre a amostra. A fonte de radiação utilizada foi um Iluminador LED (LMI-6000 LED Fiber optic, potência luminosa de 780 lumens, Dolan Jenner Industries, Massachusetts, USA) ajustado na intensidade máxima e com as duas fibras ópticas direcionadas horizontalmente e diametralmente opostas em relação a amostra, conforme mostrado na Figura 10. Após a inserção da amostra dentro do vaso contendo água a 37°C, a aquisição de dados foi feita até o término da liberação do NO das membranas de PVSA-SNO.
24
Figura 10. Vista lateral do frasco de reação do NOA com as duas fibras ópticas ajustadas horizontalmente em relação à amostra.
3.5 Quantificação de NO nas membranas de PVA-SNO
3.5.1 Método do ascorbato
Nos experimentos de quantificação de NO, as amostras foram S-nitrosadas nas condições descritas no item 3.4 e as medidas foram realizadas no NOA operado nas mesmas condições de pressão descritas no item 3.4.
Adicionou-se 4,0 mL de uma solução de ácido ascórbico (0,19 mol L-1)
e 1,0 mL de uma solução de hidróxido de sódio (1,0 mol L-1) no frasco de
reação do NOA. A solução de ascorbato48,54 de sódio (pH 11) resultante da mistura, termostatizada a 37° C, foi utilizada como meio redutor para a
25
liberação de NO dos grupos S-NO das membranas. A curva de calibração foi feita utilizando-se como padrão S-nitrosoglutationa (GSNO)48. Alíquotas
contendo 0,8 a 200 nmols de GSNO foram injetadas em triplicata na solução de ascorbato a 37° C. As amostras recém S-nitrosadas foram inseridas no frasco de reação contendo ascorbato a 37°C, levando à liberação do NO das membranas. Após as análises, as amostras foram secas em estufa a 60°C por 24 h e pesadas em balança analítica. A área sob a curva gerada pelo equipamento foi integrada e os resultados foram expressos em nmols de NO por massa de membrana seca.
3.5.2 Método fotoquímico
Novamente utilizou-se o NOA para a quantificação de NO nas mesmas condições de pressão descritas no item 3.4 Neste caso, entretanto, posicionaram-se as duas fibras ópticas horizontalmente em relação à amostra (Figura 10). Ao invés de ascorbato, adicionou-se 5 mL de água no frasco de reação do NOA, termostatizado a 37°C. A calibração do equipamento foi feita através da injeção em duplicata de alíquotas contendo 15 a 270 nmols de GSNO com irradiação contínua até total decomposição da GSNO de cada alíquota. Após purgar o meio com N2, inseriram-se as amostras de PVA-SNO
já com as lâmpadas acesas a fim de promover a clivagem homolítica da ligação S-NO e a liberação de NO. O NO liberado foi medido em tempo real até o término da liberação. Após as análises, as amostras foram secas em estufa a 60°C por 24 h e pesadas em balança analítica. A área sob a curva gerada pelo equipamento foi integrada e os resultados foram expressos em nmols de NO por massa de membrana seca.
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3.6 Fluxometria por laser Doppler
Medidas do fluxo microcirculatório sanguíneo local após a aplicação tópica das membranas de PVA-SNO foram realizadas utilizando-se um Fluxômetro de Laser Doppler composto por um monitor de perfusão de dois canais, modelo BLF21D (Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, EUA), com um diodo emissor de luz laser infravermelha (λ= 780 nm, potência óptica de saída < 2mW) e uma sonda Tipo D1. A sonda do equipamento é composta por duas fibras ópticas: uma emite a luz e a outra coleta a luz espalhada.
Esta técnica utiliza um feixe de luz coerente que sofre um deslocamento em sua frequência devido ao Efeito Doppler. O feixe de luz é espalhado por partículas estacionárias e em movimento (principalmente hemácias no sangue) presentes no tecido. Parte da luz refletida é coletada pela fibra óptica coletora e o sinal espectral é processado e transformado em unidades de fluxo volumétrico. Este efeito só aparece, entretanto, quando a luz refletida por partículas estacionárias próximas às partículas em movimento retorna com frequência inalterada55,56. A luz emitida penetra cerca 1,0 a 1,5 mm na pele e
atinge os capilares dérmicos presentes nesta região. A Figura 11 ilustra um corte transversal da pele e um feixe de luz sendo emitido e coletado após ter sido refletido pelas estruturas do tecido.
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Figura 11. Representação do corte transversal da pele mostrando um feixe de laser sendo incidido sobre a pele, atingindo capilares dérmicos e sendo refletido e coletado pela fibra óptica coletora.
Amostras das membranas de PVA-SNO recém nitrosadas conforme descrito no item 3.4 foram fixadas com uma fita adesiva e mantidas durante 4 min sobre a pele do antebraço de um voluntário. Após 4 min, a fita foi parcialmente levantada a amostra de PVA-SNO foi removida e a sonda foi posicionada sobre o local de aplicação da amostra. O fluxo microcirculatório sanguíneo antes e depois da aplicação da membrana de PVA-SNO foi medido
28
nas mesmas unidades arbitrárias. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FCM-Unicamp (parecer No 756.369 de 21/07/2014).
3.7 Estudo da estabilidade do NO nas membranas de
PVA-SNO
Neste estudo buscou-se avaliar a estabilidade da carga de NO de uma membrana de PVA-SNO seca, armazenada em dessecador e protegida da luz em função do tempo. Uma membrana de PVA-SH recém S-nitrosada conforme descrito no item 3.4 foi congelada no freezer por 45 min e, em seguida, seca por liofilização durante 90 h, sendo mantida sempre protegida da luz. Ao término da liofilização, uma amostra de cerca de 3 mg desta membrana foi cortada e encaminhada ao NOA para quantificação da carga de NO pelo método fotoquímico descrito no item 3.5.2. O restante da membrana foi armazenado em um dessecador contendo sílica ativada, protegida da luz e à temperatura ambiente. Durante dias sucessivos outras amostras com massa entre 2 e 4 mg desta membrana foram cortadas e o conteúdo de NO determinado pelo mesmo método. Os resultados foram expressos em nmols de NO por mg de membrana seca em função do tempo.
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A reação de PVA e AMS em meio ácido resulta na formação de ligações éster entre os grupos carboxílicos do AMS e hidroxilas das cadeias de PVA. Após a reação entre AMS e PVA, as cadeias de polímero ficam parcialmente reticuladas através de ligações covalentes. O AMS age, portanto, como um agente reticulante, além de funcionalizar o polímero através da inserção de grupos sulfidrilas (-SH) passíveis de serem posteriormente nitrosados.
Utilizando-se a técnica de espectroscopia no infravermelho por refletância total atenuada buscou-se confirmar a reação de esterificação entre o PVA e o AMS por meio da comparação entre os espectros obtidos da membrana de PVA, do AMS e da membrana de PVA-SH (Figura 12). No espectro do MAS, observa-se uma banda em 1680 cm-1 atribuída ao estiramento C=O de ácidos carboxílicos, que está ausente nos espectros das duas membranas. No espectro da membrana de PVA-SH, nota-se o aparecimento de uma banda em 1720 cm-1, atribuída ao estiramento C=O de
ésteres, ausente no espectro da membrana de PVA puro. O aparecimento desta banda de estiramento C=O de ésteres permite a confirmação da esterificação entre PVA e AMS. A banda referente ao estiramento da ligação S-H situa-se entre 2600 e 2550 cm-1, porém normalmente esta é uma banda fraca. No
espectro do AMS ela aparece com intensidade fraca, porém no espectro da membrana de PVA-SH ela não pôde ser observada.
30
Figura 12. Espectros na região do infravermelho da membrana de PVA, do ácido mercaptosuccínico (AMS) e da membrana de PVA-SH. O aparecimento da banda em 1720 cm-1 referente ao estiramento C=O de ésteres confirma a
31
O processo de inversão de fases leva à formação de membranas com morfologia porosa, que é preservada após secagem por liofilização. Além disso, a liofilização aumenta a reticulação física do material que se dá através da formação de cristalitos entre os grupos hidroxila não-esterificados do PVA que interagem por ligações de hidrogênio20. Como a cristalização é
dependente da proximidade e empacotamento das cadeias, o afastamento que ocorre devido à inserção de AMS entre cadeias a uma distância superior à necessária para que os grupos OH interajam por ligações de hidrogênio, prejudica este processo e altera as propriedades físico-químicas da membrana de PVA-SH em relação ao PVA puro, conforme representado esquematicamente na Figura 13.
32
Figura 13. Esquema representando (A) as interações de hidrogênio no PVA puro e (B) a diminuição das interações de hidrogênio do PVA-SH nas proximidades dos pontos de reticulação, devido ao afastamento entre as cadeias de PVA causado pela esterificação com AMS.
A morfologia das membranas de PVA e PVA-SH foi avaliada através da técnica de microscopia eletrônica de varredura. Visualmente, verifica-se que a membrana de PVA apresenta a estrutura típica de membranas assimétricas, sendo composta por duas camadas: uma camada superior fina e
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transparente e uma camada inferior mais espessa e opaca. Esta camada superior pôde ser descolada mecanicamente da camada inferior, conforme ilustrado no esquema da Figura 14, sem comprometer a integridade destas duas camadas. Para estas membranas foram obtidas micrografias, apresentadas na Figura 15 em ampliações diferentes, das regiões apontadas pelas setas na Figura 14, que indicam as faces de cima das camadas superior e inferior, a seção transversal obtida por fratura criogênica da camada inferior e a face de baixo da camada inferior.
Figura 14. Esquema representando a vista lateral da membrana de PVA mostrando as camadas superior e inferior e as regiões onde foram obtidas as imagens de MEV.
Nas Figuras 15A e B estão apresentadas as micrografias da face de cima da camada superior, fina e transparente. A morfologia desta camada se
34
assemelha à de um filme de PVA preparado por casting, denso e totalmente sem poros. As Figuras 15C e D apresentam as micrografias da face de cima da camada inferior da membrana de PVA contendo poros circulares interconectados em toda sua superfície. As Figuras 15E e F apresentam a morfologia da face de baixo desta mesma camada, apresentando uma superfície irregular e sem poros. Nas Figuras 15G a 15 J, estão apresentadas as micrografias da seção transversal da camada inferior em diferentes ampliações, mostrando um interior contendo poros circulares interconectados em toda sua extensão.
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Figura 15. Micrografias das membranas de PVA mostrando (A, B) a face de cima da camada superior em duas ampliações diferentes, evidenciando a inexistência de poros nesta camada, (C, D) a face de cima da camada inferior em duas ampliações diferentes, mostrando poros circulares interconectados em toda superfície, (E, F) a face de baixo da camada inferior em duas ampliações diferentes, mostrando uma superfície irregular e sem poros e (G - J) a seção transversal em quatro ampliações diferentes, mostrando toda a extensão da membrana, inclusive com a camada superior, contendo poros circulares interconectados. As dimensões indicadas na parte superior das imagens se referem às dimensões das barras de escala.
36
A membrana de PVA-SH, entretanto, não apresenta nenhuma evidência de formação de uma camada superior densa nem de descolamento desta, sendo formada por uma estrutura única contínua, como representado no esquema da Figura 16. A Figura 17 mostra as micrografias das faces de cima e de baixo e da seção transversal por fratura criogênica da membrana de PVA-SH, apontadas pelas setas da Figura 16.
Figura 16. Esquema representando a vista lateral da membrana de PVA-SH mostrando uma única camada e as regiões onde foram obtidas as imagens de MEV.
As Figuras 17A e B mostram duas micrografias de regiões distintas da face de cima de uma mesma membrana, ambas na mesma ampliação. Nota-se que esta face da membrana é composta por um mosaico de regiões fechadas e sem poros, e regiões abertas, com aspecto de fios interconectados. As mesmas morfologias são observadas na face de baixo, como mostrado nas Figuras 17C e D. As Figuras 17E e F, em ampliações diferentes, mostram um panorama
37
geral da fratura, onde se observa poros macroscópicos alongados com eixos principais orientados horizontalmente, de paredes não porosas e superfícies rugosas. Deve-se considerar que a morfologia de poros horizontais pode ser o resultado do colapso da estrutura porosa durante a secagem da amostra. Nas Figuras 17G e H, é possível observar a superfície interna dos poros com maior clareza através de duas micrografias de uma mesma região em ampliações diferentes. Além disso, nas membranas de PVA-SH não se observa a formação e descolamento de uma camada superior, o que provavelmente se deve à reticulação intra e intermolecular que ocorre em toda a extensão deste material, que reticula covalentemente as cadeias poliméricas, impedindo que haja esta separação.
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Figura 17. Micrografias das membranas de PVA-SH mostrando (A, B) a face de cima em duas regiões distintas na mesma ampliação, mostrando regiões fechadas sem poros e regiões abertas com aspectos de fios, (C, D) a face de baixo em duas regiões distintas na mesma ampliação, mostrando uma morfologia semelhante à da face de cima e (E - F) a seção transversal em quatro ampliações diferentes, mostrando poros alongados com eixos principais orientados horizontalmente de paredes não porosas e superfícies rugosas. A Figura 17F mostra um zoom de uma região da Figura 17E, e a Figura 17H mostra um zoom de uma região da Figura 17G. As dimensões indicadas na parte superior das imagens se referem às dimensões das barras de escala.
