A injeção de adrenalina no núcleo mediano da rafe provoca hipofagia em ratos submetidos à restrição alimentar

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS

I INNJJEEÇÇÃÃOODDEEAADDRREENNAALLIINNAANNOONNÚÚCCLLEEOOMMEEDDIIAANNOODDAARRAAFFEE P PRROOVVOOCCAAHHIIPPOOFFAAGGIIAAEEMMRRAATTOOSSSSUUBBMMEETTIIDDOOSS À ÀRREESSTTRRIIÇÇÃÃOOAALLIIMMEENNTTAARR

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Santa Catarina para obtenção do grau de Mestre em Neurociências e Comportamento.

Mestranda: SIMONE MAIDEL

Orientadora: Profa. Dra. Marta Aparecida Paschoalini

SUMÁRIO

Resumo ... i

Abstract ... iv

Lista de Abreviaturas ... vii

1. Introdução ... 01 2. Objetivo ... 19 3. Materiais e Métodos ... 21 3.1. Animais ... 22 3.2. Cirurgia ... 23 3.3. Cânula-guia ... 24 3.4. Drogas Administradas ... 24 3.5. Injeções Intracerebrais ... 24 3.6. Caixa Experimental ... 25 3.7. Esquema Experimental ... 26 3.8. Categorização Comportamental ... 27 3.9. . Histologia ... 30 3.10. Análise de Dados ... 30 4. Resultados ... 31

4.1. Locais atingidos pela injeção de adrenalina (AD), noradrenalina (NA) e veículo (VEH) em ratos submetidos à restrição alimentar ... 32

4.2. Administração de AD no Mediano da Rafe e seus efeitos sobre a ingestão de alimento, de água e de comportamentos não ingestivos em ratos submetidos à restrição alimentar ... 34

4.2.2. Ingestão de Água ... 37

4.2.3. Comportamentos Não Ingestivos ... 39

4.3. Administração de NA no Mediano da Rafe e seus efeitos sobre a ingestão de alimento, de água e de comportamentos não ingestivos em ratos submetidos à restrição alimentar ... 43

4.3.1. Ingestão do Alimento ... 43

4.3.2. Ingestão de Água ... 46

4.3.3. Comportamentos Não Ingestivos... 48

4.4. Administração de AD e NA na Região Lemniscal e seus efeitos sobre a ingestão de alimento, de água e de comportamentos não ingestivos em ratos submetidos à restrição alimentar ... 52

4.4.1. Ingestão do Alimento ... 52

4.4.2. Ingestão de Água ... 55

4.4.3. Comportamentos Não Ingestivos... 57

4.5. Administração de AD e NA nos Núcleos Pontinos e seus efeitos sobre a ingestão de alimento, de água e de comportamentos não ingestivos em ratos submetidos à restrição alimentar ... 60

4.5.1. Ingestão do Alimento ... 60

4.5.2. Ingestão de Água ... 63

4.5.3. Comportamentos Não Ingestivos... 65

5. Discussão ... 67

No presente trabalho, nós examinamos os efeitos de microinjeções de adrenalina (AD), noradrenalina (NA) ou veículo (VEH) dentro do MR, e áreas adjacentes, sobre o comportamento ingestivo em ratos submetidos a um regime de restrição alimentar.

Ratos Wistar machos (n=36, 250-350g), mantidos em caixas individuais, foram implantados com uma cânula-guia sobre o MR permitindo a injeção local de VEH (NaCl 0,9%, 200nl), AD e NA (200 nl, 6, 20 e 60 nmol) através de uma cânula injetora conectada por um tubo de polietileno a uma microseringa (5µl). Após um período de recuperação de 4 dias, foram submetidos à restrição alimentar (15g/dia por rato) durante 7 dias antes do início dos experimentos. Após esse período, em dias alternados (intercalados com um dia livre), os animais receberam injeções do tratamento utilizado, foram colocados na caixa experimental e a latência para o primeiro episódio de alimentação, assim como a freqüência e a duração de cada episódio alimentar foram registradas durante 30 min. A quantidade de alimento consumido foi avaliada pela diferença entre o peso do alimento no início e no final do período de registro.

A análise dos nossos dados mostra que injeções de AD (20 nmol) no MR diminuíram a ingestão de alimento induzida pela restrição alimentar quando comparadas à injeção de VEH (VEH: 5,81 ± 0,29 g vs. AD: 3,46 ± 0,54 g), resposta que foi acompanhada por uma redução na duração total de ingestão do alimento, sem afetar a latência e a freqüência da alimentação. Injeções equimolares de AD na região lemniscal (RL) reduziram a ingestão do alimento e a duração total desse comportamento, não afetando a latência e a freqüência do consumo de alimento. Injeções de NA no MR ou RL, assim como injeções de AD ou NA nos núcleos pontinos, não alteraram os comportamentos registrados.

Os resultados obtidos em nosso estudo sugerem que a ativação de receptores adrenérgicos no MR pode reduzir a ingestão alimentar pela antecipação da conclusão dos episódios de alimentação (processo de saciação); que esta ativação pode ser exercida de modo mais significativo pelos aferentes contendo adrenalina que pelos contendo noradrenalina, ou ainda, que esta ativação pode envolver a participação de um outro receptor, possivelmente β 2 . Além disso, nossos dados sugerem que a RL pode ocupar um importante papel nos caminhos neurais envolvidos com a regulação do comportamento alimentar .

Palavras-chave: ingestão do alimento, serotonina (5-HT), adrenalina, noradrenalina, núcleo mediano da rafe, região lemniscal.

In the present work, we have examined the effects of adrenaline (AD), noradrenaline (NE) or vehicle (VEH) injections into the MR on ingestive behavior of rats in a food restriction regimen.

Male Wistar rats (n=36, 250-350g) were housed in individual cages with free access to water and food until the beginning of food restriction regimen. The animals were chronically implanted with a guide cannula 1 mm above MR to allow for local injections of vehicle (NaCl 0,9%, 200nl,), AD e NA (200 nl, 6, 20 e 60 nmol) through an inner cannula connected by polyethylene tubing to a microsyringe (5µl). Four days after surgery, all animals were submitted to a 7-days long food restriction protocol (15g/day/rat). After this, day in day out (beetwen day off) , the animals received the drugs injections and, immediately after , were placed into the testing cage, and the latency for the first feeding bout, as well as the frequency and duration of each feeding episode were recorded during the next 30 min. The differences between food weight at the beginning and at the end of the recording period were taken as the amount of food consumed.

The results showed that MR injections of AD (20 nmol) decreased food intake when compared to VEH (VEH: 5,81 ± 0,29 g vs. AD: 3,46 ± 0,54 g). This hypofagic response was accompainied by a decreased duration of feeding but didn’t have effects upon the latency for feeding initiation or frequency of feeding. Injections of AD (20 nmol) into RL decreased the food intake and the duration of feeding when compared to VEH, but didn´t affect latency or frequency of feeding consume. The treatment with NA in MR or RL, as well as AD or NA injections into NP, didn’t affect the analysed behaviors.

The results of the present study suggest that activation of adrenergic receptors into MR can decrease food intake through of conclusion of a feeding bout (satiation process) and may involve the action of other adrenoreceptor, possible the β 2. Such activation might be exerted more importantly by epinephrine-containing afferents than by norepinephrinergic inputs to MR neurons. Besides, our date suggest that RL can play an important role of serotonergic circuits involved in the ingestive behavior of rats.

Keywords: food intake, serotonin (5-HT), adrenaline, noradrenaline, median raphe nucleus, lemniscal region.

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT Serotonina

AD Adrenalina

AgRP Proteína relacionada ao Agouti AHL Área Hipotalâmica Lateral ARC Núcleo Arqueado

CART Transcrito regulado pela cocaína-anfetamina CCK Colecisticinina

CRH Hormônio liberador de corticotropina DR Núcleo Dorsal da Rafe

HDM Hipotálamo Dorsomedial

HPA Eixo hipotálamo-pituitária-adrenal HVM Hipotálamo Ventromedial

LC Locus Coeruleus MR Núcleo Mediano da Rafe

NA Noradrenalina

NP Núcleos Pontinos NPV Núcleo Paraventricular NPY Neuropeptídeo Y NTS Núcleo do Trato Solitário POMC Pró-opiomelanocortina RL Região Lemniscal

SSC Seqüência de saciedade comportamental TRH Hormônio liberador de tireotropina

Vários dos mecanismos neurais envolvidos com a regulação do comportamento alimentar têm sido investigados nas últimas décadas, aumentando significantemente o conhecimento sobre redes neurais e mediadores químicos que regulam a ingestão de alimento e o peso corporal (Williams e cols.,2001). Diversas moléculas sinalizadoras participam desse processo, tais como os neurotransmissores clássicos, neuropeptídeos e hormônios (Hoebel, 1997; Kalra e cols., 1999). Entre os neurotransmissores clássicos, destacam-se as catecolaminas (Van Der Gugtena e cols., 1977; Rowland e cols.,1996), a serotonina (Blundell, 1984; Montgomery e cols., 1986; Fletcher e Paterson, 1989) e o glutamato (Stanley e cols., 1993a; Stanley e cols., 1993b; Burns e Ritter, 1997); entre os neuropeptídeos, destacam-se o neuropeptídeo Y (Hillebrand e cols.,2002; Sainsbury e cols., 2002), a galanina (Kyrkouli e cols.,1990) e a colecistocinina (Willis e cols.,1984; Blevins e cols., 2000); entre os hormônios, destacam-se a participação da insulina e da leptina (Baskin e cols., 1999; Woods e Seeley, 2000; Reidy e Weber, 2000).

Sinais gerados em resposta ao comportamento alimentar são integrados no córtex cerebral via mecanismos envolvendo principalmente o hipotálamo e o tronco encefálico caudal (Blevins e cols, 2002; Funahashi e cols, 2002). O hipotálamo, que além de uma circuitaria que interliga diversos sítios neurais, possui uma rede de elaboração e emissão de sinais anorexigênicos e orexigênicos, que ajustam os sinais relacionados ao apetite e saciedade (Bray e cols, 1989; Blundell, 1991; Strube, 1994; Rowland e cols, 1996; Kalra e cols., 1999). Essa estrutura consiste em mais de 40 núcleos e áreas histologicamente distintas e muitos destes núcleos ainda podem ser divididos em subnúcleos que, além do comportamento ingestivo, estão envolvidos em muitos outros comportamentos como por exemplo a ingestão hídrica, adaptação ao

estresse, comportamento sexual, defensivo e agressivo, conforme as conexões intra e extra-hipotalâmicas estabelecidas (Berthoud, 2002).

Estão envolvidos na regulação do comportamento alimentar vários sítios hipotalâmicos, tais como o núcleo arqueado (ARC), a área hipotalâmica lateral (AHL), o núcleo paraventricular (NPV), o hipotálamo ventromedial (HVM) e o hipotálamo dorsomedial (HDM) (Luiten e cols., 1987; Steffens, 1988; Horvath e cols.,1999; Berthoud, 2002). Note-se, entretanto, que outras estruturas como a amígdala, o núcleo parabraquial, o núcleo do trato solitário (NTS), os núcleos da rafe e o locus coeruleus (LC) também participam da regulação do comportamento alimentar (Grossman e Grossman, 1963; Bendotti e Samanin, 1986; Nagai e cols, 1987; Fletcher e Davies, 1990; Wirtshafter, 2001; Adell e cols, 2002).

Dos núcleos hipotalâmicos envolvidos na regulação do comportamento ingestivo, tanto o ARC como NPV parecem ter um papel fundamental no controle do comportamento alimentar e metabolismo energético (Shor-Posner e cols.,1986; Leibowitz, 1988; Leibowitz e cols., 1988; Schwartz, 2000) por apresentarem - dentro de cada núcleo específico - populações neuronais distintas anatomicamente e funcionalmente, que formam uma rede de trabalho extremamente complexa, caracterizada pela coexistência de diferentes neurotransmissores e também por exibirem notável plasticidade neuroquímica dependendo do estado fisiológico do organismo (Swanson e Sawchenko, 1980; Chronwall, 1985; Kiss, 1988; Atrens e Menezes, 1993; Berthoud, 2002).

O ARC recebe forte aferência intra-hipotalâmica de núcleos como o NPV, o HDM e HVM e entradas mais fracas da AHL (Guan e cols, 2001), além de receber aferência extra-hipotalâmica de estruturas como a amígdala, núcleo intersticial da estria terminal e vários locais do tronco encefálico, incluindo o NTS (Li e cols.,

1999; De Falco e cols., 2001) e o núcleo mediano da rafe (MR) (Neary e cols., 2004). As influências hormonais para o ARC também são importantes com relação à ingestão do alimento, pois a leptina (Glaum e cols., 1996; Reidy e Weber, 2000), assim como glicocorticóides (Hisano e cols., 1998), esteróides sexuais (Tong e cols., 1990), insulina e metabólitos como a glicose (Lynch e cols., 2000) têm acesso direto aos neurônios do ARC via receptores específicos.

Tanto a leptina quanto a insulina circulam em níveis proporcionais ao volume de gordura corporal (Considine, 1996; Schwartz e cols., 2000) e atuam no SNC proporcionalmente a seus níveis plasmáticos (Baura, 1993; Schwartz e cols., 2000), onde agem sobre a homeostase energética e também reduzem a ingestão alimentar (Campfield, 1995; Woods e Stricker, 1999; Schwartz e cols., 2000). Microinjeções de leptina dentro do hipotálamo ou especificamente no ARC promovem uma resposta anoréxica (Saloh, 1997) que não é observada após a destruição deste núcleo (Dawson e cols., 1997; Tang-Christensen e cols., 1999). Dentro do ARC, uma população neuronal sensível a leptina e insulina contém RNAm para o neuropeptídeo Y (NPY) e freqüentemente co-expressam AgRP (proteína relacionada ao Agouti) (Broberger e cols., 1998), enquanto outra população neuronal distinta, também sensível à leptina e insulina, co-expressam pró-opiomelanocortina (POMC) e o transcrito regulado pela cocaina-anfetamina (CART) (Kristensen e cols., 1998; Vrang e cols., 1999; Booth e Thibaut, 2000).

Injeções de NPY dentro dos ventrículos centrais ou diretamente no hipotálamo de ratos estimulam a ingestão alimentar (Stanley e cols., 1986; Schwartz e cols., 2000), diminuem o consumo energético e, simultaneamente, estimulam enzimas lipogênicas no fígado e tecido adiposo branco (Billington e cols., 1991; Schwartz e cols., 2000). Melanocortinas são peptídeos clivados da molécula precursora POMC e

agonistas sintéticos de seus receptores (MC3 e MC4) suprimem a ingestão alimentar, enquanto que antagonistas têm o efeito oposto (Fan e cols., 1997). O relato que camundongos geneticamente deficientes de receptores MC4 são hiperfágicos e obesos (Huszar, 1997) indica que a estimulação tônica destes receptores pode limitar a ingestão alimentar e a massa de gordura corporal. O peptídeo AgRP é um antagonista de receptores MC3 e MC4 (Ollmann, 1997) e causa hiperfagia quando administradada i.c.v (Rossi e cols., 1998) ou é transgenicamente expressa (Ollmann, 1997).

Note-se que a maioria dos neurônios sintetizadores de NPY/AgRP, assim como os POMC/ CART do ARC são sensíveis à insulina e expressam receptores para leptina (Baskin e cols., 1999; Cheung e cols., 1997) e ambos os tipos neuronais são regulados de um modo oposto. Ou seja, neurônios NPY/AgRP são inibidos pela leptina e, conseqüentemente, são ativados em condições onde os níveis de leptina estão baixos (Hahn e cols., 1988; Stephens e cols., 1995; Schwartz e cols., 1996; Broberger e cols., 1998) enquanto que neurônios POMC/ CART são ativados pela leptina e inibidos quando seus níveis plasmáticos estão reduzidos (Schwartz e cols., 1996; Thornton e cols., 1997; Kristensen e cols., 1998). Além disso, sabe-se que informações sobre o estado dos substratos energéticos disponíveis a longo-prazo (via leptina do tecido adiposo), disponíveis a médio-prazo (via hormônios como insulina e grelina bem como aferentes vagais do trato gastrointestinal e fígado) e disponíveis imediatamente (via neurônios locais sensíveis à glicose) são recebidas pelo ARC e intergradas com informações interoceptivas adicionais sobre o balanço energético e outras necessidades homeostáticas advindas de suas conexões intra-hipotalâmicas; bem como com informações de aferências neurais de áreas corticais, da amígdala e do núcleo intersticial da estria terminal, que trazem informações pertinentes a atributos polimodais (olfatórios, gustativos e visuais) do alimento para o ARC (para revisão, Berthoud,

2002). Estes dados sugerem que o ARC, em comparação a outros locais hipotalâmicos, seja o maior local para a transdução de informações do nível circulante de leptina e insulina (da mesma forma que do balanço energético) em uma resposta neuronal (Schwartz e cols., 2000).

Outras áreas hipotalâmicas como o NPV, área perifornical e AHL recebem forte aferência de neurônios NPY/AgRP e POMC/CART do ARC (Elmquist e cols., 1999; Schwartz e cols., 2000; Berthoud, 2002) e, também, parecem estar envolvidos na rede neuronal responsável pela homeostase energética. A estimulação química do NPV inibe a ingestão do alimento e a estimulação da AHL promove uma resposta contrária, da mesma forma, lesões bilaterais no NPV causam hiperfagia e na AHL causam anorexia e perda de peso (Bray e cols., 1990; Stanley e cols., 1993; Schwartz e cols., 2000). Receptores para leptina também são encontrados nos neurônios do NPV e AHL, indicando que sinais de adiposidade circulantes podem agir diretamente sobre estes núcleos (Schwartz e cols., 2000). Além disso, muitos neurônios do NPV enviam aferentes à AHL e vice-versa, sendo que estes dois núcleos além de receberem forte aferência do ARC também a ele se projetam, estabelecendo uma refinada via neuronal de comunicação entre estes núcleos, importante para o metabolismo energético e ingestão alimentar (Schwartz e cols., 2000; Berthoud, 2002).

Relativo ao NPV, vários neuropeptídeos sintetizados localmente são capazes de reduzir a ingestão alimentar e o peso corporal quando administrados centralmente. Dentre eles destacam-se o hormônio liberador de corticotropina (CRH), que é o maior regulador do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) e pode causar anorexia e ativar o sistema nervoso simpático (Bray e cols., 1990; Dallman, 1993; Schwartz e cols., 2000), o hormônio liberador de tireotropina (TRH), que além de estimular a tireóide também reduz a ingestão de alimento (Kow e Pfatt, 1991) e a

ocitocina, que também é capaz de reduzir a ingestão do alimento (Verbalis e cols, 1995).

De particular interesse nesse trabalho, destaca-se que o NPV é um dos principais locais onde a serotonina (5-HT) atua modulando a ingestão de alimento em mamíferos (Steffens e cols., 1988; Curzon, 1990; Leibowitz, 1990; Simansky e cols., 1993; Blundell e Halford, 1996; Rowland e cols., 1996; Halford e cols., 1998; Leibowitz e Alexander, 1998; Wurtman e Wurtman, 1998; De Vry e Schreiber, 2000; Collin e cols., 2002; Currie e cols., 2002). Observa-se que a administração direta e indireta de agonistas de receptores 5-HT no NPV reduz a ingestão de alimentos (Hutson e cols., 1986; Weiss e cols., 1990; Shor-Postner e cols., 1996) e que o bloqueio da síntese neuronal de 5-HT com p-clorofenilalanina (pCPA) (MacKenzie e cols., 1979; Dryden e cols., 1996), ou lesões neurotóxicas de neurônios serotonérgicos (Saller e Stricker, 1976) promovem o efeito oposto, ou seja, aumentam o consumo alimentar.

A biossíntese da 5-HT se dá a partir do aminoácido precursor triptofano, encontrado na dieta alimentar, que é convertido inicialmente em 5-hidroxitriptofano para, depois, ser descarboxilado a 5-HT. Dessa forma, manipulações fisiológicas ou farmacológicas que tendem a reduzir a concentração plasmática de triptofano também diminuem a concentração central de triptofano (Haider e Haleem, 2000) e, conseqüentemente, podem interferir com a síntese serotonérgica. Dados na literatura sugerem que uma restrição alimentar suave (mantenedora de 80% do peso corporal) por um período inferior a 4 semanas é suficiente para baixar os níveis de leptina e insulina e estimular o consumo de alimento sem alterar significativamente a concentração de outros sistemas de neurotransmissores (NPY, NA, 5-HT), diferentemente do que ocorre na situação de restrição alimentar severa ou jejum – onde há um significativo aumento tempo-dependente na concentração de NPY no NPV, uma redução nos níveis de CRH,

TRH e um aumento na atividade parassimpática, além de uma diminuição na concentração dos níveis plasmáticos de triptofano e uma redução na concentração de 5-HT hipotalâmica (Chaouloff e cols., 1997; Haider e Hallem, 2000).

Sete famílias diferentes de receptores da serotonina, 5-HT1-7 , com vários subtipos de receptores em algumas dessas famílias (principalmente em receptores 5-HT1 e 5-HT2) são os responsáveis pelos efeitos fisiológicos desse neurotransmissor (Baez e cols., 1995). Esses receptores são responsáveis pela redução da ingestão de alimento associada à injeção central de agonistas serotoninérgicos como quipazina, meta-clorofenilpiperazina (mCPP) e d-norfenfluramina no PVN (Smith e cols., 1999). A ativação do receptor 5-HT1A e a administração aguda do agonista flesinoxana na dose de 10mg/kg em ratos aumenta a ingestão de alimento, assim como aumenta o nível de neuropeptídeo Y (NPY) no PVN e no núcleo arqueado (ARC). No entanto, a administração crônica desse agonista leva a sub-regulação dos receptores perdendo o poder de estimular a ingestão (Dryden e cols.,1996 a).

A estimulação do receptor 5-HT1B leva a diminuição da ingestão. A deleção gênica desse receptor bloqueia a redução da ingestão de alimento, sugerindo um importante papel desse receptor na homeostase energética. O mCPP, um agonista 5-HT1B/2C, reduz o nível de NPY e a ingestão de alimento agudamente e após 7 dias de administração na dose de 10mg/kg em ratos (Corwin e cols., 1991). Os receptores 5-HT2C e 5-HT3 parecem ter um envolvimento menor sobre a regulação da ingestão alimentar, quando comparados aos discutidos anteriormente. Mesmo assim, ratos transgênicos sem receptor 5-HT2C apresentam epilepsia e aumento de peso (Hammer e cols., 1990) e o receptor 5-HT3 parece estar envolvido em resposta anorética a dietas deficientes em determinados aminoácidos (Tecott, 1995).

Medicamentos que bloqueiam a recaptação de serotonina, como a fluoxetina e a sertralina, diminuem significativamente a ingestão alimentar. O efeito da fluoxetina sobre o apetite não é inibido pela metergolina (antagonista serotoninérgico), sugerindo que a droga pode ter uma ação por outro mecanismo além da serotonina (Stark e cols., 1985). Medicamentos como a dexfenfluramina, que liberam serotonina na fenda sináptica e que agem como inibidores parciais da recaptação também diminuem a ingestão de alimento e esses efeitos são atenuados pela metergolina e bloqueados por lesões no núcleo parabraquial lateral do hipotálamo (Garattini, 1995).

Tipicamente, os efeitos hipofágicos dos componentes 5-HT descritos anteriormente tem sido atribuídos a uma aceleração do processo de saciedade. De acordo com Blundell (1991), saciação é o processo no qual sinais aferentes associados à ingestão de alimento desencadeiam o término da refeição (sinais como estímulos visuais, gustativos, olfativos, aumento da motilidade do trato gastrointestinal, hormônios liberados durante a digestão ou os metabólitos originados a partir da digestão dos alimentos), e saciedade diz respeito aos sinais pós ingestivos que impedem o início de uma nova refeição, determinando o intervalo entre o final de uma refeição e o início de outra. A seqüência de alterações comportamentais medidas durante o período pós ingestivo (denominada seqüência de saciedade comportamental, SSC, caracterizada pela ingestão alimentar seguida por pequeno período de atividade, autolimpeza e repouso) é associada com a cessação natural da alimentação (término da refeição) e desenvolvimento da saciedade (inibição do comportamento alimentar). A SSC pode ser usada para discriminar entre diferentes drogas que reduzem a ingestão alimentar através de mecanismos fisiológicos pós-ingetivos que aumentam a saciedade (preservam SSC) ou através de mecanismos comportamentais não específicos como hiperatividade,

sedação, vômito ou mal-estar (interferirem ou interrompem SSC) (Blundell, 1991; Halford e cols., 1998; Hewitt e cols.,2002).

Dessa forma, drogas que aumentam a atividade serotonérgica preservam a SSC e antecipam o início do repouso, reduzindo a motivação para iniciar a refeição e adiantando a sensação de saciedade; da mesma forma que inibidores seletivos de recaptação 5-HT também preservam a SSC. A ativação de diferentes subtipos de receptores 5-HT (em ratos e camundongos) promove efeitos adicionais sobre a saciedade e processo apetitivo. Componentes que estimulam especificamente receptores 5-HT2C e/ou 5-HT1B , como mCPP (Kitchener e Dourish, 1994), CP-94,253 (Halford e Blundell, 1996) e TFMPP (Schreiber e cols., 2000), aumentam a saciedade e regulam o tamanho da refeição, possivelmente através da atenuação do apetite. Por outro lado, agonistas dos receptores 5-HT2A/2C e 5-HT1A/1B , como DOI (Simansky e Vaidya, 1990) e RU-24969 (Kitchener e Dourish, 1994), respectivamente, interrompem a SSC por induzirem hiperatividade (efeito similar ao das anfetaminas), fragmentando o comportamento alimentar . Já o MK-212, agonista de receptores 5-HT2, interrompe a SSC por induzir sedação, diminuindo a freqüência do comportamento alimentar (De Vry e Screiber, 2000).

O maior determinante do consumo alimentar durante refeições individuais é o início da saciedade (Woods e cols., 1998; Schwartz e cols., 2000). O NTS recebe sinais de saciedade iniciados por estimulação química ou mecânica do estômago e intestino delgado durante a ingestão alimentar, bem como sinais neurais relacionados ao metabolismo energético (Friedman e cols.,1999) e sinais humorais (como a CCK) que são liberados de células secretoras neuroendócrinas do revestimento do lúmen intestinal (Moran e Schwartz, 1994). Evidências que a leptina potencializa os efeitos da CCK para ativação dos neurônios do NTS (Emond e cols., 1999), que este

núcleo possui neurônios sensíveis à glicose (Ritter e cols., 2000) e uma enorme concentração de receptores MC4 (Mountjoy e cols., 1994), além de ser a única estrutura cerebral (além do ARC) com uma significativa população de neurônios POMC (Bronstein e cols., 1992), somado a evidências que este núcleo (NTS) envia informações ao córtex através de sistemas do tronco encefálico (como o Locus Coeruleus e Núcleos da Rafe) (Berthoud, 2002), bem como de que é inervado pelo o MR (Schaffar e col., 1988) e LC (Van Bockstaele e cols., 1999) enquanto também projeta seus axônios diretamente dentro de núcleos hipotalâmicos como o ARC e o NPV, fortalecem e corroboram a hipótese que neurônios do NTS formam um substrato de mecanismos integrativos responsáveis pela conexão de informações aferentes associadas à saciedade com aferências descendentes de neurônios prosencefálicos envolvidos na homeostase energética (Schwartz e cols., 2000).

A grande maioria das fibras serotonérgicas que inervam a maior parte das estruturas prosencefálicas do sistema nervoso central se originam primariamente do núcleo dorsal (DR) e do núcleo mediano da rafe (MR) (Azmitia e Segal, 1978; Jacobs e Azmitia, 1992; Fletcher e Coscina, 1993; Larsen e cols., 1996; Vertes e cols, 1999; Lowry, 2002; Adell e cols.,2002; Perrin e cols.,2003), e como tal, estão intimamente envolvidos na regulação de várias funções fisiológicas além do comportamento ingestivo, tais como temperatura corporal, humor, comportamento sexual e memória (Adell e cols, 2002), distúrbios de ansiedade (Jones e Blackburn, 2002), cognição e aprendizagem (Menezes, 1999), adaptação ao estresse (Graeff e cols, 1996), bulimia e anorexia nervosa, que se caracterizam por severo comprometimento do comportamento alimentar (Barbarich, 2002, Patrick, 2002), controle do ciclo sono-vigília e da atividade locomotora. Além disso, receptores 5-HT são alvo de algumas drogas psicotrópicas usadas para o tratamento de depressão, esquizofrenia e desordens

obsessivo-compulsivas (Adell e cols., 2002). Dessa forma, manipulações que alterem a transmissão serotonérgica nestes núcleos potencialmente podem alterar uma variedade de expressões comportamentais. Entretanto, além do DR e MR, outro núcleo serotonérgico (localizado na região supralemniscal) pode estar potencialmente envolido nas alterações comportamentais serotonérgicas e merece atenção. Conforme estudo feito por Vertes e Craine (1997), neurônios localizados na área denominada B9 (correspondente à região supralemniscal) possuem mais neurônios serotonérgicos que qualquer outro núcleo da rafe (excetuando-se o DR). No rato, as células serotonérgicas da região supralemniscal podem ser contínuas com aquelas da coluna paramediana do MR, estando localizadas principalmente dentro do lemnisco medial (LM) e dispersos longitudinalmente na borda dorsal deste núcleo e áreas próximas (Vertes e Craine, 1997; Piñeyro e Blier, 1999). Embora a função deste grupo serotonérgico (B9) ainda não seja conhecida, algumas de suas projeções para o ARC, NPV, HVM (Sawchenko e cols.,1983; Willoughby e Blessing, 1987) e o NTS (Schaffar e cols., 1988), assim como sua densa projeção para o MR (Semba, 1993; Vertes e Craine, 1994) sugerem algum envolvimento deste núcleo com as funções reguladas por estas estruturas, incluindo o comportamento ingestivo.

Um grande número de estruturas neurais inerva o NPV, principalmente aferências do tronco encefálico advindas da medula ventrolateral, do NTS, do Locus Coeruleus e dos Núcleos da Rafe, enquanto que aferências do córtex e áreas límbicas são relativamente escarsas (Swanson e Sawchenko, 1980; Sawchenko and Swanson, 1983; Willoughby e Blessing, 1987; Saper 2000; Currie e cols., 2002; Perrin e cols., 2003).

Detalhadas comparações anatômicas levam a conclusão que o NPV é seletivamente e extensivamente inervado pelo MR (Vertes e Martin, 1988; Fletcher e

Coscina, 1993; Larsen e cols., 1996; Lowry, 2002; Perrin e cols., 2003), sugerindo que este núcleo seja o maior responsável pela serotonina liberada no NPV (onde atua modulando a ingestão de alimento, como citado anteriormente). O MR também está densamente interconectado com outras estruturas reguladoras da ingestão de água e alimento, envia e recebe projeções do hipotálamo lateral, da região perifornical, da área pré-óptica e do órgão subfornical (Vertes e cols., 1999; Voigt e cols., 2000; Wirtshafter, 2001). Evidências na literatura também mostram que o MR tanto envia quanto recebe aferências do NTS (Schaffar e cols., 1988; Piñeyro e Blier, 1999; Berthoud, 2002). Além disso, vários estudos que postulam o controle serotonérgico inibitório sobre o comportamento ingestivo reforçam a possível participação do MR (Hutson e cols, 1986; Hillegaard, 1990; Wirtshafter e Krebs, 1990; Fletcher, 1991; Currie e Coscina, 1993; Currie e cols, 1994; Larsen e cols., 1996; Wirtshafter, 2001). Logo, manipulações que afetem a liberação de 5-HT no MR podem alterar significativamente o comportamento ingestivo.

Tipicamente, a atividade de descarga dos neurônios serotonérgicos pode ser controlada por dois mecanismos principais: autoregulação através da influência da 5-HT sobre seus receptores localizados nos próprios neurônios serotonérgicos e heteroregulação, por meio de neurônios locais não serotonérgicos (sensíveis ou não às ações da 5-HT) ou através de aferências que atuam sobre os neurônios deste núcleo. Sabe-se que um grande número de neurônios no MR não são serotonérgicos (Wirtshafter, 2001; Adell e cols., 2002), além disso, as conexões aferentes com o MR fornecem substrato neuroanatômico para a interação entre neurônios serotonérgicos / não serotonérgicos e diferentes sistemas de neurotransmissores, sugerindo um múltiplo e fino sistema de controle sobre a freqüência de disparo dos neurônios deste núcleo (para revisão, Jacobs and Azmitia, 1992; Piñeyro e Blier, 1999; Adell e cols.,2002).

Dados na literatura confirmam que o nível extracelular de múltiplos neurotransmissores presentes no MR, incluindo entre outros, a própria 5-HT, noradrenalina (NA), dopamina, histamina, glutamato, ácido gama-aminobutírico (GABA), glicina, óxido nítrico, e diferentes neuropeptídeos, pode influenciar a freqüência de disparo dos neurônios serotonérgicos, e por conseguinte, a liberação de 5-HT em regiões prosencefálicas (Jacobs and Azmitia, 1992; Piñeyro e Blier, 1999; Adell e cols, 2002).

Concernente a autoregulação, os neurônios serotonérgicos do MR apresentam uma abundância moderada de receptores 5-HT1 (A, B) (Pazos e Palacios, 1985; Sotelo e cols., 1990; Kia e cols.,1996; Adell e Artigas, 1998; Adell e cols, 2002), que funcionam como autoreceptores e regulam a freqüência de descarga de neurônios 5-HT, assim como a síntese e liberação de 5-HT nas áreas de projeção (Sprouse e Aghajanian, 1987; Sinton e Fallon, 1988; Bosker e cols., 1994; Adell e cols., 2002) . Todavia, a liberação basal de 5-HT pelos núcleos da rafe não parece estar sob controle tônico desses autoreceptores. A redução da atividade de disparo dos neurônios serotonérgicos induzida pela ativação dos receptores 5-HT1 é mediada por uma hiperpolarização da membrana através da abertura dos canais de potássio (Mongeau e cols.,1997). No entanto, o papel fisiológico desses autoreceptores é funcionar como sensores que respondem com a redução da desgarga e liberação serotonérgica quando a concentração do transmissor endógeno no espaço extracelular se torna excessiva (Adell e cols., 2002).

Relativo a heteroregulação, e de especial importância para o trabalho ora apresentado destaca-se que o MR recebe densa inervação noradrenérgica originada do LC, da área tegmental lateral e de outros núcleos catecolaminérgicos próximos, além de neurônios serotonérgicos deste núcleo possuírem receptores adrenérgicos, enzimas

sintetizadoras, degradadoras e transportadoras de NA (Jones e Moore, 1977; Barbaran e Aghajanian, 1981; Jones e Friedman, 1983; Koyama e Kayama, 1993; Peyron e cols.,1996; Adell e cols.,2002), suportando a idéia que NA endógena podem influenciar de forma consistente e determinante a freqüência de disparo destes neurônios e, por conseguinte, as respostas comportamentais evocadas pela 5-HT, conforme o tipo de receptor adrenérgico ativado (Mongeau e cols., 1997). Dados na literatura mostram que a adrenalina (AD) endógena também pode influenciar tanto neurônios noradrenérgicos quanto neurônios serotonérgicos. Um grupo neuronal, similar ao grupo monoaminérgico clássico, contém todas as enzimas sintetizadoras de catecolaminas, inclusive feniletanolamina-N-metil transferase (PNMT, que catalisa a N-metilação da NA em AD) e é capaz de sintetizar, estocar e liberar pequenas quantidades de AD. Esse grupo neuronal predomina nas regiões C1, C2 e C3 da medula e enviam axônios a uma variedade de estruturas troncoencefálicas e prosencefálicas, incluindo o LC, DR, MR e o núcleo acumbens (Hokfelt e cols., 1984; Stone e cols., 2003).

Atinente aos receptores adrenérgicos, estudos baseados em clonagem molecular e/ou critérios farmacológicos têm identificado 9 subtipos de receptores, pertencentes à família dos receptores acoplados à proteína G, que podem ser divididos em três grupos : α1 (A, B, D) , α2 (A, B, C) e β (1, 2, 3) (para revisão, Wozniak e cols., 1999; Philipp e Hein, 2004), os quais são responsáveis pelos efeitos biológicos da AD e NA.

Os receptores α1 exibem uma afinidade muito maior pelos seus agonistas e antagonistas que a observada nos receptores α2 , em acréscimo, NA e AD endógenas parecem ter afinidade equipotente sobre estes receptores, enquanto que, para receptores β adrenérgicos, o subtipo β2 parece ser mais sensível à AD (Wozniak e cols., 1999). Note-se, entretanto, que dados na literatura evidenciam que a AD é um agonista mais

potente que a NA em dose equimolar para alterar o comportamento ingestivo, quando aplicados sobre o hipotálamo (Leibowitz, 1988).

Receptores β1 e β2 adrenérgicos são acoplados a proteína Gs , a qual ativa a adenilato ciclase. Em contraste, receptores α1 e α2 são acoplados em dois outros tipos de proteína G, Gq e Gi , respectivamente. A proteína Gq estimula a fosfolipase C para gerar IP3 (trifosfato de inositol) e DAG (diacilglicerol) como segundos mensageiros enquanto que a proteína Gi inibe a adenilato ciclase (Wozniak e cols., 1999). Como receptores β e α adrenérgicos são acoplados à diferentes proteínas G podem, conforme a quantidade e o tipo de receptores expressos em determinado local, ativar mecanismos intracelulares sinergísticos ou oponentes, variando a resposta evocada pelo ligante.

Relativo aos adrenoreceptores dos grupos α1 e α2 presentes em neurônios serotonérgicos do MR, dados na literatura mostram que existem altos níveis de RNAm para receptores α1B adrenérgicos (Day e cols., 1997) e níveis moderadamente elevados para receptores α2A (Rosin e cols.,1993), sendo que estes receptores adrenérgicos parecem alterar a liberação de 5-HT neste núcleo por mecanismos diferentes. A Fenilefrina, um agonista do receptor α1 adrenérgico, não altera a liberação de 5-HT , todavia, cirazolina (um agonista mais potente) em dose equimolar promove um grande aumento da liberação de 5-HT no MR. A ausência do efeito da fenilefrina sobre a liberação serotonérgica pode resultar de uma baixa afinidade deste agonista pelo receptor, enquanto que os fatores que desencadeiam a liberação de 5-HT pela ação da cirazolina, apesar de não serem conhecidos até o momento, podem ser atribuídos a uma ação sobre um receptor adicional (localizado sobre neurônios serotonérgicos ou não serotonérgicos presentes no MR) e/ou a uma rápida dessensibilização dos receptores α1 adrenérgicos (localizados sobre neurônios serotonérgicos no MR) (Adell e Artigas,1999). A administração de prazosina (um antagonista α1) marcadamente reduz a

liberação de 5-HT no MR, evidenciando que neste núcleo a liberação de 5-HT pode ser tonicamente estimulada pela ativação dos receptores α1 adrenérgicos. Este antagonista não afeta a concentração de 5-HIAA (ácido-hidroxiindolacético, um metabólito da degradação e indicador da produção de 5-HT no organismo), denotando que sua ação modula a liberação, mas não o metabolismo da 5-HT no MR (Adell e Artigas, 1999). Em acréscimo, a redução de 5-HT extracelular observada após a administração do antagonista α1 , prazosina, foi maior no hipocampo que no estriado (estruturas inervadas pelo MR e DR, respectivamente), sugerindo uma sensibilidade maior do MR para agentes α1 adrenérgicos. Como neste núcleo o receptor α1B adrenérgico predomina (Day e cols.,1997; Adell e cols.,2002), infere-se que ele seja o responsável pela influência facilitatória tônica adrenérgica sobre neurônios serotonérgicos.

Componentes α2 adrenérgicos também afetam a liberação de 5-HT no MR, sendo que, in vivo, a liberação serotonérgica deste núcleo diminui cerca de 30% após a aplicação local de clonidina (um agonista α2), enquanto no DR essa redução chega a 60%, refletindo balanço diferente entre autoreceptores α2 adrenérgicos (localizados em aferentes noradrenérgicos) e heteroreceptores α2 (localizados em neurônios serotonérgicos) presentes nestes núcleos (Adell e cols., 2002). A aplicação de RX821002 (um antagonista α2) e de BRL44408 (um antagonista seletivo α2A) aumentam a liberação de 5-HT no MR (Adell e Artigas, 1999; Adell e cols.,2002). Adicionalmente, nota-se que a aplicação de clonidina neste núcleo diminui a concentração de 5-HIAA (Clemente e cols., 1992), em acordo com evidências na literatura de que a síntese de 5-HT é inibida após a ativação de adrenoreceptores α2 (Yoshioka e cols., 1992).

Lesões em neurônios noradrenérgicos centrais com 6-OHDA (6-hidroxidopamina, uma neurotoxina que destrói seletivamente neurônios

catecolaminérgicos) leva ao desaparecimento dos efeitos observados com componentes seletivos α2 adrenérgicos sobre a descarga serotonérgica do MR, revelando que estes receptores encontram-se predominantemente em terminais noradrenérgicos (Yoshioka e cols., 1992; Haddjeri e cols., 1996). Por esta razão, sugere-se que a clonidina inibe a liberação de NA de vesículas pré-sinápticas (localizadas nos terminais noradrenérgicos), removendo, então, o tônus estimulatório dos receptores α1 adrenérgicos localizados sobre os neurônios serotonérgicos, resultando em uma liberação de 5-HT diminuída no MR.

Concernente ao MR, embora não existam dados específicos sobre a presença de receptores β adrenérgicos neste núcleo, essa idéia não pode ser descartada. Dados na literatura evidenciam a presença de receptores β adrenérgicos sobre terminais serotonérgicos em outras regiões do SNC (Hensler e cols.,1991), contudo, parece que eles não exercem modulação direta sobre a liberação de 5-HT. Primeiro, porque o efeito inibitório da NA sobre a liberação de 5-HT (através de receptores α2 adrenérgicos) não é bloqueado por antagonistas β adrenérgicos (Frankhuijzen e cols., 1980; Gothert e Huth, 1980), e segundo, porque agonistas β adrenérgicos aplicados isoladamente não exercem qualquer efeito sobre a liberação de 5-HT (Baumann e Waldmeier, 1981; Frankhuijzen e cols., 1988; Mendelson e McEwen, 1992). Entretanto, não se descarta a idéia que a estimulação de receptores β adrenérgicos possa ter um efeito modulatório - sobre uma concomitante ativação sustentada e prolongada - na liberação de 5-HT, através de alguns mecanismos ainda não identificados (Mongeau e cols., 1997). Também não pode ser excluída a hipótese de que a própria 5-HT regule a função dos receptores β adrenérgicos, pois dados na literatura evidenciam alterações (redução) no número e na função destes receptores após prejuízo ou lesão da neurotransmissão serotonérgica (Sulser e Sanders-Bush, 1987).

A freqüência de descarga dos neurônios serotonérgicos no MR, bem como a liberação de 5-HT em áreas de projeção, pode ser regulada por influências adrenérgicas. No entanto, a papel dessas entradas no MR e possíveis efeitos sobre o comportamento ingestivo ainda não foi investigado. O presente trabalho tem por objetivo investigar se injeções locais de AD e NA sobre o MR exercem efeitos modulatórios sobre o comportamento ingestivo em ratos submetidos à restrição alimentar.

3.1 Animais

Ratos (Rattus norvegicus) Wistar machos, pesando entre 250 e 350g e provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina, foram utilizados como sujeitos experimentais. Previamente aos experimentos, esses animais foram distribuídos em grupos de cinco por caixa de polipropileno (49 x 34 x 16cm) forradas com maravalha e submetidos a 7 dias de adaptação ao biotério do laboratório, com livre acesso a água e ração (CR-1, Nuvilab) e mantidos sob temperatura constante de 24 ± 2oC com ciclo claro/escuro de 12 horas (luzes acendendo às 06:00h). Durante esse período, os animais foram manipulados somente durante a limpeza das caixas (a cada 48h). Após a cirurgia para implantação da cânula guia, os animais retornaram ao mesmo biotério e foram mantidos individualmente nas caixas de polipropileno, sendo manipulados regularmente para a verificação da cânula-guia e habituação ao manejo. Após um período de recuperação não inferior a 4 dias, iniciaram a restrição alimentar (15g/rato ao dia), com água ad libitum, permanecendo dessa forma durante todo o período experimental. Os experimentos foram realizados em acordo com os princípios éticos de experimentação animal, postulados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, sendo o protocolo de experimentação aprovado pelo Comitê de Ética ao Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa Catarina.

3.2 Cirurgia

Para a implantação da cânula-guia, cada animal foi anestesiado com uma mistura de xilazina/ketamina (13mg/Kg xilazina; 87mg/Kg ketamina) injetadas por via intraperitoneal. Em seguida, foi colocado em um aparelho estereotáxico tendo a cabeça fixada por intermédio de barras posicionadas no conduto auditivo e no focinho. Na região de acesso cirúrgico na cabeça, o animal recebeu, por via subcutânea, cerca de 2ml de Xylestesin (cloridrato de lidocaína a 2% com vaso- constritor). Após assepsia com álcool iodado, uma incisão longitudinal foi realizada no escalpo, de forma a expor a calota craniana. A porção exposta do crânio foi raspada e seca para garantir a adesão do acrílico. A posição para a perfuração e implantação da cânula-guia na região do MR foi então marcada.

As seguintes coordenadas, obtidas de acordo com o Atlas Estereotáxico de Paxinos e Watson (1998), foram seguidas:

• 7,8 mm posterior ao Bregma

• 2,7 mm lateral à linha média

• 7,5 mm de profundidade a partir da calota craniana

A perfuração da calota craniana para a introdução da cânula-guia foi feita com o auxílio de uma broca esférica de uso odontológico, abrindo um orifício com cerca de 3mm de diâmetro.

3.3 Cânula-guia

A cânula-guia foi confeccionada a partir de agulha hipodérmica, com 0,7 mm de diâmetro externo e 18 mm de comprimento. A cânula-guia foi fixada à calota craniana com acrílico autopolimerizável de uso odontológico e auxílio de parafusos de joalheiro (previamente fixados à calota), formando uma estrutura sólida capaz de resistir aos eventuais choques mecânicos e à manipulação para injeção das drogas. A fim de evitar a obstrução da cânula-guia até o momento da injeção das drogas, foi introduzido em seu interior fino estilete de aço, que não ultrapassou o comprimento da guia e teve sua extremidade externa fixada ao acrílico.

3.4 Drogas Administradas

A NA e AD (Sigma Co, St. Louis, USA) foram utilizadas nas doses de 6 nmol, 20 nmol e 60 nmol dissolvidas em solução salina (NaCl 0,9 %), sendo que o grupo controle recebeu apenas o veículo.

3.5 Injeções intracerebrais

A injeção intracerebral das drogas e do veículo foi realizada por meio de uma agulha injetora (Mizzy-Slide-Park; 0,3 mm de diâmetro), introduzida na cânula-guia (1,4 mm menor que a injetora) e conectada por um tubo de polietileno a uma microseringa Hamilton (capacidade de 5 µl). Com o objetivo de minimizar variações na pressão intracerebral, as soluções foram administradas no período de 1 min, sendo o volume injetado de 200 nl para qualquer uma das condições de tratamento.

Observa-se, abaixo, uma fotografia da caixa experimental utilizada para o registro comportamental e avaliação da ingestão de alimento.

Ela foi confeccionada em vidro transparente de 4 mm e possui o mesmo comprimento e largura que a caixa de hospedagem (49 x 34 cm), tendo porém, uma altura maior (40 cm) para evitar fugas. Além de possuir um bebedouro e um comedouro acoplados, três paredes e o fundo foram recobertos com papel plástico adesivo preto (contact), permanecendo uma lateral da caixa com vidro transparente, frente a qual, foi posicionado um espelho (com dimensões idênticas) num ângulo que não permitiu que o animal visualizasse sua imagem refletida durante o experimento, mas que possibilitou a visualização lateral dos seus comportamentos, registrados digitalmente ou em VHS para posterior análise, fornecendo a identificação correta dos comportamentos apresentados pelo animal durante a sessão experimental.

Após a recuperação da cirurgia para implantação da cânula-guia, os animais foram mantidos num regime de restrição alimentar (15g ração/rato ao dia) e água

ad libitum cerca de uma semana, tempo suficiente para motivar o comportamento

ingestivo (Chaoloff e cols., 1996; Haider e Haleem, 2000; Baldo e cols., 2002). Nos dois dias que antecederam a primeira sessão experimental, os ratos –individualmente - foram transferidos para a sala onde o registro comportamental ocorreria, com as mesmas condições de temperatura ambiente e luminosidade encontradas no biotério de origem, e foram habituados a manipulação, aos procedimentos de infusão da droga e à caixa experimental. No segundo dia, adicionalmente, o filete previamente introduzido na cânula-guia foi desprendido do acrílico e o animal recebeu uma injeção fictícia em tempo real (1 min ou mais). Essa medida foi adotada para proporcionar ao animal um período de adaptação ao ambiente e condições experimentais, minimizando possíveis efeitos relacionados ao estresse. As seguintes condições de tratamento foram utilizadas: administração de veículo, de 6, 20 e 60 nmol de AD ou NA em doses equimolares, aplicadas em diferentes seqüências para cada grupo experimental.

Após o período de habituação, foi iniciado o procedimento experimental. Em dias alternados (intercalados por um dia livre) cada rato recebeu, no mínimo, a injeção do veículo e mais duas condições de tratamento. Conforme a integridade da cânula-guia e condições gerais, o mesmo animal avançava no esquema experimental e recebia outras condições de tratamento, porém, nenhum grupo de animais chegou a receber todas as condições propostas (veículo, 6 , 20 e 60 nmol de AD; 6, 20 e 60 nmol de NA). Nos dias de teste, o animal foi retirado de sua caixa, recebeu a injeção de NA, AD (nas doses anteriormente descritas) ou veículo e foi colocado na caixa experimental, tendo livre acesso à água, porém sem a apresentação de alimento. Após os primeiros 10 min, necessários para que a droga se difundisse e o animal reconhecesse o ambiente, foi

disponibilizado ao animal uma quantidade de ração previamente pesada e o registro digital ou em VHS, por 30 min., foi iniciado. Findado o tempo experimental, o animal foi recolocado em sua caixa e levado ao biotério de origem; a ração restante na caixa experimental foi recolhida e pesada, sendo o consumo de alimento medido pela diferença entre a quantidade de ração inicial e final. Note-se que o animal, ao retornar a sua caixa, recebia apenas a quantidade de ração (em gramas) complementar àquela já ingerida, totalizando a quantidade definida pela restrição alimentar (15g/ por rato ao dia). Com o objetivo de evitar pistas odoríferas, após cada teste, a caixa experimental foi limpa com tecido umedecido em solução alcoólica 20%. Essa rotina experimental foi seguida até que, para cada condição de tratamento averiguada, houvesse um número de sujeitos experimentais suficientes para a análise estatística.

3.8 Categorização

Comportamental

Para analisar criteriosamente as possíveis mudanças comportamentais desencadeadas pela administração de diferentes doses de AD e NA sobre o comportamento alimentar, alguns comportamentos foram categorizados de modo a facilitar a análise da SSC, em acordo com as categorias comportamentais propostas e utilizadas por Halford e cols., 1998. Dessa forma, os registros em VHS, ou digitais, foram analisados com o programa de análise comportamental Etholog 2.2 (Ottoni, 1999), levando-se em consideração a postura e os movimentos corporais do rato, como descritos no Quadro 1.

Quadro 1: relação dos comportamentos observados durante os 30 min de período experimental, da descrição comportamental e dos critérios de análise utilizados para a

avaliação dos efeitos observados após a administração de AD nas doses de 6, 20 e 60 nmol ou de NA em doses equimolares nas áreas investigadas por este trabalho.

COMPTO DESCRIÇÃO COMPORTAMENTAL CRITÉRIOS DE _ANÁLISE

Ingestão do Alimento

Quando o animal estiver efetivamente ingerindo alimento sólido, com comportamentos característicos de deglutição; Quantidade Latência Duração Freqüência Ingestão de Água

Quando o animal lambe a ponta do bebedouro; Latência, Duração e Freqüência Exploração

do alimento

Quando cheira, carrega ou manipula a ração sem ingeri-la, ou seja, sem apresentar comportamentos característicos de deglutição;

Duração Freqüência

Exploração não locomotora

Quando o animal estiver ativamente explorando o ambiente com a cabeça, seja cheirando o ar ou o chão, sem tirar as quatro patas do local onde se encontra;

Duração Freqüência

Exploração vertical

Quando o animal estiver explorando o ambiente apoiado somente nas patas traseiras, estando as patas dianteiras livres e não apoiadas no fundo da caixa ou comedouro;

Duração Freqüência

Autolimpeza Quando o animal executar comportamentos orofaciais típicos de autolimpeza, como limpar ou roer as unhas, lamber a cabeça e o corpo; ou coçar-se com a boca;

Duração Freqüência

Locomoção Quando o animal estiver deambulando pela caixa, sem apresentar qualquer um outro dos comportamentos já citados;

Duração Freqüência

Imobilidade Quando o animal permanecer imóvel, sem apresentar qualquer outro comportamento já citado.

Duração Freqüência Referente aos critérios de análise comportamental adotados:

• Quantidade: refere-se à diferença entre a quantidade de ração apresentada ao animal no início da sessão experimental e a ração restante ao final da mesma, medida em gramas, representando um registro alimentar do consumo durante os 30 min.;

• Latência: refere-se ao tempo, medido em segundos, que o animal levou para realizar pela primeira vez determinada resposta comportamental;

• Duração: refere-se ao tempo, medido em segundos, que o animal permaneceu executando determinada resposta comportamental;

• Freqüência: refere-se ao número de vezes, durante os 30 min. da sessão experimental, que o animal exibiu determinada resposta comportamental.

Após o esquema experimental, os animais foram profundamente anestesiados com pentobarbital sódico (50mg/kg) e foram perfundidos transcardialmente com salina 0,9%, seguido de formol 10%. O posicionamento das cânulas foi verificado por meio da injeção de 200 nl de Azul de Evans. Após dissecadas, as peças permaneceram imersas em formol 10% por um período de 5 a 7 dias, sendo porteriormente cada peça incluída em ágar e cortada em fatias de 100 µm de espessura por um vibrótomo. Os cortes foram então montados em lâminas gelatinizadas e permaneceram secando cerca de uma semana; depois foram coradas pelo método de Nissl e permaneceram secando por igual período antes de serem analisadas ao microscópio óptico. A reprodução gráfica dos cortes e dos pontos de injeção analisados ao microscópio foi realizada a partir do Atlas do cérebro do rato de Paxinos e Watson (1998).

3.10 Análise dos dados

Os dados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância de uma via. A comparação entre os grupos foi feita aplicando o teste Duncan. Apenas valores de probabilidade de acaso menores que 5% foram considerados significantes.

4.1 LOCAIS ATINGIDOS PELA INJEÇÃO DE AD, NA E VEH EM RATOS SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO ALIMENTAR

A análise histológica mostrou que, de um total de 36 ratos com cânula-guia cronicamente implantada nas imediações do MR:

• 24 animais tiveram sua cânula injetora localizada sobre o MR. Deste grupo, 12 animais receberam injeções de VEH, 20 nmol de AD e 20 nmol de NA; 6 animais receberam, além do VEH, injeções de 6 nmol e 60 nmol de AD e 6 animais receberam, além do VEH, injeções de 6 nmol e 60 nmol de NA (Fig.1),

• 6 animais tiveram sua cânula injetora localizada sobre a região Supralemniscal ou sobre o Lemnisco Medial e receberam injeções de VEH e de AD (20 nmol) e NA (20 nmol), sendo considerados neste trabalho como Região Lemniscal (RL) (Fig. 1),

• 6 animais tiveram sua cânula injetora localizada na área dos Núcleos Pontinos (NP) e receberam injeções de VEH, de AD (20 nmol) e de NA (20 nmol) (Fig.1).

Fig.1. Desenho semi-esquemático dos locais atingidos pela injeção de VEH, AD e NA em ratos submetidos à restrição alimentar. A figura mostra a localização aproximada dos locais de injeção no MR (em vermelho, N=24), RL (em azul, N= 6) e NP (em verde, N= 6). Seções coronais do cérebro de rato obtidas do Atlas de Paxinos e Watson, 1998.

7,6 mm posterior ao Bregma

7,8 mm posterior ao Bregma

4.2 ADMINISTRAÇÃO DE AD SOBRE O MR E SEUS EFEITOS SOBRE A INGESTÃO DE ALIMENTO, DE ÁGUA E DE COMPORTAMENTOS NÃO INGESTIVOS EM RATOS SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO ALIMENTAR

4.2.1 INGESTÃO DE ALIMENTO

A) Quantidade, Duração e Latência

A ANOVA de uma via indica diferença estatisticamente significante entre os tratamentos aplicados no MR de ratos submetidos à restrição alimentar quando são analisados os dados obtidos para a quantidade de alimento ingerido [ F (3,43) = 2,49; p = 0,001] e para a duração da ingestão de alimento [F(3,43)= 9,17; p = 0,00008]. Os resultados apresentados na Fig.2 mostram que a administração de 20 nmol de AD provocou uma resposta hipofágica, com uma redução de aproximadamente 40% na quantidade de alimento ingerido quando comparado ao grupo controle. Observa-se o consumo total de alimento de 5,79 ± 0,25 g após o tratamento com VEH (média ± e.p.m, N = 24) e de 3,46 ± 0,54 g após a administração de AD na dose de 20 nmol (média ± e.p.m, N = 12). Essa hipofagia foi acompanhada por uma redução significante na duração de ingestão de alimento e por uma tendência de aumento na latência para desencadear o primeiro episódio alimentar .

As injeções de AD nas doses de 6 ou 60 nmol não provocaram qualquer alteração na quantidade de alimento ingerido, duração do comportamento ingestivo e latência para iniciar a ingestão de alimento (Fig.2).

INGESTÃO DO ALIMENTO TRATAMENTO gr amas 0 2 4 6 8 10 VEH AD 6 AD 20 AD 60

*

DURAÇÃO DA INGESTÃO DE ALIMENTO

TRATAMENTO segundos 0 400 800 1200 1600 2000 VEH AD 6 AD 20 AD 60

*

LATÊNCIA PARA INGESTÃO DO ALIMENTO

TRATAMENTO segundos 0 100 200 300 400 VEH AD 6 AD 20 AD 60

Fig. 2: Administração de veículo (VEH) e de adrenalina (AD) nas doses de 6, 20 ou 60 nmol no MR de ratos submetidos à restrição alimentar e seus efeitos sobre a quantidade de alimento ingerido, duração total e latência para iniciar o consumo alimentar. A análise comportamental foi realizada durante 30 min. Os dados representam a média ± e.p.m , N= 24 para o tratamento com VEH, N=6 para 6 nmol , N=12 para 20 nmol e N=6 para 60 nmol.

B) Freqüência de Ingestão e Exploração do Alimento

Após a administração de AD (6, 20 e 60 nmol) não se observa modificação estatisticamente significante na freqüência de exibição para o comportamento de ingestão alimentar. Também não foram observadas diferenças estatísticas entre os tratamentos para as respostas do comportamento de exploração do alimento (duração e freqüência de exibição), conforme apresentado na Tab.1.

TABELA 1: Duração total e freqüência de exibição (média ± erro padrão da média) dos comportamentos de ingestão do alimento e exploração do alimento, observados durante 30 minutos após a injeção de veículo (VEH) ou de 6, 20 e 60 nmol de adrenalina (AD) no MR de ratos submetidos à restrição alimentar (N=24 para o tratamento com VEH, N=6 para a dose de 6 nmol, N=12 para a dose de 20 nmol e N=6 para a dose de 60 nmol).

Ingestão do Alimento

TRATAM. Frequência de Exibição (n0 de vezes/ 30 min) VEH AD 6 AD 20 AD 60 21,83 ± 2,32 25,00 ± 4,67 20,18 ± 3,36 26,00 ± 7,68

Exploração do Alimento

TRATAM. DURAÇÃO (s) Frequência de Exibição (n0 _{de vezes/ 30 min)} 105,08 ± 12,28 18,04 ± 2,03 100,28 ± 14,05 23,16 ± 2,77 128,66 ± 19,02 21,45 ± 2,81 VEH AD 6 AD 20 AD 60 103,25 ± 15,17 26,16 ± 4,68

4.2.2 INGESTÃO DE ÁGUA

A ANOVA de uma via não mostra diferença estatística entre os tratamentos administrados no MR de ratos submetidos à restrição alimentar quando são analisados os dados obtidos de latência para desencadear a resposta dipsogênica, bem como para os dados obtidos de duração e de freqüência para exibição do comportamento de ingestão hídrica, conforme apresentado na Fig.3.

LATÊNCIA PARA INGESTÃO DE ÁGUA TRATAMENTO segundos 0 400 800 1200 VEH AD 6 AD 20 AD 60

DURAÇÃO DA INGESTÃO DE ÁGUA

TRATAMENTO segundos 0 40 80 120 160 VEH AD 6 AD 20 AD 60

FREQUÊNCIA PARA INGESTÃO DE ÁGUA

TRATAMENTO núm er o de ve ze s / 3 0 m in 0 2 4 6 8 10 VEH AD 6 AD 20 AD 60

Fig. 3: Administração de veículo (VEH) e de adrenalina (AD) nas doses de 6, 20 ou 60 nmol no MR de ratos submetidos à restrição alimentar e seus efeitos sobre a latência para iniciar o comportamento dipsogênico, duração total e freqüência para ingestão de água. A análise comportamental foi realizada durante 30 min. Os dados representam a média ± e.p.m , N= 24 para o tratamento com VEH, N=6 para 6 nmol, N=12 para 20 nmol e N=6 para 60 nmol.

4.2.3 COMPORTAMENTOS NÃO INGESTIVOS

A) Locomoção

A ANOVA de uma via mostra diferença estatisticamente significante entre os tratamentos aplicados no MR de ratos submetidos à restrição alimentar quando são analisados os dados de duração [F(3,43)= 3,57, p= 0,02] e de freqüência de exibição do comportamento de locomoção [F(3,43)= 3,87, p= 0,01]. Após administração de AD na dose de 6 nmol, verifica-se um aumento significante na duração do comportamento de locomoção; entretanto essa dose não altera a freqüência de exibição desse comportamento. A injeção de 60 nmol de AD foi capaz de aumentar significantemente, cerca de 2 vezes, tanto a duração do comportamento de locomoção quanto a freqüência de exibição desse comportamento. Após a aplicação de AD na dose de 20 nmol não se observa modificação nas respostas do comportamento de locomoção (Tab.2).

B) Imobilidade

A análise de variância não mostra diferença estatística entre os tratamentos quando são analisados os resultados obtidos para duração e freqüência de exibição do comportamento de imobilidade (Tab.2).

C) Exploração Vertical

A análise de variância de uma via indica que não houve diferença estatisticamente significante entre os tratamentos aplicados no MR de ratos submetidos à restrição alimentar, quando são analisados os resultados obtidos para a duração e freqüência de exibição do comportamento de exploração vertical. (Tab.2).

D) Exploração Não Locomotora

A ANOVA de uma via revela que houve diferença estatisticamente significante entre os tratamentos aplicados no MR de ratos submetidos à restrição alimentar quando são analisados os dados obtidos para as respostas de duração [F(3,43)= 12,29, p= 0,000006] e de freqüência de exibição do comportamento de exploração não locomotora [ F(3,43)= 5,42, p= 0,002 ]. Após a administração de AD na dose de 20 nmol a duração do comportamento de exploração não locomotora foi aproximadamente 2 vezes e meio maior que a duração observada no grupo controle. Observa-se também, após administração desta dose, que a freqüência de exibição desse comportamento foi aproximadamente uma vez e meio maior que a freqüência verificada após o tratamento com VEH. Outras doses de AD (6 e 60 nmol) não alteraram significantemente a resposta do comportamento de exploração não locomotora (Tab.2).

E) Autolimpeza

A ANOVA de uma via indicou diferença estatisticamente significante entre os tratamentos quando foram analisados os dados para a duração [ F (3,43) = 4,72, p = 0,006 ] e para a freqüência de exibição do comportamento de autolimpeza [ F (3,43) = 9,63, p= 0,00005 ]. Após a administração de 20 nmol de AD no MR de ratos

submetidos à restrição alimentar observa-se que a duração do comportamento de autolimpeza foi aproximadamente 3 vezes e meio maior que a observada após o tratamento com VEH. Esta dose de AD (20 nmol) também promoveu um aumento na freqüência de exibição desse comportamento, cerca de 2 vezes e meio a freqüência observada no grupo controle. De modo similar, a administração de AD na dose de 60 nmol induziu um aumento de aproximadamente 4 vezes na duração do comportamento de autolimpeza e de cerca de 2 vezes na freqüência de exibição desse comportamento, quando foram comparados aos resultados obtidos após tratamento com VEH. A administração de AD na dose de 6 nmol não interferiu de maneira estatisticamente significante com as respostas de duração e freqüência de exibição do comportamento de autolimpeza (Tab.2).

TABELA 2: Duração total e freqüência de exibição (média ± erro padrão da média) dos comportamentos não ingestivos de locomoção, imobilidade, exploração vertical, exploração não locomotora e autolimpeza, observados durante 30 minutos após a injeção de veículo (VEH), 6, 20 e 60 nmol de adrenalina (AD) no MR de ratos submetidos à restrição alimentar (N=24 para o tratamento com VEH, N=6 para dose de 6 nmol , N=12 para dose de 20 nmol e N=6 para 60 nmol). (*) p < 0,05 em relação ao tratamento com VEH.

COMPTO TRATAM DURAÇÃO

(s) FREQUENCIADE EXIBIÇÃO (n0. de vezes/30min) VEH 51,60 ± 7,81 17,20 ± 2,71 AD 6 97,91 ± 11,67 * 31,83 ± 3,83 AD 20 63,09 ± 13,76 23,36 ± 5,35 Locomoção AD 60 97,12 ± 17,78 * 36,83 ± 6,60 * VEH 58,14 ± 23,84 3,00 ± 0,94 AD 6 18,15 ± 13,28 2,50 ± 1,52 AD 20 144,19 ± 49,21 8,36 ± 2,37 Imobilidade AD 60 126,72 ± 106,22 5,50 ± 4,25 VEH 38,78 ± 8,346 8,58 ± 1,56 AD 6 45,26 ± 18,15 10,16 ± 3,24 AD 20 77,93 ± 25,16 15,63± 4,80 Exploração Vertical AD 60 61,39 ± 15,84 15,50 ± 4,98 VEH 195,86 ± 21,82 34,16 ± 3,20 AD 6 145,19 ± 24,51 37,50 ± 3,37 AD 20 510,49 ± 75,19 * 57,81 ± 6,40 * Exploração Não Locomotora AD 60 224,20 ± 62,04 47,33 ± 6,83 VEH 44,69 ± 6,69 4,29 ± 0,40 AD 6 87,18 ± 29,76 7,33 ± 1,78 AD 20 158,46± 43,59 * 11,09± 1,94 * Autolimpeza AD 60 176,81 ± 77,81 * 10,66 ± 1,35 *

4.3 ADMINISTRAÇÃO DE NA SOBRE O MR E SEUS EFEITOS SOBRE A INGESTÃO DE ALIMENTO, DE ÁGUA E DE COMPORTAMENTOS NÃO INGESTIVOS EM RATOS SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO ALIMENTAR

4.3.1 INGESTÃO DE ALIMENTO

A) Quantidade, Duração e Latência

A ANOVA de uma via não indica diferença estatisticamente significante entre os tratamentos aplicados no MR de ratos submetidos à restrição alimentar quando se analisam os dados para a quantidade de alimento ingerido, tão pouco quando se analisam os dados para a duração da ingestão de alimento ou de latência para desencadear o primeiro episódio alimentar (Fig.4).

B) Freqüência de Ingestão e Exploração do Alimento

Após a administração de NA (6, 20 e 60 nmol) não se observa modificação estatisticamente significante quando são analisados os dados para freqüência de exibição para o comportamento de ingestão alimentar ou duração e freqüência de exibição para o comportamento de exploração do alimento (Tab.3).

LATÊNCIA PARA INGESTÃO DE ALIMENTO TRATAMENTO segun dos 0 50 100 150 200 VEH NA 6 NA 20 NA 60

Fig. 4: Administração de veículo (VEH) e de noradrenalina (NA) nas doses de 6, 20 ou 60 nmol no MR de ratos submetidos à restrição alimentar e seus efeitos sobre a quantidade de alimento ingerido, duração total e latência para iniciar o consumo alimentar. A análise comportamental foi realizada durante 30 min. Os dados representam a média ± e.p.m , N= 24 para o tratamento com VEH, N=6 para 6 nmol , N=12 para 20 nmol e N=6 para 60 nmol.

DURAÇÃO DA INGESTÃO DO ALIMENTO

TRATAMENTO segundos 0 400 800 1200 1600 2000 VEH NA 6 NA 20 NA 60 INGESTÃO DO ALIMENTO TRATAMENTO gr amas 0 2 4 6 8 10 VEH NA 6 NA 20 NA 60

TABELA 3: Duração total (média ± erro padrão da média, em segundos) e freqüência de exibição (média ± erro padrão da média, em número de vezes) dos comportamentos de ingestão do alimento e exploração do alimento, observados durante 30 minutos após a injeção de veículo (VEH) ou de 6, 20 e 60 nmol de noradrenalina (NA) no MR de ratos submetidos à restrição alimentar (N=24 para o tratamento com VEH, N=6 para a dose de 6 nmol, N=12 para a dose de 20 nmol , N=6 para a dose de 60 nmol).

Ingestão do Alimento

TRATAM. Frequência de Exibição (n0 de vezes/ 30 min) VEH NA 6 NA 20 NA 60 21,83 ± 2,32 23,0 ± 4,76 21,58 ± 5,19 30,50 ± 2,88

Exploração do Alimento

4.3.2 INGESTÃO DE ÁGUA

A ANOVA de uma via mostra que não houve diferença entre os tratamentos aplicados no MR de ratos submetidos à restrição alimentar, quando são analisados os dados obtidos de latência para desencadear a resposta dipsogênica, tão pouco para os dados obtidos de duração e de freqüência para exibir o comportamento de ingestão hídrica (Fig.5).

LATÊNCIA PARA INICIAR A INGESTÃO DE ÁGUA TRATAMENTO segundos 0 400 800 1200 VEH NA 6 NA 20 NA 60

DURAÇÃO DA INGESTÃO DE ÁGUA

TRATAMENTO segundos 0 40 80 120 160 VEH NA 6 NA 20 NA 60

FREQUÊNCIA PARA INGESTÃO DE ÁGUA

TRATAMENTO núm er o de v ez es / 30 m in 0 4 8 12 VEH NA 6 NA 20 NA 60

FIG 5: Administração de veículo (VEH) e de noradrenalina (NA) nas doses de 6, 20 ou 60 nmol no MR de ratos submetidos à restrição alimentar e seus efeitos sobre a latência para iniciar a ingestão hídrica, duração total e freqüência para beber água. Os dados representam a média ± e.p.m , N= 24 para o tratamento com VEH, N=6 para 6 nmol, N=12 para 20 nmol e N=6 para 60 nmol.