Estudo da recuperação e purificação do limoneno-1,2-diol obtido por biotransformação fúngica do limoneno

Faculdade de Engenharia de Alimentos

TIAGO DANIEL MADUREIRA DE MEDEIROS

ESTUDO DA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO LIMONENO-1,2-DIOL OBTIDO POR BIOTRANSFORMAÇÃO FÚNGICA DO LIMONENO

CAMPINAS 2018

ESTUDO DA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO LIMONENO-1,2-DIOL OBTIDO POR BIOTRANSFORMAÇÃO FÚNGICA

Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciência de Alimentos.

Supervisor/Orientador: PROF. DR. JULIANO LEMOS BICAS ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO

DEFENDIDA PELO ALUNO TIAGO DANIEL

MADUREIRA DE MEDEIROS, E

ORIENTADA PELO PROF. DR. JULIANO LEMOS BICAS

CAMPINAS 2018

Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas (Orientador) Faculdade de Engenharia de Alimentos (UNICAMP)

Prof. Dr. Marcus Bruno Soares Forte (Membro Titular) Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP

Prof. Dr. Marcel Otavio Cerri (Membro Titular)

Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia – FCFAR - UNESP

A Ata da Defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.

―Queres de verdade ser santo? - Cumpre o pequeno dever de cada momento; faz o que deves e está no que fazes.‖ (Caminho, 815)

desse tempo e me sustentou em cada manhã, em cada eucaristia.

A minha família em Uberlândia, minha Mãe e meus irmãos Marina e Davi, por serem meu local de origem, meu refúgio e alegria, por serem pacientes e compreensivos com minha ausência e sobretudo por nunca faltarem. A minha família em Brasília, meu Pai, Isabel e meus irmãos Maria Clara, Pedro Henrique e Catarina, por serem também parte de mim, pelo apoio nas dificuldades e suporte para planos futuros.

Ao meu orientador, Professor Dr. Juliano Bicas, pela paciência, apoio e disponibilidade, pelo apoio direto, orientações e ensinamentos e pelo apoio indireto, sendo um exemplo de postura pessoal e profissional.

A FAPESP (2016/21619-7) e ao CNPq (400411/216-4), pelo financiamento do projeto e auxílio na realização desse tempo de formação. A UNICAMP, em especial a FEA, por providenciar as condições necessárias para boa realização desse estudo.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001

A Thaís, por ser uma grande parceira no laboratório, na discussão dos problemas da pesquisa, na realização dos experimentos, enfim, em toda vivência da pesquisa. Ao Adones, Michel e Aline por todos os ensinamentos, principalmente no início do mestrado. A Natália, Marina, Mayra, Marcela, Dayane e todos que tornam os dias, todos os coffee breaks e todo o ambiente do laboratório de Biotecnologia de alimentos, um ambiente tão agradável. Ao Gustavo, Ana Paula, Bruno, Angélica, Alexsandra e demais membros do laboratório de Bioaromas e de Compostos bioativos, pelo auxilio no uso de equipamentos e os ensinamentos compartilhados. A Dalva, Bianca (LAC), Dora, Débora, Nadir, Rose, Bianca (Biblio), Márcia e demais funcionários da FEA. A Marília, Nayara, Esther, Eric, e demais amigos da FEA que tornaram mais agradável a vivência nessa faculdade.

Aos meus amigos de Uberlândia, em especial aos do MUR Uberlândia, que me ensinaram a sonhar, e estimularam em mim o desejo de unir Fé e Razão. Nesse sentido, agradeço também o GOU Beraká, Mayara, Felipe, Fidelis, Jonesmar, Valquíria,

Dênis, Arthur, José Ernesto, Leonardo, Paulo e tantos outros bons amigos do Carmelo e do Centro Cultural, pelo companheirismo, paciência e suporte ao longo desse tempo. Ao Plínio e Rose, Luciana e Fernando, Beth e Marcelo, Dona Mitiê e tantas famílias que me ―adotaram‖ nesse tempo. Aos Padres, Fabiano, JB, Claudiney, Luan, Marcel e tantos outros pelos conselhos e por cada missa.

Ao Vínicius e demais companheiros do ―albergue‖, companheiros nesse segundo ano de Campinas. A todos que porventura posso ter esquecido, mas que estiveram comigo e fizeram parte de todo esse tempo da minha vida, a todos o meu muito obrigado.

isopreno (C5H8). Mono (10 carbonos) e sesquiterpenos (15 carbonos) correspondem às moléculas mais voláteis nessa classe, e estão presentes em plantas, animais e micro-organismos. Estes grupos de terpenos costumam ser encontrados em óleos essenciais como constituintes majoritários. Um exemplo é o R-(+)-limoneno, principal constituinte do óleo da casca de laranja, disponível em grandes quantidades e baixo preço. O limoneno é precursor de vários compostos de alto valor agregado, como o carveol, carvona e álcool perílico. A oxifuncionalização do limoneno pode ainda dar origem a outros compostos como, por exemplo, o limoneno-1,2-diol, cuja rota metabólica de produção em micro-organismos já foi descrita. Porém, essa molécula ainda foi pouco estudada quanto a sua produção, recuperação e potenciais atividades biológicas. A biotransformação de terpenos é uma alternativa interessante para obtenção desses compostos, devido à enantioespecificidade e as condições brandas em que as reações ocorrem. Portanto, o desenvolvimento de processos com maiores rendimentos e de métodos de purificação e separação desses compostos são importantes para viabilizar o uso dos processos biotecnológicos como alternativa para síntese química. Nesse estudo, avaliamos as diferentes operações unitárias que podem ser utilizadas para purificação de limoneno-1,2-diol obtido por biotransformação fúngica. As operações unitárias envolvidas foram: extração líquido-líquido e cromatografia de coluna aberta, foi observada a possibilidade de usar uma extração sequencial com dois diferentes solventes como forma de purificação. Para a extração líquido-líquido, observou-se que o melhor solvente tanto quanto recuperação quanto por seletividade é o acetato de etila, que foi dessa forma escolhido como solvente utilizado nos outros testes. Quanto a cinética, viu-se que o tempo não influencia significativamente na quantidade de limoneno-1,2-diol recuperado, fixando-se 40 segundos como tempo de extração em vórtex para as análises em Cromatógrafo Gasoso. Quanto ao número de extrações, viu-se que duas extrações já garantem uma recuperação de mais de 90% do limoneno-1,2-diol. Além disso, a possibilidade de usar extração sequencial com dois solventes (hexano e acetato de etila) é interessante, permitindo a obtenção de extratos com mais de 95% de pureza de limoneno-1,2-diol em voláteis. Para a etapa de coluna cromatográfica foram testadas três diferentes metodologias, em que foram usados diferentes gradientes de fase móvel, usando hexano, acetato de etila e etanol, intituladas coluna 1 (40 mL Hexano, 60 mL Etanol) , 2 (30 mL Hexano, 10 mL Hexano 1:1 Acetato de Etila, 10 mL Acetato de Etila e 30 mL de Etanol) e 3 (40 mL Hexano, 5 mL Hexano 4:1 Acetato de Etila, 5 mL Acetato de Etila 3:2 Hexano e 20 mL Etanol), sendo o gradiente de eleição descrito na metodologia Coluna 2 considerado o mais apropriado, levando a frações com pureza de até 99% em voláteis, apesar de recuperar aproximadamente 20% do limoneno-1,2-diol submetido ao processo. Portanto, o estudo conseguiu definir um método apropriado de purificação de fácil realização, que poderá ser empregado para obtenção do composto isolado para futuros testes de atividade biológica.

Palavras-chave: Atividade biológica; Colletotrichum; Cromatografia de coluna aberta; Extração com solvente.

ABSTRACT

The terpenes are a group of natural compounds whose structure can be divided in isoprene molecules (C5H8). Monoterpenes and Sesquiterpenes are the more volatile within this group, and they can be found in plants, animal and microrganisms. These classes of terpenes are also the main constituents of Essential Oils. A noticeable example is R-(+)-limonene, the main substance in orange peel oil. Thus, it is disponible in large amounts and low price. Limonene works as a precursor to many different products with a higher market value, e.g carveol, carvone and peryllic alcohol. Besides these examples, other compounds can be produced by limonene’s oxyfunctionalization. For instance, limonene-1,2-diol results from fungic and bacterial metabolization of limonene. However, this compound was not studied enough regarding your production, downstream processing and biological properties. Terpenes biotransformation is an interesting alternative to chemical production of these compounds, as it features enantiospecifity and mild reaction conditions. Nevertheless, several issues as low yields, costly purification processes still represent challenges to a large scale terpenes production by biotechnological processes. In face of all that was mentioned before, this study evaluated some unit operations that can be applied to purify limonene-1,2-diol obtained by fungic biotransformation. The main operations were solvent extraction and column chromatography. The possibility to use two solvents sequential extraction as purification process is described. Regarding the liquid-liqud extraction, the best solvent considering selectivity and recovery percentual is ethyl acetate. Therefore, this solvent was chosen to the other essays. Evaluating the extraction kinetics, the time of extraction did not affect the recovery significantly. Then, the extraction time was set in 40 seconds, refering to the extraction to prepare the sample for GC analysis. The essay to evaluate the best number of extractions showed that two extractions are enough to recover more than 90% of the limonene-1,2-diol in the broth. Another test made was the two solvents sequential extraction (using hexane and ethyl acetate), this alternative is interesting as it allows a purity higher than 95%, considering volatile compounds. Finally, regarding column chromatography, three different methods were tested, using different gradient of mobile phase with hexane, ethyl acetate and ethanol, called Column 1 (40 mL Hexane, 60 mL Ethanol), 2 (30 mL Hexane, 10 mL Hexane 1:1 Ethyl acetate, 10 mL Ethyl acetate and 30 mL de Ethanol) and 3 (40 mL Hexane, 5 mL Hexane 4:1 Ethyl acetate, 5 mL Ethyl acetate 3:2 Hexane and 20 mL Ethanol). The method called Column 2 was considered the most appropriate gradient to elution, as it allows recovering limonene-1,2-diol with more than 99% of purity (GC), but it recover about 20% of limonene-1,2-diol used in the column. Therefore, this study was able to develop a feasible and easily applicable method of purification, it can be used to obtain the compound to be used in future biological essays.

Keywords: Biological activity; Colletotrichum; Column chromatography; Solvent extraction.

CG - Cromatografia Gasosa Diol – Limoneno-1,2-diol Et – Etanol

FID – Flame ionization detector FR - Fator de recuperação FP - Fator de purificação Hex- Hexano

Lim - Limoneno YM – Yeast malt

1. Introdução e Justificativa ... 13 1.1 Objetivos ... 15 1.1.1 Objetivo geral ... 15 1.1.2 Objetivos específicos... 15 2. Revisão Bibliográfica ... 16 2.1 Terpenos ... 16 2.2.1 Limoneno ... 18

2.2 Processos biotecnológicos para a produção de terpenos ... 21

2.2.1 Biotransformação do limoneno ... 22

2.2.2 Limoneno-1,2-diol... 24

2.2.2.1 Produção biotecnológica... 25

2.2.2.2 Propriedades Físico-Químicas ... 28

2.2.2.3 Atividade Biológica ... 28

2.3 Recuperação e purificação de bioprodutos (downstream processing) ... 30

2.3. 1 Clarificação ... 30

2.3.2 Recuperação/Concentração ... 31

2.3.2.1 Extração líquido-líquido ... 32

2.3.2 Purificação ... 33

2.3.2.1 Métodos Cromatográficos ... 34

2.4 Identificação de compostos terpênicos ... 35

3. Material e Métodos ... 38

3.1 Micro-organismo e reagentes ... 38

3.2 Produção de limoneno-1,2-diol por biotransformação fúngica do limoneno ... 38

3.2.1 Pré-cultivo ... 38

3.2.2 Crescimento da Biomassa ... 38

3.2.3 Biotransformação ... 38

3.3 Extração ... 38

3.3.1 Avaliação da clarificação ... 38

3.3.2 Avaliação de diferentes solventes ... 39

3.3.3 Cinética de extração ... 39

3.3.4 Extração sequencial ... 39

3.4.3 Coluna 3 ... 42

3.5 Análises de voláteis por cromatografia gasosa ... 42

3.6 Avaliação Global do Processo ... 43

3.7 Tratamento estatístico ... 44

4. Resultados e Discussão ... 45

4.1 Avaliação da recuperação do limoneno-1,2-diol ... 45

4.1.1 Escolha do solvente de extração ... 45

4.1.2 Efeito da clarificação na recuperação de diol... 48

4.1.3 Efeito do tempo de extração (cinética de extração) ... 50

4.1.4 Efeito da extração sequencial ... 51

4.2 Purificação do limoneno-1,2-diol ... 55

4.2.1 Purificação em coluna aberta ... 55

4.2.3 Avaliação Global do Processo ... 60

5. Considerações Finais ... 62

1. Introdução e Justificativa

A agropecuária e a agroindústria são atividades econômicas de grande importância na economia brasileira, responsáveis por uma parcela considerável das exportações e aproximadamente, 5% do PIB nacional (IBGE, 2017). Dentro desse setor, o cultivo de laranja é uma atividade destacada, visto que o Brasil é o maior produtor mundial de laranja, com uma produção anual de 16 milhões de toneladas, segundo a estimativa da FAO da produção referente ao ano de 2014 (FAO, 2015). Estima-se que 80% dessa produção é processada (CONAB, 2013), o que gera uma grande quantidade de subprodutos, constituído majoritariamente pela casca e polpa. Seguindo a tendência de uma abordagem ambientalmente sustentável, uma diretiva da União Europeia (2008/98/EC) determina que esse subproduto seja submetido à valorização para aproveitamento, ao menos parcial (NEGRO et al., 2016).

A temática do desenvolvimento sustentável e da preservação do ambiente tem tido grande destaque e repercussão nas últimas décadas, levando ao surgimento de novos conceitos, como o de biorrefinarias, e ao incentivo das pesquisas nessa área. As biorrefinarias são sistemas de produção em que a biomassa é aproveitada para obtenção de energia e outros produtos de interesse comercial.

O conceito de química verde vai de encontro às aspirações por processos mais amigáveis em relação ao meio ambiente e que aproveitam os resíduos de processamento de outros produtos. Dentro desse campo, tem se investido em pesquisa, visando otimizar processos, aumentar o valor agregado dos subprodutos e descobrir novas aplicações para compostos que antes não atraíam atenção (AISSOU et al., 2017). Boa parte da pesquisa tem focado também em substituir processos químicos por processos biotecnológicos, isso é, que usam micro-organismos para obtenção dos compostos-alvo (FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017).

No caso do processamento da laranja, subprodutos como a casca de laranja podem ser utilizados para obtenção de biogás e bioetanol por processos fermentativos. Por outro lado, o óleo essencial da casca de laranja é rico em R- (+) -limoneno, um monoterpeno cíclico que por apresentar atividade antimicrobiana, pode prejudicar a etapa de fermentação, tornando necessária a retirada desse composto.

O limoneno pode ser modificado microbiologicamente por diferentes reações, que geram produtos de maior valor agregado, o que propicia divisas a partir de um subproduto abundante e colabora com os anseios por processos ambientalmente sustentáveis.

Dentre os compostos derivados do limoneno, temos o limoneno-1,2-diol, que apesar de ainda não ter sido amplamente estudado quanto às suas propriedades biológicas, que não estão bem determinadas, é um composto promissor, considerando as interessantes propriedades apresentadas por outros compostos estruturalmente similares e derivados do limoneno, como o carveol, carvona, α-terpineol e álcool perílico.

Considerando a importância de se avaliar as potenciais atividades biológicas desse composto, é necessário o desenvolvimento de processos de recuperação e purificação do limoneno-1,2-diol produzido a partir dos processos biotecnológicos já estabelecidos em nosso grupo de pesquisa. Dessa forma, o foco desse trabalho foi estabelecer um processo para recuperar o limoneno-1,2-diol a partir do caldo fermentado, para sua posterior utilização em testes biológicos.

1.1 Objetivos

1.1.1 Objetivo geral

Recuperar e purificar limoneno-1,2-diol obtido pela biotransformação fúngica de limoneno, utilizando diferentes técnicas de recuperação e purificação.

1.1.2 Objetivos específicos

a. Produzir limoneno-1,2-diol pela biotransformação fúngica de limoneno empregando o fungo filamentoso Colletotrichum nymphaeae;

b. Avaliar efeito da clarificação do meio fermentado, utilizando filtração, nas concentrações de limoneno e limoneno-1,2-diol presentes na biomassa e sobrenadante;

c. Testar diferentes solventes para maximizar a extração de limoneno-1,2-diol presente no sobrenadante do meio biotransformado por Colletotrichum

nymphaeae;

d. Avaliar a cinética de extração de limoneno-1,2-diol presente no sobrenadante do meio fermentado, utilizando o solvente previamente selecionado;

e. Avaliar o efeito de extrações sequenciais na recuperação de limoneno-1,2-diol presente no sobrenadante do meio fermentado, empregando diferentes solventes; f. Adaptar um sistema de cromatografia em coluna aberta para separar limoneno-1,2-diol e o limoneno remanescente eventualmente presente no extrato orgânico; g. Concentrar os extratos obtidos por rotaevaporação;

h. Caracterizar os extratos obtidos em termos de componentes voláteis, particularmente limoneno e limoneno-1,2-diol, utilizando cromatografia gasosa acoplada a detector de ionização por chama (FID).

i. Calcular fator de recuperação e fator de purificação para diferentes etapas do processo.

2. Revisão Bibliográfica 2.1 Terpenos

Os compostos oriundos do metabolismo celular podem ser subdivididos em produtos do metabolismo primário ou do metabolismo secundário. No primeiro caso, podemos citar proteínas, ácidos nucléicos e açúcares, que participam no crescimento e reprodução, e outros materiais poliméricos, de alto peso molecular, como lignina, celulose e algumas proteínas que participam da estrutura celular. Já os produtos do metabolismo secundário não estão associados ao crescimento, mas desempenham outras funções celulares, como a defesa contra patógenos. Como exemplos deste caso estão os terpenos, alcaloides, derivados de ácidos graxos, fenilpropanóides, polipeptídeos não-ribossomais e cofatores enzimáticos (ÖZLEM BAHADIR, 2012).

O interesse nos metabólitos secundários tem crescido por conta das diversas propriedades biológicas apresentadas, o que tem atraído à atenção das indústrias farmacêutica, alimentícia e de cosméticos. Dentre os grupos de metabólitos secundários, os terpenos se destacam quanto a sua abundância e diversidade na natureza (AJIKUMAR et al., 2008).

Os terpenos são uma classe de hidrocarbonetos que podem ser decompostos em estruturas de isopreno (C5H8), enquanto que seus derivados que contém outras funções orgânicas, como aldeídos, cetonas e álcoois, são também chamados terpenoides (DUPUY et al., 2011a). Os terpenos são produzidos, majoritariamente, pelo metabolismo secundário de plantas e desempenham importante papel na interação de plantas com o ambiente, servindo, por exemplo, como mecanismo de defesa contra insetos e fitopatógenos (BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; GAÑÁN; BRIGNOLE, 2013).

Além disso, o uso de óleos essenciais ricos em terpenos em aplicações medicinais também data de longo tempo, sendo reconhecidas, entre outras propriedades, a atividade anti-inflamatória, analgésica, anticâncer (FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017). Os terpenos podem ser classificados com base na quantidade de carbonos presentes na molécula, sendo divididos da seguinte forma: monoterpenos (10 carbonos), sesquiterpenos (15 carbonos), diterpenos (20 carbonos), triterpenos (30 carbonos) e tetraterpenos ou carotenos (40 carbonos). Os dois primeiros grupos apresentam maior volatilidade e são encontrados principalmente em óleos essenciais, normalmente sendo responsáveis por mais de 90% da composição, enquanto os outros são encontrados em

resinas e gomas (BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; JEMMALI; CHARTIER; ELFAKIR, 2016). Os monoterpenos por apresentarem insaturações em suas estruturas, em geral, são suscetíveis a modificações por exposição ao calor, luz e oxigênio, o que pode afetar sua qualidade como aromas (GONÇALVES et al., 2017).

Existem duas vias pelas quais os precursores terpênicos são originados: a via do mevalonato e a via do 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP) ou 1-deoxilulose-5-fosfato (DXP) (Figura 1). A via do mevalonato é encontrada em eucariotos (mamíferos, citosol e mitocôndria de plantas e fungos) e a via MEP/DXP é encontrada em eubactérias, algas verdes e plantas superiores. Os produtos dessas vias que servem como precursores para a síntese dos diferentes terpenos são isopentenil pirofosfato (IPP) e o dimetilalilpirofosfato (DMAPP) (AJIKUMAR et al., 2008).

CITOPLASMA - MITOCÔNDRIA CLOROPLASTOS

Via do mevalonato Via do DXP

3x Acetil CoA Gliceraldeido fosfato + piruvato 1-deoxilulose-5-fosfato e metileritritol 4-fosfato HMG - CoA Mevilonina Mevalonato

IPP* C5 IPP* Isopreno

C10 GPP GPP Monoterpenos Sesquiterpenos _{FPP C}15 FPP C20 GGPP Fitol Diterpenos Carotenoides Esqualeno Triterpenos Esteróis C40 C30 Ubiquinona Poliprenóis C5n Plastoquinona

Figura 1- Esquema das principais vias envolvidas na síntese de compostos terpênicos. (Retirada de FELIPE; BICAS, 2017).

2.2.1 Limoneno

O limoneno é um monoterpeno presente como principal constituinte do óleo essencial de cítricos e comercialmente extraído da casca de laranjas, da qual esse composto representa mais de 90% da composição do óleo extraído. Assim, ele é um subproduto abundante derivado do processamento de cítricos (BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009) e um dos compostos voláteis mais abundantes (MARMULLA; HARDER, 2014). Quanto a propriedades físico-químicas, ele é praticamente insolúvel em água, apresentando um valor de solubilidade de 0,015 mmol/L (FICHAN et al., 1999), insolúvel em propileno glicol (PEG), levemente solúvel em glicerol e solúvel em óleos e etanol e seu ponto de ebulição está entre 175ºC e 177ºC (BURDOCK, G. 2010).

Na indústria, o limoneno apresenta diversas aplicações, como, por exemplo, em fragrâncias, óleos essenciais artificiais, produtos de limpeza, tintas e na formulação de solventes (BAJER et al., 2016; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017). O limoneno é um produto considerado GRAS (Generally Recognized as Safe) pela Food and Drug Administration (FDA) e o interesse têm crescido nesse composto devido essas propriedades mencionadas e a possibilidade de usá-lo como substituto para compostos derivados de petróleo em algumas de suas aplicações (AISSOU et al., 2017).

Em seu trabalho, Aissou et al. (2017), avaliaram o uso de limoneno como precursor para outros compostos de interesse industrial, utilizando processos de catalise química, obtendo α-terpinoleno, 3-metil-ciclopentanona e cis-linalool óxido. Além disso, também avaliaram a possibilidade de usar o limoneno como solvente para extração de compostos bioativos como carotenoides, óleos e aromas. Para isso, combinaram o procedimento experimental com técnicas de simulação, usando Hansen

solubility parameters (HSP) e Conductor-like Screening Model for Real Solvents

(COSMO-RS), e concluíram que o limoneno pode ser usado como um substituto de hexano em processos de extração de compostos do óleo essencial.

No óleo da casca de laranja ele está majoritariamente presente na forma do enantiômero R-(+)–limoneno (Figura 2A), enquanto que na terebintina, por exemplo, ele está mais presente na forma S-(–)-limoneno (Figura 2B) (DE CARVALHO; DA FONSECA, 2006). Essas diferenças estruturais impactam nas propriedades de aroma e biológicas apresentadas, além das diferenças nos produtos que podem ser obtidos e nos micro-organismos capazes de metabolizá-lo.

Figura 2 - Formas enantioméricas do monoterpeno limoneno.

Este composto também pode ser alterado por micro-organismos a fim de se obter compostos oxigenados correlatos. Existem diversas vias relatadas pelas quais o limoneno é metabolizado por micro-organismos (Figura 3). Dentre os produtos de suas vias podemos citar vários terpenoides: carveol, carvona, álcool perílico e α-terpineol, que podem ser aplicados na indústria de fragrâncias, aromatizantes, antimicrobianos, solventes e como repelentes de inseto (JONGEDIJK et al., 2016; KUMAR et al., 2017; WANG et al., 2014). Alguns dos principais processos de produção de terpenos via biotecnologia serão descritos posteriormente.

Figura 3 – Esquema das principais vias metabólicas de biotransformação do limoneno. Via 1: O grupo metil substituinte é oxidado a compostos perílicos, Via 2: Formação de diol a partir da dupla ligação entre carbonos 1 e 2. Via 3: Adição de hidroxila ao carbono 6. Via 4: Epoxidação da dupla ligação do isoprenil. Via 5: Adição de hidroxila ao carbono 3. Via 6: Epoxidação da ligação entre carbonos 8 e 9 (MARÓSTICA; PASTORE, 2007). Adaptado de: (BICAS et al., 2008).

2.2 Processos biotecnológicos para a produção de terpenos

A produção microbiana de compostos terpênicos tem crescido nos últimos anos, estimulado pela atual busca de processos mais limpos e obtenção de produtos que tenham maior apelo quanto a sua ―naturalidade‖, além de não dependerem dos efeitos da sazonalidade (FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017). Tal fato acompanha o crescimento da chamada ―Biotecnologia Branca‖ ou ―Biotecnologia Industrial‖, área de estudo que visa à obtenção dos produtos a partir de processos ―limpos‖ e sustentáveis, utilizando biocatalisadores e substratos reaproveitados de outros processos (ABRAHÃO; MOLINA; PASTORE, 2013; BERGER, 2009).

A produção microbiológica de terpenos pode ocorrer tanto por síntese de novo como por biotransformação. A síntese de novo é caracterizada por processos em que o micro-organismo gera compostos complexos a partir de estruturas e precursores simples, enquanto que a biotransformação é o processo pelo qual o micro-organismo converte um composto em outro estruturalmente semelhante, isso é, uma reação química catalisada por enzimas (ou células que as contenham) (BICAS; MOLINA, 2016). Estes processos podem ser realizados em condições brandas, em temperatura ambiente e baixas pressões, tornando o processo mais econômico, já que o gasto de energia é consideravelmente reduzido (ABRAHÃO; MOLINA; PASTORE, 2013).

Alguns processos industrialmente relevantes de produção de terpenos já foram desenvolvidos, para produção de diversos compostos como vanilina, patchouli, farneseno e nootkatona, usando majoritariamente micro-organismos geneticamente modificados, tendência que tem crescido em bioprocessos no geral, por conta do avanço das técnicas de biologia molecular e as condições mais favoráveis de produção utilizando a modificação genética de bactérias, leveduras e fungos já bem estudados (FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017).

Alguns processos biotecnológicos utilizados para produção de compostos de aroma estão descritos na Figura 4. A nootkatona é produzida a partir de valenceno, e para obtenção de ambos compostos, organismos geneticamente modificados podem ser utilizados como Saccharmyces cerevisiae, algumas empresas como Evolva e Isobionics já comercializam esse composto produzido por biotecnologia. Por sua vez, o farneseno, sesquiterpeno aplicável nas indústrias de aromas e combustíveis, é produzido usando S.

cerevisiae geneticamente modificado também, alguns estudos chegando a uma produção

de 170 mg/L desse composto. A empresa Amyris em parceria com a Firmenich produzem um produto rico em patchoulol, um álcool sesquiterpeno, contendo outros

compostos do óleo de patchouli também. Esse composto já foi produzido utilizando S.

cerevisiae geneticamente modificado, bem como Physcomitrella patens, no caso do

último micro-organismo, chegando a uma produção de 1,34 mg/g de peso seco (SALES et al., 2018).

Figura 4 – Exemplos de produção biotecnológica de compostos de aroma por síntese de

novo (linhas tracejadas) e biotransformação (linha contínua), retirado de Sales et al.

(2018)

A seguir, serão enfatizados processos de biotransformação do limoneno, terpeno precursor para muitos terpenoides com diversas aplicações, e objeto de estudo desse trabalho.

2.2.1 Biotransformação do limoneno

A biotransformação consiste no uso de micro-organismos ou enzimas para catalisar reações químicas. Tem-se observado um crescimento das pesquisas nesse campo devido a alguns benefícios, como a sua alta regiosseletividade e enantiosseletividade, as condições brandas em que ocorrem e a obtenção de produtos intitulados ―naturais‖, um apelo de crescente importância nas últimas décadas. A

especificidade química das biotransformações é um fator de considerável importância, visto que diferentes enantiômeros de uma mesma molécula são capazes de interagir de formas diferentes com os sistemas biológicos de forma a gerarem respostas biológicas diferentes (FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017).

O uso de células inteiras de micro-organismos, em relação ao uso de enzimas purificadas, é comparativamente vantajoso. Mesmo que as enzimas tenham como vantagem a facilidade de purificação e uma menor quantidade de subprodutos da reação, o uso de células inteiras normalmente envolve menores custos e é mais simples, no caso de reações que requerem cofatores (ÁGUILA et al., 2008). Os compostos terpênicos são conhecidos por, em geral, apresentarem caráter apolar. Por conta disso, são capazes de difundir através da membrana com facilidade. (WERF et al., 1999).

As reações de oxifuncionalização do limoneno, por exemplo, muitas vezes envolvem enzimas do grupo citocromo P450, presentes em plantas, animais, micro-organismos e que apresentam preferência por compostos lipofílicos, ampla especificidade e necessidade de cofatores (BERGER, 2009), portanto na biotransformação do limoneno, o uso de células inteiras tem sido considerado mais vantajoso, visto que nas células inteiras o cofator pode já estar presente, dispensando a adição deste.

Uma das principais dificuldades quanto à biotransformação de terpenos é a considerável toxicidade dos compostos, como o limoneno, para as células. Para superar essa barreira, diferentes adaptações biológicas e tecnológicas podem ser utilizadas, como sistemas bifásicos ou uso de células em repouso (resting cells) ao invés de células em crescimento logarítmico (WILLRODT et al., 2017).

Considerando as diferentes vias descritas na Figura 3, diversos micro-organismos e processos já foram estudados para obtenção dos diferentes produtos que são conhecidos.

Na via 1, em que há oxidação do grupo metil, três dos intermediários da rota são de interesse industrial: ácido perílico, álcool perílico e aldeído perílico, com maior destaque para o álcool perílico, um dos derivados de limoneno de maior destaque, com alegações de atividade anticâncer para tumores de fígado, mama e pulmões (MARÓSTICA; PASTORE, 2007), testes in vivo e in vitro já foram realizados para esse composto, que pode ser obtido pela biotransformação por leveduras, bactérias e fungos filamentosos, como Penicillium digitatum (ADAMS; DEMYTTENAERE; DE KIMPE, 2003; MARÓSTICA; PASTORE, 2007).

A terceira via é responsável pela produção de dois principais componentes, o carveol e a carvona, que apresentam propriedades de aroma interessantes para sua aplicação na indústria de fragrâncias. Essas substâncias estão presentes também no óleo essencial de várias plantas, por exemplo, o óleo de alcarávia (60% de R-(+)-carvona) e óleo de hortelã (70 a 80% de S-(-)-carvona) (MARÓSTICA; PASTORE, 2007). Os principais produtores descritos desses compostos são fungos filamentosos como P.

digitatum e Pleurotus sapidus (ONKEN; BERGER, 1999).

Já pela reação de epoxidação da ligação dupla da unidade isoprenil, o α-terpineol é produzido, sendo um terpenoide que tem crescido muito em atenção quanto a pesquisas, tanto por suas propriedades de aroma, quanto por possíveis atividades biológicas. É um sólido cristalino, sem cor e opticamente ativo, estando presente na natureza tanto na forma (+), (-) , quanto na mistura racêmica (KHALEEL; TABANCA; BUCHBAUCHER, 2018). Sua biotransformação foi primeiramente descrita em 1969, utilizando Cladosporium sp., o potencial de uso de Penicillium na sua transformação também já é bem conhecido(MARÓSTICA; PASTORE, 2007).

As vias por quais são obtidos isopiperitenol e isopiperitenona, bem como a de epoxidação e produção de limoneno-8,9-epóxido foram menos estudadas, com poucos relatos na literatura (MARÓSTICA; PASTORE, 2007).

Por fim, a via 2, em que há produção de limoneno-1,2-diol, é a de interesse nesse trabalho, e suas características serão descrita de forma mais extensa em sequência.

2.2.2 Limoneno-1,2-diol

O limoneno-1,2-diol é o produto da segunda via pela qual o limoneno é metabolizado (Figura 3), em que há uma epoxidação na dupla ligação entre os carbonos 1 e 2, seguido da formação do diol correspondente.

O limoneno-1,2-diol pode ser encontrado no mel produzido a partir de plantas do gênero Tilia, resultando da hidroxilação do limoneno (BLANK; FISCHER; GROSCH, 1989). Esse composto também é encontrado no extrato aquoso de Pinus

koraiensis (LEE et al., 2017).

A sua síntese química é descrita na literatura por diversas vias, uma delas é como o principal produto da reação heterogênea de limoneno usando substratos minerais como caulinita e sílica à 30% de umidade relativa (LEDERER et al., 2016). Também foi encontrado como um dos principais produtos da oxidação de R-(+)-limoneno, utilizando como catalizadores químicos compósitos preparados pela inclusão

dos sais de potássio de polioxotungstatos em uma estrutura metalorgânica porosa (GRANADEIRO et al., 2013). Outro método é a epoxidação e formação do diol correspondente, por oxidação utilizando peneiras moleculares. Um sistema reacional é feito, por exemplo, utilizando t-butanol como solvente, hopeita como catalizador, à temperatura de 60ºC, durante 18h (SANTA A. et al., 2008).

No entanto, apesar de poder ser sintetizado quimicamente, a produção biotecnológica desperta maior interesse e tem crescido em destaque, por isso, a seguir serão descritos diferentes processos para síntese de limoneno-1,2-diol por via biotecnológica.

2.2.2.1 Produção biotecnológica

A conversão do limoneno em limoneno-1,2-diol já foi descrita para alguns micro-organismos, como a biotransformação fúngica utilizando Fusarium oxysporum 152B (MOLINA et al., 2015), Corynespora cassiicola (DM 62475) e Diplodia

gossypina (ATCC 10936) (ABRAHAM et al., 1985), e bacteriana com Pseudomonas fluorescens (BICAS et al., 2008a). Tal conversão, aparentemente, está envolvida no

metabolismo energético de F. oxysporum 152b (MOLINA et al., 2015), P. fluorescens (BICAS et al., 2008a) e micro-organismos do genêro Colletotrichum (SALES et al., 2017) quando limoneno é utilizado como única fonte de carbono e energia. Alguns detalhes de tais processos são apresentados abaixo.

Em processos de biotransformação de terpenos, alguns desafios para recuperação do produto são: a baixa quantidade do acúmulo de produto, a baixa solubilidade em água de alguns substratos e produtos, além de sua instabilidade química e volatilidade. Para a viabilização do uso desses processos, a otimização das diferentes etapas do processo, a redução do número de etapas, além do uso de ferramentas no processo ou na manipulação dos micro-organismos para aumentar os rendimentos de produção e diminuir o custo são necessários (BICAS; MOLINA, 2016).

Em seu estudo, Abraham et al. (1985) partiram de 1300 g de (R) -(+)-limoneno (20 g/L) e obtiveram 900 g de (1S,2S)–limoneno-1,2-diol com pequenas quantidades de (1R,2R)-limoneno-1,2-diol a partir de uma batelada com 70 L, utilizando biotransformação fúngica com Corynespora casiicola (DSM 62475).

No caso da bactéria Rhodococcus erythropolis, esta conversão ocorre em duas etapas: na primeira há uma epoxidação da ligação dupla 1,2 por meio da ação da enzima limoneno-1,2-monoxigenase, que é dependente de FAD e NADH e apresenta baixa

atividade em relação à enzima que catalisa a segunda etapa da via, ou seja, aquela em que há hidrólise do limoneno-1,2-epóxido pela ação da enzima limoneno-1,2-epóxido hidrolase, que se soma à hidrólise espontânea desse composto, cuja estabilidade é baixa (Figura 5) (WERF et al., 1999).

Figura 5 – Via metabólica de conversão de limoneno a limoneno-1,2-diol em R.

erythropolis, conforme descrito em Van der Werf et al (1999).

Os autores deste estudo purificaram a enzima limoneno-1,2-epóxido hidrolase de R. erythropolis e notaram que essa enzima tem massa molecular de ~17kDa, apresenta maior atividade catalítica para o enantiômero (+)-limoneno-1,2-epóxido, em comparação ao enantiômero (–), além de ser uma enzima intracelular que não requer cofatores (Figura 5) (VAN DER WERF et al., 1999). A baixa estabilidade do composto limoneno-1,2-epóxido aliada à maior atividade da segunda enzima da via, cerca de 170 vezes maior, em relação à primeira leva ao acúmulo de limoneno-1,2-diol no meio fermentado. Vias semelhantes a esta foram também descritas para F. oxysporum (MOLINA et al., 2015) e Sphinghobium sp. (BICAS et al., 2008).

Com base na avaliação do crescimento fúngico, e no crescimento de fungos mutantes cuja produção de certas enzimas foram suprimidas, Wang et al. (2014) propuseram um mecanismo de degradação de limoneno semelhante ao descrito por Wan der Werf et al. (1999) para R. erythropolis. Porém, as enzimas envolvidas para essa via metabólica em Grossporia clavigera são diferentes das utilizadas pela bactéria. Uma monoxigenase que usa FAD como cofator pode ser responsável pela epoxidação, outra possibilidade é que enzimas como do citocromo P450 sugerido para bactérias sejam responsáveis. Quanto a segunda etapa, diferentemente de R. erythropolis que tem uma uma epóxido hidrolase única, G. clavigera possui uma epóxido hidrolase clássica cuja produção foi fortemente estimulada quando limoneno foi o único substrato. No caso do

mutante que teve a produção dessa enzima suprimida, ainda houve crescimento, porém em menor intensidade que a cepa selvagem.

A avaliação da utilidade de micro-organismos fitopatógenos para processos de biotransformação é interessante para desenvolvimento de processos de produção de terpenoides, já que esses normalmente têm capacidade de crescimento utilizando terpenos como fontes de carbono, contornando sua toxicidade (MOLINA et al., 2015).

Avaliando os metabólitos produzidos por Grosmannia clavigera, em meio contendo malte (1%) (MEA) e nitrogênio de levedura (YNB), em ambos adicionando o limoneno, Wang et al. (2014) observaram a produção de limoneno-1,2-diol como principal composto quando cultivado em YNB, sendo que no MEA ele quase não foi detectado. Fora isso, o limoneno-1,2-diol foi um dos intermediários menos tóxicos, não tendo praticamente nenhum efeito inibitório no crescimento fúngico, especialmente se comparado aos outros intermediários (WANG et al., 2014).

A produção de limoneno-1,2-diol por biotransformação fúngica utilizando

Colletotrichum nymphaeae foi descrita por Sales et al. (2017), que obtiveram

inicialmente uma produção entre 3.31 e 4.01 g/L de limoneno-1,2-diol dependendo do substrato utilizado (R-(+)-limoneno, S-(-)-limoneno e terpeno cítrico). Estudos subsequentes chegaram, após processo de otimização, a uma produção ótima de quase 8 g/L, utilizando o mesmo micro-organismo em biorreator de 2,5 L (SALES, 2018).

Com base nos resultados obtidos por Sales et al. (2017), o sistema enzimático responsável pela conversão de limoneno no respectivo 1,2-diol em C. nymphaeae não é o mesmo daquele descrito para R. erythropolis. No genoma de ambas as espécies de

Colletotrichum estudadas (C. acutatum e C. nymphaeae) foram encontradas sequências

de proteínas que apresentam similaridade aquelas descritas para G. clavigera, único fungo para qual as enzimas responsáveis por essa via metabólica foram descritas até o momento. No entanto, essa hipótese ainda deverá ser verificada com validação dessas enzimas descritas (SALES et al., 2017).

Apesar da existência de trabalhos que descreveram e otimizaram a produção de limoneno-1,2-diol por biotransformação fúngica, não se encontra na literatura estudos focados no desenvolvimento do processo para recuperação e purificação desse composto de forma a obter o composto puro para avaliação de atividade biológica. Para início de testes e desenvolvimento desses processos, é necessário que se conheçam as

propriedades físico-químicas do produto de interesse, por isso a seguir serão apresentadas as principais propriedades físico-químicas do limoneno-1,2-diol.

2.2.2.2 Propriedades Físico-Químicas

Em termos de propriedades físico-químicas, o limoneno-1,2-diol não é um composto muito volátil, é levemente solúvel em água e solúvel em etanol, apresenta ponto de fusão de 74ºC e ebulição a 241ºC (BURDOCK, G. 2010).

Não se encontra na literatura, até onde conseguimos chegar, descrição de valores exatos de solubilidade, porém é conhecida a baixa solubilidade em água, como descrito em De Carvalho; Van Keulen; Da Fonseca, (2000). Pode-se também supor que sua solubilidade em água seja maior do que aquela de outros monoterpenos com apenas uma função álcool em sua estrutura, como carveol (19 mmol/L), linalool (10,11 mmol/L) e α-terpineol (12,25 mmol/L) (FICHAN et al., 1999). O coeficiente de partição também não é descrito, porém na plataforma química Pubchem, o LogP do limoneno-1,2-diol é descrito como 1,5 e sua solubilidade é estimada como 694,7 mg/L ( limonene glycol, 2018).

Este composto possui um aroma mentolado e pode ser aplicado como aromatizante em bebidas alcóolicas e não-alcóolicas, gomas de mascar, gelatinas e pudins (MOLINA et al., 2015).

2.2.2.3 Atividade Biológica

Até o presente momento foram encontrados poucos relatos de propriedades biológicas associadas ao limoneno-1,2-diol. No entanto, dadas às semelhanças químicas, é razoável supor que este composto possa ter atividades biológicas semelhantes às já atribuídas a outros monoterpenos hidroxilados como, por exemplo, atividade antioxidante, já relatada para α-terpineol e álcool perílico (CROWELL et al., 1994a), e atividade antiproliferativa, já descrita para álcool perílico, ácido perilíco, carveol e α-terpineol (BICAS et al., 2011; GELB et al., 1995; WILLRODT et al., 2017), não só atuando na prevenção da formação de tumores, como também na regressão de tumores já estabelecidos (BICAS et al., 2008b; KHALEEL; TABANCA; BUCHBAUCHER, 2018). Por este motivo, o estudo dessas propriedades pode ser importante para valorizar e aumentar o interesse por tal composto. Nesse contexto,

novos processos de obtenção, recuperação e purificação podem se tornar muito úteis, para posterior avaliação de sua atividade biológica.

Lee et al., (2017) observaram atividade antitumoral dos resíduos de processamento de sementes de Pinus koraiensis, e entre os compostos presentes no extrato aquoso desses resíduos está o monoterpeno (+)-(1S,2S,4R)-limoneno-1,2-diol, indicando uma possível atividade antiproliferativa desse composto em linhagens tumorais de células de adenocarcinoma em pulmão. O mecanismo provável para o efeito do extrato aquoso observado foi a indução de apoptose por um mecanismo dependente de caspase-3.

Por sua vez, Schmidt & Guen (2017), ao avaliarem o metabolismo de R-(+)-limoneno ingerido por seres humanos, encontraram 1S,2S,4R-R-(+)-limoneno-1,2-diol como um dos principais metabólitos, não encontrando outro enântiomero. Este metabólito apresenta um pico de concentração no sangue duas horas após exposição ao limoneno e uma meia-vida curta, sua eliminação sendo dada majoritariamente na forma conjugada. A presença de limoneno-1,2-diol como um dos metabólitos produzidos por biotransformação após exposição dos pacientes a limoneno também foi relatada por Vigushin et al., (1998), que apontam os metabólitos como parte das respostas biológicas observadas, já que o limoneno é metabolizado extensivamente.

Um dos possíveis mecanismos para essa atividade é por inibição da isoprenilação de proteínas celulares, inibindo subsequentemente o crescimento do número de células. Além disso, os monoterpenos por apresentarem atividade inibitória em doses que não se mostraram tóxicas aos organismos, despertam interesse como possíveis agentes terapêuticos para prevenção e tratamento de tumores (CROWELL et al., 1994a, 1994b).

Alguns monoterpenos se destacam por atividades antimicrobianas ou contra insetos. O limoneno-1,2-diol, porém, não apresenta atividade tóxica significativa contra insetos e micro-organismos no geral, sendo por vezes encontrado como resultado de metabolização para contornar efeitos tóxicos, como no caso das larvas de Trichoplusia

2.3 Recuperação e purificação de bioprodutos (downstream processing)

O downstream processing abarca as etapas de clarificação, recuperação, purificação e acondicionamento do produto obtido por bioprocessos (STRUBE et al., 2011). As etapas downstream muitas vezes são responsáveis pela maior parte dos custos do processo, e podem, portanto, tornar o processo inviável, pois muitos compostos são produzidos em baixos rendimentos, o que dificulta a recuperação destes em quantidade suficiente (JONGEDIJK et al., 2016; SERRANO-CARREÓN, 2003). Para que os produtos obtidos por biotecnologia possam então concorrer com os produtos obtidos quimicamente é necessário que haja o desenvolvimento de processos de recuperação e purificação com menor custo (KURZROCK; WEUSTER-BOTZ, 2011)

Em downstream processing é comum a divisão do processo em etapas, nomeadamente: clarificação ou separação biomassa-sobrenadante, concentração ou purificação primária, purificação secundária, polimento e acondicionamento (STRUBE et al., 2011). Essas etapas serão descritas de forma mais completa a seguir, focando especialmente nos terpenos.

2.3.1 Clarificação

A clarificação é assim chamada, por ser a etapa em que a biomassa é separada do sobrenadante, reduzindo a turbidez do meio. Além da biomassa, outros sólidos insolúveis são retirados, realizando uma purificação prévia do meio fermentado. Existem duas principais técnicas para essa etapa: centrifugação e filtração (PESSOA JR, 2005).

A centrifugação tem como princípio a separação por diferenças na densidade entre as partes que compõem o sistema, exercendo uma força que levará à precipitação dos sólidos insolúveis presentes no meio. Em escala industrial é a técnica mais utilizada por ser de mais fácil aplicação e menor custo.

A filtração, por sua vez, utiliza a diferença de tamanho entre as partículas que compõem o sistema, e é mais frequentemente utilizada em escala laboratorial. O escalonamento para escala industrial é mais complexo, e por isso essa técnica é menos utilizada em larga escala. Os principais métodos de filtração são a filtração convencional e com vácuo. A filtração convencional pode ser feita utilizando filtros de placa, filtros convencionais fechados e filtração tangencial (útil para pequenos volumes de suspensões). Para grandes volumes de suspensões microbianas, é comum o uso de filtro rotativo a vácuo (FRV) (PESSOA JR., 2005)

Após a separação dos sólidos insolúveis e do sobrenadante, é importante saber se o produto de interesse é intracelular ou extracelular. Se for extracelular, o composto alvo estará majoritariamente diluído no sobrenadante, e dessa forma a biomassa pode ser descartada, na maioria das vezes. Por sua vez, se o composto for intracelular, a biomassa é a parte a ser utilizada, e terá que ser submetida a procedimentos de rompimento celular, que podem ser mecânicos, físicos ou químicos, como por exemplo sonicação, ultrassom, moinho de bolas, prensa, calor, entre outros (STRUBE et al., 2011).

2.3.2 Recuperação/Concentração

Como citado anteriormente, um dos principais desafios da produção por biotecnologia são as pequenas concentrações de produto comumente observadas nos meios fermentados. Adicionalmente, os grandes volumes dificultam o manuseio e transporte do meio fermentado e sua subsequente purificação, que ainda é amplamente feita de modo off-line (não integrado ao processo de produção) (SERRANO-CARREÓN, 2003).

Nesse sentido, é importante retirar o composto alvo do meio de cultura, visto que o composto mais abundante, e primeiro obstáculo da purificação, é a água e, de preferência, diminuir o volume com que se trabalha facilita a execução das etapas subsequentes, diminuindo custo do processo (HECKE; KAUR; WEVER, 2014).

Para a extração de compostos terpênicos de material derivado de plantas, podem ser utilizados diversos métodos como destilação a vapor, extração com solventes, extração com fluido supercrítico, microextração com fase sólida e extração assistida por micro-ondas (FOJTOVÁ; LOJKOVÁ; KUBÁŇ, 2008). A extração com fluido supercrítico é uma das que mais tem atraído a atenção ultimamente, pela alta capacidade do solvente, e sua seletividade, além de ser uma técnica mais amigável ambientalmente (WASEEM; LOW, 2015).

Outras técnicas que podem ser utilizadas são ultrafitração e precipitação, em se tratando da recuperação dos compostos terpênicos presentes em meios fermentados. Porém, apesar da pesquisa e desenvolvimento de novas tecnologias para recuperação de compostos, que podem ser aplicadas a terpenos, a principal técnica empregada ainda é a extração líquido-líquido ou extração com solvente orgânico, que será abordada subsequentemente.

2.3.2.1 Extração líquido-líquido

A operação unitária mais comumente empregada para recuperação dos compostos terpênicos é a extração líquido-líquido, utilizando solvente orgânico. O uso dessa técnica já é bem estabelecido para a obtenção de compostos de aroma e fragrâncias do óleo essencial de plantas e apresenta baixo custo e facilidade de operação (STARMANS; NIJHUIS, 1996). A extração de compostos terpênicos pode ser feita por diferentes solventes distribuídos ao longo do gradiente de polaridade, devido à diversidade estrutural e de grupos funcionais encontrada dentro dos compostos dessa classe.

No caso de extração de óleos essenciais, em geral, essa é feita utilizando solventes apolares, como éter de petróleo, devido ao caráter hidrofóbico da maior parte dos compostos constituintes (ÖZLEM BAHADIR, 2012). A extração total do material utilizando solventes polares, como acetona, etanol e metanol aquoso, seguida de re-extração com acetato de etila, clorofórmio e hexano também é uma boa estratégia para extração de terpenoides e esteróis (ÖZLEM BAHADIR, 2012).

Dentre os compostos utilizados para extração de compostos terpênicos estão: éter etílico e clorofórmio, utilizados principalmente para extração de lactonas de sesquiterpenos, diterpenos, esteróis e triterpenoides de menor polaridade. Acetato de etila e acetona têm sido utilizados para extrair diterpenoides oxigenados, esteróis e triterpenoides. Etanol, metanol e água são utilizados com triterpenoides altamente oxigenados e polares, e com glicosídeos de esterois (ÖZLEM BAHADIR, 2012).

Para monoterpenos, objeto desse estudo, bem como para sesquiterpenoides, quando presentes em óleo essencial, o principal procedimento para sua obtenção é a destilação com vapor para extração dos óleos essenciais. A extração com solventes orgânicos não-polares, como éter de petróleo, éter etílico e hexano, também é eficaz (ÖZLEM BAHADIR, 2012). Já em estudos de biotransformação de monoterpenos, é mais comum o uso de acetato de etila como solvente orgânico na extração líquido-líquido (DE CARVALHO; VAN KEULEN; DA FONSECA, 2000; LI et al., 2006; MARÓSTICA JR et al., 2009; BICAS et al., 2010; MOLINA et al., 2015).

No caso dos produtos dos processos de biotransformação do limoneno, sugere-se que a extração com solvente orgânico possa sugere-ser feita sugere-sem a sugere-separação da prévia biomassa, pois a maior parte do limoneno se concentra junto a biomassa, bem como parte dos produtos formados, apesar desses se concentrarem majoritariamente no meio de cultura (ONKEN; BERGER, 1999). A decisão quanto ao uso ou não de ambas as

partes, no entanto, vai depender da avaliação das condições específicas de cada processo.

Molina et al. (2015) obtiveram uma eficiência de extração de 42,2% de limoneno-1,2-diol obtido por biotransformação de S-(–)-limoneno, quando utilizaram extração com acetato de etila na proporção de uma parte de solvente para cada parte de meio de cultura fermentado com agitação em vórtex por 40s.

Bier et al. (2016) utilizaram uma metodologia de extração adaptada de Shashireka et al. (2008), usando uma solução de diclorometano/n-pentano (1:1) na proporção 2:1 em relação ao meio fermentado, para recuperação dos metabólitos carveol, carvona, limoneno-1,2-diol e α-terpineol, sendo o limoneno-1,2-diol o composto obtido em maior quantidade.

Harman-Ware et al. (2016) avaliaram o efeito de quatro diferentes solventes para a extração de compostos do pinheiro: hexano, hexano:acetona (1:1, v/v), hexano:dietil éter (1:1, v/v) e hexano:acetato de etila (1:1, v/v), avaliaram também o efeito de diferentes temperaturas e tempos de extração, e viram que a condição ótima foi utilizar solução hexano:acetona (1:1), a 22ºC por 1 hora, considerando os mono-, sesqui-, di e triterpenoides presentes. Os monoterpenoides presentes foram α-pineno, β-pineno, camfeno e 3-careno.

Em se tratando de extração com solventes, vários parâmetros são importantes na escolha do melhor processo, como o solvente utilizado, sua seletividade, o tempo de extração, a quantidade de extrações necessárias para maior recuperação. Além disso, o solvente tem que ser imiscível, e deve-se levar em conta sua toxicidade, o coeficiente de partição, densidade e estabilidade (UDACHAN; SAHOO, 2014). O solvente ―ideal‖ seria de baixo custo, não-tóxico, biocompatível, apresentar completa imiscibilidade com a fase aquosa, ser altamente seletivo e permitir uma fácil recuperação do produto (KIM; IANNOTTI; BAJPAI, 1999).

2.3.2 Purificação

A purificação, que também pode ser designada em outras classificações de

downstream processing como purificação de alta resolução, tem como objetivo separar

o composto-alvo de compostos cujas propriedades são semelhantes, como a estrutura e a polaridade. As técnicas mais amplamente utilizadas são as de cromatografia, porém outros métodos podem ser usados, como a cristalização.

2.3.2.1 Métodos Cromatográficos

A cromatografia é uma técnica de separação de componentes com base em propriedades físico-químicas. Um componente particiona entre duas fases que estão em contato, uma destas se mantém estacionária, enquanto a outra é móvel. As diferentes interações entre os componentes e a fase estacionária levam os componentes da amostra a migrarem de formar diferencial pelo sistema (COLLINS, 2006)

Para fins preparativos, a Cromatografia de Camada Delgada e a Cromatografia de Coluna Aberta são métodos simples e efetivos, em se tratando de purificação de monoterpenos (ÖZLEM BAHADIR, 2012). As fases estacionárias que podem ser utilizadas são diversas, tais como a sílica-gel, alumina, celulose, dextranas e poliamida. Dentre esses, o mais amplamente utilizado para compostos de baixa e média polaridade é a sílica-gel. A diferenciação enantiomérica de compostos quirais pode ser feita utilizando uma fase estacionária quiral, como a ciclodextrina, por exemplo (BERGER, 2009).

Wang et al. (2015) extraíram e purificaram, a partir do óleo essencial de Litsea

cubeba, R-(+)-limoneno, citral, α-pineno, β-pineno e linalool, utilizando uma

cromatografia de coluna aberta com sílica-gel e eluíram com uma mistura de solventes: inicalmente com hexano, passando por uma solução mista de hexano e acetato de etila e, por fim, acetona.

Madyastha e Renganathan. (1984) isolaram α-terpineol utilizando uma cromatografia em coluna aberta, utilizando sílica-gel como fase estacionária e uma solução 10% de acetato de etila em hexano como fase móvel, para a purificação dos outros terpenoides utilizaram como fase móvel soluções que variaram de 3-15% de acetato de etila em hexano, obtendo os terpenoides com graus de pureza maiores que 99,5%. Essa mesma metodologia foi adaptada para separação de limoneno e α-terpineol em estudos em nosso grupo de pesquisa (ainda não publicados).

O limoneno e o limoneno-1,2-diol apresentam diferentes coeficientes de partição em água, sendo que o limoneno apresenta forte caráter hidrofóbico, e o limoneno-1,2-diol apresenta tendência a se concentrar mais na fase aquosa, quando o solvente orgânico é bastante apolar (MOLINA et al., 2015; NEGRO et al., 2016). Dada esta diferença, supõe-se que a separação dos dois em coluna com sílica gel seja relativamente simples e tenha elevada resolução.

De Carvalho et al. (2000) usaram essa diferença na partição para a purificação de limoneno-1,2-diol. Eles desenvolveram um método para separar limoneno-1,2-diol

de limoneno-1,2-epóxido com base na partição deles em um sistema bifásico, utilizando uma extração líquido-líquido, seguida de uma cromatografia com sílica-gel e, como fase móvel, primeiro uma solução 40% de acetona em água para eluição do limoneno-1,2-diol, seguida de acetona 99% para retirada do epóxido. Após rotaevaporação da solução de acetona 40%, o diol permaneceu na solução aquosa e foi submetido a outra extração líquido-líquido com acetato de etila para posterior recuperação do composto utilizando rotaevaporação.

Em outro exemplo, Pinheiro e Marsaioli (2007) avaliaram a biotransformação de (R)-(+)-limoneno por Trichosporum cutaneum CCT 1903 e obtiveram (+)-(4R)-p-1-ment-1-ene-8,9-diol e (R)-(+)-limoneno-1,2-diol, que foram separados por cromatografia utilizando sílica-gel como fase estacionária e uma mistura de hexano:acetato de etila, na proporção 9:1, seguida da proporção 1:1, como fase móvel.

2.4 Identificação de compostos terpênicos

Como citado anteriormente, os monoterpenos são compostos voláteis, em sua maior parte. Portanto, a técnica de Cromatografia Gasosa é a mais frequentemente utilizada para sua detecção em amostras e identificação. O equipamento de Cromatografia Gasosa (GC) é acoplado a um detector, sendo os mais comuns para monoterpenos, o Detector de Ionização de Chama (FID) e a Espectrometria de Massas (MS) (QIU; SMUTS; SCHUG, 2017).

Tanto o GC-FID quanto o GC-MS podem atuar de forma complementar trazendo diferentes informações. O GC-FID permite avaliar as diferentes faixas de concentração de diferentes compostos da amostra, porém é menos informativo quanto à estrutura e à identificação dos compostos da amostra, pode se usar comparação do tempo de retenção da amostra com tempo de retenção do composto que se deseja determinar (WASEEM; LOW, 2015).

Por sua vez, o uso de GC-MS é desejável para identificação da estrutura, sendo bastante útil para avaliação dos compostos voláteis presentes em diferentes matérias-primas, ele é capaz de identificar com mais clareza picos que se sobrepõem, fornecer informações estruturais do composto, especialmente para aqueles que não se tem padrão (QIU; SMUTS; SCHUG, 2017) (WASEEM; LOW, 2015).

Outra metodologia que pode ser usada para a determinação de compostos voláteis, sem uso de solventes orgânicos, é a técnica de SPME (Solid Phase

pode ser usado para adsorver os compostos de interesse da amostra e posteriormente dessorvê-los no injetor do equipamento, utilizando alta temperatura. Para terpenos, esse método é aplicável já que eles aderem fortemente as substâncias que compõem o revestimento (BAJER et al., 2016).

Considerando as diferentes atividades biológicas observadas para diferentes enântiomeros do mesmo composto, é importante determinar a configuração absoluta. Uma das metodologias que podem ser empregadas para esse fim é o GC-MS, utilizando coluna quiral, e dessa forma comparar o tempo de retenção encontrado com o do padrão previamente conhecido (BERGER, 2009; HE; QIAN; QIAN, 2018; VANEK; VALTEROVA; VAISAR, 1999).

Wan der Werf et al. 1999, obtiveram em seu processo de produção três diferentes diasteroisômeros de limoneno-1,2-diol: (1R,2R,4S) -, (1S,2S,4R) - e (1R,2S,4S)-limoneno-1,2-diol. Para determinar sua configuração absoluta, os autores empregaram a técnica de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Espectrometria de Massas, Cromatografia Gasosa com coluna quiral e a atividade óptica específica. Combinando todos os resultados eles foram capazes de diferenciar os compostos quanto a configuração absoluta, já que os resultados de RMN e massas eram os mesmos, os resultados foram comparados com o composto puro padrão, conforme pode ser visto na Tabela 1.

Tabela 1. Dados de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrometria de Massa (MS) de limoneno-1,2-diol. Adaptado de Werf et al., (1999)

Composto Técnica analítica Dados

(1S,2S,4R)-Limoneno-1,2-diol MS m/z 170[M*J(1), 152(19), 137(13),123(7), 108 (30), 93 (24), 82 (25), 71 (100), 58 (31), 43 (92) ¹H RMN 1,23 (s, 3H), 1,70 (s, 3H), 1,4-2,0 (m, 5H), 2,1-2,3 (m, 1H), 3,61 (t, J = 2,9 Hz, 1Heq), 4,70 (s, 2H) ¹³C RMN 21,1 (q), 26,2 (t),26,5 (q), 33,7 (t), 34,0 (t), 37,5 (d), 71,4 (s), 73,9 (d), 109,0 (t), 149,3(s) [α] 20 D +41,8º (c= 1,0, acetona) GC Quiral rt = 16,25 (140ºC), rt = 38,42 (120ºC) (1R,2R,4S)-Limoneno-1,2-diol [α] 20D -38,5º (c = 1,2 acetona) GC Quiral rt = 16,11(140ºC) rt = 38,06 (120ºC) (1R,2S,4S)-Limoneno-1,2-diol MS m/z 170 [M+] (1), 152 (15), 137 (14), 126 (12), 108 (48), 93 (32), 81 (30), 71 (100), 58 (23),43 (56)

3. Material e Métodos

3.1 Micro-organismo e reagentes

A cepa do micro-organismo Colletotrichum nymphaeae CBMAI 0864 foi gentilmente cedida pelo Coleção Brasileira de Micro-organismos Ambientais e Industriais (www.cpqba.unicamp.br/colecoes/cbmai.html). Os solventes: acetato de etila, clorofórmio, hexano, diclorometano, butanol e etanol utilizados foram de grau analítico. Os padrões limoneno (98% de pureza em CG, densidade = 0,842 g/mL) e limoneno-1,2-diol (97% de pureza em CG) foram adquiridos da empresa Sigma Aldrich.

3.2 Produção de limoneno-1,2-diol por biotransformação fúngica do limoneno

3.2.1 Pré-cultivo

O micro-organismo C. nymphae foi previamente cultivado em placas de Petri, contendo meio YM (1% glicose, 0,5 % peptona, 0,3 % extrato de levedura e 0,3% extrato de malte), durante 72 horas em estufa a 30ºC.

3.2.2 Crescimento da Biomassa

O inóculo para crescimento em meio de cultura líquido foi feito com a transferência de uma fração do ágar (aproximadamente 1cm²) contendo o micro-organismo (vide 3.2.1). Este frasco foi incubado em shaker por 72 horas, à temperatura de 30ºC e agitação de 150 rpm (MOLINA et al., 2015).

3.2.3 Biotransformação

A biomassa anteriormente obtida (item 3.2.2) foi filtrada a vácuo em Funil de Buchner e ressuspendida em tampão fosfato 20µM e pH 7,0. O R-(+)-limoneno foi adicionado ao meio na concentração 2,0% (v/v) e o frasco foi incubado em shaker a 27º C e 200 rpm por 192 horas (SALES et al., 2017).

3.3 Extração

3.3.1 Avaliação da clarificação

Para avaliar a distribuição de limoneno-1,2-diol entre biomassa e sobrenadante foram avaliadas as concentrações de limoneno e de limoneno-1,2-diol na fração acetoetílica resultante da extração em triplicata de amostras do meio antes e após a filtração, e da biomassa. A filtração foi feita à vácuo usando Funil de Buchner, papel de

filtro, partindo de um volume de 50 mL, do qual foram retiradas alíquotas de 3 mL, já a biomassa foi pesada e dividida em amostras de 0,5 g para a extração.

3.3.2 Avaliação de diferentes solventes

Foi avaliado o efeito do uso de solventes de diferentes polaridades (acetato de etila, diclorometano, hexano, clorofórmio e butanol) na recuperação do composto de interesse no sobrenadante (determinada conforme item 3.5). Para isso foram feitas extrações em triplicatas, utilizando a proporção 1:1 (v/v) solvente/meio.

Após avaliação, concluiu-se que o melhor solvente para recuperação é o acetato de etila, sendo este escolhido como solvente a ser utilizado nas análises subsequentes.

3.3.3 Cinética de extração

A cinética de extração foi avaliada pela realização, em triplicata, da extração com acetato de etila em diferentes intervalos, a partir de uma mesma matriz (mesma concentração de compostos terpênicos). As extrações foram realizadas em tubo Falcon, utilizando uma alíquota de 3 mL de amostra, o mesmo volume de solvente (acetato de etila) e agitação em vórtex na velocidade máxima, durante os seguintes tempos: 20, 40, 60, 120, 240 e 480 segundos. Também se avaliou a extração em shaker (Innova 4335, New Brunswick Scientific), sob agitação (200 rpm) e temperatura (25ºC) controladas nos pontos de 5, 10 e 15 minutos. Cada amostra foi avaliada quanto à quantidade de limoneno-1,2-diol recuperado, conforme item 3.5.

3.3.4 Extração sequencial

Para avaliar o efeito de extração sequencial na quantidade de limoneno-1,2-diol recuperada, o meio fermentado foi extraído em vórtex por 60 segundos, conforme descrito em 3.3.3. Foram empregados ciclos sequenciais de extração utilizando apenas um solvente (acetato de etila ou hexano) ou uma combinação deles (dois ciclos de extração com hexano seguido de dois ciclos de extração com acetato de etila). A concentração limoneno-1,2-diol foi quantificada em cada extrato, conforme item 3.5.