UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E DESENVOLVIMENTO
CAMILA ACORDI DA SILVA
Avaliação comparativa da integridade celular e genética das células estromais mesenquimais do tecido adiposo abdominal e facial humano durante as passagens e
exposição à radiação ultravioleta, em cultivo
FLORIANÓPOLIS 2019
CAMILA ACORDI DA SILVA
Avaliação comparativa da integridade celular e genética das células estromais mesenquimais do tecido adiposo abdominal e facial humano durante as passagens e
exposição à radiação ultravioleta, em cultivo
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do título de Mestre.
Orientador: Profa. Dra. Andréa Gonçalves Trentin Coorientadora: Ms. Priscilla Barros Delben
FLORIANÓPOLIS 2019
CAMILA ACORDI DA SILVA
Avaliação comparativa da integridade celular e genética das células estromais mesenquimais do tecido adiposo abdominal e facial humano durante as passagens e
exposição à radiação ultravioleta, em cultivo
O presente trabalho em nível de mestrado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Geison Souza Izídio , Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof.(a) Carmen Simioni, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof.(a) Luciane Maria Perazzolo, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de mestre em Biologia Celular e do Desenvolvimento.
____________________________ Prof. Dr. Geison Souza Izídio
Coordenador do Programa
____________________________ Prof. Dr.(a) Andréa Gonçalves Trentin
Orientadora
Florianópolis, 15 de Março de 2019.
Assinado de forma digital por Andrea Goncalves Trentin:62837451991 Dados: 2019.08.23 09:09:54 -03'00'
Geison de Souza Izidio:03239439930
Assinado de forma digital por Geison de Souza Izidio:03239439930 Dados: 2019.08.29 14:56:57 -03'00'
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ser meu porto seguro e por me dar equilíbrio na vida acadêmica, profissional e pessoal.
Á Universidade Federal de Santa Catarina pela oportunidade de realizar uma pós-graduação pública de qualidade, e de realizar pesquisa no Brasil.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida. Aos profissionais da UFSC que contribuíram para realização deste trabalho, profissionais da limpeza, manutenção, secretaria e coordenação. Em especial ao grupo LAMEB pelo auxílio nos experimentos.
Agradeço a minha orientadora, Profa. Dra. Andréa Gonçalves Trentin, por sua sabedoria e competência em me orientar. Por me deixar fazer parte de sua equipe desde 2014 do IC ao mestrado no LACERT, pelo incentivo e ajuda durante esta caminhada. Agradeço por me ensinar sobre células-tronco e por abrir portas para o meu caminho.
Ao programa de Pós-Graduação, e a cada professor, pelos aprendizados e conselhos durante esses dois anos. Em especial ao coordenador e Prof. Geison pelo empenho e sabedoria em ouvir seus alunos e solucionar problemas.
A minha coorientadora e amiga Priscilla Barros Delben, palavras não são suficientes para expressar todo o carinho que tenho por ela. É minha inspiração dentro e fora da universidade. Agradeço por toda sua dedicação em estar presente, por cada risada e também pelas lágrimas compartilhadas. Agradeço por ser tão paciente comigo, sempre disposta a me ouvir e a me ensinar. Agradeço por você ficar comigo até tarde da noite e/ou nos finais de semana realizando experimentos. Agradeço por todos os sucos, açaís e doces compartilhados... Foram fundamentais para deixar a rotina mais leve e feliz! Obrigada pelas músicas, pelos emotions, e pelos momentos de descontração. Agradeço por você ter me ajudado a solucionar as indecisões da minha vida. Obrigada por segurar firme a minha mão e acreditar em mim. Gratidão amiga!
Ao médico Dr. Rogério S. Gomes e toda sua equipe do Hospital Dr. Carlos Correa por acolherem a ideia do projeto e colaborarem com a coleta das amostras de tecido adiposo. E a todos os pacientes que aceitaram doar suas amostras de pele para realização deste trabalho.
A minha amiga Adriane Fagundes que de colega de IC se tornou uma grande amiga. Obrigada por sua amizade, pelos trabalhos, pelos diálogos no carro, pelos bares e conversas, e por todos os momentos bons vividos no laboratório e fora dele. Obrigada por existir!
A Laís Andrade, que já chegou conquistando um lugar muito especial no meu coração. Obrigada por me ensinar a manter o sorriso sempre no rosto independente da circunstância. Obrigada por amar a ciência e a vida acadêmica, o mundo vai melhorar muito com suas descobertas. Obrigada por trazer energia boa!
A Bianca Luise Teixeira, por todos os ensinamentos teóricos e os práticos, por toda a sua ajuda no laboratório, obrigada pela parceria!
A Profa. Dra. Debora Cristina Olsson, por sua motivação em estudar e ensinar. Agradeço por me mostrar o caminho da clínica e por me apresentar anjos de 4 patas. Obrigada!
A todos os colegas do grupo LACERT, Alessandra, Augusto, Daniel, Daniely, Denise, Felipe, Maiara, Victor, Prof. Ricardo, que me ajudaram nesse trabalho, e também aqueles que já saíram, mas que foram importantes na minha caminhada até aqui, Gisele, Rafaela, Diana, Helena, Talita, Fernanda, Aruana e Juliano. Muito obrigado!
A Thalli, Tina, Ana, May, Ale, Mi, Bia, Fer, Sami, Gana, Sissa, Mila, agradeço por várias vezes me ouvirem falando de algum trabalho ou congresso, e por compreenderem a minha ausência em alguns momentos. Amo vocês família de amigas!
Ao meu marido Adalto, por me acompanhar em cada passo, apoiando todas as minhas decisões, por me escutar e me ajudar a solucionar qualquer tipo de problema. Obrigado por me fazer acreditar que posso mais do que imagino. Te amo!
Aos meus pais Luiz e Elizeti, minha irmã Nicole, e meus avôs Jorge e Perpetua, pelo apoio, força e carinho, por permanecerem do meu lado em todos os momentos. Obrigado pelo amor e incentivo. Amo vocês imensamente!
“A capacidade definitiva de um homem não está nos momentos de conforto e conveniência, mas nos períodos de desafios e controvérsias” (Martin Luther King).
RESUMO
As células estromais mesenquimais (CEM), originalmente isoladas da medula óssea, estão presentes em vários outros tecidos, como o tecido adiposo (TA) e apresentam grande potencial de uso na Medicina Regenerativa. A facilidade de obtenção, a eficiência e a qualidade das CEM são fundamentais para o sucesso da terapia celular. De acordo com a localização anatômica, o TA é obtido por procedimentos cirúrgicos distintos, como lipoaspiração (mais comum), abdominoplastia e ritidoplastia, além de apresentar origem embrionária diferente. Sabe-se que longos períodos de cultivo podem comprometer a integridade das células levando ao aumento do estresse oxidativo e predispor a danos no DNA. Tendo em vista estes aspectos, neste trabalho foram avaliadas comparativamente as CEM de TA (CEM-TA) facial e abdominal quanto à integridade celular e genética durante a senescência replicativa (passagens baixa, média e alta) e após a exposição à radiação ultravioleta (RUV) A e B. Inicialmente foi avaliado o rendimento tecidual e celular das amostras obtidas do TA por ritidoplastia e lipoaspiração. A seguir, foram avaliados o padrão fenotípico mesenquimal, a morfologia e adesão ao plástico, a viabilidade celular e o acúmulo de yH2AX (biomarcador de dano de DNA) durante as passagens celulares (baixas, médias e
altas) submetidas ou não à RUV. Os resultados mostraram que as CEM analisadas são similares quanto às características mesenquimais: morfologia fusiforme, adesão ao plástico, presença de marcadores de membrana de células mesenquimais e ausência de células hematopoiéticas. Na condição padrão de cultivo (não exposição à RUV), ambas as CEM-TA (faciais e abdominais) apresentaram redução progressiva do número total de células com o aumento das passagens. Destaca-se que as CEM-TA faciais apresentaram maior número de células do que as abdominais em passagens baixas e menor acúmulo de dano antes e após a exposição à RUV-B. Por outro lado, o TA abdominal apresentou melhor rendimento celular e tecidual, e as CEM-TA desta região anatômica, menor acúmulo de dano de DNA após a exposição à RUV-A do que as CEM-TA faciais. Entretanto, após a RUV as CEM-TA de ambas as fontes apresentaram alterações morfológicas durante a expansão celular tornando-se mais espalhadas e hipertróficas, similares às células senescentes. Em conclusão, CEM-TA de diferentes regiões anatômicas possuem propriedades biológicas distintas. Este trabalho fornece ainda evidências da importância de se avaliar a estabilidade das CEM-TA durante o cultivo e expansão celulares visando o uso em futuras aplicações clínicas.
Palavras-chave: Histona -H2AX, tecido adiposo, senescência replicativa, senescência
ABSTRACT
Mesenchymal stromal cells (MSCs), originally isolated from bone marrow, are also found in other tissues, including adipose tissue (TA). They are applicable for the use in the Regenerative Medicine because of the easy obtaining. Therefore, the efficiency and quality of MSCs are fundamental for the success of the cellular therapy. According to the anatomical location, TAs are obtained by distinct surgical procedures, such as liposuction (the most commonly and widely used), abdominoplasty and rhytidoplasty and have different embryonic origin and distribution. Long periods in culture can compromise the cellular integrity resulting in oxidative stress and promoting DNA damage. Therefore, in this study MSCs form facial and abdominal TA were comparatively evaluated regarding cellular and genetic integrity during replicative senescence (at low, medium and high passages) and after exposure to ultraviolet radiation A (UVA) and B (UVB) in culture. The efficiency of tissue and cell obtaining from the TA were evaluated as well as the mesenchymal characterization profile (cell morphology and plastic adhesion, cell viability and accumulation of yH2AX − a DNA
damage biomarker). Both MSC-TAs displayed the mesenchymal fusiform morphology, plastic adhesion and were positives to the mesenchymal cell surface markers and thus were characterized as facial and abdominal adipose tissue mesenchymal stromal cells (ASCs). The total number of ASCs (assessed by nuclei staining with DAPI) progressively decreased with the passages of culture. Under control conditions (no UVA or UVB stimulus) higher number of facial ASCs was recorded at low passages compared to abdominal ASCs. On the other hand, abdominal ASCs displayed higher levels of DNA damage before and after UVB exposure although they showed improved efficiency of cellular and tissue production. Moreover, Both UVA and UVA induced morphological changes in both ASCs that became more spread and hypertrophic during cell expansion and passages. Therefore, ASCs from different anatomical locations display distinct biological properties. In summary, this paper provides evidence for the importance of assessing ASC stability during cell culture and expansion aiming their safer use in future applications of cell therapy and regenerative medicine.
Key words: Histone -H2AX, adipose tissue, replicative senescence, early senescence,
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Classificação e origem das células-tronco...17
Figura 2. A multipotencialidade das MSC...19
Figura 3. Distribuição e tipos de TA...20
Figura 4. Esquema das estruturas e disposições do TA facial e abdominal humano...21
Figura 5. Diferenças embrionárias do TA facial e abdominal...22
Figura 6. Procedimento para obtenção do TA por cirurgia plástica...23
Figura 7. Isolamento das CEM-TA faciais e abdominais...35
Figura 8. Caracterização e análise clonogênica das CEM-TA faciais e abdominais...37
Figura 9. Avaliação da morfologia das CEM-TA, número de células e imunocitoquímica para -H2AX durante a expansão celular...39
Figura 10. Avaliação da morfologia e viabilidade celular das CEM-TA durante a expansão celular após a exposição a UVA e a UVB...42
Figura 11. Imunofluorescência para -H2AX durante a expansão celular das CEM-TA em cultivo e após a irradiação UVA e UVB...43
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AB – Abdômen
ANOVA – Análise de variância ASC – Adipose Stromal Cell
CEM – Células estromais mesenquimais
CEM – TA – Ab – Células estromais mesenquimais derivadas do TA abdominal CEM – TA – Fa – Células estromais mesenquimais derivadas do TA facial CT – Células-tronco
CTCN – Células-tronco da crista neural DBS - Double strand break
DMEM – Dulbecco's modified eagle medium DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Deoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucleico) EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
EO – Estresse oxidativo
EROS - Espécies reativas de oxigênio FA- Face
LACERT – Laboratório de células-tronco e regeneração tecidual LAMEB – Laboratório Multiusuário de Estudo em Biologia MSC – Mesenchymal Stromal Cell
MTS- 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl) -5-(3-carboximetoxifenil) -2-(4sulfofenil) -2H-tetrazolium PBS – Tampão fosfato salina
PS – Penicilina e estreptomicina RUVA – Radiação ultravioleta A RUVB – Radiação ultravioleta B SBF – Soro bovino fetal
TA – Tecido adiposo
TA AB– Tecido adiposo abdominal TA FA – Tecido adiposo facial
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina ɣ-H2AX – Gamma-H2AX
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL...15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...17
2.1. CÉLULAS-TRONCO...17
2.2. CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS (CEM)...18
2.3. TECIDO ADIPOSO...20
2.4. CEM DO TECIDO ADIPOSO (CEM-TA)...23
2.5. AGENTES ESTRESSORES QUE GERAM LESÕES NO DNA...25
2.6. HISTONA -H2AX...26 2.7. SENESCÊNCIA CELULAR...26 2.8. RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA...27 3. JUSTIFICATIVA...28 4. OBJETIVOS...29 4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...29 5. MATERIAIS E MÉTODOS...30 5.1. PACIENTES...30
5.2. CULTURA PRIMÁRIA E ISOLAMENTO DAS CEM-TA...30
5.3. MORFOLOGIA CELULAR...31
5.4. ANÁLISES DO FENÓTIPO MESENQUIMAL...32
5.4.1. Diferenciação osteogênica...32
5.4.2. Diferenciação adipogênica...32
5.4.3. Citometria de fluxo...33
5.4.4. Ensaio de formação de unidade formadora de colônia (CFU-C)...33
5.5. ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR...33
5.6. IMUNOCITOQUÍMICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DO -H2AX...34
5.7. RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA...34
5.8. ANÁLISE ESTATÍSTICAS...35
6. RESULTADOS...35
6.1 ISOLAMENTO E CULTURA CELULAR DAS CEM-TA FACIAIS E ABDOMINAIS...35
6.2. CARACTERIZAÇÃO CELULAR E AVALIAÇÃO CLONOGÊNICA DAS CEM-TA
FACIAIS E ABDOMINAIS...37
6.3. AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA E DA INTEGRIDADE DO DNA DAS CEM DURANTE A EXPANSÃO EM CULTURA...38
6.4. ANÁLISE DO EFEITO DA IRRADIAÇÃO UVA E UVB NA VIABILIDADE DAS CEM-TA FACIAIS E ABDOMINAIS E DANOS NO DNA DURANTE A EXPANSÃO EM CULTURA...40 7. DISCUSSÃO...45 8. CONCLUSÃO...48 REFERÊNCIAS...49 APÊNDICE A...57 APÊNDICE B...60
1. INTRODUÇÃO GERAL
O tecido adiposo (TA) é atualmente considerado um importante órgão com função metabólica e com alto poder regenerativo (JOKINEN, 2017). Desde o século passado, quando a sua participação no metabolismo dos hormônios sexuais foi comprovada, o TA foi reconhecido como um órgão endócrino com diversas funções (FURSTENBERG et al., 2010), e atualmente, com sua heterogeneidade morfológica, funcional e regulatória é considerado fundamental para o controle do metabolismo, imunidade e saciedade (CUNHA; MACHADO, 2014; SCHOETTL, FISHER and USSAR, 2018). Além disso, TA é considerado uma fonte promissora de células-tronco (CT) para aplicações clínicas, devido à abundância e facilidade de obtenção e alto rendimento celular (KIM JEONG, 2014; BEAR, 2013).
Neste sentido, o avanço nas pesquisas em terapia celular foi significativo a partir de 2001 com a descrição de uma nova fonte de células adultas, as células estromais mesenquimais (CEM) isoladas do TA (CEM-TA) (ZUK et al., 2001). No entanto, CEM-TA de localizações anatômicas diferentes podem exibir epítopos de superfície distintos, bem como rendimento celular de obtenção, capacidade de diferenciação e propriedades morfológicas diferenciadas (RUSSO et al., 2014). Isso pode trazer repercussões relevantes na resposta das células, influenciando sua capacidade de autorrenovação, quiescência e/ou senescência e futuras aplicações clínicas (GIBELLINI et al., 2015).
Em cultivo, o fenótipo das CEM-TA pode ser afetado por uma grande variedade de fatores, como, por exemplo, o meio de crescimento, o tipo de suplementação utilizada (soro bovino fetal, lisado de plaquetas, corticoides, antioxidantes), nível de confluência, etc. (BAER E GEIGER, 2012; MAITRA, 2005). Fatores endógenos ou exógenos à célula podem ocasionar lesões no DNA e reduzir suas propriedades de autorrenovação e seu sucesso terapêutico (ZOUBOULIS; MAKRANTONAKI, 2011; BETHEL et al., 2013). Neste sentido a senescência celular ao longo das passagens em cultivo e exposição a agentes estressores como radiação ultravioleta podem ocasionar alterações na morfologia das CEM, aumentando espécies reativas de oxigênio induzindo a apoptose (morte celular programada), e/ou mutações genéticas (HAYFLICK, 1961; SOSINSKA,2016).
Neste sentido, danos que resultam na quebra da dupla fita da molécula de DNA (Double Strand Breaks - DBS) desencadeiam a fosforilação da histona H2AX na serina 139 e
seu acúmulo na forma de isoforma -H2AX no local lesado (COOK, 2009) pode comprometer
a integridade genética e as características e propriedades das CEM-TA.
No entanto, não existem dados na literatura avaliando comparativamente diferentes fontes teciduais de CEM-TA quanto à integridade celular e genética durante a senescência replicativa e frente a agentes estressores. Desse modo, as CEM-TA do abdômen e da face são excelentes modelos para esse tipo de estudo, pois além de possuírem diferentes origens anatômicas e embrionárias, são expostas de forma diversa a fatores estressores como a radiação ultravioleta. Além disso, os procedimentos em cultivos prolongados podem resultar em lesões no DNA. Desse modo, é importante o monitoramento do acúmulo de lesões de DNA e a estabilidade celular e genética das culturas de CEM visando uma futura aplicação terapêutica de qualidade e segurança.
2.0. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. CÉLULAS-TRONCO
Células-tronco (CT) correspondem a células indiferenciadas que possuem a capacidade de se autorrenovar e de diferenciar em tipos celulares especializados. A capacidade de diferenciação é estabelecida dependendo da origem e potencialidade das CT. As CT se dividem assimetricamente originando outra CT e uma célula progenitora que irá se diferenciar em fenótipos celulares de reposição do tecido (LEE et al., 2016; ODORICO et al., 2001; THOMSON, 1998). Podem ser classificadas quanto à fase de desenvolvimento do tecido de origem em embrionárias, fetais ou adultas (SANDERS et al., 2006) e quanto a potencialidade em totipotentes, pluripotentes ou multipotentes (AMORIN et al., 2012). As CT totipotentes são encontradas do estágio embrionário de zigoto à mórula podendo originar todos os tecidos do organismo e anexos embrionários. Já as CT pluripotentes são provenientes da massa celular interna do blastocisto e possuem potencial de diferenciação em todos os tipos celulares do embrião, mas não nos anexos embrionários (AMORIN et al., 2012; WAGERS; WEISSMAN, 2004). As CT fetais e adultas por sua vez são classificadas como multipotentes, pois possuem potencial de diferenciação restrito aos folhetos embrionários de origem e podem gerar e manter os tecidos do organismo (WAGERS; WEISSMAN, 2004; WISLET-GENDEBIEN et al., 2005) (Figura 1).
As CT embrionárias foram sugeridas como as mais versáteis para as aplicações clínicas (ROSSANT, 2001), porém as controvérsias éticas que envolvem o seu uso e a falta de conhecimento sobre os mecanismos que regulam a sua diferenciação e sua capacidade tumorigênica (BLUM E BENVENISTY, 2008), têm estimulado os pesquisadores a procurar fontes de CT mais seguras. Desta forma, estudos têm se dedicado à identificação de CT em tecidos adultos como modo de desenvolver estratégias para a regeneração e reparo tecidual. Além disso, essas células podem ser obtidas de modo autólogo reduzindo as complicações relacionadas à rejeição (BAKSH et al., 2004; RABIE et al., 2007).
Figura 1. Classificação e origem das células-tronco. As células-tronco podem ser classificadas de acordo com a fase de desenvolvimento do tecido de origem (embrionárias, fetais ou adultas) e seu potencial de diferenciação celular (totipotentes, pluripotentes e multipotentes). As CT embrionárias podem
ser totipotentes ou pluripotentes e são encontradas do zigoto ao estágio embrionário da mórula.
Adaptado de YABUT, 2011.
2.2. CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS (CEM)
Dentre as CT adultas, estão às chamadas células-tronco mesenquimais (CTM) que apresentam capacidade de formar colônias aderentes ao plástico e morfologia fusiforme (FRIEDENSTEIN et al., 1987; SCHIPANI; KRONENBERG, 2009). Essa denominação foi baseada na hipótese de que vários tecidos derivados do mesênquima, tais como gordura, sangue do cordão umbilical, fluido amniótico, placenta, polpa dentária, tendões, membrana sinovial e músculo esquelético, sejam gerados por estas células (SCHIPANI; KRONENBERG, 2009) (Figura 2). Além disso, as CTM apresentam importante função parácrina na manutenção e reparo tecidual (ZOMMER, 2018).
O termo CTM foi definido pelo pesquisador Arnold Caplan e durante muito tempo utilizado pela literatura (YOUNG; BLACK, 2004; CAPLAN, 2001). Atualmente, com o avanço das pesquisas e devido à discordância na comunidade científica sobre o comportamento fenotípico in vitro, o termo CTM está sendo substituído por célula estromal mesenquimal (CEM) (BERNARDO; FIBBE, 2013; JEREMIAS et al., 2014), adotado no presente estudo. As CEM devem possuir algumas das características definidas em 2005 pela Sociedade Internacional de Terapia Celular para as CTM, como morfologia fibroblastóide e aderência ao plástico; capacidade de proliferação in vitro e diferenciação em fenótipos mesenquimais (osteogênico, condrogênico e/ou adipogênico) quando cultivadas em condições apropriadas (BERNARDO; FIBBE, 2013; DOMINICI et al., 2006). As CEM são ainda caracterizadas pelo padrão de antígeno membranar de superfície que deve ser positivo para CD105 (endoglina, marcador angiogênico), CD73 (SH3 e SH4) e CD90 (Thy-1) e negativo para CD34 (receptor de células endoteliais), CD45 (marcador de células hematopoéticas) e CD11b ou CD14 (receptor de lipopolissacarídeo) (DA SILVA MEIRELLES; CAPLAN; NARDI, 2008; DOMINICI et al., 2006).
A justificativa para a terapia celular com uso de CEM se deve à sua presença em diversos tecidos, por serem pouco imunogênicas e tumorigênicas e por não apresentarem controvérsias éticas (CHAGASTELLES; NARDI, 2011; RABIE et al., 2007). As CEM têm sido demonstradas capazes de modular a manutenção e o reparo tecidual pela secreção de fatores (ação parácrina). Alguns autores sugerem que esta função parácrina seja mais eficiente para uma terapia do que a aplicação da própria célula em si (JEREMIAS, 2013; ZOMMER, 2018). Em conjunto, estas características tornam as CEM atrativas para uso na medicina regenerativa. Neste sentido, uma série de pesquisas com a utilização de CEM tem se dedicado à busca de fontes alternativas dessas células. Em 2001, uma pesquisa pioneira (ZUK, et al., 2001) identificou e isolou CEM em grande quantidade do tecido adiposo obtido de lipoaspirados humanos.
Figura 2. A multipotencialidade das CEM. As CEM da medula óssea se autorrenovam (seta curvada) e se diferenciam (seta reta) em linhagens mesenquimais.
Adaptado de UCCELLI, MORETTA and PISTOIA, 2008.
2.3. TECIDO ADIPOSO
O tecido adiposo (TA), reconhecido como um sistema endócrino dinâmico e não apenas um órgão inerte de armazenamento de energia (SCHOETTL, FISHER and USSAR, 2018), corresponde a um tecido conjuntivo frouxo responsável por armazenar energia, fornecer rigidez, proteger contra choques mecânicos, manter a homeostase térmica e auxiliar na estática visceral (CUNHA1; CUNHA; MACHADO, 2014). O TA está distribuído em todo o organismo na região subcutânea (TA subcutâneo), infiltrado aos órgãos (TA visceral), medula óssea dentre outros (GESTA et al., 2007) (Figura 3). A distribuição e a função do TA se modificam com a idade, massa gorda máxima em adultos de meia idade, sendo influenciadas pela etnia e gênero (SAELY e DREXEL, 2012).
Figura 3. Distribuição e tipos de tecido adiposo. O TA é amplamente distribuído por todo o organismo humano.
Adaptado de SCHOETTL, FISHER and USSAR, 2018.
O TA subcutâneo, também denominado de tela subcutânea, está localizado subjacente à pele. Na região abdominal, flanco e coxas, o TA pode apresentar dois estratos distintos separados pela fáscia superficial (tecido conjuntivo denso): o areolar (mais superficial e vascularizado) e o lamelar (mais profundo e menos vascularizado, também denominado de camada de reserva de gordura). Além disto, a deposição horizontal do TA abdominal é contínua com septos de tecido conjuntivo denso gerando as bolsas desse tecido nos dois estratos (SILVA, 2010). Na região facial, o TA subcutâneo não apresenta a camada de reserva de gordura, possuindo apenas um estrato (STECCO, 2011). O TA facial, apesar de conter bolsas de adipócitos, apresenta distribuição horizontal irregular, podendo haver tecidos dérmicos ou musculares separando um depósito de TA do outro (ASTON, 2011) (Figura 4).
Figura 4. Esquema das estruturas e disposições do TA facial e abdominal humano. A) Folículo piloso, pele, TA, e tecido muscular. O TA facial é um tecido intermediário localizado entre a pele e a região muscular constituído por uma única camada de adipócitos que contém vasos e nervos. B) Já o TA subcutâneo abdominal está localizado entre a pele e o músculo, e pode apresentar dois estratos distintos separados pela fáscia superficial: a camada areolar (mais superficial e vascularizado) e a camada lamelar (mais
profundo e menos vascularizado).
Adaptado de STECCO, 2011.
O TA é altamente heterogêneo e a sua compartimentalização e deposição anatômica diferem em perfis metabólicos e fisiológicos (KWOK et al., 2016). Na região da face, o TA apresenta origem ectodérmica sendo proveniente da crista neural, uma estrutura transitória originada durante a neurulação de vertebrados. As células da crista neural em associação com outras células oriundas dos folhetos embrionários ectoderma, mesoderma e endoderma, participam da morfogênese do crânio e da face (ADAMEYKO, 2016). Já na região do tronco e membros, o TA apresenta origem mesodérmica sendo proveniente tanto do mesoderma paraxial quanto do mesoderma lateral (tecido adiposo subcutâneo) (BETHEL et al., 2013; RABIE et. al., 2007) (Figura 5).
Camada areolar Camada lamelar Músculo Pele Folículo Piloso A B
Figura 5. Diferenças embrionárias do TA facial e abdominal. A) As células da crista neural migram do neuroectoderma dorsal e organizam o desenvolvimento facial. B) O desenvolvimento do TA
abdominal apresenta origem mesodérmica paraxial e lateral
.
Adaptado de ADAMEYKO, 2016 and ENERBACK, 2010
2.4. CEM DO TECIDO ADIPOSO (CEM-TA)
O TA é um reservatório rico em CEM que podem ser colhidas com procedimentos minimamente invasivos (SBARBATI, et al., 2010; TREMOLADA; COLOMBO; VENTURA, 2016) e de alto rendimento como a lipoaspiração (LADEIRA, et al., 2012; TREMOLADA; COLOMBO; VENTURA, 2016; TSUJI; RUBIN; MARRA, 2014; QOMI, T. R. and SHEYKHHASAN, M, 2017). Outras formas de obtenção de TA incluem os excedentes de ritidoplastia (lifting) facial obtidos como descartes biológicos em cirurgias plásticas (PATROCÍNIO, 2006) (Figura 6).
Figura 6. Procedimento para obtenção do TA por cirurgia plástica. A) Lipoaspiração para obtenção do TA abdominal. B) Ritidoplastia para obtenção do TA facial.
Fonte: Imagem elaborada pela autora deste trabalho (2019).
O aumento de procedimentos estéticos na população, dentre eles a lipoaspiração, fornece TA em abundância. Com um 1 g de TA, 2,0 x 106 células podem ser isoladas (fração estromal), das quais 10% correspondem às CEM (BEAR et al., 2013). Outros autores afirmam que o número de CEM isoladas pode ser ainda maior (BAER E GEIGER, 2012; Kim Jeong, 2014). O rendimento certamente varia com as características dos doadores, como etnia, sexo, idade, histórico de doença e também a localização (subcutânea/gordura visceral), método de obtenção ou condições de cultura celular (BAER E GEIGER, 2012). Ademais, de acordo com a localização anatômica do TA, as CEM podem exibir epítopos de superfície, rendimento celular, capacidade de diferenciação, propriedades morfológicas e função parácrina diferentes (RUSSO et al., 2014). Isso pode influenciar significativamente a resposta destas células, como a capacidade de autorrenovação, quiescência e senescência e afetar futuros tratamentos da medicina regenerativa (RUSSO et al., 2014; GIBELLINI et al., 2015).
Como nos demais tecidos, as CEM-TA sofrem alterações estruturais e morfológicas ao longo do tempo que podem se traduzir na deterioração das suas funções e resultar no
acúmulo de lesões físicas, químicas e/ou mecânicas, potencializadas pela exposição a fatores ambientais. De fato, as áreas mais expostas do corpo, como rosto, pescoço e mãos, estão geralmente sob uma maior influência de fatores extrínsecos (ZOUBOULIS; MAKRANTONAKI, 2011). Com o avanço da idade do organismo, os reservatórios de CEM-TA diminuem, principalmente nas áreas mais expostas aos fatores extrínsecos (BETHEL et
al., 2013). Os danos genéticos são um problema para o uso clínico de CEM por gerar
consequências inesperadas sendo um importante tema de estudo visando à segurança da aplicação terapêutica.
2.5. AGENTES ESTRESSORES QUE GERAM LESÕES NO DNA
O uso terapêutico das CEM requer programas de controle que garantam qualidade, segurança e rastreabilidade, sendo um dos principais cuidados, a integridade genética. Como as demais células, as CEM estão sujeitas a diversos fatores (exógenos e endógenos à célula) que podem gerar danos ao DNA e reduzir o sucesso terapêutico (WYLES et al., 2014; PANICH et al., 2016).
Os danos de DNA são alterações químicas da dupla hélice da molécula que comprometem a estabilidade genômica e o DNA (MENK; MUNFORD, 2014) e ocorrem de forma indireta, pela oxidação, com ataque das bases púricas e pirimídicas, preferencialmente a guanina (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2006). Este processo predispõe à quebra na cadeia do DNA, resultando em quebras de dupla fita, modificando suas bases e podendo trazer diversas consequências como alterações cromossômicas, mutações e apoptose (MENK; MUNFORD, 2014). Mais de vinte diferentes tipos de danos nas bases do DNA foram identificados após exposição a diversas formas de estresse de grande energia (como radiação ʎ e radiação ultravioleta B) e estresse oxidativo (como processos inflamatórios e radiação ultravioleta A), in vitro e in vivo (BERRA et al., 2006).
Os danos de DNA podem ser ocasionados ainda por altas concentrações de espécies reativas de oxigênio (EROS) gerado no organismo e/ou pelo ambiente artificial durante o cultivo celular. O acúmulo desses danos leva à perda da integridade celular e compromete o potencial de diferenciação celular (DUAILIBI, et al., 2012). Quando não reparadas corretamente, as lesões podem ocasionar aumento da taxa de mutação e promover o fenótipo
oncogênico, além de induzir senescência e apoptose (SHEN, 2011), desempenhando papel importante nos processos biológicos de envelhecimento e tumorigênese (MENK; MUNFORD, 2014).
No ambiente natural, diversos agentes estressores geram danos ao DNA, como fatores de crescimento, corticoides, pró-oxidantes (substâncias químicas), radiação solar (radiação ultravioleta A ou B), poluição e outros. Já no ambiente artificial (in vitro), as células podem ser afetadas pelo nível de confluência, suplemento, expansão da cultura, replicação celular, temperatura dentre outros (BAER E GEIGER, 2012; MAITRA et al., 2005). Portanto, o estudo aprofundado e detalhado da resposta celular a esses agentes estressores é fundamental para sua aplicação segura e eficiente na medicina regenerativa.
2.6. HISTONA -H2AX
Os danos que resultam na quebra da dupla fita da molécula de DNA desencadeiam a fosforilação da histona H2AX, uma variante da histona H2A (ROGAKOU, 1998) que por sua vez é uma isoforma da histona (H2) envolvida na formação do nucleossomo, unidade estrutural da cromatina (RICHMOND, 2003). A H2AX é fosforilada na serina 139 em consequência da quebra da dupla fita gerando a isoforma -H2AX que se acumula no local
(COOK, 2009). Esse processo é importante para que a lesão seja sinalizada ao sistema de reparo do DNA (SIDDIQUI et al., β015). Desse modo, o -H2AX é amplamente utilizado
como marcador abundante, rápido e sensível para detecção de lesão de DNA (BANERJEE, 2011; SIDDIQUI, et al., β015). O -H2AX recruta proteínas de correção de danos de DNA
garantindo a sua retenção nos locais de quebra da dupla fita (SIDDIQUI, et al., 2015). Como esses danos podem ocorrer como consequência de diversos processos celulares, incluindo a replicação do DNA, senescência celular, exposição a EROs (BONNER, 2008) e exposição a radiações de alta energia (LOPEZ et al., β01β), a análise da presença de -H2AX é importante
para avaliar a segurança da aplicação terapêutica das CEM-TA (LOPEZ et al., 2012).
Senescência celular é o processo de parada irreversível na proliferação celular em resposta a fatores estressores endógenos ou exógenos (KUILMAN et al., 2010). Está envolvida no envelhecimento celular e perda da função tecidual ao longo da vida e evitando a proliferação de células potencialmente tumorais (VARGAS et al., 2012). Entretanto, mesmo não proliferativas, as células senescentes são metabolicamente ativas e liberam moléculas de sinalização parácrina e autócrina denominado de fenótipo secretório associado à senescência (SAFS – Senescence Associated Secretory Phenotype). As características da célula senescente são comuns aos dois tipos de senescência (replicativa e precoce), como hipertrofia e achatamento celular, membrana celular irregular com muitos prologamentos e fibra de estresse no citoplasma, além da liberação de interleucinas moduladoras inflamatórias e imunológicas, aumento de ciclinas como a p21, heterocromatização, acúmulo da enzima beta galactosidase ácida, perda ou alteração da função celular, e redução da resposta ao microambiente (COPEE et al., 2010).
Desde a descrição por Hayflick e Moorhead da proliferação limitada das células humanas diploides em cultura (HAYFLICK AND MOORHEAD, 1961), os mecanismos da senescência envolvidos em processos biológicos, fisiológicos e patológicos vem sendo estudados (BURTON, 2011). As CEM possuem duração limitada in vitro, de forma similar às células somáticas (WAGNER 2008). O potencial de autorrenovação e de regeneração das CEM é reduzido com as passagens em cultivo o que pode comprometer sua utilização clínica. Após inúmeras passagens, as CEM entram em estágio de senescência replicativa, resultante da perda dos telômeros (fragmento de DNA nas extremidades dos cromossomos) (BAXTER, 2004). Parte do DNA telomérico é reduzida a cada divisão celular até alcançar o Limite de Hayflick, que é o tamanho mínimo para a viabilidade celular, que se ultrapassado pode gerar instabilidade cromossômica (HAYFLICK and MOORHEAD, 1961). Assim, para manter a integridade genética, a célula em senescência replicativa para de forma irreversível o seu ciclo celular. No cultivo prolongado (com o aumento de passagens) as células senescentes permanecem vivas, apesar das alterações em suas funções (ITAHANA, 2001; HAYFLICK e MOORHEAD, 1961).
A senescência precoce, por sua vez, é induzida pelo acúmulo de danos celulares e genéticos que promovem parada irreversível do ciclo celular de forma independente do Limite de Hayflick (RODIER, 2011). Vários eventos podem acelerar e/ou desencadear a senescência
precoce, incluindo diversas formas de estresse, como o oxidativo, liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e danos de DNA (TURINETTO, 2016).
2.8. RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA
Uma das principais causas de senescência precoce é o acúmulo de danos oxidativos ocasionado pela radiação ultravioleta. Devido à sua importância ambiental, a luz solar é um importante exemplo de agente exógeno que pode causar alterações no DNA. A superfície terrestre recebe diversos tipos de energia radioativa do sol, classificadas como radiação eletromagnética não ionizada, luz ultravioleta (UV), luz visível e luz infravermelha (KOCHEVAR et al, 2008). A luz UV é o componente mais prejudicial e mutagênico do espectro da radiação solar (RAVANAT el al, 2001).
A luz UV representa 45% de todo espectro solar, situa-se abaixo do comprimento de onda de luz visível e é classificada em três faixas de acordo com seu comprimento de onda: UVA (400 – 315 nm), UVB (315 – 280 nm) e UVC (280 – 100 nm), que não atinge a superfície terrestre (ROWLAND, 2006). Cerca de 95% da emissão UV da luz solar natural que atinge a Terra é a UVA (SAGE et al., 2012). Assim como UVB, UVA é capaz de ultrapassar a barreira da pele causando inúmeros danos na molécula de DNA e consequentemente nas células (CORREA, 2015).
A luz UVB é a mais energética, e mesmo atingindo as camadas superficiais da pele, é responsável por 90% dos danos provocados pela luz sol por ser amplamente absorvida pelo DNA (WOOLLONS et al., 1997; JAGGER, 1985; HEARST, 1995; FRIEDBERG et al., 2006; JEONG et al, 2013). Já a radiação UVA, apesar de ser menos energética, tem alto poder de penetração e atinge as camadas mais profundas da pele, cujo efeito biológico principal é o fotoenvelhecimento (CORREA, 2015). Os fótons de luz UVA são em sua maior parte absorvidos pela melanina, mas parte deles também é absorvida por proteínas ou ácidos nucléicos promovendo mutações e gerando espécies reativas de oxigênio (EROs) e danos oxidativos (BURTON, 2011). O acúmulo progressivos desses danos pode conduzir as células ao estado apoptótico, senescente ou neoplásico (BERRA, 2006).
A terapia celular com CEM apresenta grande potencialidade para tratamento de inúmeras condições fisiopatológicas. Assim, a busca por melhores fontes teciduais e procedimentos de manuseio destas células in vitro são alvo de muitas pesquisas. Uma importante fonte de CEM é o tecido adiposo. Este tecido é relativamente fácil de obter de modo minimamente invasivo com alto rendimento celular, que possibilita o uso autólogo sem necessidade de expansão in vitro. Além disso, o TA é considerado uma fonte de CEM de custo mais acessível pelo uso reduzido de meios e reagentes de laboratório.
As CEM do TA apresentam potencial de diferenciação em múltiplas linhagens celulares de maneira regular e reprodutível e são obtidas de muitas formas sendo as mais utilizadas a lipoaspiração abdominal e ritidoplastia facial. Entretanto, o TA do abdômen e da face, além de possuírem diferentes origens embrionárias, são expostos de forma diferencial a diversos fatores estressores. Além disso, os procedimentos prolongados em cultura podem resultar em lesões ao DNA das células obtidas do TA. Por isso, o monitoramento de dano de DNA é fundamental para avaliar a estabilidade genética durante o cultivo de CEM, especialmente as destinadas aos procedimentos de terapia celular (WILSON; BOHR, 2007). Os resultados deste trabalho poderão direcionar o uso melhor e mais seguro das CEM do TA em futuras aplicações terapêuticas bem como auxiliar na compreensão da biologia destas células frente a estímulos danosos ao DNA.
4. OBJETIVOS
Analisar comparativamente as CEM faciais e abdominais humanas quanto à integridade celular após a exposição à radiação ultravioleta (UVA e UVB) em cultivo.
4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Analisar comparativamente o rendimento tecidual e celular das amostras de TA provenientes de ritidoplastia e lipoaspiração;
2. Avaliar comparativamente o padrão fenotípico mesenquimal das CEM faciais e abdominais humanas;
3. Padronizar a exposição à radiação ultravioleta B (RUVB) em culturas de CEM faciais e abdominais;
4. Analisar comparativamente as CEM faciais e abdominais humanas em passagens baixas (P3-P8), médias (P14-P17) e altas (P25-P35) de cultivo quanto à morfologia, adesão ao plástico, viabilidade e acúmulo de -H2AX;
5. Analisar comparativamente, em passagens baixas, médias e altas, as CEM faciais e abdominais humanas irradiadas com UVA e UVB, quanto à morfologia, adesão ao plástico, viabilidade e acúmulo de -H2AX.
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. PACIENTES
Os fragmentos de pele humana e tecido adiposo subcutâneo foram obtidos de três pacientes do sexo feminino com a faixa de idade entre 54-56 anos e média de idade de 55 anos submetidas ao lifting facial (ritidoplastia para isolamento da CEM-TA-Fa) e três pacientes do sexo feminino com faixa de idade entre 44-46 anos e média de idade de 45 anos submetidas à lipoaspiração abdominal (para isolamento da CEM-TA-Ab), e todas as pacientes sem doenças crônicas virais, metabólicas, isquêmicas, autoimunes ou outras. Idade, bem como etnia e índice de massa corporal (IMC) de cada paciente foram levados em conta. Os pacientes consentiram em participar de acordo com as diretrizes estabelecidas para ensaios clínicos em humanos, de acordo com os princípios éticos estabelecidos pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) tendo recebido certificado de aprovação (certificado 2.963.519) do Comitê de Ética na Pesquisa em Seres Humanos (CEPSH) da Universidade Federal de Santa Catarina. Os tecidos adiposos subcutâneos faciais e abdominais humanos foram considerados como resíduo biológico e obtidos do Centro de Cirurgia Plástica do Hospital Dr. Carlos Corrêa (Brasil).
Os fragmentos de tecido adiposo facial e abdominal foram obtidos em condições assépticas, transferidos para frascos estéreis contendo tampão fosfato (PBS) suplementado com penicilina e estreptomicina (PS, 1U/g, Gibco) e imediatamente transportados a 4oC para o Laboratório de Células-Tronco e Regeneração Tecidual (LACERT) da Universidade Federal de Santa Catarina para os seguintes procedimentos experimentais.
As CEM do tecido adiposo abdominal (CEM-TA-Ab) foram obtidas a partir do lipoaspirado manuseado em cabine de proteção biológica (Vecco, EUA) na sala de cultivo celular. O lipoaspirado foi lavado com PBS (phosphate buffered saline, Gibco, EUA) e incubado com colagenase tipo I [0,010 g/ml] (Sigma-Aldrich, EUA) durante 40 minutos, a 37ºC. Amostras de tecido adiposo facial e abdominal foram pesadas e o volume calculado. A enzima foi neutralizada em DMEM (Sigma-Aldrich, EUA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF – Vitrocel, USA), e a suspensão obtida foi filtrada em malha de 70 um e seguido de centrifugação durante 5 minutos a 382 g. O pellet foi suspendido em tampão de lise de hemácias (NH4Cl; KHCO3; EDTA; ddH2O), mantidas em banho maria à 37ºC durante
10 minutos e novamente centrifugado por 5 minutos em 382 g. Em seguida, o sobrenadante foi descartado, as células suspensas em DMEM suplementado com 10% de SBF, estreptomicina ([10μg/ml]; Sigma-Aldrich, USA) e penicilina ([200U/ml]; Sigma-Aldrich, USA), semeadas em garrafas de cultura de 25 cm2 (Corning, EUA) e mantidas a 37ºC, 5% CO2. Houve troca de meio de cultivo celular diariamente durante os três primeiros dias,
selecionando assim apenas as células aderentes ao plástico. Esta foi considerada neste trabalho como condição padrão de cultivo celular.
Para a obtenção das CEM derivadas do tecido adiposo facial (CEM-TA-Fa) foram utilizados excedentes de pele oriundos da região temporal da face. A tela subcutânea foi separada mecanicamente da derme e incubada com colagenase I durante 40 minutos. O restante do procedimento de isolamento seguiu os passos descritos acima para o isolamento das CEM-TA-Ab. As CEM-TA na cultura primária (passagem zero, P0) foram obtidas por tripsinização (tripsina a 0,05% / EDTA a 0,02%) a 90% de confluência. As células foram plaqueadas em meio completo a 1: 2 da densidade inicial. O procedimento foi repetido quando as monocamadas atingiram 90% de confluência para a próxima passagem (P). Os experimentos foram realizados em passagens baixas (P3 a P8), médias (P14 a P17) e altas (P25 a P35).
As CEM-TA foram criopreservadas em várias passagens (P3 a P35) em 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e 90% de solução SBF a uma densidade de 1x106 células por tubo criogênico (Starstedt, Alemanha, 1 ml em cada tubo) e armazenadas no ultrafreezer (-80 °C , Bosch, Alemanha) durante a noite, e depois em nitrogênio líquido para posterior análise. As células foram descongeladas em DMEM a 90%/SBF a 10%, centrifugadas (382 x g, 5 minutos), suspensas em meio completo e cultivadas como descrito acima.
5.3. MORFOLOGIA CELULAR
Análises morfológicas foram realizadas em todas as passagens celulares por microscopia de contraste de fase na ampliação de 10X e algumas imagens na ampliação de 40X (Olympus DP71) e fotografias foram tiradas com um sistema de captura de imagem (Olympus MVX10).
5.4.ANÁLISES DO FENÓTIPO MESENQUIMAL
5.4.1. Diferenciação osteogênica
A diferenciação osteogênica foi realizada conforme descrito anteriormente (COURA et al 2008) com modificações. Resumidamente, as CEM-TA faciais ou CEM-TA abdominais em P3-P8 foram semeadas a uma densidade de 104 células/poço em meio completo até 100% de confluência e depois transferidas para meio indutivo osteogênico consistindo de meio completo suplementado com 10-8 M dexametasona, 5 μg/ml de ácido ascórbico, 3,15 mg/mL de -glicerofosfato (todos da Sigma Aldrich). As células foram mantidas a 37ºC e 5% de CO2
durante 28 dias, com troca de meio a cada 3 dias. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com uma solução vermelho de alizarina a 2% (Sigma Aldrich) durante 10 min para observação dos depósitos de cálcio cor de laranja-vermelho.
A diferenciação adipogênica também foi realizada como descrito anteriormente (COURA et al 2008) com modificações. Resumidamente, as monocamadas de CEM-TA faciais e abdominais 90% confluentes em P3-P8 foram cultivadas em meio completo suplementado com 10-2 M de dexametasona, 100 μM de indometacina, β,5 μg/ml de insulina e 0,5 mM de isobutilmetilxantina (todas da Sigma Aldrich). As células foram mantidas a 37ºC e 5% de CO2 durante 22 dias, com troca de meio a cada 3 dias. As células foram fixadas com
paraformaldeído a 4% e coradas com uma solução de Oil Red O a 2% (Sigma Aldrich) durante 10 min para observação de vacúolos lipídicos de cor vermelha em células diferenciadas.
5.4.3. Citometria de fluxo
A citometria de fluxo foi realizada para a detecção dos marcadores antigênicos CD34, CD45, CD73, CD90 e CD105 como previamente descrito (JEREMIAS et al., 2014). Resumidamente, 1x105 CEM-TA faciais ou abdominais em P3 foram obtidas por tripsinização e incubadas com os seguintes anticorpos conjugados com fluorocromos: anti-CD34 (PE/clone 581), anti-CD45 (FITC/clone HI30), anti-CD73 (PE/clone AD2), anti-CD90 (FITC/clone 5E10) e anti-CD105 (PercP/clone 266) (1 h, 4oC, escuro; todos da BD Bioscience). Frações de glóbulos brancos foram usadas como controles positivos para CD34 e CD45. A coloração de controle negativo foi realizada utilizando anticorpos de isotipo IgG de camundongo conjugados com fluoróforos. As células foram então lavadas com PBS e avaliadas por citometria de fluxo (FACS Scalibur; BD Biosciences). Os dados foram analisados pelo Flowing Software (Centro Turku de Biotecnologia, Universidade de Turku, Finlândia).
5.4.4. Ensaio de formação de unidade formadora de colônia (CFU-C)
A análise do ensaio de unidades formadoras de colônia foi realizada como descrito anteriormente (ALT et al, 2011). Resumidamente, as culturas de CEM-TA faciais ou abdominais em P3 foram tripsinizadas e semeadas a baixa densidade (50 células/cm2) e cultivadas durante 5 dias. As células foram então fixadas em paraformaldeído a 4%, coradas
com violeta de cristal a 2% (10 min). Colônias contendo 10 ou mais células foram contadas, bem como o número de células por colônia e a eficiência clonal foi expressa como a proporção de células plaqueadas que formaram colônias. Os dados foram plotados em gráficos e analisados pelo software Graph Pad Prism.
5.5. ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR
A viabilidade das células CEM-TA faciais e abdominais foi avaliada por ensaio MTS [(3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4sulfofenil) -2H-tetrazólio] utilizando o kit CellTiter 96 AQueous Ensaio de Proliferação Celular N Radioativo (Promega) de acordo com instruções do fabricante. Resumidamente, as células em passagens baixas (P3-P8), médias (P14-P17) e altas (P25-P35) foram semeadas em triplicata a uma densidade de 2.000 células/poço de uma placa de 96 poços e, após 24, 48 e 72 horas, incubadas com MTS dissolvido em meio completo por 3 horas a 37ºC e 5% de CO2, sendo os meios posteriormente
substituídos por 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma- Aldrich, EUA) e a absorbância medida a 480nm em um multileitor de placas (SpectraMax Paradigm).
5.6. IMUNOCITOQUÍMICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DO -H2AX
As quebras de fita dupla foram avaliadas por imunomarcação para -H2AX, um
marcador para esse dano ao DNA (KUO and YANG, 2008; LOPEZ et al, 2012) como descrito anteriormente (SIDDIQUI, et al., 2015). As CEM-TA faciais e abdominais em passagens baixas, médias e altas foram cultivadas sob condições padrão, descritas acima, durante 3 dias. Em alguns experimentos, foram submetidos à irradiação UVA ou UVB, conforme descrito abaixo. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 30 minutos à temperatura ambiente e permeabilizadas com Triton a 0,5%, seguido do bloqueio de sítios inespecíficos com PBS 10%. As amostras foram então incubadas com o anticorpo primário anti-fosfo-histona H2A.X, isotipo IgG1 (ser 139, clone JBW301, Millipore, EUA) a 1:200 durante 60 minutos à temperatura ambiente, seguido da incubação com o anticorpo secundário anti-mouse Alexa Fluor 488, isotipo IgG, a 1:500, durante 60 minutos à temperatura ambiente. Os citoplasmas foram corados com Alexa Fluor 594 (Phalloidin),
isotipo IgG, anti-coelho, a 1:40 por 20 minutos em temperatura ambiente e os núcleos celulares corados com DAPI (4´-6-diamidina-2-fenilindol) a 1:1000 durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram visualizadas em um microscópio de epifluorescência inversa (OLYMPUS, IX71) e imagens captadas em ampliação de 100X e 400X usando uma câmera Olympus MVX10. Células exibindo dois ou mais focos -H2AX e marcação irregular
de pontos distintos no núcleo foram consideradas positivas.
5.7. RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA
As CEM-TA faciais e abdominais em passagens baixas (P3-P8), médias (P14-P17) e altas (P25-P35) foram semeadas a uma densidade de 2x103 células/poço em uma placa de 96 poços e cultivadas por 2 dias em meio completo em 37ºC e 5% de CO2. As culturas foram
irradiadas (0,56 W /cm2) em caixa fechada contendo uma lâmpada Vilber Lourmat (VL-6 - LM; 230 V; e 50/60 HZ), durante 15, 30 ou 60 minutos (UVA) e 7, 14 ou 28 minutos (UVB), correspondendo a 15, 30 e 60 mJ/cm2, respectivamente. Uma cultura controle, mantida em PBS, foi utilizada em todas as dosagens.
5.8. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad versão 5 para Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Os dados são mostrados como a média ± desvio padrão. Foram realizados os testes ANOVA de duas vias, com pós-teste de Tukey. Todos os experimentos foram realizados com pelo menos 3 réplicas biológicas (3 doadores) e experimentais. Diferenças entre os valores médios foram consideradas significativas quando p <0,05.
6. RESULTADOS
As CEM-TA faciais foram isoladas de 3g do tecido inicial (tecido adiposo facial da ritidoplastia) (Figura 7 A, B) que resultou em 4,5 ml de suspensão de tecido após dissociação mecânica e digestão com colagenase I (Figura 7C) e em 0,1 ml de sedimento celular após processamento (Figura 7 D). As CEM-TA abdominais por outro lado, foram isoladas de 50 ml de lipossucção abdominal (Figura 7 E, F) produzindo 17,5 ml de suspensão de tecido adiposo após digestão com colagenase I (Figura 7G) e em 0,6 ml de pellet celular após processamento (Figura 7 H).
Figura 7. Isolamento das TA faciais e abdominais. TA-Fa (A - D) e CEM-TA-Ab (E - H). Painel superior: (A, B) fragmentos da pele facial por ritidoplastia. Suspensão do tecido adiposo facial (C) após lavagem com PBS e dissociação mecânica e digestão com colagenase I e (D) sedimento celular
após o processamento. Painel inferior: (E, F) procedimento de lipoaspiração abdominal. Suspensão do tecido adiposo abdominal (G) após lavagem com PBS e digestão com colagenase I e (H) sedimento celular após o
Fonte: Imagem elaborada pela autora deste trabalho (2019).
Ambos as CEM-TA faciais e abdominais aderiram ao plástico da placa de cultura exibindo a morfologia fusiforme mesenquimal e atingiram a confluência no dia 3 de cultura primária, quando foram subcultivadas para a passagem 1 (P1).
Embora obtidos por diferentes quantidades de tecidos iniciais e processamento, as CEM-TA faciais e abdominais expandiram-se de forma semelhante em cultura primária e
também foram equivalentes em relação à característica CEM de adesão e morfologia fibroblastóide (Fig. 2A).
6.2. CARACTERIZAÇÃO CELULAR E AVALIAÇÃO CLONOGÊNICA DAS CEM-TA FACIAIS E ABDOMINAIS
Análises de citometria de fluxo revelaram que tanto as CEM-TA faciais como as abdominais foram negativas para os marcadores hematopoiéticos CD34 (99% e 98%, respectivamente) e CD45 (99% e 99%, respectivamente) e positivas para os marcadores mesenquimais CD73 (97% e 99%, respectivamente) e CD90 (96% e 99%, respectivamente) (Figura 8B).
Após a avaliação da expressão de marcadores de superfície celular, a capacidade de se diferenciar em derivados mesodérmicos foi avaliada (Fig. 8C). Ambas as CEM-TA foram capazes de se diferenciar em osteócitos e adipócitos identificados por matriz extracelular calcificada corada por Alizarina Vermelho, e por inclusões lipídicas coradas por óleo vermelho, respectivamente.
Posteriormente, a capacidade clonogênica das CEM foi avaliada pelo ensaio de formação de colônias (Figura 8D). Ambas as CEM-TA faciais e abdominais foram capazes de gerar colônias fibroblastóides in vitro sendo que as CEM-TA faciais apresentaram maior eficiência clonal mas com tamanho menor de colônia (1x menos células por colônia) que as abdominais.
Portanto, esses dados de marcadores imunofenotípicos e o potencial de diferenciação, juntamente com a capacidade de adesão plástica, morfologia alongada e potencial clonogênico, indicam que tanto as CEM-TA faciais como as abdominais isoladas e cultivadas sob nossas condições de cultura apresentam as características das CEM.
Figura 8. Caracterização e análise clonogênica das CEM-TA faciais e abdominais. (A) Microscopia de contraste de fase das CEM-TA-Fa e CEM-TA-Ab aos 2 dias de cultura (P3)
revelando a morfologia das células e capacidade de adesão plástica. Barra de escala = β00 μm. (B) Histogramas representativos da análise imunofenotípica por citometria de fluxo. (C) Diferenciação mesenquimal. As gotículas
lipídicas coradas pelo Red Sudan (parte superior) e a matriz de cálcio extracelular corada pelo Vermelho de Alizarina (painel inferior) revelaram potencial de diferenciação fenotípica adipogênica e osteogênica, respectivamente. Barra de escala: β00 μm. (D) Fotomicrografias representativas de colônias das CEM-TA-Fa e
CEM-TA-Ab coradas com Oil red e vermelho de alizarina. Os limites das colônias são destacados em linha pontilhada. Barra de escala: β00 μm. Todos os dados são a média ± DP de γ réplicas biológicas (doadores).
Fonte: Imagem elaborada pela autora deste trabalho (2019).
6.3. AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA E DA INTEGRIDADE DO DNA DAS CEM DURANTE A EXPANSÃO EM CULTURA
Durante os procedimentos de cultura, 48 horas após a semeadura, ambas as CEM-TA faciais e abdominais foram aderentes ao plástico e exibiram a morfologia fusiformes nas passagens baixas (P3-P8) e médias (P14-P17). Em passagens altas (P25-P35), entretanto, as células apresentaram morfologia espalhada e hipertróficas exibindo extensões citoplasmáticas (Figura 9A, coluna da esquerda) semelhantes às células senescentes (YAJUN et al., 2016). Redução progressiva no número de CEM-TA faciais e abdominais avaliadas pela quantificação de núcleos corados com DAPI foi observada durante as passagens (Figura 9B). Além disso, em P3-P8, as CEM-TA faciais exibiram 88 células/campo, 1,2 vezes mais que as CEM-TA abdominais. Nas P14-P17, no entanto, ambos as CEM-TA faciais e abdominais,
exibiram cerca de 55 células/campo, uma redução de 1,6 vezes e 1,3 vezes, respectivamente, em comparação com as passagens baixas. Redução adicional no número de células para cerca de 45 células/campo (diminuição de 1,2 vezes em comparação com P14-P17) também foi observada em P25-P35 para ambas, sugerindo senescência replicativa progressiva.
Em seguida, o dano ao DNA foi avaliado pela quantificação de -H2AX (Figura 9A,
coluna da esquerda e C), um marcador de lesão de DNA e integridade celular (COOK, 2009; SIDDIQUI, et al., 2015). A coloração por imunofluorescência revelou focos de -H2AX nas
CEM-TA faciais e abdominais em todos as P3-P8, P14-P17 e P25-P35. Em passagens baixas (P3-P8), 28% de CEM-TA faciais e 68% de CEM-TA abdominais positivas para -H2AX por
campo foram registrados (2,4 vezes maior em CEM-TA abdominais em comparação com as faciais, Figura 9C). A proporção de CEM-TA faciais positivas para -H2AX aumentou 2,4
vezes (67% células/campo) em P14-P17 e permaneceu constante em P25-P35 (68% células/campo). Para as CEM-TA abdominais, no entanto, os valores em P14-P17 e P25-P35 permaneceram semelhantes aos de P3-P8 (85 e 72 células/campo, respectivamente).
Juntos, esses dados sugerem que tanto as CEM-TA faciais quanto as abdominais sofrem senescência replicativa progressiva e danos no DNA durante a expansão (após passagens médias) em cultura. As CEM-TA abdominais iniciam este processo ainda em passagens baixas quando as CEM-TA- faciais exibem níveis significativamente mais baixos de senescência.
Figura 9. Avaliação da morfologia das CEM-TA, número de células e imunocitoquímica para γ-H2AX durante a expansão celular. (A) Coluna esquerda: Fotomicrografia em fase de contraste das CEM-TA-Fa e das CEM-TA-Ab após 48 horas de plaqueamento em passagens baixas (P3-P8), médias (P14-P17) e altas (P25-P35). Coluna da direita: Imagens imunofluorescentes
da -H2AX na imunomarcação das CEM-TA-Fa e das CEM-TA-Ab aos 3 dias de cultura em P3-P8, P14-P17 e
P25-Pγ5. Barra de escala = β00 μm. (B) Quantificação do número total de núcleos celulares corados por DAPI por campo microscópico (aumento de 10x) em P3-P8, P14-P17 e P25-P35. (C) Proporção das CEM-TA faciais e das CEM-TA abdominais positivas para -H2AX em relação ao número total de células. Os valores são expressos
como média ± desvio padrão de três experimentos independentes realizados em triplicata. ** p <0,01 e *** p <0,001 entre as CEM-TA-Fa e das CEM-TA-Ab pelo teste t de Student. # p <0,05, ## p <0,01 e ### p <0,001 vs.
Fonte: Imagem elaborada pela autora deste trabalho (2019).
6.4. ANÁLISE DO EFEITO DA IRRADIAÇÃO UVA E UVB NA VIABILIDADE DAS CEM-TA FACIAIS E ABDOMINAIS E DANOS NO DNA DURANTE A EXPANSÃO EM CULTURA
Como as irradiações UVA e UVB mostraram-se envolvidas no fotoenvelhecimento da pele (devido à sua abundância e profundidade de penetração) (CORREA, 2015) e nos danos ao DNA e modulação imune anormal (que resultam em cânceres de pele) (BOWDEN, 2004), respectivamente, investigamos seu possível envolvimento na morfologia e o crescimento das CEM-TA faciais e abdominais (Fig. 10) e ao dano ao DNA (Fig. 11) durante a expansão em cultura.
Foi utilizada a dosagem subletal de 5J/cm2 de radiação UVA para as CEM, previamente determinada no LACERT (BARROS-DELBEN, P, não publicado). Os resultados revelaram que após a exposição UVA, tanto as TA faciais quanto as CEM-TA abdominais apresentaram alteração da morfologia alongada e fusiforme para a mais espalhada e hipertrófica com área citoplasmática aumentada contendo vesículas em todas as passagens (P3-P8, P14-P17 e P25-P35) (Figura 10A, coluna esquerda) sugerindo senescência celular. Após a irradiação UVA, foi observada diminuição progressiva do número de células por campo através das passagens. Em P3-P8, as culturas de CEM-TA faciais e abdominais continham 61 células/campo e 46 células/campo, respectivamente (Figura 10B), representando uma redução de 1,4 vezes e 1,6 vezes, respectivamente, em relação às culturas e passagens correspondentes não expostas. (Figura 9 B), com valores 1,3 vezes maiores nas CEM-TA faciais do que nas abdominais. Em P14-P17, ambas as CEM-TA exibiram 36 células/campo, representando uma redução de 1,5 vezes em relação às culturas e passagens correspondentes não expostas (Figura 9B). Redução mais intensa ainda no número de CEM-TA por campo (17 células/campo para as faciais e 8 células/campo para as abdominais) foi registrada em P25-P35 em comparação com as culturas correspondentes não expostas mostradas na Figura 9B (2,7 vezes e 5,6 vezes , respectivamente), com valores 2,1 vezes maiores nas CEM-TA faciais quando comparados com as abdominais.
A dosagem subletal de UVB foi determinada por irradiação de culturas de CEM com irradiações de 15, 30 e 60 mJ/cm2 e avaliação da viabilidade celular por ensaio MTS (Fig. 10C). A dosagem de 15 mJ/cm2 promoveu a redução de 2,3 vezes na absorbância por MTS de ambas as CEM-TA em comparação com as respectivas culturas não expostas (controle, Figura 10C). Além disso, a dosagem de 30 mJ/cm2 diminuiu em 1,6 vezes e 2,2 vezes (1,6 vezes maior em CEM-TA faciais comparado as abdominais) e a de 60 mJ/cm2 em 2,2 vezes e 2,7 vezes os valores de CEM-TA faciais e abdominais, respectivamente, em comparação com as respectivas culturas de controle. Uma vez que todas as doses de irradiação UVB diminuíram a viabilidade das CEM, 30 mJ/cm2 foi usado nos experimentos seguintes, porque foi a dosagem não letal mais precisa e forte.
Quanto à irradiação UVA, ambas as culturas, CEM-TA faciais e abdominais, em todas as passagens apresentaram alterações morfológicas após a exposição ao UVB (Figura 10A, coluna da direita). No entanto, uma grande diminuição no número de CEM-TA faciais e
abdominais por campo (Figura 10D) em relação às culturas correspondentes não expostas (Figura 9B) foi observada em todas as passagens: 6,3 vezes e 9,3 vezes, respectivamente, em P3-P8 (1,5 vezes maior nas CEM-TA faciais quando comparado as abdominais) e 3,4 vezes e 11 vezes, respectivamente, em P14-P17 (3,3 vezes maior em CEM-TA faciais comparado as abdominais) e 5,1 vezes e 9 vezes, respectivamente em P25 -P35.
Figura 10. Avaliação da morfologia e viabilidade celular das CEM-TA durante a expansão celular após exposição à UVA e UVB. (A) Fotomicrografia de contraste de fase das CEM-TA-Fa e das CEM-TA-Ab após 48 horas de plaqueamento e irradiação com UVA (5J, coluna da esquerda)
e com UVB (30 mJ/cm2, coluna direita) em baixo (P3-P8), médio (P14- P17) e passagens altas (P25-P35). Barra de escala = β00 μm. (B) Quantificação do número total de núcleos celulares corados por DAPI por campo microscópico (aumento de 10x) em P3-P8, P14-P17 e P25-P35 após irradiação UVA. (C) CEM-TA-Fa e das
CEM-TA-Ab (ambas na passagem P3-P8) viabilidade por ensaio MTS após 48 horas de plaqueamento e irradiação UVB a 15, 30 ou 60 mJ/cm2 expressa como absorvência a 480 nm. (D) Quantificação do número total
de núcleos celulares corados por DAPI por campo microscópico (aumento de 10x) em P3-P8, P14-P17 e P25-P35 após irradiação UVB. Os valores são expressos como média ± desvio padrão de três experimentos independentes realizados em triplicata. * p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001 entre as CEM-TA faciais e das
CEM-TA abdominais pelo teste t de Student. ## p <0,01 e ### p <0,001 vs. a respectiva CEM em P3-P8 (passagem baixa) por ANOVA com teste post-hoc de Tukey.
Fonte: Imagem elaborada pela autora deste trabalho (2019).
Como a radiação UV causa quebras na cadeia dupla do DNA levando a um bloqueio da replicação do DNA (HEARST, 1995; FRIEDBERG et al., 2006), foi avaliado o número de células positivas para -H2AX após exposição à UVA (Fig. 11A, coluna esquerda) e UVB
(Figura 11A, coluna da direita) durante a expansão das CEM-TA faciais e abdominais em cultura. Os resultados mostraram 58 células/campo de CEM-TA faciais positivas para -H2AX
após a irradiação UVA em P3-P8, aumentando 1,5 vezes em P14-P17 e 1,4 vezes em P25-P35 (Figura 11B) em comparação com valores de passagens baixas (P3-P8). Os resultados mostraram que 15 CEM-TA abdominais/campo foram positivas para -H2AX após irradiação
UVA em P3-P8 (3,9 vezes menor que CEM-TA faciais), aumentando 5,5 vezes em P14-P17 e 5,3 vezes em P25-P35 em comparação com passagens baixas. Após a irradiação UVB, no entanto, 64 células/campo de CEM-TA faciais foram positivas para y-H2AX, aumentando para
