Modelagem estatística da contaminação microbiológica de áreas de cultivo de moluscos bivalves
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção de grau de Doutor em Aquicultura
Orientador: Walter Quadros Seiffert
Coorientador: Luis Hamilton Pospissil Garbossa
Florianópolis 2017
Este trabalho é dedicado ao meu pai José Oscar de Souza e a minha mãe Salete Ventura de Souza.
À Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina – Epagri pela liberação para a realização do curso de doutorado. Aos colegas do Centro de Desenvolvimento em Aquicultura e Pesca da Epagri por terem atendido às demandas do centro durante o período de doutorado contando com um funcionário a menos. Ao pesquisador André Luis Tortato Novaes pelo apoio, aconselhamentos, revisões de texto e troca de ideias durante todas as etapas do curso de doutorado. Ao pesquisador do Centro de Informações de Recursos Ambientais e de Hidrometeorologia de Santa Catarina – Ciram, Luiz Fernando de Novaes Vianna pelo apoio nos primeiros passos com o uso de Sistemas de Informações Geográficas e pelas críticas e sugestões durante o desenvolvimento da tese. Especial agradecimento ao coorientador do doutorado e pesquisador do mesmo centro, Luis Hamilton Pospissil Garbossa, pelos conhecimentos compartilhados, pelo apoio desde as primeiras conversas sobre a intenção de realizar o doutorado e pelo encorajamento para a realização do estágio no exterior. À colega Kelly Besen pela disponibilização de base de dados de sólidos suspensos e turbidez nas baías da Ilha de Santa Catarina.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES pela concessão de bolsa para realização de estágio doutoral no exterior por meio do Programa Ciências do Mar e aos professores Claudio Manoel Rodrigues de Melo e Walter Quadros Seiffert pelo apoio na obtenção da bolsa. Ao orientador do doutorado, Walter Quadros Seiffert, agradeço ainda pela confiança nos trabalhos desenvolvidos, mesmo que boa parte do tempo a distância.
Ao Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science – Cefas por ter me recebido e disponibilizado a estrutura e o apoio necessários para o desenvolvimento da tese durante o período na Inglaterra. À Gerente do Grupo de Sanidade de Alimentos, Michelle Price-Hayward, e ao supervisor do estágio doutoral e cientista sênior, David Lees, pelo apoio na obtenção da documentação para a realização do estágio. A Andrew Younger pela revisão do artigo referente ao Capítulo I da tese, a Nick Taylor pelas discussões sobre estatística e pela indicação do curso de estatística utilizando a linguagem R. A Ron Lee pelo compartilhamento de informações sobre as análises estatísticas usadas em seus estudos de equivalência de legislações. Estendo os agradecimentos aos membros da equipe do Cefas que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento do trabalho: David Harverson, David Ryder, Paulette Posen, Andy Powell, Simon Kershal, Robert Hartfield, Anna Neish, James Lowther, Clement Garcia, Ioanna Katsiadaki e Justin Avant. Agradecimento especial ao pesquisador Carlos José Alexandre de
Campos por ter viabilizado a realização do estágio no Cefas, por todo seu empenho na obtenção de documentação e pela dedicação na supervisão do trabalho realizado na Inglaterra. O agradecimento se estende ao apoio durante todo o curso de doutorado, aos aconselhamentos, revisões de textos e importantes contribuições em todos os capítulos da tese.
Ao Marine, Environment & Technology Center – Maretec por ter me recebido e disponibilizado todo apoio necessário para o desenvolvimento da tese durante o período em Portugal. Ao professor Ramiro Neves pela confiança de ter aceitado supervisionar o estágio no Maretec e pelas contribuições para a evolução do trabalho. Ao professor Tiago Domingos pela troca de ideias sobre a abordagem estatística adotada na tese. Estendo os agradecimentos aos demais membros do Maretec que de alguma forma contribuíram com o desenvolvimento da tese: João Sobrinho, Ligia Pinto, Carlos Amilton Silva Santos, Francisco Campuzano, Marko Tosic, Lucian Simionesei, Hilda de Pablo e Ana Oliveira. Agradecimento especial ao pesquisador Guilherme Franz pelo fundamental apoio durante o desenvolvimento do modelo hidrodinâmico.
À empresa Action Modullers por ter cedido licença de uso do software MOHID Studio durante o período do doutorado e à empresa ESRI Portugal pela licença do software ArcGis.
Agradecimento especial a minha irmã e professora do Instituto Federal Catarinense, Thaysi Ventura de Souza, pelos aconselhamentos e sabedoria para me manter calmo e focado nos momentos de dificuldade para avançar na tese. À professora da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Daniele Matias Dantas, pelo encorajamento para a realização do estágio no exterior.
Aos meus pais José Oscar de Souza e Salete Ventura de Souza pelo apoio para a realização do doutorado e do estágio no exterior. Agradecimento especial aos meus irmãos Thomas Ventura de Souza e Thaysi Ventura de Souza e a minha cunhada Carolina Rivello por terem enfrentado os problemas familiares desse período sem contar com minha ajuda. Aos meus sobrinhos, Alice a Antonio Rivello Ventura de Souza, por me inspirarem e alegrarem meus dias no exterior, mesmo que nas rápidas conversas por internet. Por fim, agradeço às pessoas com quem convivi no exterior e que tornaram esse período de intenso trabalho mais leve - na Inglaterra: Carlos Campos, Célia Jorge de Campos, Sara Jorge de Campos, Sofia Velez, Robert Hartfield, Andy Younger, Andy Powell, Simon Kershal, Anna Neish, Lesley, Ioanna Katsiadaki, Keith Harrison, Lewes Coates; e em Portugal: Juliana Amorim, Cristina Latoeira, Lucian Simionesei, Guilherme Franz, Clarisse Machado, Marko Toisic, Viton Araújo e Catarina Manso.
A presente tese é composta por quatro capítulos. No primeiro é feita a contextualização dos objetivos da pesquisa. O segundo apresenta uma revisão das práticas de monitoramento em vigor no Brasil, na União Europeia e nos Estados Unidos da América para a classificação de áreas de produção de moluscos. Os sistemas de classificação não são imediatamente comparáveis porque alguns são baseados no monitoramento de água e outros da carne dos moluscos. Para criar uma base comum de comparação, modelos de regressão foram desenvolvidos para correlacionar os níveis de organismos indicadores fecais (FIOs) na água e nos moluscos. Diferenças importantes nos níveis de segurança proporcionados pelas classificações estabelecidas pelas diferentes legislações foram identificadas. O terceiro capítulo descreve uma metodologia para o desenvolvimento de modelos de regressão para prever os níveis de FIOs em áreas costeiras influenciadas por fontes de poluição localizadas em múltiplas bacias hidrográficas. Concentrações de FIOs em mexilhões (Perna perna) e em água marinha medidas em 50 locais nas baías da Ilha de Santa Catarina (SC, Brasil) entre agosto de 2012 e outubro de 2013 foram utilizadas no estudo. Modelos de regressão foram utilizados para estudar as relações entre as variações espaciais dos níveis de FIOs e características geográficas de bacias hidrográficas próximas aos pontos de monitoramento. Ao considerar na análise bacias hidrográficas com exutórios localizados em até 3 km dos pontos de monitoramento foi possível aumentar em até 150% o coeficiente de determinação (R2) dos modelos. Variáveis meteorológicas foram testadas para prever a variação temporal nos níveis de FIOs. Para otimizar os modelos, o efeito cumulativo desses parâmetros foi avaliado considerando diferentes janelas de tempo antes das coletas. Essa abordagem permitiu aumentar o R2 dos modelos em até 160%. No quarto capítulo, um único modelo é desenvolvido para prever tanto variações espaciais quanto temporais dos níveis de FIOs. O referido modelo é validado e usado para prever a poluição fecal nas baías em diferentes cenários. Foram comparados 288 pares de resultados medidos/modelados, dados obtidos de março de 2009 a abril de 2010 em 15 pontos de monitoramento. Os resultados da validação indicaram que o modelo fornece uma representação justa dos níveis de FIOs no ambiente de estudo dentro das condições meteorológicas sob as quais o modelo foi treinado.
Palavras-chave: Aquicultura. Perna perna. Modelos de regressão. Coliformes. Validação cruzada.
This thesis is composed of four chapters. The first one contextualizes the objectives of the research. The second one presents a review of the monitoring practices for classification of commercial shellfish production areas in force in Brazil, European Union and United States of America. The classification systems are not immediately comparable principally because some regulations are based on the monitoring of water and others of shellfish flesh. To create a common baseline to compare these regulations, regression models were developed based on monitoring data and used to correlate levels of faecal indicator bacteria in water and in shellfish. Important differences in the levels of shellfish safety provided by the classifications in the different legislations were identified. The third chapter describes a methodology for developing regression models to predict the FIO levels in coastal areas influenced by pollution sources located in multiple catchments. Concentrations of faecal indicator organisms (FIO) in mussels (Perna perna) and water sampled from 50 sites in the North and South bays of Santa Catarina (SC, Brazil) from August 2012 to October 2013 were used in the study. Regression models were used to study the relationships between the spatial variations of FIO levels and geographic characteristics of catchments located near the monitoring points. By considering in the analysis catchments with outlets within three kilometres from the monitoring points, it was possible to increase the coefficients of determination (R2) of the models up to 150%. Meteorological variables were tested to predict the temporal variation in the FIO levels. To optimize the models, the cumulative effect of these parameters was evaluated considering different time windows prior to samplings. This approach allowed increasing the models’ R2 up to 160%. In the fourth chapter, a single model is developed to predict both the spatial and the temporal variations in the FIO levels. The referred model is validated and applied to predict the FIO levels in the bays under different scenarios. The analysis considered 288 pairs of measured/modelled results to validate the model, data obtained from March 2009 to April 2010 regarding 15 monitoring points. The validation results indicated that the model provides a fair representation of the FIO levels in the studied environment under the meteorological conditions under which the model was trained.
Keywords: Aquaculture. Perna perna. Regression models. Coliforms. Cross-validation.
Figura 1 - Níveis de segurança microbiológica (mais alto para mais baixo = da esquerda para a direita) oferecidos pelas diferentes legislações que regulam a qualidade microbiológica de áreas de produção de moluscos no Brasil, nos EUA e na UE. ... 48 Figura 2 - Gráfico de dispersão descrevendo as relações dos níveis de FIO em mexilhões (A) e em ostras (B) com os níveis de FIO na água. A: p=0,00004; R2=0,28; Log
10 FIO em mexilhões=1,71+0,576*Log10 FIO na água; B: p=0,0009; R2=0,20; Log
10 FIO em
ostras=1,76+0,442*Log10 FIO na água. ... 50 Figura 3 - Classificação das áreas de produção de moluscos no Brasil, considerando os resultados de cinco amostras coletadas em um único dia (linha tracejada) e as séries temporais de um mínimo de 12 resultados (linha pontilhada). A linha contínua indica o percentil 80 das concentrações de FIOs em mexilhões para as cinco amostras obtidas em cada dia de amostragem. Os limites utilizados para classificar as áreas de produção são os estabelecidos na legislação da UE. O número de amostras/dias de amostragem para as áreas de produção de um a oito (P1 a P8) foram 400/80, 345/69, 395/79, 300/60, 359/72, 205/41, 350/70 e 275/55, respectivamente. ... 51 Figura 4 - Localização da área de estudo, mostrando pontos de amostragem nas baías Norte e Sul, Santa Catarina, Brasil. ... 69 Figura 5 - Esquema da abordagem utilizada para correlacionar as bacias hidrográficas com os níveis de FIO nos pontos de monitoramento de água/molusco. A - Modelos básicos - Neste caso, apenas a área da bacia hidrográfica mais próxima foi considerada na análise; B até E - Modelos considerando raios em torno dos pontos de monitoramento para determinar a área das bacias hidrográficas; B – Nenhum exutório localizado dentro do raio selecionado: o ponto não foi considerado na análise; C – Um exutório dentro do raio selecionado: a área dessa bacia hidrográfica foi considerada na análise; D e E - Mais de um exutório dentro do raio selecionado: a área combinada dessas bacias hidrográficas foi considerada na análise. ... 71 Figura 6 - Evolução do coeficiente de determinação (R2) e nível de significância (p) dos modelos de regressão linear para prever níveis de
FIO em água e em mexilhões considerando quatro diferentes parâmetros geográficos como variáveis explicativas. A geografia de bacias hidrográficas cujos exutórios estavam localizados a diferentes distâncias dos pontos de monitoramento foi considerada na análise. A linha pontilhada cinza indica o nível de significância de 0.05 para valores de p. ... 74 Figura 7 - Gráficos de dispersão comparando modelos básicos e otimizados desenvolvidos para prever níveis de FIO em água e mexilhões com base em quatro diferentes parâmetros geográficos das bacias hidrográficas. ... 74 Figura 8 - Evolução do coeficiente de determinação e nível de significância de modelos de regressão linear para prever os níveis de FIO na água e nos mexilhões. Três parâmetros meteorológicos em diferentes janelas de tempo antes da amostragem são testados como variáveis explicativas. A linha pontilhada cinza indica o nível de significância de 0,05 para os valores de p. ... 78 Figura 9 - Gráficos de dispersão comparando modelos básicos e otimizados desenvolvidos para prever os níveis de FIO em água e em mexilhões com base na radiação solar e na precipitação. ... 79 Figura 10 - Localização da área de estudo, mostrando pontos de amostragem nas baías Norte e Sul, Santa Catarina, Brasil. ... 98 Figura 11 - Médias geométricas das concentrações de FIO na água em pontos de amostragem influenciados por bacias hidrográficas com diferentes populações humanas. A linha preta representa o modelo linear desenvolvido para prever as GMs de FIOs na água em termos de MPN/100 mL-1 (Y) com base na população humana de bacias hidrográficas localizadas em até 3.1 km (X): -1/Y = -0.75141 + 0.35732*X. p: 2.875e-10; R2 ajustado: 0,61; Erro padrão residual: 0,20. ... 104 Figura 12 - Médias geométricas dos níveis de FIO medidos e modelados para as águas das baías Norte e Sul durante os períodos de treinamento (a e A) e validação do modelo (b e B). Os resultados modelados foram gerados pelo modelo espacial. ... 105
radiação solar e precipitação (pontos negros). O gráfico de superfície representa o modelo temporal desenvolvido para prever a GM das concentrações de FIOs em água em termos de MPN/100mL-1 (Y) com base na radiação solar cumulativa de 53 h (WH/m2) (X1) e precipitação cumulativa de 158 h (milímetros) (X2): -1/Y = -4.299e-01 -1.873e-05*X1 +2.740e-02 *(X2^0.5); p = 0.003; R2 ajustado = 0.66; Erro padrão residual = 0.07865. ... 107 Figura 14 - Radiação solar e precipitação acumuladas e as GMs das concentrações de FIO modeladas e medidas durante o período de treinamento do modelo. Os resultados modelados foram gerados pelo modelo temporal. A linha horizontal pontilhada indica o valor máximo para cada parâmetro registrado nas campanhas de monitoramento de água realizadas durante o treinamento do modelo. ... 108 Figura 15 - Radiação solar e precipitação acumuladas e as GMs das concentrações de FIO modeladas e medidas durante o período de validação do modelo. Os resultados modelados foram gerados pelo modelo temporal. A linha horizontal pontilhada indica o valor máximo para cada parâmetro registrado nas campanhas de amostragem de água realizadas durante o treinamento do modelo. ... 109 Figura 16 - Resultados medidos e modelados de FIOs em água obtidos durante os períodos de treinamento (A) e validação do modelo (B1). B2 representa resultados para o período de validação com os pares de dados referentes às campanhas 2 (C2) e 15 (C15) removidos da base de dados. Os resultados modelados foram gerados pelo modelo temporal... 110 Figura 17 - Concentrações de FIO medidas e modeladas em água para os períodos de treinamento (A) e validação do modelo (B). Os resultados modelados foram gerados pelo modelo integrado. ... 111 Figura 18 - Variações espaciais das concentrações de FIO nas baías Norte e Sul (MPN.100 mL-1) previstas pelo modelo integrado em diferentes cenários ambientais: Precipitação média e 3º quartil da radiação solar registrada em 2012-2013 (cenário A); Precipitação média e 1° quartil da radiação solar em 2012-2013 (cenário B); Nenhuma precipitação e radiação solar máxima registrada durante o
período de treinamento do modelo (cenário C); Radiação solar mediana e o 3º quartil da precipitação em 2012-2013 (cenário D); Radiação solar mediana e o 1º quartil da precipitação registrada em 2012-2013 (cenário E); Radiação solar mínima e chuvas máximas registradas durante o treinamento do modelo (cenário F); Precipitação e radiação solar medianas e população humana registrada em 2010 (cenário G); Precipitação e radiação solar medianas e redução de 50% na população humana nas 22 bacias hidrográficas mais populosas (cenário H); Precipitação e radiação medianas e aumento de 15% na população humana, representando a população humana da região estimada para 2017 (cenário I). ... 115
Tabela 1 - Microorganismos causadores de doenças associadas ao consumo de moluscos bivalves. Adaptado de FAO (2012) ... 26 Tabela 2 - Resumo dos padrões legislativos utilizados para classificar as áreas de produção de moluscos no Brasil, nos EUA e na UE ... 44 Tabela 3 - Classificação das áreas de produção de moluscos de acordo com os critérios microbiológicos estabelecidos na Resolução nº 357 do CONAMA, Programa Nacional de Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves (PNCMB)¸ National Shellfish Sanitation Program dos EUA, e legislação da UE. ... 46 Tabela 4 - Resumo dos coeficientes dos modelos de regressão que descrevem as relações entre os níveis de FIOs na água e nos mexilhões. ... 47 Tabela 5 - Comparação entre modelos básicos e otimizados para prever níveis de FIO em água e mexilhões com base em parâmetros geográficos das bacias hidrográficas. A transformação aplicada aos conjuntos de dados é indicada entre parênteses na primeira e segunda colunas. DF - Graus de liberdade; r - coeficiente de correlação; R2 - Coeficiente de determinação; RSE - Erro padrão residual. ... 75 Tabela 6 - Resultados de modelos de regressão múltipla relacionando níveis de FIO na água (que passaram por transformação recíproca) e em mexilhões (transformados por meio de raiz recíproca) a parâmetros geográficos das bacias hidrográficas (transformação logarítmica de base 10). RSE - Erro padrão residual, POP - População humana residente, URB - Área urbanizada das bacias hidrográficas, ÁREA - Área total das bacias hidrográficas, IMP - Porcentagem de cobertura impermeável. ... 81 Tabela 7 - Resumo dos parâmetros de validação obtidos a partir dos modelos espacial, temporal e integrado. p - valor p da análise de regressão tendo como variável explicativa os valores medidos e como dependente as previsões do modelo; R2 - Coeficiente de Determinação; 𝑂 – Média dos valores observados; 𝑠𝑜- Desvio padrão dos valores observados; 𝑃 – Média dos valores previstos; 𝑠𝑝 - Desvio
padrão dos valores previstos; MAE – Erro Absoluto Médio; RMSE – Raiz Quadrado do Erro Quadrático Médio; d - Índice de concordância. Observe que 𝑃, 𝑠𝑝, MAE e RMSE são expressos em log10 of NMP.100 mL-1. ... 106 Tabela 8 - Estatísticas descritivas dos dados meteorológicos de 2012-2013 utilizados para determinar os cenários ambientais a serem modelados. ... 112
CIDASC – Companhia Integrada de Desenvolvimento Agrícola de Santa Catarina
CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente CFU – Unidade Formadora de Colônia
EUA – Estado Unidos da América EU – União Europeia
FDA – Food and Drug Administration FIO – Organismos Indicadores Fecais GIS – Sistema de Informações Geográficas GM – Média Geométrica
MPN – Número Mais Provável MAE – Erro Absoluto Médio
NSSP – National Shellfish Sanitation Program
PNCMB – Programa Nacional de Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves
RBMs – Modelos Baseados em Regressão R2 – Coeficiente de Determinação
RMSE – Raiz Quadrada do Erro Quadrático Médio SPAs – Áreas de Produção de Moluscos
SUMÁRIO
1 CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL ... 23
1.1 RISCOS ASSOCIADOS AO CONSUMO DE MOLUSCOS ... 23
1.2 PRESENÇA DE MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS NA ÁGUA E NOS MOLUSCOS CULTIVADOS NA BAÍA DA ILHA DE SANTA CATARINA ... 28
1.3 ORGANISMOS INDICADORES FECAIS ... 29
1.4 LEGISLAÇÃO INTERNACIONAL PARA CONTROLE DE RISCOS MICROBIOLÓGICOS EM ÁREAS DE CULTIVO DE MOLUSCOS BIVALVES ... 30
1.5 LEGISLAÇÃO BRASILEIRA SOBRE LIMITES MICROBIOLÓGICOS PARA O CULTIVO DE MOLUSCOS BIVALVES ... 30
1.6 O USO DE MODELOS MATEMÁTICOS PARA PREVER RISCOS MICROBIOLÓGICOS ... 32 2 JUSTIFICATIVA ... 33 3 HIPÓTESE ... 34 4 OBJETIVOS ... 34 4.1 OBJETIVO GERAL ... 34 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 34 5 ESTRUTURA DA TESE ... 35
6 CAPÍTULO II: ANÁLISE CRÍTICA DO ARCABOUÇO JURÍDICO INTERNACIONAL QUE REGULA A CLASSIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ÁREAS DE PRODUÇÃO DE MOLUSCOS BIVALVES ... 37
6.1 RESUMO ... 37 6.2 INTRODUÇÃO ... 38 6.3 MÉTODOS ... 41 6.4 RESULTADOS ... 42 6.5 DISCUSSÃO ... 52 6.6 AGRADECIMENTOS ... 56 6.7 REFERÊNCIAS ... 57
7 CAPÍTULO III: OTIMIZANDO MODELOS ESTATÍSTICOS PARA PREVER NÍVEIS DE POLUIÇÃO FECAL EM ÁREAS COSTEIRAS ... 65
7.1 RESUMO ... 65
7.2 INTRODUÇÃO ... 66
7.3.1 Descrição do local de estudo ... 68 7.3.2 Base de dados ... 69 7.3.3 Análises estatísticas ... 70 7.4 RESULTADOS ... 72 7.4.1 Correlação entre os parâmetros geográficos e a variação
espacial dos níveis de FIOs ... 72 7.4.2 Correlações entre parâmetros meteorológicos e as
flutuações temporais nos níveis de FIO ... 77 7.4.3 Análise de regressão linear múltipla ... 79 7.5 DISCUSSÃO ... 81 7.6 CONCLUSÕES ... 85 7.7 AGRADECIMENTOS ... 86 7.8 REFERENCES ... 86 8 CAPÍTULO IV - DESENVOLVIMENTO, VALIDAÇÃO
E APLICAÇÃO DE MODELOS DE REGRESSÃO PARA
PREVER CONCENTRAÇÕES DE ORGANISMOS
INDICADORES FECAIS EM ÁGUAS COSTEIRAS ... 95 8.1 INTRODUÇÃO ... 96 8.2 MATERIAL E MÉTODOS ... 97 8.2.1 Descrição do local de estudo ... 97 8.2.2 Desenvolvimento dos modelos ... 99 8.2.3 Validação dos modelos ... 100 8.2.4 Aplicando os modelos para prever as concentrações de FIO
em diferentes cenários ... 102 8.3 RESULTADOS ... 103 8.3.1 Modelo espacial ... 103 8.3.2 Modelo temporal ... 107 8.3.3 Modelo integrado ... 110 8.3.4 Aplicando os modelos para prever as concentrações de FIO
em diferentes cenários ... 111 8.4 DISCUSSÃO ... 115 8.5 AGRADECIMENTOS ... 119 8.6 REFERÊNCIAS ... 119 9 CONCLUSÕES GERAIS ... 129 10 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 131
11 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL
A produção mundial de pescado em 2014 foi de 167,2 milhões de toneladas (FAO, 2016a). A parcela desse montante que é proveniente da pesca não tem aumentado significativamente nos últimos anos, mantendo-se em torno de 90 milhões de toneladas desde 2003. Já a parcela proveniente da aquicultura vem crescendo de forma consistente, tendo passado de 38,9 milhões de toneladas em 2003 para 73,8 milhões de toneladas em 2014. Esse panorama evidencia a importância dos cultivos aquáticos para o suprimento da demanda mundial por pescado. Os moluscos marinhos representam 21.5% da produção aquícola mundial, sendo as almejas e berbigões o grupo mais cultivado (5,3 milhões de toneladas), seguido pelas ostras (5,1 milhões de toneladas), vieiras e mexilhões (1,9 milhões de toneladas cada) (FAO, 2016b).
No Brasil, a produção da aquicultura foi de 562.500 toneladas em 2014, sendo 22.100 toneladas de moluscos bivalves (FAO, 2016a). Os cultivos de moluscos estão concentrados no litoral sul do Brasil, especialmente no estado de Santa Catarina, onde a maior parte da produção nacional é gerada. Os maricultores catarinenses produziram 20.437 toneladas no ano de 2015 (Epagri, 2016), sendo os mexilhões
Perna perna a espécie mais cultivada (17.370 toneladas) seguidos pelas
ostras Crassostrea gigas (3.030 toneladas) e pelas vieiras Nodipecten
nodosus (37,2 toneladas). Em torno de 70% da produção estadual de
moluscos é cultivada nas baías da Ilha de Santa Catarina. Estas baías ficam entre o continente e a Ilha de Santa Catarina, onde se situa o núcleo da Região Metropolitana de Florianópolis, o maior aglomerado populacional do estado, onde vivem mais de 800.000 habitantes (Disponível em: www.cidades.ibge.gov.br).
1.1 RISCOS ASSOCIADOS AO CONSUMO DE MOLUSCOS Moluscos bivalves são animais filtradores, capazes de concentrar contaminantes existentes na água em que são cultivados. Os contaminantes podem envolver substâncias tóxicas, toxinas produzidas por microalgas e microrganismos patogênicos. No caso específico dos contaminantes microbianos, o risco é aumentado pelo hábito de se consumir os bivalves crus (Ex: ostras) ou levemente cozidos (Ex: mexilhões) (Butt et al., 2004; D Lees, 2000). Mesmo quando consumidos cozidos os riscos relacionados ao consumo de bivalves persistem, uma vez que estudos indicam que o cozimento pode ser apenas parcialmente
efetivo na redução dos níveis de patógenos nos moluscos (Croci et al., 2005; Hewitt and Greening, 2006; Souza et al., 2015). A contaminação marinha por patógenos de origem humana é comumente associada à inexistência ou a ineficiência de sistemas de coleta e tratamento de esgotos em áreas urbanas localizadas em bacias hidrográficas que drenam para áreas costeiras (Garbossa et al., 2017). O diagnóstico realizado pelo Sistema Nacional de Informações sobre Saneamento Básico do Ministério das Cidades, realizado em 2011, revelou que o índice médio de atendimento da população com rede de coleta de esgotos em Santa Catarina era de apenas 21%, o que posicionava o estado em 19º, entre as 27 unidades da federação. Apenas 58,7% da população urbana de Florianópolis, 34,3% de São José, 4,5% de Palhoça e 0% de Biguaçu (cidades integrantes da região metropolitana de Florianópolis) possuíam atendimento com rede de esgoto (SNSA/MCIDADES, 2014). Esse panorama é bastante preocupante do ponto de vista da saúde pública quando se considera que as baías da Ilha de Santa Catarina são o principal centro produtor de moluscos filtradores do Brasil.
A Erro! Fonte de referência não encontrada. apresenta os microrganismos que já foram implicados em casos de doenças associadas ao consumo de bivalves. É possível observar que muitos dos patógenos listados estão associados com contaminação fecal de origem humana. Gastroenterites virais causadas por Norovírus são as doenças mais comumente associadas ao consumo de moluscos em muitos países desenvolvidos (Lee et al., 2008). Um estudo que se estendeu por dois anos realizado no Reino Unido mostrou que 76,2% das amostras de ostras coletadas em 39 áreas de produção estavam contaminadas com esse vírus (Cefas, 2011). Em alguns países, como a Itália, a hepatite A é um problema importante. O consumo de moluscos tem sido associado a 62% dos casos dessa doença naquele país (Mele et al., 1997). Infecções por
Salmonella associadas ao consumo de moluscos bivalves costumavam ter
significativa importância na Europa e América do Norte, mas ocorrem com menor frequência atualmente (Lee et al., 2008). Isso se deve em parte às ações de saúde pública que reduziram a incidência dessas infecções na comunidade, consequentemente reduzindo o risco dos moluscos serem contaminados, e em parte aos controles sanitários estabelecidos na produção de moluscos (Lee et al., 2008).
O Brasil não conta com um mecanismo de vigilância epidemiológica dedicado à identificação e à investigação de casos de doenças veiculadas por moluscos. Raramente são realizados diagnósticos para determinação das causas específicas de doenças alimentares e a associação de gastroenterites com o alimento que originou o problema é
dificultada nos casos de patógenos com longos períodos de incubação, como o de alguns vírus. Esses fatores somados fazem com que os dados epidemiológicos disponíveis em Santa Catarina não permitam um diagnóstico adequado da relação entre consumo de moluscos e enfermidades associadas (Souza et al., 2014).
1.2 PRESENÇA DE MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS NA ÁGUA E NOS MOLUSCOS CULTIVADOS NA BAÍA DA ILHA DE SANTA CATARINA
Apesar da escassez de evidências epidemiológicas de ocorrência de doenças de origem microbiana relacionadas ao consumo de moluscos em Santa Catarina, estudos identificaram a presença de muitos dos patógenos que estão listados na Tabela 1 em moluscos e nas águas utilizadas para a malacocultura nas baías da Ilha de Santa Catarina. Coelho et al. (2003) investigaram a presença do vírus da hepatite A em quatro áreas produtoras de moluscos na baía da Ilha de Santa Catarina e obtiveram seis amostras positivas de um total de 132 analisadas. Pereira et al. (2006) analisaram 90 amostras de ostras de três locais da Baía da Ilha de Santa Catarina entre 2003 e 2004. Eles não detectaram Vibrio
cholerae, V. parahaemolyticus e Salmonella sp., porém estafilococos
coagulase-positiva foram observados em uma amostra. Ramos et al. (2012b) analisaram 180 amostras de ostras coletadas de locais de cultivo entre 2006 e 2007. Nenhuma amostra foi positiva para Salmonella, 15 amostras foram positivas para Vibrio alginolyticus, e V. cholerae foi detectado em quatro amostras. Moresco et al. (2012) pesquisaram a presença de microrganismos entéricos em águas de onze praias da Ilha de Santa Catarina, incluindo pontos próximos a três importantes regiões de cultivo de moluscos. Das 132 amostras analisadas, 55% foram positivas para adenovírus, 51,5% para vírus da hepatite A, 7,5% para norovírus GI, 4,5% para norovírus GII, e 3% para poliomavírus. Souza et al. (2012) realizaram uma investigação em água marinha e ostras em quatro pontos da baía da Ilha de Santa Catarina (três deles em áreas de cultivo de moluscos). O estudo detectou a presença de adenovírus em todas as amostras de ostras analisadas, além da presença de Norovírus humano GI e do protozoário Cryptosporidium spp. em um dos locais monitorados. Souza et al. (2017) monitoraram níveis de bactérias e vírus em berbigões,
Anomalocardia brasiliana, e observaram que, apesar dos níveis de
bactérias estarem dentro dos limites permitidos pela legislação brasileira (E. coli < 230 MPN e Salmonella sp. ausentes em 25 g de carne), vírus entéricos estavam presentes nos moluscos. As maiores concentrações detectadas foram para o vírus da hepatite A, seguidas por Rotavirus-A, Adenovírus Humano e Norovirus GI.
1.3 ORGANISMOS INDICADORES FECAIS
Analisar a presença e as concentrações de todos os patógenos descritos anteriormente para fins de proteção da saúde pública envolve custos significativos. Por este motivo, alguns grupos de microrganismos são utilizados como indicadores da presença de contaminação fecal em áreas de cultivo de moluscos e consequentemente dos riscos microbiológicos. Esses organismos, chamados de Organismos Indicadores Fecais (FIOs), estão associados à possível presença de agentes patogênicos na água ou nos moluscos, apesar de não serem tipicamente causadores de doenças (Rees et al. 2010). De acordo com Myers et al. (2014), um organismo indicador de contaminação fecal na água idealmente deve: ter a possibilidade de ser testado facilmente; ser de origem humana ou de outros animais; sobreviver no ambiente pelo mesmo tempo ou tempo maior do que os patógenos; estar presente em densidades correlacionadas com a contaminação fecal; poder ser usado como indicador de vários patógenos diferentes; ser indicador apropriado para uso em ambientes de água doce e salinos. Organismos comumente adotados como indicadores fecais são os coliformes fecais, Escherichia
coli e Enterococcus spp..
A abundância e a distribuição de FIOs no meio marinho são determinadas pelo efeito combinado da intensidade da luz solar, mistura de água, aportes de esgoto e do material em suspensão na água (Campos et al. 2013). Condições favoráveis para a sobrevivência de FIOs são baixa radiação solar, baixa temperatura, baixa salinidade, baixas densidades de micro-predadores e altos níveis de matéria orgânica. A chuva é o parâmetro mais comumente associado a níveis máximos de FIOs no ambiente marinho (Campos et al. 2013). A ressuspensão de sedimentos contaminados na coluna de água é um importante fator determinante da distribuição de FIOs em estuários rasos e deposicionais durante períodos de alta precipitação (Campos et al. 2013).
É um consenso entre cientistas que as concentrações de coliformes termotolerantes (fecais) na água não são indicadores robustos do risco para a saúde humana, pois a presença desse grupo na água não se correlaciona bem com a presença de patógenos bacterianos ou virais na carne de moluscos (Schwab, et al. 1998). Por esse motivo, indicadores alternativos e potencialmente mais representativos, como os fagos F+RNA, vêm sendo recomendados conjuntamente com análises de E. coli, para gerar informações sobre os riscos de agentes patogênicos virais (Rees et al. 2010).
1.4 LEGISLAÇÃO INTERNACIONAL PARA CONTROLE DE RISCOS MICROBIOLÓGICOS EM ÁREAS DE CULTIVO DE MOLUSCOS BIVALVES
Para reduzir o risco de doenças relacionadas ao consumo de moluscos filtradores, muitos países implementaram controles da produção comercial e/ou a extração recreativa de moluscos (Murray e Lee, 2010). Essencialmente, esses controles consistem no monitoramento de FIOs em moluscos e/ou água e na classificação das áreas de produção com base nos resultados desse monitoramento seguida, quando necessário, de tratamentos pós-colheita (depuração, relocação, tratamento térmico) antes da venda para consumo humano (OMS e FAO, 2012). O uso de FIOs, como os coliformes fecais ou Escherichia coli, nesse tipo de monitoramento fornece uma indicação do risco potencial de contaminação por agentes patogênicos de origem fecal.
Os programas internacionais de controle sanitário de moluscos no mundo ocidental geralmente adotam uma de duas abordagens básicas em relação ao tipo de amostra. A abordagem utilizada na União Europeia (UE) e em países com acordos comerciais com a UE adotam o monitoramento de FIOs na carne de moluscos, enquanto a abordagem utilizada nos Estados Unidos da América (EUA) e países com acordos comerciais com os EUA classificam áreas de produção baseados no monitoramento de FIOs em águas superficiais. Alguns países que exportam mariscos para UE e/ou EUA desenvolveram modificações ou utilizam um híbrido dos sistemas da UE e dos EUA (Busby, 2010; Sauve, 2010). Tanto nos sistemas da UE como nos EUA, os resultados do monitoramento microbiológico são utilizados para classificar as áreas de produção de moluscos em relação às normas prescritas pelos respectivos regulamentos oficiais.
1.5 LEGISLAÇÃO BRASILEIRA SOBRE LIMITES
MICROBIOLÓGICOS PARA O CULTIVO DE MOLUSCOS BIVALVES
Os níveis máximos de microrganismos FIOs em áreas de cultivo de moluscos bivalves no Brasil são regulados por duas legislações. A Resolução nº 357 do Conselho Nacional do Meio Ambiente, publicada em 17 de março de 2005, estabelece o limite máximo aceitável de coliformes termotolerantes em águas utilizadas para o cultivo de moluscos bivalves destinados à alimentação humana. O Programa Nacional de Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves
(PNCMB) foi instituído por meio da Instrução Normativa Interministerial nº07, publicada em oito de maio de 2012 e complementado pela portaria 204 do Ministério da Pesca e Aquicultura, de 28 de junho do mesmo ano. Visando minimizar os riscos microbiológicos, essa legislação estabelece o controle da colheita e dos tratamentos pós-colheita aos quais os moluscos devem ser submetidos (ex: depuração e tratamento térmico) com base na concentração de Escherichia coli na parte comestível dos moluscos, analisada com frequência mínima quinzenal. Tanto os limites microbiológicos estabelecidos pela legislação brasileira para água quanto para a parte comestível dos moluscos diferem de maneira geral das legislações dos EUA e da UE.
Apesar das diferenças entre a legislações nacionais e as dos EUA e da UE, inexistem estudos comparando os níveis de segurança proporcionados pelos critérios brasileiros em um contexto internacional. Os estudos e monitoramentos oficiais disponíveis classificam as áreas de cultivo em Santa Catarina com base exclusivamente nos parâmetros brasileiros. Um estudo realizado entre 2006 e 2007 na região insular baía sul da Ilha de Santa Catarina indicou que a qualidade da água atendia aos parâmetros previstos na Resolução CONAMA 357 (Ramos et al., 2010). Já em investigação conduzida pela Epagri entre 2007 e 2008 (dados não publicados), de 37 pontos monitorados, oito estariam com resultados acima dos limites previstos pela mesma legislação. Na região das baías da Ilha de Santa Catarina 18 pontos foram monitorados e cinco deles apresentaram resultados acima dos limites legais. Em estudo similar realizado entre 2009 e 2010 pela mesma empresa (dados não publicados), os resultados indicaram que de 39 locais monitorados, nove apresentavam valores acima dos permitidos na legislação. Vinte desses pontos de monitoramento eram situados nas mesmas baías, três deles apresentando resultados acima dos limites. Em Santa Catarina, o Ministério da Pesca e Aquicultura estabeleceu convênio com a Companhia Integrada de Desenvolvimento Agrícola de Santa Catarina – Cidasc para a execução do PNCMB. A Cidasc realiza desde 2012 o monitoramento oficial disponibilizando os resultados da classificação das áreas em relação ao risco microbiológico em seu website (www.cidasc.sc.gov.br), atualizando o status das áreas quinzenalmente.
1.6 O USO DE MODELOS MATEMÁTICOS PARA PREVER RISCOS MICROBIOLÓGICOS
Para reduzir os riscos microbiológicos relacionados ao consumo de moluscos bivalves ou ao banho em áreas costeiras, instituições de saúde pública e responsáveis pelo controle de recursos hídricos estão cada vez mais utilizando modelos matemáticos para prever a qualidade da água e comunicar ao público quando agentes patogênicos em concentrações perigosas estarão presentes e os níveis de segurança para banho ou consumo de moluscos podem ser comprometidos (EPA, 2016). Modelos matemáticos auxiliam as autoridades a superar dificuldades associadas à demora nas notificações após análises de FIOs em água/moluscos utilizando métodos convencionais baseados em cultura de microrganismos.
Fundamentalmente, dois tipos de modelos são utilizados: modelos baseados em regressão (ou “black box”) e modelos mecanicistas (de Brauwere et al., 2014). Os modelos baseados em regressão ligam um conjunto de variáveis de entrada (explicativas) a uma variável de saída (por exemplo, concentrações de FIOs) com base em análise de regressão. As variáveis explicativas comumente utilizadas para prever as concentrações de FIOs incluem características de uso ou cobertura do solo, população humana ou animal e dados meteorológicos e hidrológicos (Campos et al., 2017; de Brauwere et al., 2014). Os modelos mecanicistas usualmente associam um modelo de dispersão e decaimento de FIOs a modelos hidrodinâmicos e de qualidade de água pré-existentes. Esses modelos são úteis para a compreensão detalhada dos processos que determinam a dispersão dos poluentes de origem fecal em áreas costeiras (de Brauwere et al., 2014).
Modelos para prever níveis de FIOs em corpos de água em resposta a mudanças nas populações humana ou animal, ou no uso do solo na bacia hidrográfica adjacente estão bem documentados para sistemas de drenagem de água doce. Porém, esse tipo de estudo não é tão abundante em ambientes estuarinos (Van Dolah et al., 2008). Os estudos realizados em áreas estuarinas são geralmente limitados às porções intermaré de rios, sendo que mais estudos são necessários para esclarecer se as associações detectadas nessas zonas podem ser extrapoladas para as porções dos rios com maior influência marinha ou em áreas estuarinas abertas (Robert F. Van Dolah et al., 2008). A qualidade da água em ambientes estuarinos é comumente influenciada por múltiplos afluentes que drenam diferentes bacias hidrográficas e fontes de poluição. Assim sendo, os níveis de FIOs nos pontos de monitoramento de água ou moluscos dentro de um mesmo
estuário podem variar significativamente em escalas espaciais curtas (Beliaeff and Cochard, 1995; Kelsey et al., 2004).
Para serem usados como ferramentas preditivas, modelos devem ter seu poder preditivo avaliado (EPA, 2016; Francy and Darner, 2006). Avaliar a capacidade preditiva de um modelo é diferente de avaliar o ajuste dos dados ao modelo de regressão desenvolvido (“goodness of fit”), uma vez que a capacidade preditiva diz respeito a possibilidade de uso do modelo para futuras observações (Ge and Frick, 2007a). Estatísticas típicas utilizadas para testar a qualidade de ajuste de dados aos modelos, como o coeficiente de determinação (R2) e o erro padrão do modelo, são ineficazes para esse propósito (Willmott, 1982). Também é importante avaliar a precisão das previsões do modelo em relação a um conjunto de dados independente (validação cruzada). Estudos envolvendo validação cruzada de modelos de regressão para predição de concentrações de FIOs em águas costeiras são raros (Crowther et al., 2011; Ge and Frick, 2007b). Assim sendo, mais estudos descrevendo o desenvolvimento e validação de modelos que acomodem o efeito de fontes de poluição localizadas em múltiplas bacias hidrográficas são necessários para permitir a previsão com confiança dos níveis de FIOs em áreas estuarinas.
2 JUSTIFICATIVA
Moluscos bivalves são organismos filtradores que podem acumular microrganismos nocivos aos seres humanos. O monitoramento da qualidade dos moluscos e/ou da água seguindo diferentes metodologias é classicamente adotado como ferramenta de decisão para determinar a condição sanitária dos moluscos e o tipo de tratamento pós-colheita que deve ser dado aos mesmos antes que sejam destinados ao consumo humano. Modelos numéricos vêm sendo utilizados para prever a qualidade da água e para comunicar ao público quando agentes patogênicos em concentrações perigosas estarão presentes em águas costeiras e, portanto, os níveis de segurança para consumo de moluscos podem ser comprometidos. A implementação de um modelo para prever os níveis de poluição de origem fecal em áreas de cultivo de moluscos pode ser uma ferramenta importante para auxiliar autoridades responsáveis por programas de controle sanitário. Porém, poucos estudos desenvolveram e validaram modelos para regiões costeiras influenciadas por fontes de poluição localizadas em mútiplas bacias hidrográficas. Para que essa ferramenta possa ser utilizada com confiança pelos gestores de tais programas, é necessário que a sua eficiência seja analisada.
3 HIPÓTESE
Variações temporais e espaciais dos níveis de poluição de origem fecal em áreas de cultivo de moluscos bivalves podem ser previstas satisfatoriamente em ambientes costeiros influenciados por fontes de poluição localizadas em múltiplas bacias hidrográficas por meio de modelos estatísticos.
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver um modelo estatístico capaz de prever as variações espaciais e temporais dos níveis de poluição de origem fecal em áreas utilizadas para malacocultura nas baías da Ilha de Santa Catarina e que permita auxiliar no controle da qualidade sanitária dos moluscos cultivados.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Comparar as legislações brasileira e internacional para classificação de áreas de cultivo de moluscos bivalves em relação a riscos microbiológicos;
• Identificar os padrões espaciais e temporais de contaminação de origem fecal em água marinha e em mexilhões Perna perna nas baías da Ilha de Santa Catarina, assim como as variáveis geográficas e meteorológicas que influenciam esses padrões; • Estabelecer metodologia para o desenvolvimento de modelos
estatísticos para prever os níveis de poluição de origem fecal em áreas costeiras influenciadas por fontes de poluição localizadas em múltiplas bacias hidrográficas;
• Desenvolver e validar modelo para prever variações espaciais e temporais dos níveis de contaminação de origem fecal nas baías da Ilha de Santa Catarina;
• Realizar simulações utilizando o modelo desenvolvido com o intuito de prever os níveis de contaminação fecal nas baías da Ilha de Santa Catarina em diferentes condições meteorológicas
e considerando flutuações na população humana de bacias hidrográficas que deságuam nessas baías.
5 ESTRUTURA DA TESE
A presente tese foi estruturada em quatro capítulos. O Capítulo I apresenta a introdução geral da tese, contextualizando o problema e os objetivos da pesquisa. O Capítulo II apresenta o artigo científico intitulado "Análise crítica do arcabouço jurídico internacional que regula a classificação microbiológica de áreas de produção de moluscos bivalves". Esse artigo apresenta uma revisão dos padrões microbiológicos e das práticas de monitoramento em vigor no Brasil, União Europeia e Estados Unidos da América para a classificação de áreas de malacocultura. O Capítulo III apresenta o artigo científico intitulado "Otimizando modelos estatísticos para prever níveis de poluição fecal em áreas costeiras". O artigo descreve uma metodologia para o desenvolvimento de modelos de regressão para prever os níveis de FIOs em áreas costeiras influenciadas por fontes de poluição localizadas em múltiplas bacias hidrográficas. O Capítulo IV apresenta o artigo científico intitulado "Desenvolvimento, validação e aplicação de modelos de regressão para prever concentrações de organismos indicadores fecais em águas costeiras". Nesse capítulo, um modelo é desenvolvido para prever as variações espaciais e temporais dos níveis de FIOs nas baías Norte e Sul de Santa Catarina utilizando como base a metodologia proposta no segundo capítulo. Esse modelo é validado e aplicado para prever os níveis de coliformes nas baías em diferentes cenários.
6 CAPÍTULO II: ANÁLISE CRÍTICA DO ARCABOUÇO
JURÍDICO INTERNACIONAL QUE REGULA A
CLASSIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ÁREAS DE
PRODUÇÃO DE MOLUSCOS BIVALVES1
Robson Ventura de Souzaa, Carlos José Alexandre de Camposb, Luis Hamilton Pospissil Garbossaa, Luiz Fernando de Novaes Viannaa, Argeu Vanza, Guilherme Sabino Ruppa, Walter Quadros Seiffertc
Afiliações:
a Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina (Epagri), Brasil
b Centre for Environment, Fisheries & Aquaculture Science (Cefas), Reino Unido
c Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Brasil
6.1 RESUMO
Este estudo apresenta uma revisão dos padrões microbiológicos e das práticas de monitoramento para a classificação de áreas comerciais de produção de moluscos em vigor no Brasil, na União Europeia e nos Estados Unidos da América. Os parâmetros de classificação não são imediatamente comparáveis principalmente porque alguns regulamentos são baseados no monitoramento de água e outros da carne de moluscos. Para criar uma linha de base comum para comparar esses regulamentos, modelos de regressão foram desenvolvidos com base em dados de monitoramento e utilizados para correlacionar os níveis de bactérias indicadoras fecais na água e nos moluscos. Verificou-se que o sistema de classificação utilizado na União Europeia proporciona o mais alto nível de segurança microbiológica (menores níveis de bactérias indicadoras de contaminação fecal na carne dos mexilhões) para categorias de classificação que não exigem tratamentos pós-colheita antes da comercialização, enquanto o sistema dos Estados Unidos da América proporciona o nível mais alto de segurança microbiológica para categorias de classificação que exigem estes tratamentos. A legislação brasileira prescreve depuração como tratamento pós-colheita para moluscos com níveis muito maiores de coliformes do que os sistemas dos
1 Artigo publicado no periódico Reviews in Aquaculture (ISSN: 1753-5131, Fator de impacto 4.618) no dia 13/11/2017. DOI: 10.1111/raq.12222.
Estados Unidos e da União Europeia. Constatou-se que os limites microbiológicos para a água do mar estabelecidos na Resolução Brasileira CONAMA 357 são mais rigorosos do que os regulamentos utilizados na União Europeia e nos Estados Unidos. Os resultados também sugerem que o Programa Nacional de Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves e a legislação da União Europeia são os menos rigorosos quanto aos níveis máximos tolerados de contaminação fecal. Este estudo fornece informações sobre margens de segurança para produtos à base de moluscos bivalves comercializados internacionalmente.
Palavras-chave: Mexilhão, coliformes, saúde humana, comércio internacional, legislação, segurança microbiológica
6.2 INTRODUÇÃO
Moluscos filtradores acumulam microrganismos, incluindo bactérias e vírus humanos patogênicos, quando cultivados em águas poluídas por esgoto e podem apresentar risco significativo para a saúde quando consumidos crus ou levemente cozidos (Butt et al., 2004; David Lees, 2000). Para reduzir o risco de doenças humanas, muitos países implementaram controles de saúde pública sobre a produção comercial e/ou a colheita recreativa de moluscos (Murray and Lee, 2010). Essencialmente, esses controles consistem no monitoramento de organismos indicadores fecais (FIOs) em moluscos e/ou água e na classificação das áreas de produção com base nos resultados desse monitoramento seguida, quando necessário, por tratamentos pós-colheita (depuração, relocação, tratamento térmico) antes da venda para consumo humano (WHO and FAO, 2012). A classificação das áreas de produção fornece uma indicação do risco potencial de contaminação por agentes patogênicos.
Os programas internacionais de controle sanitário de moluscos no mundo ocidental geralmente adotam uma de duas abordagens básicas em relação ao tipo de amostra. A abordagem utilizada na União Europeia (UE), e em países com acordos comerciais com a UE, adota o monitoramento de FIOs na carne dos moluscos enquanto a abordagem utilizada nos Estados Unidos da América (EUA), e países com um memorando de entendimento com os EUA, classifica áreas de produção baseada no monitoramento de FIOs em águas superficiais. Alguns países que exportam moluscos para a UE e/ou os EUA desenvolveram modificações ou utilizam um híbrido dos sistemas da UE ou dos EUA
(Busby, 2010; Sauve, 2010). Tanto nos sistemas da UE como nos EUA, os resultados do monitoramento microbiológico são utilizados para classificar as áreas de produção de moluscos (SPAs) em relação às normas prescritas pelos respectivos regulamentos oficiais. Na UE, as SPAs são classificadas como A, B ou C de acordo com os níveis de
Escherichia coli monitorados na carne dos moluscos. Os moluscos
colhidos nas áreas de classe A podem ser vendidos para consumo humano sem tratamento adicional. Os que pertencem às áreas de classe B devem ser depurados ou relocados em áreas de classe A e os de áreas de classe C devem ser relocados por um longo período de tempo (até dois meses) ou submetidos a um processo de tratamento térmico aprovado. Nos EUA, as áreas de produção são classificadas em uma de cinco classes com base em níveis de coliformes totais ou coliformes fecais em águas superficiais. Os moluscos de águas "aprovadas" podem ser vendidos diretamente no mercado sem tratamento prévio. Os moluscos de áreas "restritas" só podem ser vendidos após depuração ou relocação. As áreas "condicionalmente aprovadas" ou "condicionalmente restritas" estão sujeitas a poluição periódica e, portanto, podem ser fechadas por um período de tempo após esses eventos. Os moluscos de "áreas proibidas" não podem ser vendidos para consumo humano.
No Brasil, os mecanismos legais que limitam a presença de contaminantes microbiológicos em SPAs são exercidos sob duas regulamentações. Resolução nº 357, de 17 de março de 2005 - CONAMA (doravante denominada ‘CONAMA’) prescreve padrões baseados em concentrações de FIOs (coliformes termotolerantes) em água (Ministério do Meio Ambiente, 2005) enquanto o Programa Nacional de Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves - PNCMB implementado em 8 de maio de 2012 prescreve padrões baseados em concentrações de E.
coli na carne dos moluscos (Ministério da Pesca e Aquicultura, 2012). Os
moluscos de áreas "Liberadas", os menos contaminados, podem ser comercializados sem necessidade de tratamento posterior; os moluscos de áreas "Liberadas sob condição" devem ser purificados antes da venda para consumo humano; e os moluscos de áreas "Proibidas" não podem ser colhidos para consumo humano.
A Tabela 2 compara os critérios microbiológicos utilizados para a classificação das SPAs no Brasil, na UE e nos EUA. Os padrões para água marinha estabelecidos na legislação brasileira diferem dos padrões para água marinha que constam no regulamento dos EUA. Em relação aos padrões para moluscos, o PNCMB estabelece limites microbiológicos que equivalem a maioria dos padrões da legislação da UE. No entanto, o padrão microbiológico permitido para áreas "Liberadas sob condição" na
legislação brasileira abrange os intervalos de contaminação permitidos para as classes B e C combinadas, de acordo com a legislação da UE. Esta diferença pode ter implicações importantes em termos de segurança microbiológica dos moluscos e, portanto, à saúde humana, pois os moluscos provenientes de classes B e C diferem em qualidade microbiológica e devem ser tratados por diferentes meios antes de serem colocados no mercado para consumo humano. Em 2013, um grupo internacional de especialistas discutiu este assunto em um workshop no Brasil e recomendou uma revisão desses padrões (Souza et al., 2014). Outras diferenças entre as legislações da UE e do Brasil discutidas no workshop foram as práticas de monitoramento e a interpretação dos resultados do monitoramento para fins de classificação de SPAs. De acordo com o PNCMB, não é exigido que as autoridades competentes considerem a série temporal de resultados microbiológicos para classificar as SPAs. Em vez disso, requer a coleta de uma amostra composta de moluscos (cinco amostras espacialmente distribuídas coletadas no mesmo dia) em uma área de produção para determinar sua classificação (Ministério da Pesca e Aquicultura, 2013). A classificação das áreas de produção é atualizada no recebimento dos resultados microbiológicos obtidos na ocasião da seguinte amostragem, que deve ser realizada pelo menos quinzenalmente. Na UE, o "Guia de boas práticas sobre monitoramento microbiológico de áreas de colheita de moluscos bivalves" recomenda a coleta de um mínimo de 12 amostras de cada ponto com o intervalo entre duas ocasiões de amostragem sucessivas de, no mínimo, uma semana durante um mínimo de seis meses para classificação inicial de uma área de produção (European Comission, 2014). Após a classificação inicial, o guia recomenda que as SPAs sejam monitoradas pelo menos quinzenalmente ao longo de um ano. Para áreas de produção com mais de três anos de dados de monitoramento disponíveis, a frequência mínima de amostragem deve ser pelo menos mensal. No que diz respeito aos regulamentos baseados no monitoramento da água, tanto o CONAMA como o National Shellfish Sanitation Program (NSSP) dos EUA exigem que a classificação seja baseada em resultados de um mínimo de 15 amostras de cada estação de monitoramento. A legislação brasileira ainda exige um mínimo de cinco amostras anuais para a manutenção do status de classificação. Uma particularidade do regulamento dos EUA é o método para determinar o percentil 90 da série temporal, que se baseia em uma função do desvio padrão: 10(log10 média + 1.28.SD log10) (doravante referido como “percentil 90 do FDA”).
As diferenças entre as legislações que regulam a qualidade microbiológica de SPAs mencionadas acima evidenciam a necessidade
de estudos comparativos para demonstrar o nível de segurança microbiológica proporcionado pelas diferentes normas e sistemas de classificação. Além disso, a indústria de moluscos pode se beneficiar deste tipo de estudos de equivalência uma vez que esta informação pode subsidiar negociações de comércio internacional. O objetivo deste estudo foi comparar o nível de segurança microbiológico proporcionado pelas categorias de classificação estabelecidas nos regulamentos de controle sanitário de moluscos bivalves em vigor no Brasil, nos EUA e na UE. Esta avaliação pode auxiliar na interpretação dos dados de programas de monitoramento microbiológico em países que desejam exportar seus produtos para esses mercados ou países com múltiplas leis regendo o controle sanitário de moluscos.
6.3 MÉTODOS
Uma base de dados de concentrações de FIOs monitoradas em 28 pontos de amostragem localizados nas baías Norte e Sul da Ilha de Santa Catarina (Sul do Brasil) (321 resultados "pareados" válidos) foi utilizada para estudar a conformidade das SPAs com os critérios microbiológicos estabelecidos nos regulamentos do Brasil, dos EUA e da UE e para estudar as relações entre os níveis de FIO na água e na carne dos moluscos. Uma descrição detalhada dos pontos de monitoramento e dos métodos de amostragem e análise microbiológica é apresentada em Garbossa et al. (2014a). Em resumo, mexilhões Perna perna e amostras de água foram coletados mensalmente de agosto de 2012 a outubro de 2013. Em cinco dos pontos monitorados, também foram coletadas amostras de ostras do Pacífico, Crassostrea gigas.
Uma base de dados diferente foi utilizada para estudar mudanças temporais na classificação de SPAs. Esta base contém resultados microbiológicos de amostras compostas de moluscos (cinco amostras coletadas no mesmo dia) coletadas de oito locais situados nas baías Norte e Sul durante o período de 2012-2016. Esses dados foram obtidos através do monitoramento microbiológico oficial realizado pela CIDASC (www.cidasc.sc.gov.br). As amostras de moluscos foram testadas para E.
coli utilizando o mesmo método e pelo mesmo laboratório mencionado
em Garbossa et al. (2014a). Esses dados foram utilizados para classificar SPAs com base em amostras compostas (cinco amostras) coletadas no mesmo dia em cada ponto de monitoramento, conforme recomendado pelo PNCMB (doravante denominada “classificação de curto prazo"); e com base em uma série temporal com um mínimo de 24 resultados de
concentrações de FIOs (doravante denominada "classificação de longo prazo"), conforme recomendado pela UE (Comissão Européia, 2014). Para esta última abordagem, apenas uma amostra aleatória de cada ponto de monitoramento em cada dia de amostragem foi considerada na análise, em vez dos conjuntos de cinco amostras.
Resultados de monitoramento de um ano foram considerados para classificar as SPAs de acordo com os padrões estabelecidos nas regulamentações do Brasil, dos EUA e da UE, resumidos na Tabela 2. É importante notar que, em teoria, não seria possível classificar as SPAs de acordo com os critérios PNCMB usando os resultados de um período de monitoramento de um ano. No entanto, assumiu-se que esta abordagem seria comparável às abordagens utilizadas nos EUA e na UE.
Modelos de regressão linear foram desenvolvidos para estudar as relações entre os níveis de FIO na água e na carne dos moluscos (Tabela 3). Nesses modelos, o percentil 90 de FIOs na água (considerando tanto o percentil 90 quanto o percentil 90 do FDA) para cada local monitorado foi considerado como a variável explicativa e o percentil 80, percentil 90 e concentração máxima de FIOs em mexilhões foram considerados como as variáveis resposta. O objetivo desses modelos foi ilustrar os níveis de segurança proporcionados pelos padrões microbiológicos estabelecidos nos diferentes regulamentos que baseiam seus critérios no monitoramento de amostras de água ou de moluscos. Modelos de regressão linear também foram desenvolvidos para comparar a acumulação de FIOs por mexilhões
P. perna e ostras C. gigas. Estes modelos consideraram as concentrações
de FIOs na água como a variável explicativa e as concentrações de FIOs em mexilhões e em ostras como variáveis resposta. Para desenvolver os modelos de regressão, os dados de concentrações microbiológicas foram transformados para aumentar a parametricidade.
6.4 RESULTADOS
A Tabela 3 resume a classificação das SPAs de acordo com os critérios estabelecidos nos diferentes regulamentos. As percentagens de SPAs que não exigiriam tratamento pós-colheita dos moluscos antes da venda para consumo humano de acordo com os critérios estabelecidos nas regulamentações da UE, do Brasil e dos EUA seriam 36%, 54% e 64%, respectivamente. Seria necessária depuração de mexilhões colhidos de 50%, 46% e 29% das áreas de produção considerando os critérios estabelecidos nas mesmas regulamentações. De acordo com os critérios da legislação da UE, 14% das SPAs seriam classe C e, portanto, seria
exigido que os moluscos dessas áreas fossem relocados por um período prolongado ou cozidos por um método aprovado antes da comercialização. De acordo com os critérios estabelecidos no PNCMB e na legislação da UE, a colheita de moluscos para consumo humano seria permitida em todos os 28 pontos monitorados. No entanto, 18% e 7% desses pontos seriam proibidos para a colheita de moluscos de acordo com o CONAMA e com o NSSP dos EUA, respectivamente.
Os diferentes regulamentos foram então comparados em termos de nível de segurança microbiológica. Neste estudo de modelagem, assumiu-se que quanto menor os níveis de FIOs nos moluscos, maior o nível de segurança fornecido por cada classificação. Os resultados mostram que, para P. perna, a classe A da UE fornece o mais alto nível de segurança entre as classificações que não requerem tratamento pós-colheita. Esta foi seguida pela 'Liberada' do PNCMB, enquanto a classe 'Aprovada' dos EUA forneceria o menor nível de segurança (Figura 1). Em relação às categorias que exigem tratamento pós-colheita, a classe "Restrita" dos EUA proporcionam o mais alto nível de segurança, seguida pela classe B da UE. A classificação "Liberada sob condição" do PNCMB oferece o menor nível de segurança e pode ser considerada equivalente a classe C da UE.
Figura 1 - Níveis de segurança microbiológica (mais alto para mais baixo = da esquerda para a direita) oferecidos pelas diferentes legislações que regulam a qualidade microbiológica de áreas de produção de moluscos no Brasil, nos EUA e na UE.
A comparação dos níveis máximos de contaminação fecal tolerados pelos diferentes regulamentos (combinando todas as categorias de classificação de cada regulamento) indica que o CONAMA é o mais
rigoroso. Esta legislação permite a colheita de moluscos de áreas de produção que seriam classificadas como A pelo sistema da UE, 'Liberadas' pelo PNCMB e 'Aprovadas' pelo NSSP dos EUA. No entanto, abrange apenas uma pequena parte dos intervalos de concentrações de FIOs abrangidos pela classe B da UE, 'Restrita' dos EUA e 'Liberada sob condição" do PNCMB. O NSSP dos EUA é considerado o segundo regulamento mais rigoroso, com limites máximos de FIOs que abrangem os níveis de contaminação cobertos pelas classificações “A” da UE e 'Liberada' do PNCMB. O NSSP dos EUA também abrange uma grande parte do intervalo de concentrações de FIOs permitido pela classe B da UE e uma pequena parte do intervalo permitido pela classe "Liberada sob condições" do PNCMB. O PNCMB e a legislação da UE são considerados os regulamentos menos rigorosos em termos dos níveis máximos de FIO permitidos. Os modelos desenvolvidos neste estudo (Tabela 4) não permitem uma previsão robusta dos níveis máximos de de FIOs em água marinha que esses dois regulamentos permitiriam, uma vez que os modelos de regressão foram desenvolvidos considerando níveis máximos de FIO em água e mexilhões de 1.800 MPN.100 mL-1 e 24.000 MPN.100 g-1, respectivamente. No entanto, para fins de referência, os modelos prevêem um percentil 90 de FIOs em água de 88.143 MPN.100 mL-1 para SPAs que cumprem os requisitos para a classificação "Liberada sob condição" do PNCMB ou a classe C da UE.
A análise dos diferentes regulamentos neste artigo foi realizada utilizando resultados microbiológicos obtidos para o mexilhão P. perna. Para fornecer uma linha de comparação com outras espécies cultivadas internacionalmente, a acumulação de FIOs por esses mexilhões foi comparada com a de ostras C. gigas através de regressão linear. Os modelos foram desenvolvidos considerando os FIOs na água como a variável explicativa e os FIOs em mexilhões e ostras como variáveis resposta. Os modelos apresentaram correlações significativas, com coeficientes de determinação para essas espécies de 28,2% e 19,7%, respectivamente. Os coeficientes de inclinação destes modelos sugerem que os mexilhões tendem a acumular níveis mais elevados de contaminação bacteriana do que as ostras, particularmente para maiores níveis de contaminação nas águas (Figura 2).
