Leucocoprinus (Basidiomycota: Agaricaceae) de cultivares leveduriformes na Ilha de Santa Catarina, Florianópolis, Brasil

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Leucocoprinus (Basidiomycota: AGARICACEAE) de cultivares leveduriformes na Ilha de Santa Catarina, Florianópolis, Brasil

Trabalho de Conclusão do Curso de Graduação do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do Título de Bacharel em Ciências Biológicas

Orientadora: Profa. Dra. Maria Alice Neves

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Débora Thaís de Andrade

LEUCOCOPRINUS (BASIDIOMYCOTA: AGARICACEAE) DE CULTIVARES LEVEDURIFORMES NA ILHA DE SANTA CATARINA, FLORIANOPÓLIS,

BRASIL

Esta monografia foi julgada adequada para obtenção do Grau de “Bacharel em Ciências Biológicas”, e aprovada em sua forma final pelo Curso de Graduação em Ciências Biológicas

da Universidade Federal de Santa Catarina. Florianópolis, 28 de Junho de 2019.

________________________ Prof. Dr. Carlos Roberto Zanetti

Coordenador do Curso de Ciências Biológicas

Banca Examinadora:

________________________ Prof.ª Dr.ª Maria Alice Neves

Orientadora

Universidade Federal de Santa Catarina

________________________ Ms. Ariadne Nóbrega Marinho Furtado Universidade Federal de Santa Catarina

________________________ Ms. Celeste Heisecke Cabrera

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AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais, Cecília Inês Duz de Andrade e Valmir Antônio de Andrade, pelo imenso amor, carinho, apoio e atenção dedicados a mim durante toda minha jornada como estudante, da escola até a universidade. Gratidão por sempre estarem dispostos a fazer o possível e o impossível para me ver feliz e realizada, independente das minhas escolhas. A minha irmã Sheila Patrícia de Andrade, por sempre estar presente, cuidando de mim e me auxiliando nos momentos de dúvida, sendo uma parceira para conversas banais até discussões político-filosóficas. Agradeço à minha família por ter me proporcionado essa formação crítica, ensinando valores, virtudes e consciência para a boa convivência em sociedade.

Aos professores desta instituição, os quais dedicam boa parte de suas vidas lecionando, além de realizarem pesquisa e extensão. Agradeço especialmente aos professores que gentilmente me receberam em seus laboratórios, professor Benedito Cortês Lopes e, minha querida orientadora, professora Maria Alice Neves, por terem me ensinado, além do conhecimento de suas áreas, virtudes que levo para vida.

Aos amigos que fiz no MICOLAB, por todas as conversas e risadas nos dias de trabalho de laboratório, pelos ensinamentos de taxonomia de fungos, as saídas de campo, enfim, por todo conhecimento compartilhado. Agradeço especialmente a Maria Eduarda de Andrade Borges por ter sido, além de uma grande amiga, minha mentora no laboratório, me ensinando técnicas de como trabalhar com fungos.

Aos colegas da graduação com os quais eu pude conviver e me relacionar ao longo de cinco anos, especialmente aos amigos e amigas da turma 2014.2, Caio, Elisa, Karen, Luisa, Nicolas e Pâmela. Ao Frederico Rottgers Marcineiro por ter sido uma pessoa muito importante, companheiro de laboratório, sempre me apoiando e me ajudando durante boa parte da minha formação na universidade.

A Celeste Heisecke Cabrera e Ariadne Nóbrega Marinho Furtado pelo auxílio na elaboração do projeto que originou este trabalho, bem como por gentilmente terem aceito compor a banca examinadora. Meu agradecimento especial a Salomé Urrea-Valencia por gentilmente ter cedido seus dados e pelo apoio durante a elaboração do projeto e do presente trabalho. Sou grata por sempre que solicitado terem sido muito prestativas e atenciosas comigo.

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Ao Herbário FLOR pela oportunidade de estágio, além da presteza de ceder empréstimos quando solicitados.

As minhas amizades da vida que estão em Xaxim, por todas as conversas e momentos que deixaram essa caminhada mais leve e mais rica.

A todos que se empenharam e aos que continuam construindo uma universidade pública de qualidade, de todos para todos. Agradeço a quem, de alguma maneira, contribuíu nessa minha jornada no curso de graduação e na realização deste trabalho. Muito obrigada!

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“Por que se apressar sobre coisas bonitas? Por que não relaxar e apreciá-las?” Clara Schumann

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Resumo

Segundo dados atuais, Leucocoprinus Pat. (Agaricaceae) faz parte de um clado juntamente com Leucoagaricus (Locq.) ex Singer e estão inclusos na tribo Leucocoprineae, com base na morfologia. Macroscopicamente, os basidiomas apresentam o píleo de margem estriada, himenóforo com lamelas próximas e livres e estipe central, com presença de anel ou remanescente. Microscopicamente, destaca-se a reação metacromática do endósporo. A maioria dos fungos cultivados por formigas pertence ao clado Leucoagaricus/Leucocoprinus, cuja interação mutualística se dá com formigas da tribo Attini, e que aparecem em dois clados distintos. Embora tradicionalmente se assuma que tais fungos cultivados não apresentam uma forma de vida livre, trabalhos com sequenciamento de DNA já demonstraram a existência de fungos correspondentes de cultivares existindo fora da associação mutualística. Há cinco modelos de cultivo de fungos por formigas, sendo um deles a agricultura de leveduras, praticada exclusivamente por formigas do gênero Cyphomyrmex Mayr “grupo rimosus”. Esse tipo de cultivo é considerado um caso de coadaptação ou domesticação. Estudos recentes com filogenias moleculares revelaram a presença de fungos leucocoprináceos de vida livre em clados que compreendem os cultivares leveduriformes, considerando assim a existência desses correspondentes de vida livre. O presente trabalho buscou analisar as relações filogenéticas entre os fungos de vida livre de Leucocoprinus coletados na Ilha de Santa Catarina e cultivares leveduriformes de ninho registrados para o Brasil, baseando-se em sequências de DNA. Foi utilizado o marcador ITS para reconstrução filogenética através da análise de Máxima Verossimilhança. Além disto, 13 novos materiais do gênero Leucocoprinus foram coletados e identificados a nível de espécie, bem como foram descritos macro e micromorfologicamente, utilizando-se guias e métodos tradicionais em micologia, ampliando o conhecimento sobre o gênero na Ilha de Santa Catarina.

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Abstract

According to recent data Leucocoprinus Pat. (Agaricaceae) combinated with Leucoagaricus (Locq.) ex Singer constitute a clade inside the tribe Leucocoprineae, based on morphology characteristics. Macroscopically, the basidiocarps present the striated margin, the hymenophore with close and free lamellae, and central stipe with ring or remnant presence. Microscopically, the metachromatic reaction of the endospores stands out. Most of the fungi cultivated by ants belong to the clade Leucoagaricus/Leucocoprinus, whose mutual interaction occurs with ants of the Attini tribe, and that appear in two distinct clades. There are five models of fungus cultivation by ants, one of which is the yeast agriculture, practiced exclusively by ants of the genus Cyphomyrmex Mayr "rimosus group", being this type of growth a case of coadaptation or domestication. Although traditionally it is assumed that such cultivated fungi do not present a free-living form, reserches with DNA sequencing have already demonstrated the existence of corresponding fungi of cultivars living outside the mutualistic association. Recent studies with molecular phylogenies have revealed the presence of free-living of Leucocoprinus fungi in clades that comprise yeast cultures, considering them as a free-living species for fungi grown in the form of yeast. The objective of this work was to analyze the phylogenetic relationships between Leucocoprinus free-living fungi collected on the Island of Santa Catarina and yeast cultivars, based on DNA sequences, using the Maximum Likelihood analysis with ITS marker for phylogenetic reconstruction, demonstrated the possible existence of free-living correspondents of yeast cultivars registered for Brazil. In addition, 13 new materials of the genus Leucocoprinus were collected and identified at the species level, as well as described macro and micromorphologically, using traditional methods and guides in mycology, increasing the understanding of the genus.

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Lista de Figuras

Figura 1 – Ponto de coleta dos basidiomas na Trilha do Morro do Assopro, Florianópolis,

Santa Catarina, Brasil ... 25

Figura 2 – Basidiomas de Leucocoprinus cf. cepistipes ... 32

Figura 3 – Estruturas microscópicas de Leucocoprinus cf. cepistipes ... 33

Figura 4 – Basidiomas de Leucocoprinus cf. brebissonii ... 35

Figura 5 – Estruturas microscópicas de Leucocoprinus cf. brebissonii ... 36

Figura 6 – Basidiomas de Leucocoprinus cretaceus ... 39

Figura 7 – Estruturas microscópicas de Leucocoprinus cretaceus ... 40

Figura 8 – Árvore filogenética que relaciona sequências de fungos leveduriformes cultivados por formigas e fungos leucocoprináceos de vida livre por meio de análise de Máxima Verossimilhança, utilizando marcador ITS ... 41

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Lista de Tabelas

Tabela 1 Lista de espécimes do gênero Leucocoprinus coletados durante o desenvolvimento deste trabalho na Ilha de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil... 29 Tabela 2 Sequências incluídas nas análises moleculares ... 45

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Lista de siglas e abreviações

BR – Brasil C – Celsius cf. – Conferatum

Et al. – Et alli (e colaboradores) KOH – Hidróxido de Potássio mm – Milímetros

n – Número total de estruturas medidas O – Oeste

Q – Quociente de comprimento por largura do esporo SC – Santa Catarina

S – Sul

sp. – Species (Espécie) μm – Micrômetros

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Sumário

1. Introdução ... 19

1.1 Tribo Leucocoprineae Singer ... 19

1.2 Taxonomia e caracterização de Leucocoprinus Pat. ... 20

1.3 A simbiose entre fungos e formigas ... 21

2. Objetivos ... 24

2.1 Objetivos gerais ... 24

2.2 Objetivos específicos ... 24

3. Material e métodos ... 25

3.1 Coleta em campo ... 25

3.2 Descrições morfológicas e identificação ... 26

3.3 Análises moleculares ... 26

4. Resultados e discussão ... 27

4.1 Capítulo I – Descrição e taxonomia de Leucocoprinus Pat. ... 30

4.2 Capítulo II – Análise filogenética de cultivares leveduriformes e fungos leucocoprináceos... 41

5. Conclusão ... 46

Referências ... 47

Apêndice A – Descrição de caracteres microscópicos dos materiais SUV47, SUV113, SUV116 e SUV121 ... 52

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1. Introdução

1.1 Tribo Leucocoprineae

O estudo sistemático do reino Fungi é considerado recente, porém o conhecimento e uso destes organismos estão documentados na história de diversos povos há milhares de anos (Alexopoulos & Mims, 1979). A família Agaricaceae Chevall., uma das famílias mais diversas da ordem Agaricales (Vellinga, Kok & Bruns, 2003), é composta por fungos de hábito saprofítico, que geralmente crescem sobre serrapilheira. Agaricaceae é um grupo monofilético, que se apresenta amplamente distribuído pelo globo (Vellinga, 2004a, 2004b, 2011) e compreende 918 espécies distribuídas em 51 gêneros (Wartchow, Putzke & Cavalcanti, 2008 apud Kirk et al., 2001). Os primeiros registros da família Agaricaceae no Brasil estão documentados na publicação de Montagne (1856), no qual há descrição e caracterização de espécies, que já passaram por revisões taxonômicas, sendo sinonimizadas em gêneros pertencentes ou não à família em questão (Pegler, 1990). A família é caracterizada por apresentar esporada que varia de branco a marrom e verde a azul, trama do himenóforo regular ou trabecular e superfície do píleo variando entre epitelioide a tricodermal ou cuticular (Vellinga, Kok & Bruns, 2003). Inicialmente, Agaricaceae foi dividida em quatro tribos distintas, Agariceae, Cystodermateae, Leucocoprineae e Lepioteae (Singer, 1986), porém, posteriormente, com estudos morfológicos e de sequenciamento, foram caracterizadas apenas três tribos nesta família (Johnson & Vilgalys, 1998; Moncalvo et al., 2002).

A tribo Leucocoprineae Singer comporta táxons que apresentam formato agaricoide, lamelas livres, volva raramente desenvolvida, anel móvel, esporos de parede complexa lisa ou ornamentada, geralmente com poro de germinação bem desenvolvido, pseudoamiloides em reagente Melzer e com reação metacromática em azul de Cresyl (Singer, 1986), sendo a esporada branca ou creme, raramente esverdeada (Heinemann, 1973; Vellinga, 2004b). Os gêneros Leucoagaricus Locq. Ex Singer, Leucocoprinus Pat., Macrolepiota Singer, Sericeomyces Heinem. e Chlorophyllum Massee fazem parte dessa tribo (Singer, 1986).

A classificação proposta por Singer (1986), na qual o gênero Leucocoprinus Pat. pertence à tribo Leucocoprineae, incluída em Agaricaceae, é a mais aceita. Durante certo tempo alguns autores optaram por separar o gênero em uma família distinta, Lepiotaceae, que se diferenciava pela coloração da esporada, mas atualmente não se considera mais como uma família separada, uma vez que esta classificação não tem suporte filogenético (Vellinga, 2003,

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As análises filogenéticas, utilizando-se de diferentes métodos, têm como finalidade estimar uma filogenia que mostre a história evolutiva do grupo taxonômico estudado (Peña, 2011). Estudos baseados em marcadores moleculares como ITS (internal transcribed spacer), LSU (nuclear large subunit ribossomal RNA), SSU (mitochondrial small subunit) e rpb2 (gene codificante para a segunda maior subunidade da RNA polimerase II) demonstram a existência de um clado Leucoagaricus/Leucocoprinus (Johnson & Vilgalys, 1998; Johnson, 1999; Moncalvo et al., 2002; Vellinga, 2004b; Vellinga, Sysouphanthong & Hyde, 2011). Este clado pode se tratar de um grande gênero ou ser dividido em diversos gêneros monofiléticos menores (Vellinga & Davis, 2006) após inclusão de mais materiais de regiões tropicais (Kumar & Monimohan, 2009; Urrea-Valencia, 2013). Leucocoprinus pode ser diferenciado de Leucoagaricus por possuir na superfície do píleo estriações bem marcadas (como pregas), pseudoparáfises no himênio e esporos geralmente com poro de germinação (Singer, 1986).

1.2 Taxonomia e caracterização de Leucocoprinus

Patouillard (1888) observou caracteres semelhantes entre os gêneros Lepiota (Pers.) Gray e Coprinus Pers. como o estipe ser facilmente separado do píleo, a ausência de volva e a presença de anel, porém ambos se distinguem por características de hábito e morfologia, além da diferença na coloração da esporada, sendo a de Coprinus escura e de Lepiota branca. Patouillard reconheceu que entre os Lepiota de Fries havia espécies de Coprinus, porém estes tinham a esporada branca, e os separou em um novo gênero chamado Leucocoprinus (Patouillard, 1888).

Leucocoprinus apresenta basidiomas com o hábito gregário, solitário ou cespitoso (Gimenes, 2007). Macroscopicamente, os basidiomas são pequenos a médios e frágeis, com formato coprinoide ou lepiotoide (Urrea-Valencia, 2013). O píleo é membranoso, radialmente sulcado, de margem plicada, cuja superfície é variável (flocosa a escamosa fibrilosa), podendo ser aplanado ou umbonado e com contexto muito fino (Singer, 1986; Urrea-Valencia, 2013). O himenóforo é lamelar, as lamelas são livres, próximas e delgadas, produzindo esporada branca a amarelada (Urrea-Valencia, 2013). O estipe apresenta posição central, podendo ser reto ou bulboso, volva ausente e com anel membranoso e evanescente (Singer, 1986; Gimenes, 2007).

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Micromorfologicamente os basidiósporos de Leucocoprinus apresentam poro de germinação conspícuo (exceto algumas espécies), podendo ser cobertos por uma capa hialina (Vellinga, 2001a). Além disso, os basidiósporos também se apresentam dextrinoides em Melzer (coloração marrom-avermelhado), com reação metacromática em Azul de Crezyl (endósporo com coloração rosa ou roxa), congófilos em corante Vermelho Congo (fortemente corados) e de parede lisa (Singer, 1986; Vellinga, 2006; Gimenes, 2007). Os pleurocistidios geralmente são ausentes, enquanto os queilocistidios são abundantes e variados. A trama do himênio é regular a lacunosa, a pileipelis se apresenta com morfologias variadas e fíbulas são ausentes (Singer, 1986; Urrea-Valencia, 2013). Alguns autores discutem a validade da presença de pseudoparáfises como um caracter diagnóstico. No entanto a taxonomia do grupo ainda é incerta (Urrea-Valencia, 2013).

1.3 A simbiose entre fungos e formigas

Ao considerarmos a vasta diversidade de insetos e de microrganismos presentes nos ambientes naturais, observamos sua inevitável coocorrência, onde por vezes suas histórias evolutivas se cruzam na forma de associações simbióticas (Caldera et al., 2009). A interação mutualística entre algumas formigas da tribo Attini (Hymenoptera, Formicidae) e fungos data entre 45–65 milhões de anos, representando um processo de coevolução que, possivelmente, teve início no solo de florestas tropicais amazônicas, por conta do substrato disponível (Mueller et al., 2001; Mueller, 2002; Vo, Mikheyev & Mueller, 2009). A observação de trilhas de formigas cortadeiras carregando material vegetal para seu ninho aparece em registros documentais da civilização Maia e em escritos dos primeiros colonizadores do Novo Mundo (Weber, 1972a). Möeller (1893) aborda as primeiras ideias de coevolução na reação mutualística entre formigas e seus cultivares fúngicos, além de descrever a existência de estruturas expandidas nas extremidades das hifas, posteriormente chamados de gongilideos, os quais são consumidos pelas formigas (Caldera et al., 2009).

Tradicionalmente, assume-se que os fungos cultivados por formigas são incapazes de existirem na forma de vida livre e que crescem exclusivamente por meio dessa associação (Vo, Mikheyev & Mueller, 2009 apud Weber, 1972b). Schultz & Brady (2008) identificaram cinco sistemas de cultivo que incluem diferentes linhagens de fungos e de formigas. As mais antigas linhagens de formigas cultivadoras de fungos praticam o modelo mais básico,

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cultivares deste modelo pertencem a um grupo parafilético dentro da tribo Leucocoprineae e, até onde é sabido, esses mesmos fungos sobrevivem fora da associação simbiótica que ocorre no ninho, ou seja, na forma de um cogumelo de vida livre, os quais não possuem espécie identificada, sendo descritos como fungos lepiotáceos (Mueller, Rehner & Schultz, 1998; Schultz & Brady, 2008; Vo, Mikheyev & Mueller, 2009). Vellinga (2004b) cita que a maioria das espécies de fungos que conhecidamente é cultivada pertence ao clado Leucoagaricus/Leucocoprinus.

A agricultura de leveduras, praticada exclusivamente por formigas do gênero Cyphomyrmex Mayr “grupo rimosus”, atipicamente mantém os cultivares de fungos lepiotáceos na forma de pequenos aglomerados irregulares de leveduras (estrutura unicelular), diferentemente das demais formigas da tribo Attini que os mantém na forma de micélio (estrutura filamentosa) (Schultz & Meier, 1995; Mueller, 2002; Schultz & Brady, 2008; Schultz & Brady, 2008 apud Snelling & Longino, 1992). Os resultados filogenéticos obtidos por Schultz & Brady (2008) entre Cyphomyrmex e seus cultivares indicam que o fungo leveduriforme pertence a um clado altamente derivado de fungos leucocoprináceos que se desenvolvem na forma unicelular quando associados às formigas, sendo esse tipo de agricultura considerado um caso de coadaptação ou domesticação (Schultz et al., 2005). Assim como fungos pertencentes à agricultura basal, estes cultivares leveduriformes podem existir na forma de vida livre, independente da simbiose com a tribo Attini, crescendo sobre serrapilheira na forma micelial, típico da tribo Leucocoprineae (Mueller, Rehner & Schultz, 1998; Schultz & Brady, 2008).

O grupo mais derivado é chamado de agricultura superior (do inglês higher agriculture). Neste grupo surgiram as attines pertencentes aos gêneros Atta Fabricius e Acromyrmex Mayr, conhecidas como formigas cortadeiras (Schultz & Brady, 2008) que mantém cultivares no formato micelial (multicelular) (Schultz & Meier, 1995). Os cultivares deste grupo descendem de leucocoprináceos cultivados na agricultura basal (Chapela et al., 1994; Schultz et al., 2005), porém o fato de aparentemente o fungo não sobreviver sem estar na associação simbiótica e que somente neste grupo há produção de estruturas nutritivas nas pontas das hifas pelo fungo (gongilideos) sugerem coevolução (Schultz & Brady, 2008).

O desenvolvimento das técnicas moleculares para reconstruções filogenéticas facilitou o entendimento da história evolutiva entre formigas e seus cultivares, estabelecendo de forma mais clara sua posição taxonômica (Chapela et al., 1994; Mueller et al., 2001). A partir do

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sequenciamento de DNA e análises moleculares, os cultivares leveduriformes de Cyphomyrmex formaram um clado monofilético dentro de um clado maior que inclui os cultivares miceliais (Mueller, Rehner & Schultz, 1998), indicando que houve uma mudança nos fungos a partir do momento da associação mutualística, tendo como ancestrais fungos miceliais que mudaram para forma de leveduras sem razão conhecida (Mueller, 2002). Além de todos os avanços há dificuldade na compreensão da complexidade desse sistema pela ausência de informações e dificuldade da colocação taxonômica dos cultivares (Caldera et al., 2009).

Alguns trabalhos demonstraram por meio de sequenciamento de DNA, principalmente da região ITS, que alguns fungos de vida livre se encaixam filogeneticamente em clados que compreendem os cultivares leveduriformes associados ao gênero de formigas Cyphomyrmex (Mueller, Rehner & Schultz, 1998; Mueller, 2002; Vo, Mikheyev & Mueller, 2009; Schultz & Brady, 2008; Urrea-Valencia, 2013). A filogenia apresentada por Urrea-Valencia (2013) demonstra o posicionamento de fungos de vida livre coletados na Ilha de Santa Catarina dentro de um clado de cultivos leveduriformes, assim como já apresentado por Mueller, Rehner & Schultz (1998), Vo, Mikheyev & Mueller (2009) e Mueller et al. (2018), cuja macromorfologia desses materiais é muito semelhante ao gênero Leucocoprinus. No entanto, a micromorfologia apresentou caracteres que, além de impossibilitarem a identificação, não condiziam com o conceito tradicional desse gênero (Urrea-Valencia, 2013).

Dessa forma, se torna importante ampliar o conhecimento taxonômico das espécies de Leucocoprinus através de coletas de novos materiais, bem como a sua análise morfológica, que em conjunto com dados moleculares, obtidos por Urrea-Valencia (2013), gerará dados filogenéticos mais assertivos. No presente trabalho destaca-se a busca por mais informações sobre Leucocoprinus, principalmente os que fazem associações mutualísticas com formigas cultivadoras de fungos na forma de leveduras.

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2. Objetivos

2.1 Objetivo geral

Entender as relações filogenéticas entre fungos do gênero Leucocoprinus e cultivares leveduriformes mantidos por formigas, com base em dados moleculares.

2.2 Objetivos específicos

Ampliar a amostragem de Leucocoprinus por meio de coletas.

Reconhecer as relações filogenéticas entre espécimes de Leucocoprinus e fungos leveduriformes cultivados por formigas.

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3. Material e métodos

3.1 Coletas em campo

Foram realizadas 6 expedições a campo entre os meses de Janeiro e Março de 2019. Destas, cinco foram realizadas na Trilha do Morro do Assopro (27º35'29"S 48º28'30"O), próxima ao mirante do Morro da Lagoa da Conceição (Figura 1) e uma foi realizada na Trilha de acesso à Praia de Naufragados, que faz parte do Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (27°49'00.1"S 48°33'38.7"O). Os dois locais estão na porção insular do município de Florianópolis, Santa Catarina. No mês de abril uma coleta foi realizada no Departamento de Botânica da Universidade Federal de Santa Catarina, localizado no campus João David Ferreira Lima, também no município de Florianópolis.

Figura 1 – Ponto de coleta dos basidiomas na Trilha do Morro do Assopro, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil. Fonte: Google Earth Pro (acesso em 05 de Abril de 2019).

As coletas foram realizadas com auxílio de canivete para retirar os basidiomas do substrato e foi feito o registro fotográfico dos materiais frescos. Os cogumelos foram armazenados em caixa plástica compartimentalizada. Por se tratarem de materiais delicados a caixa coletora foi colocada dentro de uma caixa térmica de isopor com gelo reutilizável (gelotech) para manter as características externas a serem descritas. Estruturas macroscópicas

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fossem perdidos. Ao fim deste trabalho os materiais coletados serão depositados no herbário FLOR da Universidade Federal de Santa Catarina.

3.2 Descrições morfológicas e identificação

Os basidiomas frescos foram levados ao Laboratório de Micologia, na Universidade Federal de Santa Catarina (MICOLAB/UFSC), para descrição macroscópica, que seguiu a metodologia de Largent, Hadley & Stuntz (1986), observando forma, textura, cor e tamanho do píleo, estipe e demais estruturas. O Online Auction Color Chart (Kramer, 2004) foi utilizado para referenciar as cores. Depois de descritos os materiais foram desidratados na desidratadora de alimentos Excelvan® a 35ºC por cerca de 6 a 8 horas, para serem devidamente armazenados em sacos zip lock.

As descrições microscópicas foram realizadas a partir da observação de cortes do basidioma. Os cortes foram montados em lâminas com água, KOH 3%, reagentes Melzer, Azul de Cresyl, Congo Red + KOH 3% ou Floxina + KOH 3%. As estruturas foram observadas sob microscópio de luz Olympus CX22LED e descritas conforme Largent, Johnson & Walting (1977) e Vellinga (2001a), analisando forma, presença ou ausência de reações e tamanhos das microestruturas. A medição das estruturas microscópicas foi realizada no aumento total de 100x, utilizando a régua micrométrica acoplada ao microscópio, sendo que foram escolhidas aleatoriamente um total de 20 estruturas/cada.

A identificação do material em nível de gênero seguiu as chaves dicotômicas de Stuntz (1977) e Singer 1986 e, em nível de espécie, seguiu chaves de Dennis (1952), Pegler (1972), Gimenes (2007), Rother & Silveira (2008, 2009), Birkebak (2010) e Niviero, Popoffi & Albertó (2012).

3.3 Análises moleculares

A montagem da árvore filogenética incluiu 4 sequências de materiais coletados por Urrea-Valencia (2013) na Ilha de Santa Catarina (comunicação pessoal), bem como 17

sequências disponíveis no banco de dados GenBank

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Essas sequências foram selecionadas a partir da utilização da ferramenta BLAST. Ao todo 22 sequências foram utilizadas, incluindo uma sequência de Chlorophyllum molybdites (G. Mey.) Massee, como grupo externo. O marcador molecular utilizado foi ITS.

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As sequências foram alinhadas no programa ClustalW e editadas manualmente, quando necessário, por meio do programa MEGA 7.0.26. (Kumar, Stecher & Tamura, 2016). O melhor modelo de substituição de nucleotídeos resultante TPM3uf+G, sem sítios invariantes, foi estimado pelo programa jModelTest2 2.1.6 (Posada, 2008) e a análise de Máxima Verossimilhança (ML), realizada para reconstrução filogenética, foi executada no programa RAxML-HPC2 Workflow 8.2.10 (Stamatakis, 2014), com 1000 interações de bootstrap, ambos disponíveis no portal Cipres (https://www.phylo.org/). A edição manual da árvore foi realizada no programa FigTree v1.4.3 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).

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4. Resultados e Discussão

Os resultados do presente trabalho foram divididos em dois capítulos.

O capítulo I aborda a análise taxonômica e descrição de L. brebissonii, L. cepistipes e L. cretaceus a partir de coletas realizadas na Ilha de Santa Catarina. Pranchas com desenhos de estruturas microscópicas e fotos dos materiais estão inclusas neste capítulo.

O capítulo II traz a análise filogenética relacionando sequências de fungos leveduriformes cultivados por formigas com sequências de espécimes de vida livre identificados como pertencentes ao gênero Leucocoprinus por Urrea-Valencia (2013), bem como sequências de materiais de fungos de vida livre identificados como pertencentes a tribo Lepiotaceae por Mueller, Rehner & Schultz (1998) e Vo, Mikheyev & Mueller (2009). Neste capítulo é discutida a existência de caracteres que não condizem com a circunscrição clássica de Leucocoprinus, assim como já observado por Urrea-Valencia (2013).

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Tabela 1 – Lista de espécimes do gênero Leucocoprinus coletados durante o desenvolvimento deste trabalho na Ilha de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.

Número do coletor Local Data Táxon

DTA009

Trilha do Morro do Assopro (Morro da Lagoa), Florianópolis, SC, BR

25/01/2019 Leucocoprinus cf. cepistipes

DTA014 Trilha de Naufragados,

Florianópolis, SC, BR 26/01/2019

Leucocoprinus fragilissimus DTA018

DTA020

27/01/2019 Leucocoprinus fragilissimus

DTA021

DTA022

DTA023

DTA024

DTA025

DTA026

28/01/2019 Leucocoprinus cf. brebissonii

DTA027

15/03/2019 Leucocoprinus cf. brebissonii

DTA028

DTA029

Departamento de Botânica, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, BR

15/04/2019 Leucocoprinus cretaceus

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4.1 Capítulo I – Descrição e taxonomia de Leucocoprinus

Foram coletados um total de 20 espécimes, dos quais, 13 foram identificados como pertencentes ao gênero Leucocoprinus (tabela 1), distribuídos em 4 táxons: Leucocoprinus brebissonii (Godey) Locq., Leucocoprinus cepistipes (Sowerby) Pat., Leucocoprinus cretaceus (Bull.) Locq. e Leucocoprinus fragilissimus (Ravenel ex Berk. & M.A. Curtis) Pat.. Os demais exemplares coletados não foram identificados como pertencentes ao gênero em questão, mas a gêneros próximos como Leucoagaricus e Lepiota.

A espécie L. fragilissimus não foi descrita neste trabalho por se tratar de um táxon comum.

As expedições a campo inicialmente tiveram como objetivo a busca e coleta de Leucocoprinus os quais fossem cogumelos de vida livre correspondentes ao grupo que é cultivado por formigas na forma de levedura. Mesmo que estes exemplares não tenham sido encontrados no período de coletas, a identificação dos materiais coletados se tornou importante para a diferenciação das espécies do gênero, descritas neste capítulo.

A) Leucocoprinus cf. cepistipes (Sowerby) Pat. [as „cepaestipes‟], J. Bot., Paris 3: 336 (1889). Figuras 3 e 4.

Basidiomas de cor branca (oac909), branca-amarelada (oac7) ou creme (oac900). Píleo com 20–58 mm de diâmetro, centro e esquâmulas que se destacam da superfície em cor de acinzentado (0ac745), marrom claro (entre oac701 e oac702), marrom-acinzentado escuro (entre oac640 e oac641), convexo-cônico a plano, superfície seca, pulverulenta e esquamulosa, margem reta e plicada até o segundo terço do píleo. Contexto muito fino. Lamelas livres, abundantes, próximas a muito próximas, desiguais (presença de lamélulas), brancas (oac900 e oac909), margem inteira e reta. Estípe com 49–85 mm de comprimento, 4–9 mm de largura na base e 3–4 mm na região mediana, central, clavado, cilíndrico, aspecto frágil, superfície brilhante, glabro e fistuloso. Anel mediano a súpero, frágil, deliquescente. Volva ausente.

Basidiósporos (8-)10–11(-14) x 5–8 µm (Q=1,49–1,78; n=20) dextrinoides em Melzer, metacromáticos em azul de Cresyl, hialinos em água, levemente amarelados em KOH, abundantes, ovoides a elipsoides, com poro de germinação, parede lisa e espessa.

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Basídios 16–29 x 10–15 µm (n=20) clavados, portando quatro esterigmas. Queilocistidios 22–60 x 9–18 µm (n=20) abundantes, levemente uniformes, utriformes, oblongos, pouco cilíndricos, clavados, amplamente clavados, uniformes e flexuosos. Pseudoparáfises presentes. Superfície do píleo em epitélio irregular. Trama da lamela subregular a irregular. Hifas globulares hialinas em água e KOH. Superfície do estipe subregular a regular.

Hábito solitário ou gregário, crescendo sobre serrapilheira em solo de mata.

Materiais analisados: Brasil, SC, Florianópolis: Trilha do Morro do Assopro, 25 de Janeiro de 2019, Andrade DT 009 (FLOR); Brasil, SC, Florianópolis: Trilha do Morro do Assopro, 27 de Janeiro de 2019, Andrade DT 018 (FLOR); Brasil, SC, Florianópolis: Trilha do Morro do Assopro, 15 de Março de 2019, Andrade DT 028 (FLOR).

Comentários: É cosmopolita, sendo muito comum em regiões tropicais e subtropicais, cresce em ambientes internos, como casas de vegetação, e ambiente externo (Birkebak, 2010), sendo esta a espécie tipo do gênero (Guzmán-Dávalos & Guzmán, 1982). A espécie é caracterizada por apresentar basidiomas brancos, com esquâmulas flocosas de coloração castanho clara a castanho-amarelada na superfície do píleo (Rother & Silveira, 2009).A morfologia macroscópica da coloração do píleo quando os basidiomas são jovens é muito semelhante à de Leucocoprinus brebissonii (Gimenes, 2007). Os basidiósporos variam entre 2 4 µm de tamanho, além da cor do píleo variar entre branco com cinza-lilás e castanho-acinzentado (Pegler, 1972; Gimenes, 2007 apud Vellinga, 2001b).

Alguns autores tratam erroneamente Leucocoprinus cretaceus, espécie toda branca, como L. cepaestipes (=cepistipes) (Rother & Silveira, 2009 apud Vellinga, 2001b). Dennis (1952) comenta que Leucocoprinus cepistipes parece ser uma daquelas espécies antigas que todo mundo comenta, mas ninguém conhece exatamente, além de o material tipo não ter sido preservado para poder ser estudado.

Wartchow, Putzke & Cavalcanti (2008) reconhecem que Leucocoprinus squamulosus (Mont.) Pegler é feneticamente próxima de Leucocoprinus cepistipes por apresentar basidiósporos semelhantes, porém não há presença de anel e a base do estipe não é inflada (Dennis, 1952; Niveiro, Popoff & Albertó, 2012).

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Figura 2 – Basidiomas de Leucocoprinus cf. cepistipes. A. coleta DTA009 (foto: acervo próprio). B. coleta DTA018 (foto: Débora de Andrade). C. coleta DTA028 (foto: Lara Ferst).

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Figura 3 – Estruturas microscópicas de Leucocoprinus cf. cepistipes. a. basidiósporos. b. basídios. c. queilocistídios. Escala = 10 µm.

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B) Leucocoprinus cf. brebissonii (Godey) Locq., Bull. mens. Soc. linn. Soc. Bot. Lyon 12: 95 (1943). Figuras 5 e 6.

Basidiomas de cor branca (oac909) e creme (oac816). Píleo com 22–56 mm de diâmetro, centro e esquâmulas que se destacam sutilmente da superfície em marrom claro (oac786) a marrom-café claro (oac646), plano, levemente umbonado, superfície seca, esquâmulosa, margem reta e plicada. Lamelas livres, próximas, desiguais (com lamélulas), margem reta e inteira. Estípe com 58–75 mm de comprimento, 2–4 mm de largura na base e 2 mm na região mediana, central, clavado, cilíndrico, aspecto frágil, glabro, superfície brilhante e fistuloso. Anel súpero, frágil, deliquescente. Volva ausente.

Basidiósporos (7-)8–9(-12) x 6–9 µm (Q=1,37–1,46; n=20) dextrinoides em Melzer, metacromáticos em azul de Cresyl, hialinos a levemente amarelados em água e KOH, abundantes, elipsoides a ovais, com poro de germinação, parede lisa e espessa. Basídios 18– 27 x 10–12 µm (n=20) clavados, portando quatro esterigmas. Queilocistídios 23–51 x 8–21 µm (n=20) levemente utriformes, utriformes, elipsoides, oblongos e cilíndricos. Superfície do píleo em epitélio irregular. Hifas globulares levemente amareladas a hialinas em água e KOH. Trama da lamela subregular a irregular. Superfície do estípe subregular a regular.

Hábito solitário, crescendo sobre serrapilheira em solo de mata.

Materiais analisados: Brasil, SC, Florianópolis: Trilha do Morro do Assopro, 27 de Janeiro de 2019, Andrade DT 026 (FLOR); Brasil, SC, Florianópolis: Trilha do Morro do Assopro, 15 de Março de 2019, Andrade DT 027 (FLOR).

Comentários: Assim como observado por Rother & Silveira (2009), a margem do píleo destes espécimes é plicada até o centro e não somente até o primeiro terço do diâmetro. A espécie se diferencia das demais por apresentar o centro do píleo com coloração variando entre cinza-escuro, castanho-acinzentado, castanho-escuro a quase preto (Rother & Silveira, 2009), porém o material analisado apresenta coloração marrom mais fraca, como imagens de Rother & Silveira (2008).

Leucocoprinus venezuelanus Dennis é muito semelhante a esta espécie, porém diferencia-se por apresentar esporos de tamanho menor (Dennis, 1961). Leucocoprinus heinemannii Migl. também apresenta superfície do píleo escura, mas se diferencia porque as esquâmulas são punctadas e menores (Birkebak, 2010). Gimenes (2007) comenta que em campo a aparência dessa espécie é semelhante à aparência de uma Lepiota (Pers.) Gray.

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Figura 4 – Basidiomas de Leucocoprinus cf. brebissonii. A. coleta DTA026 (foto: acervo próprio). B. coleta DTA027 (foto: Lara Ferst).

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Figura 5 – Estruturas microscópicas de Leucocoprinus cf. brebissonii. a. basidiósporos. b. basídios. c. queilocistídios. Escala = 10 µm.

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C) Leucocoprinus cretaceus (Bull.) Locq., Bull. mens. Soc. linn. Soc. Bot. Lyon 14: 93 (1945). Figuras 7 e 8.

Basidioma em cor branca (oac909). Píleo com 30–35 mm de diâmetro, plano-convexo, esquâmuloso, pulverulento, esquâmulas facilmente removíveis, superfície seca, aspecto frágil, margem inteira e discretamente plicada. Lamelas livres, muito próximas, abundantes, desiguais (com lamélulas), margem reta e inteira. Estípe com 40–56 mm de comprimento e 5–8 mm de diâmetro na base, clavado, central, cilíndrico, flexuoso, frágil, com esquâmulas do anel até a base. Anel súpero, muito frágil. Volva ausente.

Basidiósporos (8-)9(-11) x 6–7 µm (Q=1,52, n=20) dextrinoides em Melzer, metacromáticos em azul de Cresyl, congófilos, hialinos em KOH, abundantes, oblongos a elipsoides, com poro de germinação, parede lisa e espessa. Basídios 18–24 x 8–10 µm (n=20) clavados, portando quatro esterigmas. Queilocistídios 40–50x10–15 µm (n=20) levemente utriformes e lecitiformes, de ápice capitado. Pseudoparáfises presentes 44–66 x 9–13 µm (n=20). Superfície do píleo não pode ser observada por possuir esquâmulas deliquescentes. Trama da lamela regular a trabecular. Superfície do estípe regular.

Hábito solitário ou cespitoso, crescendo sobre serragem, folhas e madeira morta. Material analisado: Brasil, SC, Florianópolis: Departamento de Botânica, Universidade Federal de Santa Catarina, 15 de Abril de 2019, Andrade DT 029 (FLOR);

Comentários: Espécie de fácil reconhecimento por possuir caracteristicamente esquâmulas brancas, no píleo e estipe, que são facilmente removíveis (Rother & Silveira, 2009 apud Heinemann, 1997). Esta espécie é frequentemente observada crescendo em casas de vegetação e montes de compostagem na Europa (Wartchow, Putzke & Cavalcanti, 2008 apud Josserand, 1955).

Morgan (1907) descreve como Lepiota cretacea (Bull.) Mattir. o que é considerado Leucocoprinus cepistipes (i. e. sensu J. E. Lange). Dennis (1952) identifica basidiomas brancos com esquâmulas concolores nomeando-os como Leucocoprinus cepaestipes.

Leucocoprinus cretatus Locq. ex Lanzoni (= Leucocoprinus cretaceus) foi identificado como sinonímia de Leucocoprinus cepaestipes (=cepistipes) (Rother & Sillveira, 2009 apud Pegler, 1986), porém atualmente Leucocoprinus cepistipes é considerada uma espécie

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cobrindo a superfície do píleo (Gimenes 2007 apud Vellinga, 2001b). Dennis (1952) reconhece que há autores que consideram ambas as espécies como sinônimas, porém afirma que estas são espécies distintas.

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Figura 7 – Estruturas microscópicas de Leucocoprinus cretaceus. a. basidiósporos. b. basídios. c. queilocistídios. d. pseudoparáfises. Escala = 10 µm.

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4.2 Capítulo II – Análise filogenética de cultivares leveduriformes e fungos leucocoprináceos

O filograma apresentado na figura 8 aborda as relações evolutivas entre fungos leveduriformes cultivados por formigas e exemplares de fungos de vida livre, todos coletados em diferentes regiões do continente americano. O grupo externo escolhido foi a espécie Chlorophyllum molybdites (G. Mey.) Massee, para que fosse possível a comparação entre os espécimes de vida livre coletados por Urrea-Valencia (2013), que foram identificados a princípio como pertencentes ao gênero. Os materiais de vida livre coletados, tanto no Panamá quanto em Santa Catarina, não tiveram suas descrições publicadas.

Figura 8 – Árvore filogenética que relaciona sequências de fungos leveduriformes cultivados por formigas e fungos leucocoprináceos de vida livre por meio de análise de Máxima Verossimilhança, utilizando marcador ITS. Os valores sobre os ramos informam o bootstrap. Chlorophyllum molybdites é o grupo externo. Leucocoprinus_sp_SUV47, Leucocoprinus_sp_SUV113, Leucocoprinus_sp_SUV116 e Leucocoprinus_sp_SUV121 são fungos leucocoprináceos de vida livre coletados na Ilha de Santa Catarina, Brasil. Lepiotaceae_sp_PA302 e Lepiotaceae_sp_PA607 são fungos de vida livre coletados no Panamá. As demais sequências são de cultivares leveduriformes. O país de origem de cada sequencia é indicado na Tabela 2.

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A topologia presente no filograma é condizente com o que é apresentado por Mueller, Rehner & Schultz (1998), Vo, Mikheyev & Mueller (2009) e Urrea-Valencia (2013), onde os fungos de vida livre coletados no Panamá se agrupam com sequências de cultivares leveduriformes de forma semelhante. Nas análises deste trabalho não há sequências de cultivares do Brasil.

Bootstrap é um tipo de análise que busca inferir a variabilidade dos dados por meio de reamostragem em uma distribuição desconhecida, demonstrando por meio de seus valores a confiabilidade de um clado (Felsenstein, 1985). A coleta SUV47 se relaciona com a coleta PA607, identificada por Vo, Mikheyev & Mueller (2009) como um fungo de vida livre que mostra relação estrita com cultivares coletados em ninhos. Ambas as coletas estão próximas a um clado que inclui a maioria das sequências de cultivares leveduriformes e o material PA302 coletado no Panamá, que foi identificado por Mueller, Rehner & Schultz (1998) como um fungo leucocoprináceo de vida livre. Poém o valor de bootstrap indica baixa sustentação para os ramos.

A coleta PA302 chama atenção porque apresenta relações filogenéticas com cultivares leveduriformes, mesmo quando sequências de outros fungos de vida livre da Tribo Leucocoprineae são incluídas nas análises, como é possível observar nos filogramas de Mueller, Rehner & Schultz (1998) e Vo, Mikheyev & Mueller (2009). As sequências de fungos de vida livre com o código “PA” correspondem a espécies ainda não descritas, pois se tratam de coletas únicas (Mueller, Rehner & Schultz, 1998).

É sabido que tanto PA302 quanto PA607 são equivalentes de vida livre de cultivares leveduriformes (Vo, Mikheyev & Mueller, 2009). SUV47 poderia ser considerado como um equivalente de vida livre registrado para o Brasil, após ser feita sua análise morfológica mais detalhada, bem como sua comparação com os outros espécimes de vida livre desse clado.

As análises moleculares, quando realizadas a partir de hipóteses previamente estabelecidas, correlacionando aspectos morfológicos, ecológicos, fisiológicos ou outros dados moleculares, fornecem um suporte maior para o entendimento das filogenias moleculares (Bruns, White & Taylor, 1991), fator o qual foi limitante na realização deste trabalho, uma vez que as sequências utilizadas, tanto do Brasil quanto do Panamá, não são de materiais frescos, dificultando a total compreensão dos espécimes, uma vez que seuas descrições morfológicas não foram publicadas. A coleta SUV47 apresenta como resultado a macromorfologia esperada para o gênero Leucocoprinus (Anexo A), porém quando feita a análise microscópica (Apêndice A) aparecem estruturas globulares nas hifas (figura 9), sendo esse um caracter que a priori não é descrito para o gênero (Urrea-Valencia, 2013).

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Figura 9 – Hifas da superfície do píleo com estruturas globulares, indicadas por setas em cor vermelha. Escala = 10 µm.

No filograma é possível observar a relação entre os exemplares SUV113 e SUV121 com uma sequência de um cultivar leveduriforme com o valor de bootstrap de 98, demonstrando que quando testado o modelo, estas sequências sempre permanecem próximas, assim como já observado por Urrea-Valencia (2013). Ambos os materiais de vida livre foram coletados na mesma data e local, sendo a micromorfologia dos materiais, quando comparada, semelhante entre si e muito parecida com a de exemplares do gênero Leucocoprinus (Apêndice A). Uma análise mais detalhada da descrição macroscópica, bem como uma revisão mais detalhada dos caracteres microscópicos são muito importantes para determinar de fato se estes espécimes são equivalentes de vida livre e se realmente se trata de materiais do gênero Leucocoprinus.

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na forma de levedura. Quando analisada sua micromorfologia, a descrição se assemelha à do gênero Leucocoprinus (Apêndice A). Todas as demais sequências de cultivares se relacionam entre si de alguma maneira, sendo que alguns ramos apresentam bons valores de suporte pelo bootstrap (acima de 90).

Maiores estudos da morfologia, tanto macro quanto microscópica, bem como sequenciamento de outros materiais, são necessários para obter resultados mais assertivos de qual é o real posicionamento dos espécimes, mesmo que as sequências de materiais coletados no Brasil se mostraram bem posicionadas em ramos que se relacionam com fungos cultivados por formigas.

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Tabela 2 Sequências incluídas nas análises moleculares

Espécie Acesso GenBank País de origem

Leucocoprinus sp. SUV47 - Brasil

Leucocoprinus sp.SUV113 - Brasil

Leucocoprinus sp. SUV116 - Brasil

Leucocoprinus sp. SUV121 - Brasil

Lepiotaceae sp. PA607 EF527344 Panamá

Lepiotaceae sp. PA302 AF079745 Panamá

Cyphomyrmex minutus AF079681 Trindade e Tobago

Cyphomyrmex minutus AF079682 Trindade e Tobago

Cyphomyrmex minutus AF079683 Trindade e Tobago

Cyphomyrmex minutus AF079684 Trindade e Tobago

Cyphomyrmex minutus AF079685 Estados Unidos da América

Cyphomyrmex minutus AF079686 Estados Unidos da América

Cyphomyrmex minutus AF079687 Estados Unidos da América

Cyphomyrmex minutus AF079688 Guiana

Cyphomyrmex minutus AF079689 Panamá

Cyphomyrmex rimosus AF079691 Estados Unidos da América

Cyphomyrmex rimosus AF079692 Guiana

Cyphomyrmex rimosus AF079693 Guiana

Cyphomyrmex rimosus AF079694 Trindade e Tobago

Cyphomyrmex rimosus AF079695 Costa Rica

Cyphomyrmex salvini AF079696 Panamá

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5. Conclusão

Com este trabalho conclui-se que se faz necessário ampliar o conhecimento dos dados morfológicos por meio de mais coletas de fungos de vida livre correspondentes a cultivares leveduriformes de fungos da Tribo Leucocoprineae na Ilha de Santa Catarina, sul do Brasil. Também são necessários mais estudos moleculares incluindo novas sequências de fungos que são cultivados e fungos de vida livre para ampliar a compreensão de suas relações filogenéticas, principalmente daqueles que são mantidos pelas formigas na forma leveduriforme, uma vez que estudos envolvendo estes grupos de fungos são pouco abordados na região Neotropical e no Brasil.

Pode-se inferir também que as três espécies descritas no presente trabalho apresentam caracteres que, por vezes, se sobrepõem, dificultando a identificação baseada somente em caracteres morfológicos. Os materiais identificados como Leucocoprinus cf brebissonii apresentaram coloração das esquâmulas em tons mais claros do que está descrito na literatura, dessa forma necessitam de uma análise morfológica mais detalhada conjuntamente a uma análise molecular para correta identificação, o mesmo se aplica para os materiais identificados como Leucocoprinus cf cepistipes, tendo em vista que houve possível confusão entre essas espécies por ambas terem caracteres morfológicos semelhantes.

Fica claro que Leucocoprinus cepistipes e Leucocoprinus cretaceus se tratam de espécies diferentes por apresentarem coloração de esquâmulas distintas, bem como os basidiósporos e basídios de L. cepistipes serem maiores que os de L. cretaceus. Para a confirmação da identificação dos materiais coletados neste trabalho se faz necessário comparar a morfologia com materiais de referência e sequenciar pelo menos a região ITS do DNA para usar como identificador molecular.

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Apêndice A – Descrição de caracteres microscópicos dos materiais SUV47, SUV113, SUV116 e SUV121.

Leucocoprinus sp.

Basidiósporos metacromáticos em azul de Cresyl, dextrinoides em Melzer, hialinos em KOH, congófilos, abundantes, com poro de germinação, parede espessada, formato amplamente elipsoide, medindo (9-)10–11(-12) x 6–8 µm (Q=1,5, n=20). Presença de hifas globulares na pileipelis. Cistídios oblongos, levemente utriformes. Basídios clavados, com quatro esterigmas. Há estruturas globulares com conteúdo refringente em hifas do píleo/lamelas (aproximadamente 3x3 µm e 4x4 µm), como mostra a figura 9.

Material analisado: Brasil, SC, Itapoá: Reserva Particular do Patrimônio Natural de Volta velha – RPPN, 10 de Dezembro de 2011, Urrea-Valencia S 47 (FLOR0051053);

Basidiósporos (9-)10(-12) x 6–8 µm (Q=1,46; n=20) elipsoides a oblongos, fracamente dextrinoides em Melzer, metacromáticos em azul de Cresyl, parede espessada e com poro de germinação. Superfície do píleo irregular a subregular.

Material analisado: Brasil, SC, Florianópolis, Ilha de Santa Catarina: Morro da Lagoa, 13 de Abril de 2012, Urrea-Valencia S 113 (FLOR0050944);

Basidiósporos (9-)11(-14) x 6–8 µm (Q=1,6; n=20), elipsoides a oblogos, dextrinoides em Melzer, metacromáticos em azul de Cresyl, parede espessada e com poro de germinação.

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Basidiósporos (9-)10(-12) x 6–8 µm (Q=1,4; n=20), elipsoides a oblongos, congófilos, dextrinoides em Melzer, metacromáticos em azul de Cresyl, parede espessada e com poro de germinação. Basídios 18–26 x 12–14 µm, clavados e com quatro esterigmas. Superfície do estípe regular.

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Anexo A – Descrição macroscópica da coleta SUV47 Leucocoprinus sp.

Píleo com 25–30 mm de diâmetro, plano, centro inteiramente de cor café-acinzentado claro, dividindo-se em esquâmulas até a margem que é estriada, superfície branca. Contexto menor de 1 mm de espessura, branco. Lamelas 2 mm de largura, livres, próximas, brancas e de margem inteira. Estípe 80–90 mm de largura, 15 mm próximo ao ápice, central, cilíndrico, superfície brilhante, fibrilosa, branca, interior fibriloso. Anel súpero, membranoso e efêmero.