GABRIELA QUEILA DE CARVALHO SIQUEIRA
INVESTIGAÇÃO DE VARIANTES ASSOCIADAS COM A ÚLCERA DE PERNA NA ANEMIA FALCIFORME POR MEIO DE SEQUENCIAMENTO DE EXOMAS
CAMPINAS 2019
GABRIELA QUEILA DE CARVALHO SIQUEIRA
INVESTIGAÇÃO DE VARIANTES ASSOCIADAS COM A ÚLCERA DE PERNA NA ANEMIA FALCIFORME POR MEIO DE SEQUENCIAMENTO DE EXOMAS
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de doutora em Ciências, na área de concentração de Clínica Médica
ORIENTADORA: MÔNICA BARBOSA DE MELO
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA GABRIELA QUEILA DE CARVALHO SIQUEIRA E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MÔNICA BARBOSA DE MELO
CAMPINAS 2019
Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Rosana Evangelista Poderoso - CRB 6652
Carvalho-Siqueira, Gabriela Queila de,
C253i CarInvestigação de variantes associadas com a úlcera de perna na anemia falciforme por meio de sequenciamento de exomas / Gabriela Queila de Carvalho Siqueira. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
CarOrientador: Mônica Barbosa de Melo.
CarTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Car1. Anemia falciforme. 2. Sequenciamento do exoma. 3. Úlcera da perna. I. Melo, Mônica Barbosa, 1968-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Investigation of variants associated with leg ulcers in sickle cell anemia through exome sequencing
Palavras-chave em inglês: Sickle cell anemia
Exome sequencing Leg ulcers
Área de concentração: Clínica Médica Titulação: Doutora em Ciências Banca examinadora:
Mônica Barbosa de Melo [Orientador] Cristiane de Souza Rocha
Magnun Nueldo Nunes dos Santos Anderson Ferreira da Cunha Maria Stella Figueiredo Data de defesa: 28-06-2019
Programa de Pós-Graduação: Clínica Médica
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-2976-9759 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/3649543216689705
GABRIELA QUEILA DE CARVALHO SIQUEIRA
ORIENTADORA: MÔNICA BARBOSA DE MELO
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. MÔNICA BARBOSA DE MELO
2. PROFA. DRA. CRISTIANE DE SOUZA ROCHA
3. PROF. DR. MAGNUN NUELDO NUNES DOS SANTOS
4. PROF. DR. ANDERSON FERREIRA DA CUNHA
5. PROFA. DRA. MARIA STELLA FIGUEIREDO
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
Agradeço primeiramente a Deus pela saúde e disposição concedidas durante estes quatro anos de muito trabalho, além de sempre responder às minhas orações e súplicas, sendo estas muitas vezes referentes à minha vida acadêmica.
Sou imensamente grata à toda minha família, especialmente aos meus pais, Gesiel J. Carvalho e Marta Q. P. Carvalho, pelo amor e apoio incondicionais e por terem investido tanto em minha educação. À minha irmã Giane M. Carvalho pela parceria e cumplicidade. Sou muito grata também ao meu esposo, meu fiel companheiro, que sempre me apoiou e acreditou em mim.
Reconheço também o apoio dos pacientes que aceitaram participar desta pesquisa, cedendo o seu tempo bem como o acesso ao seu código genético por meio da coleta de sangue periférico.
Sou agradecida às instituições que abriram as portas para que meu trabalho fosse possível: o programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, o Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética da Unicamp, o Centro de Hematologia e Hemoterapia da Unicamp, a Fundação de Hematologia e Hemoterapia da Bahia e de Pernambuco.
Agradeço a Dra. Mônica pela confiança, por acreditar em meu potencial e apostar em mim, disponibilizando esta oportunidade de Doutorado direto em seu laboratório sob sua orientação. Sou grata a ela pelo conhecimento cedido, pela ajuda, pelas reuniões e pelas muitas correções, bem como pelos conselhos ofertados, que contribuíram muito para o meu crescimento profissional.
Sou grata aos meus colegas Bruno B. Souza e Galina Ananina, com os quais aprendi praticamente tudo o que sei sobre bioinformática. Eles foram muito pacientes, me ensinaram e me ajudaram, além de tornar possíveis muitas das análises realizadas neste trabalho.
Reconheço a ajuda, o apoio e o companheirismo dos meus colegas de laboratório: Sueli M. S. Costa, Gislene P. Gil, Mirta T. Ito, Ana M. Marques, Ana L. Araújo, Paulo V. Svidnicki, Pedro R. S. Cruz, Yuri C. O. Silva, Victor H. Bertozzo, Flávia F. Bajano, Thiago A. R. Rodrigues, Vinícius M. Rios, Jhonatan A. A. Fernández, Francisco C. da Silva, Daniela Stancato, Milena A. Tacla, Letícia C.
Gabriela B. Moraes e Yuri G. V. F. de Lima, obrigada pela gentileza e disponibilidade, além do excelente trabalho na secretaria do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética e da pós-graduação da Clínica Médica, respectivamente.
Agradeço a todos os professores que participaram da minha formação, que ministraram aulas, tiraram dúvidas, e que, acima de tudo, me ensinaram a amar a pesquisa.
Sou grata também pelo fomento disponibilizado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo por meio do processo 2015/24029-3.
“Tudo o que fizerem, façam de todo o coração, como para o Senhor, e não para os homens, sabendo que receberão do Senhor a recompensa da herança. É a Cristo, o Senhor, que vocês estão servindo.”
Embora a anemia falciforme (AF) seja resultante de apenas uma troca de bases na posição 7 do gene da β-globina, os aspectos clínicos desta doença são muito heterogêneos. Várias complicações podem ocorrer, dentre elas destaca-se a úlcera de perna (UP), que exerce um impacto muito negativo na qualidade de vida dos pacientes e está relacionada à gravidade da doença. No entanto, a patogênese desta complicação ainda não foi totalmente elucidada. A fim de identificar novas variantes associadas com a UP na AF realizou-se o sequenciamento de exomas em uma amostra da população brasileira de pacientes com AF com e sem UP, sendo os resultados validados em uma outra população amostral brasileira. A coorte de descoberta consistiu, inicialmente, em 40 pacientes com AF não aparentados baseando-se na abordagem de comparação de fenótipos extremos: 20 pacientes sem UP com idade superior a 40 anos, e 20 com UP crônica, todos estes atendidos no Hemocentro da Unicamp, Campinas, SP, Brasil. O DNA foi extraído de leucócitos de sangue periférico e usado para fazer o sequenciamento de exomas. Após a análise de bioinformática (que seguiu o pipeline GATK), duas abordagens foram aplicadas para a seleção das variantes a serem validadas: a análise da literatura e menores p-valores. Ao todo, 12 variantes foram selecionadas, sendo uma delas, falso-positivo. As 11 variantes remanescentes foram genotipadas por meio de sequenciamento direto e genotipagem por sondas TaqMan na coorte de validação, que consistiu em 293 pacientes com AF (destes, 153 sem UP) atendidos em centros no nordeste brasileiro: Fundação de Hematologia e Hemoterapia da Bahia (HEMOBA) e de Pernambuco (HEMOPE). Após a genotipagem na coorte de validação, o teste exato de Fisher revelou diferença estatística em uma variante que promove um códon de parada prematuro (rs12568784 G/T) no gene FLG2. Tal associação foi observada ao serem comparados os genótipos GT e GG entre casos e controles (p=0,03). A literatura fornece evidências que fundamentam o envolvimento desta variante na UP na AF, uma vez que ela leva à perda de função da proteína filagrina-2, resultando no enfraquecimento da barreira da pele, predispondo o indivíduo a inflamação e infecção, o que dificultaria o fechamento de uma lesão – úlcera. Adicionalmente, sugere-se que as demais variantes e seus genes podem ser fortes candidatos para a UP na AF.
Although sickle cell anemia (SCA) results from homozygosity of a single base change at position 7 of the β-globin gene, the clinical aspects of this disease are very heterogeneous. Many complications can occur, among them leg ulcers (LU), which have a high negative impact on patients’ quality of life and are related to the severity of the disease. Nevertheless, the pathogenesis of this complication has not yet been elucidated. In order to identify novel variants associated with LU in SCA, we performed exome sequencing in a sample of Brazilian SCA patients with and without LU, followed by validation in another Brazilian population sample. Our discovery cohort consisted, initially, of 40 unrelated SCA patients selected based on extreme phenotypes: 20 patients without LU, over 40 years of age, and 20 with chronic LU, all of them treated at Hematology and Hemotherapy Center, University of Campinas, SP, Brazil. DNA was extracted from peripheral blood leukocytes and used for exome sequencing. After the bioinformatics analysis (which follows GATK pipeline), two approaches were applied for the selection of variants to be validated: literature analysis and lower p-values. Altogether, 12 variants were selected, one of them was a false positive. The 11 remaining variants were genotyped by direct sequencing and TaqMan probes in the validation cohort, which was comprised of 293 SCA patients (of these, 153 without LU) treated at the following centers from Northeast Brazil: Hematology and Hemotherapy Foundation of Bahia (HEMOBA) and Pernambuco (HEMOPE). After the genotyping of the validation cohort, Fisher’s exact test revealed a statistically significant difference in a stop codon variant (rs12568784 G/T) in the FLG2 gene. This association was observed by comparing GT and GG genotypes between cases and controls (p=0.03). Literature provides evidence that justify this variant’s involvement in LU in SCA, since it leads to loss of function of the fillagrin-2 protein, resulting in impairment of the skin barrier, predisposing the individual to inflammation and infection, a wound of difficult healing – ulcers. Additionally, we suggest that the remaining variants and the genes in which they occur could be strong candidates for LU in SCA.
Keywords: Sickle cell anemia. Exome sequencing. Leg ulcers. Association study. Complex disease. Variants.
Figura 1 – Alterações genéticas da Hemoglobina ... 18 Figura 2 – Complicações clínicas (agudas e crônicas) que podem ocorrer na anemia
falciforme ...19
Figura 3 – Frequência do gene S no Brasil em 2007 ...21 Figura 4 – Úlcera de perna em paciente com doença falciforme ...22 Figura 5 – Principais passos do sequenciamento de exomas utilizando o kit Nextera
Rapid Capture Exome ...35
Figura 6 – Eletroforese de um pool de 6 bibliotecas em Bioanalyzer ...36 Figura 7 – Gráfico da qualidade da sequência por base ...37 Figura 8 – Eletroferograma dos genótipos possíveis para o rs12568784 G/T (FLG2) .
...42
Figura 9 – Fluxograma da genotipagem da coorte de validação ...43 Figura 10 – Perfil de genotipagem da inserção rs11454536 (gene VWDE)
utilizando-se sondas TaqMan ...44
Figura 11 – Parâmetros laboratoriais analisados entre os casos e controles de
ambas as coortes ...49
Figura 12 – Distribuição genotípica e alélica nas coortes de descoberta e de
validação para o rs12568784 (gene FLG2) ...52
Figura 13 – Análise de componentes principais a partir dos genótipos provenientes
de 7 variantes para toda a casuística avaliada ...53
Figura 14 – Localização do rs12568784 no gene FLG2 ...59 Figura 15 – Esquematização do papel do rs12568784 no desenvolvimento da úlcera
Tabela 1 – Informações gerais quanto às reações de PCR para a confirmação das
variantes selecionadas no sequenciamento de exomas ...40
Tabela 2 – Distribuição dos pacientes nas coortes ...46
Tabela 3 – Faixa etária dos pacientes incluídos ...46
Tabela 4 – Cobertura média calculada para cada amostra ...47
Tabela 5 – Quantidade de reads geradas por lane ...47
Tabela 6 – Variantes selecionadas na coorte de descoberta segundo a análise da literatura ...48
Tabela 7 – Variantes selecionadas na coorte de descoberta segundo menores p-valores ...48
Tabela 8 – Comparação dos parâmetros laboratoriais analisados entre os casos e controles de ambas as coortes ...49
Tabela 9 – Comparação do número de pacientes em tratamento com hidroxiureia entre os casos e controles ...50
Tabela 10 – Comparação entre a presença de α-talassemia entre os casos e controles da coorte de validação ...50
Tabela 11 – Variantes genotipadas na coorte de validação total ...51
Tabela 12 – Variantes genotipadas apenas nos pacientes provenientes do HEMOBA ...51
AF - Anemia falciforme
AHNAK1 - Ahnak nucleoprotein AHNAK2 - Ahnak nucleoprotein 2
ARAB - Indo-Árabe BEN - Benin
CAM - Camarões
CAR - Bantu ou República Centro-Africana
CAV2 - Caveolin 2
CBMEG - Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética
CEACAM8 - Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 CRYBG3 - Crystallin beta-gamma domain containing 3
CSV - Comma-separated values D3 - Death receptor 3
DCTN4 - Dynactin 4
DF - Doença falciforme
DNA - Ácido desoxirribonucleico
dNTP - Desoxirribonucleotídeo trifosfatado EBM - Experimental Biology and Medicine EUA - Estados Unidos da América
FCM - Faculdade de Ciências Médicas FDA - Food and Drug Administration FGF1 - Fibroblast growth factor 1
FLG2 - Filaggrin family member 2 FOXD4L1 - Forkhead box D4-like 1
HBB - Hemoglobin-beta locus HbF - Hemoglobina fetal HbS - Hemoglobina S
HEMOBA - Fundação de Hematologia e Hemoterapia da Bahia
HEMOPE - Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco HLA - Human leukocyte antigen
KL - Klotho
KRT77 - Keratin 77
LaCTAD - Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho
LAMA1 - Laminin alpha-1
LDH - Lactato desidrogenase
MAF - Frequência do alelo menos comum MAPK - Mitogen-activated protein kinases PCA - Análise de componente principal PCR - Reação em cadeia da polimerase RNA - Ácido ribonucleico
RNF213 - Ring finger protein 213
SEN - Senegal
TEK - Tyrosine kinase
TGF-b - Transforming growth factor, beta-1
TMC6 - Transmembrane channel-like protein 6 TNF - Fator de necrose tumoral
TNFRSF25 - Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 25 UBTFL1 - Upstream binding transcription factor-like 1
UP - Úlcera de perna VCF - Variant call format
VWDE - Von Willebrand factor D and EGF domain ZNF540 - Zinc finger protein 540
INTRODUÇÃO ...17
Histórico e fisiopatologia da anemia falciforme ...17
Como tratar a anemia falciforme ...19
Distribuição da doença falciforme no Brasil ...20
Lesões ulcerosas na anemia falciforme ...21
Tratamento da úlcera de perna na doença falciforme ...23
Ferramentas genéticas para a identificação de genes moduladores ...26
Associações genéticas da úlcera de perna na anemia falciforme ...27
OBJETIVOS ...29
Objetivo geral ...29
Objetivos específicos ...29
MATERIAL E MÉTODOS ...30
Aspectos éticos ...30
Recrutamento dos pacientes ...30
Seleção dos pacientes com fenótipos extremos na coorte de descoberta ...31
Seleção dos pacientes da coorte de validação ...31
Análise do prontuário ...32
Parâmetros laboratoriais ...32
Avaliando fatores influenciadores ...32
Coleta do material biológico e extração do ácido desoxirribonucleico ...33
Preparo das bibliotecas para o sequenciamento de exomas ...34
Controle de qualidade das bibliotecas ...35
Sequenciamento de nova geração ...36
Controle de qualidade das reads ...36
Análise de bioinformática ...37
Validação metodológica ...39
Validação populacional ...42
Análise estatística ...45
Descrição da idade dos pacientes ...46
Controle de qualidade das reads ...46
Identidade por descendência ...47
Variantes selecionadas após a análise de bioinformática ...47
Validação metodológica ...48
Parâmetros laboratoriais ...48
Avaliando fatores influenciadores ...50
Validação populacional ...50
Análise de componentes principais ...53
DISCUSSÃO ...54
CONCLUSÕES ...62
REFERÊNCIAS ...63
ANEXOS ...75
1. Parecer do comitê de ética em pesquisa da FCM/Unicamp ...75
2. 3. 4. Termos de consentimento livre e esclarecido ...85
5. Variantes remanescentes após os filtros aplicados na abordagem pela análise da literatura ...100
6. Variantes remanescentes após os filtros aplicados na abordagem por menores p-valores ...102
7. Artigo publicado na revista Experimental Biology and Medicine/EBM ...103
INTRODUÇÃO
Histórico e fisiopatologia da anemia falciformeA anemia falciforme (AF) é uma doença de caráter hereditário, primeiramente relatada por Herrick, no ano de 1910, em um estudante que manifestou sintomas pulmonares (1). A AF é resultante da substituição de apenas uma base nitrogenada, que promove a troca de aminoácidos, fato inicialmente observado por Ingram em 1958 (2). Ocorre a substituição de timina por adenina (CTC ® CAC) no códon 7 do gene da β-globina, localizado no cromossomo 11 (variante denominada rs334), havendo troca de aminoácidos (GAG-ácido glutâmico ® GUG-valina) (Human Genome Variation Society, HGVS, disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=334>, acesso em: 10 de abril de 2019), originando uma hemoglobina alterada, denominada hemoglobina S (HbS), assim como mostra a Figura 1.
Quando esta alteração acomete os dois alelos do indivíduo, em homozigose, origina-se a AF. No entanto, a HbS pode estar em heterozigose, ou ainda pode se combinar com outras hemoglobinopatias (tais como a hemoglobina C e β-talassemia). Este conjunto de doenças que afetam o gene da β-globina é denominado doença falciforme (DF) (3).
Na AF, durante a desoxigenação com passagem dos eritrócitos pela microcirculação, a molécula de hemoglobina sofre uma alteração conformacional. Na HbS, a substituição do ácido glutâmico (hidrofílico) pela valina (hidrofóbica), faz com que esta última estabeleça interações com outros resíduos também hidrofóbicos na cadeia da β-globina de outra molécula de HbS desoxigenada. Quando as moléculas de HbS interagem umas com as outras são originados polímeros que se alongam em fibras helicoidais, quando agrupados, eles endurecem e induzem a característica da célula em forma de foice (denominada hemácia falcizada), além de desencadear uma cascata de várias outras anormalidades celulares que participam do mecanismo fisiopatológico global (Figura 1). A polimerização das HbS contribui para a ocorrência de eventos de vaso-oclusão (característicos da doença), bem como anemia hemolítica em razão da fragilidade dos glóbulos vermelhos (4).
O fenômeno de falcização pode ser reversível após a reoxigenação (Figura 1). Contudo, a repetição deste evento pode causar lesões na membrana de
algumas células suscetíveis, tornando persistentes a rigidez e a configuração em forma de foice mesmo após a reoxigenação. Estes eritrócitos são denominados células irreversivelmente falcizadas, e permanecem com a forma anormal mesmo na ausência de polimerização intracelular da hemoglobina, assim como é apresentado na Figura 1.
Figura 1 – Alterações genéticas da Hemoglobina
A hemoglobina normal A (HbA) é formada por duas subunidades de α-globina e duas subunidades de β-globina, sendo estas últimas codificadas por HBB. A HbS é decorrente da substituição de ácido glutâmico por valina. A AF ocorre quando ambos os alelos HBB estão alterados. O indivíduo que possui apenas um dos alelos alterados é denominado traço falciforme (apresenta a molécula híbrida de hemoglobina). Nos indivíduos com AF, quando há desoxigenação, as moléculas de HbS se unem formando polímeros dentro da hemácia, fato que altera seu formato, tornando-a falcizada. Normalmente este processo é reversível após a reoxigenação.
O quadro clínico da AF depende substancialmente da ocorrência de lesões causadas pela obstrução vascular e das chamadas “crises de falcização”. Em geral, a vaso-oclusão ocorre na microcirculação, podendo, contudo, afetar grandes artérias (5). A AF, embora tenha o caráter monogênico, é uma condição multissistêmica complexa, caracterizada por complicações agudas e crônicas que acometem diversos tecidos (Figura 2).
Figura 2 – Complicações clínicas (agudas e crônicas) que podem ocorrer na anemia
falciforme
Adaptado de Kato e colaboradores (2018) (3)
Como tratar a anemia falciforme
Os avanços nos cuidados médicos gerais, o diagnóstico precoce e o tratamento mais abrangente levaram a melhorias substanciais na expectativa de vida dos indivíduos com AF em países de alta renda (6,7). Dentre as opções de tratamento estão as transfusões frequentes do concentrado de hemácias. Elas auxiliam no tratamento de complicações agudas na idade adulta (tais como o acidente vascular cerebral e o priapismo), além de prevenir algumas complicações a longo prazo e crises vaso-oclusivas recorrentes (8,9).
Até pouco tempo atrás, a hidroxiureia (HU) era o único fármaco aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da AF. Este medicamento é usado para induzir o nível máximo de hemoglobina fetal (HbF) por meio de diversas vias moleculares, tais como modificações epigenéticas, eventos de transcrição e vias de sinalização, além de vias pós-transcricionais por meio de microRNAs, reduzindo a porcentagem de HbS, diminuindo a polimerização dentro dos eritrócitos, e consequentemente minimizando os sintomas do paciente (10).
Em 2017 foi aprovado pela FDA o uso da glutamina para o tratamento da AF (11). Acredita-se que este aminoácido seja essencial para estes pacientes, uma vez que, durante a inflamação é necessária maior quantidade de glutamina no tecido imunológico (para que haja replicação celular) e renal (para o equilíbrio ácido-base). A quantidade requerida é maior que a produzida pelo organismo, logo, para obter os efeitos imunológicos máximos, além de otimizar a resposta do corpo ao estresse, a suplementação de glutamina auxiliaria na resposta do organismo frente a esta doença (12,13). Ademais, um recente estudo clínico randomizado demonstrou que crianças com AF que recebiam L-glutamina tinham um número menor de crises de dor (14).
Distribuição da doença falciforme no Brasil
Não há relatos quanto à distribuição da AF no Brasil, no entanto, a literatura dispõe destas informações relacionadas à DF. A DF é a doença hereditária com maior prevalência clínica, afetando mais de 13 milhões de pessoas em todo o mundo (15,16). Em 2007 estimou-se que no Brasil haviam de 25 a 30 mil pessoas com AF e 7 milhões de portadores, contando com o nascimento de, aproximadamente, 3500 bebês com AF anualmente, embora a prevalência seja muito variada em todo o país (17), conforme mostra a Figura 3.
Figura 3 – Frequência do gene S no Brasil em 2007
Fonte: Cançado (2007) (17)
Na AF, os haplótipos do cluster da β-globina representam o grupo étnico ou região geográfica de origem dos pacientes. Os haplótipos incluem Senegal (SEN), Benin (BEN), Bantu ou República Centro-Africana (CAR), Camarões (CAM) e Indo-Árabe (ARAB) (18,19). De acordo com a origem histórica da população afrodescendente, o haplótipo CAR é o mais comum no estado de São Paulo (20– 24). O mesmo é observado no estado de Pernambuco, predominando o haplótipo CAR (25), enquanto que em Salvador, capital do estado da Bahia, a frequência dos haplótipos CAR e BEN são semelhantes (23,26,27).
Adicionalmente, dados provenientes de estudos com microarranjos de quase 10 mil pacientes com DF representativos de quatro estados brasileiros mostraram que há uma grande heterogeneidade, indicando que estudos sobre a estrutura da população brasileira seriam fundamentais para estudos de associação sobre genótipo e fenótipo (28).
Lesões ulcerosas na anemia falciforme
As úlceras de perna (UP) foram notificadas já nos primeiros relatos de AF, mas não foram inicialmente reconhecidas como uma complicação da doença. Os casos foram relatados na literatura dermatológica, porém, a etiologia exposta nestas publicações não era clara devido à sorologia positiva dos pacientes para sífilis. A
relação causal entre AF e a UP foi somente estabelecida na publicação do trabalho de Cummer e LaRocco em 1939 (29).
Ulcerações da pele e dos tecidos subjacentes podem ocorrer em pacientes com AF, bem como em portadores de outras disfunções hematológicas, envolvendo as porções medial e lateral do tornozelo (como apresentado na Figura 4). As UP podem ser classificadas como agudas ou crônicas, de acordo com a sua duração. No entanto, não existe consenso quanto a um período de tempo específico para definir a cronicidade. Uma úlcera aguda geralmente cicatriza-se em menos de um mês, enquanto que úlceras crônicas podem perdurar por mais de seis meses, não sendo incomum sua duração por alguns anos, fechando-se e reabrindo-se repetidamente (30).
Figura 4 – Úlcera de perna em paciente com doença falciforme
Fonte: Alavi e Kirsner (2015) (31)
A UP é a manifestação cutânea mais comum na AF, influenciando importantemente a morbidade nesses pacientes. As úlceras são extremamente dolorosas e difíceis de curar, afetando diretamente a qualidade de vida dos pacientes acometidos. A etiologia dessa complicação é complexa e multifatorial, incluindo como fatores predisponentes a obstrução mecânica por alta densidade de hemácias, doença venosa, vasoconstrição, trombose, diminuição da capacidade de oxigenação e função endotelial prejudicada (31).
A ulceração é mais comum em pacientes com genótipo bSbS do que
naqueles heterozigotos para a HbS (32,33). Sua incidência é menor em pacientes com baixos níveis de lactato desidrogenase (LDH) (34), e altos níveis de hemoglobina total e HbF (35). Análises comparativas ajustadas para a idade mostraram que a frequência de UP em pacientes com AF e α-talassemia ou hemoglobina C concomitantes era menor que naqueles homozigotos (bSbS) (36),
apesar de haver estudos que apresentam resultados controversos quanto à influência da α-talassemia e do gênero (34).
Por estar mais presente nos fenótipos mais graves, sugere-se que a UP estaria associada à hemólise (35,36). Da mesma forma, outros estudos observaram a associação de marcadores hemolíticos e UP (32,36–38). Além do mais, as UP acometem também pacientes com outras anemias hemolíticas hereditárias, que não a AF, tais como a esferocitose hereditária, deficiência de piruvato quinase e talassemia (39–49).
A localização geográfica e os fatores ambientais têm um papel importante na prevalência da UP. Por exemplo, nos Estados Unidos cerca de 2,5% das pessoas com DF apresentam UP, enquanto que, na Jamaica, este número sobe para mais de 40% (30). O trauma cutâneo exerce importante papel no desenvolvimento destas lesões, que são predominantemente resultado de picadas de mosquitos, comuns em locais com clima tropical (34). Dados da Jamaica indicam que a UP é rara na infância, antes dos 10 anos de idade, e se tornam incomuns após os 30 anos de idade (50). Estudos brasileiros confirmam que a UP é incomum em crianças, acometendo geralmente a fase adulta (28).
Adicionalmente, a UP é mais comum em portadores do haplótipo Bantu de β-globina. Em um estudo da população brasileira, mostrou-se que cerca de metade dos pacientes homozigotos para o haplótipo Bantu apresentavam UP, em comparação com 12,5% do grupo de pacientes homozigotos para o haplótipo Benin (20). No Brasil, a prevalência de UP entre os pacientes adultos com DF varia entre 23,4 e 50% (51), tornando esta complicação um importante problema de saúde pública.
Tratamento da úlcera de perna na doença falciforme
Recomenda-se para o tratamento da UP uma terapia composta por medicamentos sistêmicos e locais. Para o tratamento sistêmico são sugeridos vasodilatadores, diuréticos, inibidores da enzima conversora de angiotensina e bloqueadores do receptor de angiotensina, HU, quelante de ferro, suplementação vitamínica, anticoagulantes, suporte psicológico e controle da dor. Para os cuidados locais são propostos o desbridamento, tratamento de infecções, retirada do excesso de exsudato, manutenção da umidade da ferida, proteção da ferida contra infecções
e novos traumas, alívio do edema por meio de compressão, bem como o uso de calçados confortáveis (52). Além destas recomendações gerais, a literatura já demonstrou estudos de casos e ensaios clínicos nos quais observou-se melhora na cicatrização da ferida por meio de princípios ativos promissores e terapias avançadas, os quais são apresentados a seguir.
O zinco é um elemento importante para o funcionamento do sistema imunológico, além de auxiliar no processo de cicatrização. Já foi demonstrada a eficácia da administração oral de sulfato de zinco na cicatrização de úlceras na DF (53). Ademais, trabalhos recentes mostraram resultados favoráveis por meio da aplicação tópica de nitrito de sódio (doador de óxido nítrico) (32,54). Também já foi relatada a eficácia do uso de matriz dérmica de colágeno bovino glicosaminoglicana para o tratamento de úlceras em pacientes com DF, bem como naquelas decorrentes de outras etiologias (55).
Outra opção de tratamento é o uso do oxigênio, que é capaz de diminuir a hipóxia local e proporcionar a formação de colágeno, replicação de fibroblastos, angiogênese e epitelialização. Esta terapêutica iniciou-se com a oxigenoterapia hiperbárica, e mais recentemente, com a oxigenoterapia domiciliar prolongada, por meio de um aparelho portátil que o paciente pode levar para casa. Esta última opção, além de ser mais específica para o local da ferida e minimizar muitos dos efeitos indesejáveis da terapia anteriormente mencionada, tais como fadiga e tontura, parece auxiliar apenas na cicatrização de lesões com diâmetro relativamente pequeno (56).
Estudos recentes mostraram que, o transplante autólogo de células tronco, além do de células provenientes de tecido adiposo, aplicado na lesão ulcerosa em pacientes com DF são capazes de reduzir a dor (57,58). Similarmente, o transplante de células-tronco do sangue periférico foi também utilizado como terapia para o tratamento de UP crônica na AF em um caso (37 anos, do sexo masculino), enxertado com sucesso resultando em cicatrização completa após 16 meses do procedimento (59).
Dados da literatura sugerem a relação epidemiológica entre a UP e a hipertensão pulmonar devido a uma sobreposição dos mecanismos patobiológicos (32), muito provavelmente porque ambas são provenientes da obstrução mecânica das hemácias falcizadas, trombose, menor oxigenação e redução da
biodisponibilidade do óxido nítrico (60). Consequentemente, tratamentos para a hipertensão pulmonar também poderiam tratar a lesão ulcerosa. Lionnet e colaboradores (2008) observaram a cicatrização da UP durante o tratamento da hipertensão pulmonar com um antagonista do receptor de endotelina (61). Uma década depois, Agrawal e colaboradores também observaram a cicatrização da UP em uma paciente com DF que foi submetida à tromboendarterectomia pulmonar a fim de tratar a hipertensão pulmonar (62).
Poucos são os estudos que avaliaram a correlação entre o tratamento com HU e a UP na DF. Há algumas evidências que negam essa associação (52,63). Minniti e colaboradores (2011) realizaram um grande estudo, que compreendeu 505 pacientes provenientes do National Institutes of Health, NIH, no qual não foi observada nenhuma diferença no número de pacientes com UP que utilizavam ou não o tratamento com HU (64).
Quanto à prevenção das lesões ulcerosas, recomenda-se o uso de legging com extremidade inferior sem elástico, proteção da região do tornozelo, repouso com elevação das pernas, além de evitar longos períodos em pé (32).
A epidemiologia da UP em pacientes com AF não está bem esclarecida devido à subestimativa do impacto clínico nos pacientes, uma vez que não é considerada uma complicação que represente diretamente um risco à vida, apesar da UP apresentar um impacto muito negativo na qualidade de vida dos pacientes acometidos (32). A UP associada à AF é, muitas vezes, resistente à terapia, é muito dolorosa, contribuindo para a cronicidade e o encargo psicossocial. Estas úlceras são distintas e não podem ser caracterizadas sob tipos comuns de feridas arteriais, venosas ou diabéticas, tendendo a exibir atributos arteriais e venosos mistos, dificultando na determinação de um tratamento mais apropriado e efetivo (65).
É comprovado pela literatura que a UP afeta a qualidade de vida dos pacientes. Um estudo qualitativo avaliou o impacto psicossocial dos acometidos. A pesquisa mostrou que a UP causava dor, influenciava o desempenho físico, promovia isolamento social e dificuldade nos relacionamentos interpessoais, além de aumentar a necessidade de apoio religioso (66).
Ferramentas genéticas para a identificação de genes moduladores
O objetivo principal da genética médica é a identificação de genes específicos que, quando alterados, resultam em doença humana. Vários métodos foram elaborados e testados neste caminho ao longo do desenvolvimento da genética humana (67).
O maior sucesso neste esforço foi conseguido em relação às doenças mendelianas, que são aquelas causadas por um único gene de efeito maior. Já as doenças de caráter complexo, em geral, possuem um quadro clínico variável que depende não apenas do genótipo, mas também da influência ambiental, o que na prática dificulta definir o fenótipo e, como consequência, dificulta a seleção de uma população de estudo adequada. A etiologia das doenças complexas pode envolver várias vias biológicas; além disso, elas podem ser causadas por muitos genes, cada um com uma contribuição e risco relativo pequenos, talvez até sem relevância direta para a doença (68).
Duas técnicas são mais utilizadas para estimar o efeito de genes de caracteres complexos: a análise do gene candidato e métodos de genética quantitativa (69). Na genética médica, a abordagem da análise do gene candidato recebeu atenção privilegiada, concentrando-se nos genes que são escolhidos por meio da hipótese acerca do seu papel etiológico na doença, identificado por meio de estudos de ligação, de expressão, conhecimento prévio da via biológica e até mesmo estudos de associação em escala genômica. Como todos estes estudos são baseados no uso de marcadores genéticos, houve grande evolução nas técnicas e na exploração de diversos elementos do genoma na qualidade de marcadores genéticos (70).
O advento dos estudos de associação de amplitude genômica (genome-wide association studies, GWAS) e, mais recentemente, o sequenciamento de exomas (whole-exome sequencing, WES), forneceu a primeira compreensão detalhada da base genética de traços complexos (71).
O exoma representa cerca de 1% do genoma, com aproximadamente 30 milhões de pares de bases, mas é responsável por cerca de 85% das mutações identificadas em doenças mendelianas (72). A utilização do sequenciamento de exomas na descoberta de genes em doenças humanas já está bem estabelecida,
além de ser uma técnica usada com sucesso na identificação de variantes associadas a doenças também de caráter complexo (73).
Bamshad e colaboradores (2011) sugeriram o modelo de estudo em famílias e o de fenótipos extremos para o estudo do sequenciamento de exomas. Neste último, como a frequência dos alelos que contribuem para a característica é enriquecida nos extremos da distribuição, mesmo utilizando-se um pequeno tamanho amostral, há a possibilidade da identificação de novos alelos candidatos (74). Marian (2012) enfatiza que, para tanto, é necessária a descrição rigorosa dos fenótipos, havendo muita cautela na escolha dos indivíduos pertencentes aos grupos caso e controle (75).
Emond e colaboradores (2012) investigaram genes associados à suscetibilidade de infecção por Pseudomonas aeruginosa na fibrose cística. Sendo assim, optaram pelo desenho de estudo de fenótipos extremos no sequenciamento de exomas. Para o grupo controle, o “n” foi de 48 indivíduos (que já ultrapassaram a idade média de infecção e não apresentaram infecção crônica) enquanto que para o grupo caso, foi de 43 pacientes com infecção crônica. Após as análises estatísticas e a validação, os pesquisadores identificaram o gene DCTN4 (Dynactin 4) como modulador de infecção na fibrose cística. Este foi o primeiro estudo que identificou um gene modificador em uma doença mendeliana aplicando o sequenciamento de exomas no desenho de estudo de fenótipos extremos (76). Poucos anos depois, o mesmo grupo de pesquisa realizou outro estudo, desta vez, com a casuística aumentada (86 pacientes e 3239 controles – Exome sequencing project), no qual foram identificados outros dois genes modificadores: CAV2 (Caveolin 2) e TMC6 (Transmembrane channel-like protein 6) (77).
Associações genéticas da úlcera de perna na anemia falciforme
Estudos com gêmeos têm demonstrado forte herdabilidade das funções venosas em humanos (78), sugerindo que devam existir modificadores genéticos que interfiram no risco desta complicação em pacientes com AF. No entanto, a literatura sobre associações genéticas com UP é bastante escassa. Ofosu e colaboradores (1987) realizaram um pequeno estudo sugerindo que fatores genéticos ou uma resposta imune alterada relacionados com o HLA (Human leukocyte antigen) poderiam contribuir para o aparecimento das UP, uma vez que
eles evidenciaram que os genótipos de HLA-35 e Cw4 estavam mais presentes em pacientes com AF com histórico de UP (79). Em 2006, Nolan e colaboradores realizaram um grande estudo em pacientes americanos com DF, investigando genes candidatos relacionados à vaso-oclusão falciforme. Ao final, associações entre a UP e variantes nos genes KL (Klotho), TEK (Tyrosine kinase) e genes da via TGF-b/BMP foram encontradas (36). Mais recentemente, Vicari e colaboradores (2015) associaram algumas variantes nos genes das interleucinas 1β e 6 com complicações da AF, observando-se p-valor significativo entre a variante rs1800795 (IL-6) e a UP (80).
As contribuições relativas a fatores genéticos e ambientais para a UP na AF ainda não estão bem esclarecidas. Sendo assim, associações significativas envolvendo variantes são de grande interesse, embora sejam necessários mais estudos para confirmar a atividade dos potenciais mecanismos envolvidos. Só então este conhecimento será usado para o benefício dos pacientes por meio de prevenção ou terapia personalizada (34).
OBJETIVOS
Objetivo geralInvestigar novas variantes associadas à úlcera de perna na anemia falciforme.
Objetivos específicos
Identificar novas variantes associadas a esta complicação por meio do sequenciamento de exomas de fenótipos extremos em uma população representativa do estado de São Paulo.
Validar os achados em outra população amostral, também composta por pacientes com anemia falciforme com e sem úlcera de perna, provenientes do nordeste brasileiro.
MATERIAL E MÉTODOS
Aspectos éticosO protocolo de pesquisa seguiu os princípios enunciados na Declaração de Helsinque, assim como as determinações do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, da Fundação de Hematologia e Hemoterapia da Bahia e da Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (número de aprovação: 53001315.6.1001.5404, o parecer completo encontra-se no Anexo 1).
Todos os pacientes receberam explicações sobre a pesquisa, bem como quanto à coleta e armazenamento do material biológico, além da autorização para visualização de dados contidos no prontuário, firmando sua participação voluntária por meio de assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (disponível nos Anexos 2, 3 e 4).
Recrutamento dos pacientes
O recrutamento ocorreu durante as consultas de rotina dos pacientes no Centro de Hematologia e Hemoterapia da Unicamp (Hemocentro da Unicamp) (entre janeiro de 2015 e agosto de 2016), na Fundação de Hematologia e Hemoterapia da Bahia (HEMOBA) (durante o mês de outubro de 2016 e o mês de agosto de 2017) e na Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (HEMOPE) (durante o ano de 2018).
Inicialmente foi feita a triagem dos pacientes que seriam atendidos via sistema computacional ou manual (por meio da agenda). Nesta triagem, os critérios de inclusão e exclusão foram aplicados, selecionando-se a casuística em potencial. Durante a visita do paciente ao ambulatório o mesmo foi entrevistado, confirmando ou não a história de UP, distinguindo-se a casuística em grupos caso e controle. Os critérios aplicados foram os seguintes:
Critérios de inclusão
Apresentar homozigosidade para a hemoglobina S (bSbS), não serem
aparentados, serem atendidos no Hemocentro da Unicamp, HEMOBA ou HEMOPE. -Controles: Não apresentar história de UP, fato confirmado pela análise do prontuário e pelo próprio paciente durante a entrevista.
-Casos: Apresentar história de UP (ativa ou já cicatrizada) confirmada pelo prontuário e pelo paciente durante a entrevista.
Critérios de exclusão
Ser gestante, apresentar neoplasias, diabetes ou outras doenças genéticas que interfiram no sistema hematológico, tais como a síndrome de Gilbert e a persistência hereditária da hemoglobina fetal, ter sido submetido à procedimento transfusional por período inferior a 90 dias anteriores à coleta.
Seleção dos pacientes com fenótipos extremos na coorte de descoberta
Denominou-se “coorte de descoberta” aquela que abrangia os pacientes provenientes do Hemocentro da Unicamp, uma vez que esta coorte seria aquela submetida ao sequenciamento de exomas, tendo os resultados validados em uma outra amostra.
A abordagem escolhida para o sequenciamento de exomas foi a comparação entre os fenótipos extremos. Sendo assim, buscou-se comparar os casos mais graves com os controles mais saudáveis. Para excluir um possível viés quanto à presença de α-talassemia, apesar de os resultados da literatura serem contraditórios (34,36), todos os pacientes selecionados para esta coorte não apresentavam α-talassemia coincidente.
Sendo assim, foram captados 20 pacientes para compor o grupo caso, todos com história de UP crônica (com mais de 6 meses de duração (30)), além de 20 pacientes do grupo controle sem história de UP com idade superior a 40 anos (uma vez que, após 30 anos de idade o aparecimento de uma primeira úlcera é incomum (50)).
Seleção dos pacientes da coorte de validação
“Coorte de validação” foi o nome designado à amostra que compreendeu os pacientes atendidos nos centros do nordeste (HEMOBA e HEMOPE). A mesma foi utilizada para a validação populacional dos achados provenientes do sequenciamento de exomas da coorte de descoberta. Logo, os critérios aplicados para esta coorte não foram tão rigorosos. Optou-se por não excluir os pacientes que apresentassem α-talassemia coincidente. Foram captados pacientes do grupo controle com idade superior a 21 anos (entre os atendidos no HEMOPE), e 30 anos
(quando atendidos no HEMOBA). Por conseguinte, a coorte de validação foi composta por 293 pacientes, compreendendo 153 controles e 140 casos, sendo 116 pacientes provenientes do HEMOBA, e 177 do HEMOPE.
Análise do prontuário
Uma vez que o paciente respondia afirmativamente à pesquisa, este autorizava a visualização dos dados contidos em seu prontuário. A análise destas informações demonstrou-se muito relevante, por comprovar ou não, algumas informações cedidas pelo paciente, tal como o histórico da UP.
Ressalta-se que, no HEMOBA apenas foi obtido acesso à ficha do paciente referente à consulta do dia em questão, ficha esta que era manual (não digitalizada), muitas vezes sem acesso ao prontuário da hematologia, muito menos ao prontuário completo – que incluía as demais especialidades. Desta forma, os dados laboratoriais, bem como outras informações relevantes, foram apenas obtidos quanto aos pacientes atendidos no Hemocentro da Unicamp e no HEMOPE.
Parâmetros laboratoriais
Por meio da análise dos prontuários dos pacientes da coorte de descoberta e de parte da coorte de validação (daqueles provenientes do HEMOPE) foram analisados os níveis de LDH, concentrações totais de hemoglobina (Hb) e HbF por meio de boxplot e teste de Wilcoxon-Mann-Whitney no software R (<https://www.R-project.org/>) (81). Como estes valores podem ser alterados por meio da terapia com HU e/ou procedimento transfusional, os dados foram coletados antes do início destes tratamentos.
Avaliando fatores influenciadores
Terapia com hidroxiureia
A literatura apresenta resultados contraditórios quanto ao uso da HU na UP na AF (52), além do que, na amostra selecionada muitos pacientes faziam uso desta terapia. Sendo assim, foi feito o teste de qui-quadrado usando-se o GraphPad
QuickCalcs Web (disponível em:
<https://www.graphpad.com/quickcalcs/contingency1.cfm>, acesso em 18 de abril de 2019) para verificar se havia diferença estatística entre o número de pacientes que
tomavam ou não HU dentre os casos e os controles. Ressalta-se que os pacientes avaliados neste item eram aqueles provenientes do Hemocentro da Unicamp e do HEMOPE.
Presença de α-talassemia
A literatura também apresenta resultados contraditórios quanto à influência da α-talassemia no desenvolvimento da UP na AF (34,36). A coorte de descoberta foi composta por apenas pacientes sem α-talassemia coincidente, uma vez que nesta amostra a abordagem escolhida foi a de fenótipos extremos, obtendo-se controles com idade mais avançada obtendo-sem história de UP e casos com preobtendo-sença de ulceração crônica – sendo esta uma amostra melhor caracterizada.
No entanto, na coorte de validação este critério de exclusão não foi seguido, uma vez que seriam excluídos muitos pacientes, e esta amostra seria apenas utilizada para confirmar os achados da coorte de descoberta. A análise dos prontuários dos pacientes provenientes do HEMOPE permitiu a identificação dos indivíduos com esta hemoglobinopatia, enquanto que, para aqueles provenientes do HEMOBA, foi feita a detecção no Laboratório de Genética Humana do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), de acordo com Dodé e colaboradores (1993) (82).
A fim de observar se a α-talassemia teve influência na coorte de validação foi aplicado o teste de qui-quadrado no GraphPad QuickCalcs Web, comparando-se o número de pacientes com e sem esta hemoglobinopatia nos grupos caso e controle.
Coleta do material biológico e extração do ácido desoxirribonucleico
Durante as consultas de rotina, após a entrevista e concordância em participar do estudo, foram coletados 4 mL de sangue periférico em frasco estéril vacuette® 4 mL contendo EDTA 10% como anticoagulante, sendo este sangue transportado até o CBMEG da Unicamp.
No Laboratório de Genética Humana do CBMEG foi realizada a extração do ácido desoxirribonucleico (DNA) utilizando-se o DNA Blood Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) para as amostras da coorte de descoberta. Para as amostras da coorte de validação o método utilizado foi o de fenol-clorofórmio padronizado no referido laboratório. Este protocolo não foi aplicado às amostras dos pacientes
provenientes do HEMOPE, uma vez que o DNA já havia sido extraído em Recife (também pelo método do fenol-clorofórmio) e foi transportado até o CBMEG para as demais análises.
Após a extração, todas as amostras de DNA foram quantificadas usando-se o aparelho NanoDrop 2000 (Thermo Fisher – Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), e a integridade foi analisada por meio da eletroforese em gel de agarose 1%.
Preparo das bibliotecas para o sequenciamento de exomas
O DNA de todos os pacientes da coorte de descoberta (n=40) foi quantificado no equipamento Qubit 2.0 (Thermo Fisher – Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), que se utiliza do método fluorimétrico. As amostras foram diluídas para 5 hg/µL.
Para a captura e enriquecimento dos exomas utilizou-se o kit Nextera Rapid Capture Exome (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. O conjunto de sondas foi projetado para cobrir cerca de 214.405 exons, gerando um conteúdo exônico de 37 Mb.
O protocolo consistiu em uma reação que simultaneamente fragmentou (por meio de transposases) e marcou o DNA. Adaptadores foram adicionados à reação em cadeia da polimerase (PCR) por meio da tecnologia TruSeq Exome Enrichment. As amostras das bibliotecas foram desnaturadas em DNA simples fita (Figura 5-A) e hibridizadas a sondas biotiniladas específicas para as regiões marcadas (Figura 5-B). A reação foi então enriquecida para as regiões desejadas adicionando-se beads de streptavidina que se ligaram às sondas biotiniladas (Figura 5-C). Os fragmentos de DNA biotinilados ligados às beads foram magneticamente carregados para baixo da solução (Figura 5-C). Estes fragmentos enriquecidos foram, posteriormente, eluídos das beads (Figura 5-D) e hibridizados para uma segunda reação de enriquecimento. Após a amplificação, uma biblioteca marcada estava pronta para a geração de clusters e subsequente sequenciamento de nova geração.
Figura 5 – Principais passos do sequenciamento de exomas utilizando o kit Nextera
Rapid Capture Exome Adaptado de
<https://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_nextera_rapid_capture_exome. pdf>, acesso em 16 de abril de 2019
Controle de qualidade das bibliotecas
Realizou-se a quantificação total das bibliotecas utilizando-se o aparelho Qubit 2.0 (Thermo Fisher – Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) bem como a eletroforese em Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), que realiza a análise quantitativa e qualitativa dos fragmentos da biblioteca.
A Figura 6 apresenta a eletroforese de um pool de bibliotecas. Observa-se que a mesma apresentou um tamanho médio de 300 pb, estando de acordo com o recomendado pelo fabricante. Durante as quantificações no Qubit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), os valores mantiveram-se entre 12,4 e 39,6 hg/µL, também dentro do esperado, o que permitiu que se prosseguisse com o sequenciamento.
Figura 6 – Eletroforese de um pool de 6 bibliotecas em Bioanalyzer
O eletroferograma apresenta a fragmentação da biblioteca. Assim como na eletroforese convencional, os fragmentos são separados por tamanho. Os dois picos de tamanhos extremos são marcadores. O pico referente à biblioteca encontra-se próximo a 300 pb.
Sequenciamento de nova geração
As bibliotecas capturadas foram submetidas ao sequenciamento no equipamento Illumina HiSeq 2500 (Illumina, Inc., San Diego, CA, EUA), no Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho (LaCTAD).
Sumariamente, elas foram depositadas em uma lâmina (flowcell) contendo 8 canaletas (lanes) utilizando-se um instrumento denominado cBot (Illumina, San Diego, CA, EUA). Cada pool de bibliotecas continha 6 amostras, sendo cada pool depositado em uma lane. Os oligos presentes na superfície da flowcell eram complementares aos adaptadores das bibliotecas, permitindo a amplificação dos fragmentos. A flowcell foi então colocada no aparelho HiSeq 2500, onde ocorreu a incorporação de nucleotídeos marcados por fluorescência contendo os terminadores didesoxi aos fragmentos ligados aos primers do sequenciamento.
Ao ocorrer a incorporação de um nucleotídeo, a fluorescência foi excitada com uma série de lasers e captada por câmeras. Após a captura da imagem, os terminadores foram clivados e o próximo ciclo de incorporação ocorreu (até 100 ciclos por direção do read). O sequenciamento foi realizado em 2x100 pb (paired-end, analisando-se as duas fitas – direta e reversa) com cobertura mínima solicitada de 80-100x (na qual mais de 95% das alterações de nucleotídeo único podem ser identificadas).
Controle de qualidade das reads
A fim de verificar os níveis de qualidade das sequências (reads) geradas após o sequenciamento foi utilizado o programa FastQC v. 0.11.5 (<https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/>) (83), que fornece informações sobre estatística básica, qualidade, conteúdo de bases GC, distribuição
do tamanho das sequências, níveis de duplicação das sequências e sequências sobre representadas. O programa informa uma rápida avaliação sobre o módulo analisado, usando os sinais “Ö” para resultado esperado, “!” para ligeiramente anormal e “X” para raro/anormal. A Figura 7 apresenta o gráfico mais relevante fornecido no programa. Os sequenciamentos, em sua grande maioria, apresentaram este mesmo padrão.
Figura 7 – Gráfico da qualidade da sequência por base
A linha vermelha central representa o valor mediano, os retângulos amarelos indicam os valores interquartis (25-75%), a linha azul aponta para a qualidade média. O fundo do gráfico divide o eixo y em reads de boa qualidade (verde), qualidade razoável (laranja) e de má qualidade (vermelho).
Análise de bioinformática
As sequências obtidas após o sequenciamento foram alinhadas ao genoma de referência GRCh38 utilizando-se o programa BWA v. 0.7.12-r1039 (<http://bio-bwa.sourceforge.net>) (84). Em seguida elas foram submetidas ao pipeline GATK (v. 3.5.0) (<https://software.broadinstitute.org/gatk>) (85), que consiste em comandos para calibragem das sequências e chamada de variantes, que ao final gerou um arquivo VCF (variant call format) para cada indivíduo. A partir dos arquivos VCF ainda não anotados seguiu-se com uma série de filtros aplicados no VCFtools v. 0.1.15 (<http://vcftools.sourceforge.net>) (86): exclusão das variantes com qualidade inferior a 30 (76,87,88) e cobertura inferior a 10, exclusão
das variantes multialélicas na casuística, retirada das variantes que se localizavam nos cromossomos sexuais (89), exclusão das variantes que apresentaram MAF<0,05 ou <0,1 (a fim de selecionar variantes comuns, e não, raras), remoção das variantes que não foram genotipadas em 5% da casuística (89) e daquelas que se encontravam fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) (76).
As variantes remanescentes foram extraídas do arquivo VCF e anotadas por meio do programa wANNOVAR (<http://wannovar.wglab.org>) (90). Após a anotação, as variantes sinônimas (89) e as pouco conservadas entre espécies foram excluídas. Também foi observado o impacto da variante na proteína codificada, o mesmo foi feito usando-se softwares preditivos, tais como SIFT (<http://sift.jcvi.org>), PolyPhen2 (<http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2>) (91) e FATHMM (<http://fathmm.biocompute.org.uk/>) (92), gerando um arquivo CSV (comma-separated values) contendo as variantes remanescentes anotadas.
No programa PLINK 1.9 (<http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink>) (93) foi realizada a análise de identidade por descendência (para certificar-se de que não haviam indivíduos aparentados), além do cálculo de qui-quadrado e teste exato de Fisher, obtendo-se p-valores que demonstrassem as similaridades e diferenças nos alelos para cada variante entre os grupos caso e controle.
Após todos estes filtros observaram-se muitas variantes remanescentes. Logo, a fim de se aproveitar melhor os resultados provenientes do sequenciamento de exomas, optou-se por aplicar duas abordagens distintas para selecionar as variantes a serem validadas. A primeira delas se dispôs das informações do que já havia sido publicado na literatura, enquanto que a segunda utilizou-se dos p-valores obtidos.
Análise da literatura
Nesta abordagem, as inserções e deleções (InDel) foram excluídas, o MAF de corte adotado foi o de 0,05, o teste estatístico empregado foi o qui-quadrado, e a análise dos softwares de predição se utilizou dos scores provenientes dos programas SIFT e PolyPhen2 (89), excluindo-se apenas as variantes benignas considerando-se os dois softwares. Assim sendo, após estes filtros específicos desta abordagem bem como dos demais já descritos anteriormente, 54 variantes restaram (Anexo 5).
Sendo assim, foi realizada uma pesquisa na literatura sobre cada variante e seu respectivo gene em sites com informações sobre a expressão gênica e a função da proteína codificada, tais como: PANTHER (http://www.pantherdb.org/), Human Proteome Map (http://www.humanproteomemap.org/), Gene Ontology (http://geneontology.org/) e BioGPS (http://biogps.org/#goto=welcome); além da análise dos artigos disponíveis no PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), buscando-se o nome da variante (quando não encontrado, buscando-se o gene em que ela está localizada), acrescido de palavras-chave tais como inflammation, thrombus, ulcer, vascular, skin, endothelium, wound. Desta forma, foram selecionadas seis variantes que poderiam estar relacionadas com a UP na AF levando em consideração seu sentido biológico conhecido.
Menores p-valores
Considerando este método, o MAF adotado foi aquele maior que 0,1, o teste estatístico foi mais restritivo (teste exato de Fisher) e a análise da predição da proteína abrangeu, além dos programas SIFT e PolyPhen2, o FATHMM (94), selecionando apenas as variantes deletérias e não classificadas pelos 3 softwares. Desta forma, após estes filtros específicos desta abordagem, bem como dos demais descritos anteriormente, 21 variantes restaram (Anexo 6).
Esta forma de filtragem não implicou em posterior pesquisa das variantes na literatura, incluindo assim variantes que nunca haviam sido associadas a nenhuma doença, o que proporcionaria novos achados. Como o número obtido ainda era relativamente grande, optou-se por focar nas variantes com menores p-valores, o que provavelmente indicaria maior probabilidade de associação – segundo a estatística. Ao final, outras seis variantes foram selecionadas.
Validação metodológica
Com as 12 variantes selecionadas prosseguiu-se com a validação metodológica, uma vez que o sequenciamento de exomas pode apresentar falsos positivos. Foram construídos os pares de primers para cada variante, com auxílio dos programas Gene Runner (<http://www.generunner.net/>) (95) e Primer 3 (<http://primer3.ut.ee/>) (96). Com os primers direto reverso sintetizados pela Exxtend (Paulínia, SP, Brasil) ou Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EUA)
foi realizada a PCR (Tabela 1), seguida de sequenciamento direto, genotipando-se novamente a coorte de descoberta.
Reação em cadeia da polimerase
Todas as reações continham, no mínimo, 50 hg de DNA, 50 mM de MgCl2, 10 ρmol de cada dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfatado) (dATP, dCTP,
dGTP e dTTP), 20 ρmol de cada iniciador/primer (direto e reverso), 0,5 U de Taq DNA polimerase em tampão 1X (Tampão 10X: Tris-HCl 200 mM, pH 8,4, KCl 50 mM) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), completando-se com H2O
MilliQ para um volume final de 25 µL.
As condições de amplificação foram as mesmas para todas as variantes, exceto pela temperatura de anelamento, conforme apresenta a Tabela 1. Destaca-se que a variante rs13428956 encontra-se em uma região de grande homologia, sendo assim, foi mais difícil elaborar um par de primers que fosse específico para ela; tal fato explica a alta temperatura de anelamento (Tabela 1).
Tabela 1 – Informações gerais quanto às reações de PCR para a confirmação das
variantes selecionadas no sequenciamento de exomas Variante (Gene) Primer direto (5’-3’) Primer reverso (5’-3’) Temperatura de anelamento Tamanho do fragmento (pb) rs185435736 TGCAGAAGGGAGCGGAATG 66oC 522 (AHNAK2) GACCTCAGCATTCAGTCCCC rs28367882 ACACTTGAGATGTTCCTGCCT 62oC 341 (CEACAM8) ACAGCCGTGCTCAGAAAGTT rs12568784 TACATCCCTCCCTTCTGGCT 60oC 595 (FLG2) ATTCAGGGCCAAGCTGGATC rs9950267 GCTAATGGACCCCTGAATTCA 60oC 560 (LAMA1) TGTCCTCCATAATACTGCCCA rs61745599 TTTCACCTGGATCACTCCGC 66oC 574 (RNF213) GGGGTGAATGGAGGGAACAG rs1975937 TCCCCTGCCCATCAAGTTTC 64oC 411 (ZNF540) GCCTGAGGCCTCTGAGAGTA rs4857302 CACTTTCCCTCCCAGCTTTC 58oC 329 (CRYBG3) TGCCAGTTGATTTGACAGGAT rs3782489 CTCCAGGTCCTGCAGCTTCT 59oC 509 (KRT77) ATACATGTGTTTGCAGCCTGG rs11800462 GGGAATGCTGGCTGAAAGT 60oC 499
(TNFRSF25) CAGGTCAGCCAATGTGTCAG rs13428956 GAGGGCGGCGGCCCGA 70oC 514 (FOXD4L1) GGACTGGCTGCGGCAGGGC rs201853154 ACTTGCTCGATTCAGGGAAG 60oC 337 (UBTFL1) CTCCTCAGCCTGGCTCTTAA rs11454536 CCAACCATAAGCTTCTCCGA 60oC 553 (VWDE) ACCAGAAAAGTGTGCAGAAGAG
Todos os ciclos de temperatura ocorreram em termociclador. A desnaturação inicial consistiu em 1 minuto a 95°C, seguida de 35 ciclos de 94°C por 1 minuto, anelamento dos primers em temperatura específica para cada região durante 1 minuto (Tabela 1) e extensão a 72°C por 1 minuto, finalizando com a extensão final a 72°C por 7 minutos.
Com a reação em cadeia da polimerase realizada, prosseguiu-se com a visualização do fragmento em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio, sob a luz ultravioleta procedente de transiluminador.
Sequenciamento direto
Com o fragmento da PCR visualizado em gel de agarose, seguiu-se com a reação de sequenciamento no Laboratório de Estudos em Genética Humana do CBMEG, sendo estas reações executadas com os mesmos iniciadores da PCR, segundo o método de Sanger (97).
Os materiais utilizados incluíram o produto da PCR (40 hg), Big Dye 2X (ABI PRISM Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), tampão Save Money 1X (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), 5 ρmol do primer direto ou reverso e água ultrapura para completar a reação para o volume final de 20 µL. As reações foram submetidas a 96oC por 1,5
minuto, seguido de 30 ciclos de 96oC por 12 segundos, 50oC por 6 segundos e 60oC
por 4 minutos, em termociclador.
Para a purificação da reação de sequenciamento as amostras foram precipitadas com 80 µL de etanol 80% e centrifugadas a 4.000 RPM por 45 minutos. O sobrenadante foi descartado, seguido da adição de 150 µL de etanol 70%. Uma nova centrifugação foi realizada, sendo esta por 10 minutos a 4.000 RPM, seguida do descarte do sobrenadante. As amostras foram secadas em termociclador por 3
minutos a 64oC e armazenadas a -20oC no Laboratório de Estudos em Genética
Humana do CBMEG.
O produto da reação de sequenciamento purificado foi ressuspendido em 10 µL de formamida Hi-Di (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), vigorosamente agitado e posteriormente desnaturado a 94oC por 5 minutos. A leitura
das sequências de bases nitrogenadas dos fragmentos foi realizada em sequenciador automático ABI PRISM 3700 ou ABI PRISM 3130 DNA Analyzers (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) em colaboração com o Hemocentro da Unicamp.
As sequências provenientes do sequenciador foram analisadas com o auxílio do programa FinchTV 1.5.0 (Geospiza, Informer Technologies Inc.) (<https://finchtv.software.informer.com/>), tornando possível a genotipagem dos indivíduos submetidos ao sequenciamento de exomas tal como é apresentado na Figura 8.
A B C
Figura 8 – Eletroferograma dos genótipos possíveis para o rs12568784 G/T (FLG2)
A: Homozigoto para o alelo ancestral (GG), B: Heterozigoto (GT), C: Homozigoto para o alelo variante (TT)
Validação populacional
Com a finalidade de comprovar se as variantes selecionadas estariam realmente relacionadas com a UP na AF, não se tratando de um achado ao acaso, fez-se a genotipagem na coorte de validação.
A amostra proveniente do HEMOBA foi a primeira a ser obtida. Sendo assim, nela foi feita a genotipagem das seis variantes selecionadas pela abordagem segundo a análise da literatura, que foi a primeira elaborada. A genotipagem foi realizada pelo método do sequenciamento direto (assim como descrito
