COMPORTAMENTOS NÃO INGESTIVOS NOS NP

A ANOVA de uma via não mostra diferença significante entre os tratamentos aplicados nos NP de ratos submetidos à restrição alimentar quando são analisados os dados obtidos para as respostas dos comportamentos não ingestivos de locomoção, imobilidade, exploração vertical, exploração não locomotora e autolimpeza, como apresentado na Tab. 8.

TABELA 8: Duração total (média ± erro padrão da média, em segundos) e freqüência de exibição (média ± erro padrão da média, em número de vezes/ 30 min) dos comportamentos não ingestivos de locomoção, imobilidade, exploração vertical, exploração não locomotora e autolimpeza, observados durante 30 minutos após a injeção de veículo (VEH), 20 nmol de adrenalina (AD) ou 20 nmol de noradrenalina (NA) nos NP de ratos submetidos à restrição alimentar (N=6).

COMPTO TRATAM DURAÇÃO (s)

FREQUENCIA DE EXIBIÇÃO (n0. de vezes / 30 min) VEH 23,99 ± 7,90 12,00 ± 7,90 AD 39,08 ± 9,12 17,83 ± 5,42 Locomoção NA 29,93 11,37 15,66 ± 6,41 VEH 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 AD 80,18 ± 78,99 17,83 ± 5,42 Imobilidade NA 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 VEH 23,09 ± 21,06 2,66 ± 1,90 AD 22,86 ± 12,34 4,33 ± 1,85 Exploração Vertical NA 12,80 ± 6,01 3,83 ± 1,81 VEH 137,08 ± 35,39 26,33 ± 5,63 AD 378,41 ± 190,28 36,50 ± 5,47 Exploração Não Locomotora _{NA 194,82 ± 39,61 33,16 ± 7,71} VEH 18,42 ± 7,25 2,50 ± 0,92 AD 32,30 ± 7,53 4,50 ± 0,61 Autolimpeza NA 20,23 ± 4,87 3,00 ± 1,09

Microinjeções de AD e NA em diferentes doses (6, 20 e 60 nmol) foram administradas sobre o MR de ratos submetidos à restrição alimentar, e seus efeitos sobre o comportamento ingestivo foram observados por 30 min. A análise comportamental incluiu oito categorias comportamentais, objetivando discriminar se os efeitos sobre o comportamento ingestivo foram específicos para os tratamentos utilizados - preservando a SSC (Blundell, 1991; Halford e cols., 1997), ou em decorrência de interferência por outros comportamentos manifestos, como sedação ou hiperatividade. Esse cuidado foi tomado porque manipulações que interferem com o sistema serotonérgico podem, potencialmente, influenciar inúmeros comportamentos além da ingestão de alimento. Além disso, a análise de dois outros locais (RL e NP) atingidos pelas microinjeções de AD e NA nos fornece subsídios para verificação se a ação destas substâncias é restrita ou específica para o núcleo objeto deste estudo (MR) ou envolvem outras estruturas.

Os dados obtidos em nosso trabalho mostram que a administração de AD, mas não de NA em dose equimolar (20 nmol), no MR de ratos submetidos à restrição alimentar provocou uma significativa redução na quantidade de alimento ingerido durante o período experimental. Essa redução foi acompanhada por uma diminuição na duração total desse comportamento, porém não alterou a latência para iniciar o primeiro episódio da ingestão de alimento.

Em conjunto, esses resultados sugerem que a administração de AD no MR levou à ativação de receptores adrenérgicos localizados sobre neurônios deste núcleo, consistente com dados na literatura que apontam a despolarização de neurônios serotonérgicos do MR (e a liberação de 5-HT em áreas de projeção) por influência de receptores adrenérgicos (Adell e Artigas, 1999; Adell e cols., 2002), que por sua vez, poderia ser responsável pela hipofagia observada em nosso estudo.

Descrições detalhadas do sistema serotonérgico em mamíferos (Mongeau e cols., 1997; Vertes e Crane, 1997; Piñeyro e Blier, 1999; Leger e cols.,2001; Adell e cols.,2002; Perrin e cols., 2003) confirmam que o MR representa a maior aferência serotonérgica ao NPV - estrutura que parece ter um papel fundamental no comportamento alimentar e metabolismo energético (Leibowitz, 1988; Leibowitz e cols., 1988; Shor-Postner e cols., 1996; Lowry, 2002) - e também aferências ao ARC (Neary e cols., 2004) e ao NTS (Schaffar e cols., 1988), além de estar densamente interconectado a um substrato neuroanatômico envolvido com a ingestão de alimento (Vertes e cols., 1999; Voigt e cols., 2000; Wirtshafter, 2001). O mecanismo neuroquímico pelo qual a AD parece atuar reduzindo a ingestão do alimento (através do aumento na atividade de neurônios serotonérgicos do MR) podem ser atribuídos a uma antecipação dos sinais de saciedade, ou seja, através da saciação, já que reduziram a quantidade e duração e não interferiram com a latência, resultado consistente com o papel inibitório postulado para a 5-HT no controle do comportamento alimentar (Blundell, 1979, 1984, 1991; Hutson e cols., 1986; Leibowitz e cols, 1988; Leibowitz e Alexander, 1988; Hillegaart e cols., 1990; Wirtshafter e Krebs, 1990; Currie e Coscina, 1993; Wisthafter, 2001).

Podemos supor, ainda, que sinais de saciedade oriundos do trato gastrointestinal (através da CCK e grelina), sinais relacionados ao metabolismo energético no fígado (através da insulina), bem como informações advindas do núcleo motor salivatório e núcleo oromotor do músculo esquelético (Woods e cols., 1998; Schwartz e cols., 2000), resultantes da ingestão do alimento, tenham sido enviadas ao NTS (Friedman e cols., 1999). Como este núcleo tanto envia quanto recebe influências do MR (Schaffer e cols., 1988) e inerva áreas hipotalâmicas como o ARC e NPV (Schwartz e cols., 2000; Berthoud, 2002), áreas que também recebem fortes aferências

do MR (Lowry, 2002; Perrin e cols., 2003; Neary e cols., 2004), é possível que a estimulação do MR pela dose de 20 nmol de AD; e conseqüentemente uma possível liberação de 5-HT em áreas de projeção, tenham determinado o final da refeição e reduzido a ingestão de alimento pela ação conjunta de informações centrais e periféricas que participam das vias fisiológicas da regulação da ingestão do alimento e metabolismo energético, provocando saciação.

A administração de AD (20nmol) possivelmente exerceu seu efeito inibitório sobre o comportamento ingestivo através da estimulação de receptores α1 adrenérgicos, em grande número em neurônios serotonérgicos do MR (Day e cols., 1997; Adell e Artigas, 1999; Adell e cols, 2002), que ativados desencadeiam uma cascata de eventos intracelulares que conduzem à despolarização de membrana (Wozniak e cols., 1999) e liberação de 5-HT em áreas de projeção (Adell e Artigas, 1999; Adell e cols, 2002) envolvidas com o comportamento ingestivo, como o ARC (Neary e cols., 2004), o NPV (Vertes e Martin, 1988; Fletcher e Coscina, 1993; Larsen e cols., 1996; Lowry, 2002; Perrin e cols., 2003) e o NTS (Schaffar e cols., 1998). Como a AD também têm afinidade por receptores α2 adrenérgicos, em número moderado nos neurônios serotonérgicos do MR (Rosin e cols., 1993; Adell e Artigas, 1999; Adell e cols, 2002), possivelmente esses receptores também foram estimulados. No entanto, é plausível que a ativação de receptores α1 adrenérgicos, tipicamente excitatórios, tenham ocasionado um aumento na atividade de segundos mensageiros (como DAC, PKC e fosfatases) que podem ter sido predominantes à influência da ativação dos receptores α2, tipicamente inibitórios.

Partindo dos resultados obtidos com a administração de AD em dose equimolar (20 nmol) sobre a RL, que também desencadeou uma resposta hipofágica

acompanhada por uma redução significativa na duração total de ingestão do alimento, não alterando a latência para o primeiro episódio alimentar -perfil de resposta semelhante ao encontrado no MR- podemos supor que esta região também participa da via neuronal relacionada ao controle alimentar de curta duração (de refeição para refeição). A RL possui um número de neurônios serotonérgicos maior que qualquer outro núcleo da rafe, com exceção do DR (Vertes e Crane, 1997; Leger e cols., 2001), envia densa projeção ao MR (Semba, 1993; Vertes e Crane, 1994), também inerva áreas hipotalâmicas como o ARC, NPV e HVM (Sawchenco e cols., 1983; Willoughby e Blessing, 1987), dentre outras (para revisão: Vertes e Crane, 1997; Leger e cols, 2001), inclusive o NTS (Schaffar e cols., 1988). Dado o aspecto similar de conecctividade entre a RL e o MR, é possível que a RL através de suas aferências hipotalâmicas diretas, bem como através do NTS e ainda do MR, tenha ativado as vias responsáveis pela antecipação os sinais de saciação, desencadeando a resposta hipofágica observada, em acordo com o papel supressor do comportamento ingestivo relatado a 5-HT. Dado a escassez de dados referentes às propriedades e funções da RL, não podemos deixar de considerar que outros tipos neuronais não serotonérgicos presentes nesta região, e responsivos à AD na dose de 20 nmol, também possam ter participado da ativação das vias relacionadas ao comportamento ingestivo.

O resultado após a administração de AD (20 nmol) na RL, associado ao resultado obtido no MR com o mesmo tratamento, pode refletir que informações geradas durante o curso de uma refeição (sinais de saciação e saciedade), são primariamente transmitidas para o mesencéfalo por meio de fibras aferentes do nervo vago e oriundas do trato gastrointestinal, incluindo a participação do NTS, integrando uma via capaz de promover o término da refeição; idéia suportada por evidências na literatura de que o término da refeição induzida por sinais de saciedade é preservado

mesmo quando todas as conexões entre o prosencéfalo e o mesencéfalo são destruídas (Grill e Smith, 1988).

Em nosso trabalho, apenas a administração de AD na dose de 20nmol foi capaz de alterar o comportamento ingestivo causando hipofagia quando aplicada sobre o MR, enquanto que outras doses desse tratamento (6 e 60 nmol) não tiveram efeito. É possível que a dose de concentração mais baixa de AD tenha apresentado uma afinidade reduzida pelo receptor, semelhante àquela da fenilefrina (agonista α 1 adrenérgico) que não é capaz de alterar a liberação de 5-HT no MR (Adell e Artigas, 1999), enquanto que a dose de concentração mais alta possa ter provocado uma rápida dessensibilização do receptor α 1 adrenérgico após o tratamento, reduzindo o tônus estimulatório e prejudicando a liberação serotonérgica, em acordo com dados na literatura que revelam que a ativação intensa e simultânea de receptores adrenérgicos excitatórios e inibitórios sobre o mesmo neurônio desencadeiam um efeito inibitório maior, através de uma dessensibilização dos receptores excitatórios, refletindo um mecanismo compensatório para contrabalancear a excessiva produção de adenilato ciclase (Rich e cols., 1984; Atkinson e Minneman, 1992). Podemos supor, ainda, que esse tratamento (AD na dose de 60 nmol) tenha oportunizado uma liberação de 5-HT na fenda sináptica capaz de ativar autoreceptores 5-HT1 (A,B) - em abundância moderada em neurônios serotonérgicos do MR (Sotelo e cols., 1990; Kia e cols., 1996; Adell e Artigas, 1999; Adel e cols., 2002) - os quais, por sua vez, inibiriam a liberação de 5-HT em seus terminais neuronais. Nesse sentido, nossos resultados podem refletir diferentes mecanismos de regulação utilizados em condições fisiológicas distintas, bem como que a interação entre diferentes subtipos de receptores ativados simultaneamente, sobre o mesmo local, podem desencadear uma resposta diferente da freqüentemente evocada quando ativados separadamente.

Diferentemente dos dados relacionados com a administração de AD, os resultados obtidos após a administração de NA no MR de ratos submetidos à restrição alimentar mostram que nenhuma das doses utilizadas (6, 20 e 60 nmol) foi capaz de induzir alterações significativas sobre o comportamento ingestivo ou de alterar expressivamente comportamentos não ingestivos. Como dados na literatura evidenciam que, quando administradas sobre o hipotálamo, a AD é um agonista mais potente que a NA em dose equimolar para alterar o comportamento ingestivo (Leibowitz, 1988), o resultado obtido em nosso estudo pode refletir que a concentração máxima utilizada ainda não tenha sido a ideal para que a NA tivesse eficiência e potência similares sobre os receptores adrenérgicos localizados sobre o MR, tal como a AD, ou ainda, que especificidades dos receptores adrenérgicos aos ligantes (AD e NA) possam ter obtemperado os efeitos da NA e intensificado os efeitos da AD.

Contudo, como em nosso estudo a administração de NA, em dose equimolar ou superior à dose de AD que desencadeou uma resposta hipofágica, não alterou o comportamento ingestivo, uma outra hipótese interessante é o envolvimento de receptores β2 adrenérgicos na resposta observada, já que este receptor apresenta maior afinidade pela AD (Lands e cols., 1967; Leier e cols., 1990; Schivachar e Eikenburg, 1998; Wozniak e cols., 1999) e, assim como os receptores α1 adrenérgicos, ativam uma cascata intracelular de eventos excitatórios que, somados à ativação dos receptores α1, poderiam sobrepujar a dessensibilização dos receptores excitatórios relatada ao controle da produção de adenilato ciclase em excesso (Rich e cols., 1984; Atkinson e Minneman, 1992) e promover a ativação dos neurônios serotonérgicos do MR, resultando na resposta hipofágica observada.

Dessa forma, em nosso estudo, a administração de NA pode ter falhado em desencadear um comportamento hipofágico por ter causado uma dessensibilização

do receptor α1 adrenérgico e, por não influenciar receptores β2 , ter provocado uma excitação menor nos neurônios serotonérgicos do MR, incapaz de promover a liberação de 5-HT; situação oposta à observada com a administração de AD, reforçando a idéia da participação de receptores β2 no comportamento hipofágico desencadeado por ela.

Interessantemente, sobre a RL (onde foram administradas somente injeções de AD e NA na dose de 20 nmol) um padrão semelhante pode ser observado: somente a AD desencadeou o comportamento hipofágico, permitindo generalizações similares àquelas feitas ao MR, não esquecendo que essa influência também possa envolver a participação de neurônios não serotonérgicos sensíveis ao tratamento utilizado.

Com relação aos comportamentos não ingestivos afetados pelo tratamento com AD na dose de 20 nmol sobre o MR e RL de ratos submetidos à restrição alimentar, evidências sugerem que eles não interferiram com o comportamento alimentar.

Relativo ao MR, o comportamento de autolimpeza também foi alterado de maneira similar com a administração de AD na dose de 60 nmol, que igualmente promoveu um aumento significativo na atividade locomotora (não observado após a administração da dose de 20 nmol), mas falhou em desencadear um comportamento hipofágico mesmo quando associado a uma atividade locomotora aumentada, sugerindo que este comportamento não interferiu com a ingestão de alimento. Corroborando essa idéia, nossos resultados indicam que a hipofagia observada na RL após a administração AD não está relacionada a um aumento na expressão do comportamento de autolimpeza, já que neste núcleo não se observam alterações com a freqüência ou duração desse comportamento. Além disso, estudos eletrofisiológicos mostram que populações neuronais do MR e do DR são seletivamente ativadas durante movimentos

orofaciais (mastigar, lamber e limpar a superfície do corpo com a língua) em gatos (Valle e cols., 1989; Fornal e cols., 1996) e, ainda, que a estimulação elétrica ou por meio de injeções de várias substâncias em regiões do NPV e do HVM podem desencadear o comportamento de autolimpeza (“grooming”) (Rouling e cols., 1993). Juntos, esses dados suportam a idéia que a estimulação do MR com a dose de 20nmol de AD envolveu a participação de neurônios serotonérgicos envolvidos com o comportamento de autolimpeza, os quais não foram ativados após o mesmo tratamento na RL, refletindo mecanismos diferentes para a regulação desse comportamento e da ingestão de alimento, embora MR e RL apresentem projeções serotonérgicas para áreas comuns.

Com relação ao comportamento de exploração não locomotora, como observamos um aumento significativo na duração deste comportamento após a administração de AD e NA em doses equimolares (20nmol) sobre o MR, e que o segundo tratamento não provocou hipofagia, descarta-se a possibilidade desse comportamento estar interferindo com a ingestão de alimento observada após o tratamento com AD. Como grande parte dos neurônios contidos no MR não são serotonérgicos (Wirstschafter, 2000), é possível que este comportamento tenha sido alterado pela estimulação adrenérgica de neurônios não serotonérgicos contidos neste núcleo, os quais possivelmente não se encontram associados com o comportamento ingestivo. Como a administração de AD em dose equimolar (20 nmol) sobre a RL também causou um aumento significativo do comportamento de exploração não locomotora e, a julgar por suas projeções, podemos supor que a RL também participe da regulação desse comportamento.

Embora neurônios 5-HT do MR inervem regiões associadas ao medo e ansiedade, como o córtex frontal, a amígdala, hipotálamo, hipocampo e substância cinza

periaquedutal (Jacobs e Azmitia, 1992; Chalouff, 2000) e a RL possua um perfil de projeção similar (Vertes e Craine, 1997), sugerindo que um aumento atividade serotonérgica esteja associada ao estresse e ansiedade, por meio da ativação do eixo HPA e sistema nervoso simpático (Berton e cols., 1999; Ninan, 1999; Piñeyro e Blier, 1999), em nosso estudo não utilizamos nenhum modelo animal de ansiedade, como o labirinto em cruz elevado, de modo que não temos parâmetros para avaliar se a hipofagia observada após a administração de AD no MR e RL foi decorrente de um efeito secundário da estimulação dessas vias ou foi totalmente independente. Como o substrato anatômico permite tal extrapolação, essa é uma hipótese que merece atenção e pode, num estudo futuro, ser analisada com parâmetros adequados.

Os resultados obtidos no presente estudo, independente do tratamento utilizado (AD nas doses de 6, 20 ou 60 nmol e NA em doses equimolares) e local administrado, não mostram alterações na latência, duração e freqüência do comportamento de ingestão hídrica, sugerindo que receptores adrenérgicos do MR e da RL não participam na regulação desse comportamento, embora evidências na literatura sugiram um papel inibitório das vias serotonérgicas centrais no comportamento de ingestão de água em mamíferos. Os resultados experimentais da depleção serotonérgica central pelo PCPA revelaram um aumento significante e sustentado da ingestão de água (Shisheva e cols., 1987), enquanto que injeções centrais de MK 212 (um agonista de receptores 5-HT 2 (A, C) ) provocaram redução na ingestão hídrica em ratos submetidos à privação de água (Reis e cols., 1994). Como em nosso estudo, durante os primeiros 10 min após a aplicação dos tratamentos sobre o MR o animal ficou com água ad libitum, não podemos descartar a possibilidade que alterações precoces sobre o comportamento dipsogênico não tenham sido registradas e analisadas, mascarando os resultados obtidos durante os 30 min de período experimental.

Diferentemente do observado com a análise dos dados referentes ao MR e RL, a região dos NP mostrou-se inalterada após as diferentes condições de tratamento utilizadas. Como nenhum dos tratamentos utilizados no presente trabalho foi capaz de promover alterações sobre as categorias comportamentais não-ingestivas observadas, tão pouco alterar o comportamento ingestivo, podemos inferir que ou este núcleo não possui receptores adrenérgicos ou que a estimulação adrenérgica desta região esteja associada a alterações fisiológicas ou comportamentais não privilegiados neste estudo.

Com base nos resultados apresentados, podemos concluir que:

1. O MR e a RL, através de suas aferências a regiões relatadas ao metabolismo energético e ingestão do alimento, podem ocupar um papel determinante no controle do comportamento ingestivo, principalmente relacionado ao término da refeição (saciação);

2. A administração de AD sobre neurônios serotonérgicos (MR e RL) foi mais expressiva e significativa que a administração de NA (em dose equimolar ou superior) sobre a resposta de comportamentos ingestivos ou não ingestivos; sugerindo que esta ativação pode ser exercida de modo mais significativo pelos aferentes fisiológicos contendo adrenalina que pelos aferentes noradrenérgicos, conforme situações fisiológicas específicas;

3. A ação adrenérgica modulatória sobre o MR, e provavelmente RL, é predominantemente facilitatória, através da ativação de receptores α1 adrenérgicos (em acordo com substanciais evidências: Baraban e Aghajanian, 1980; Marwaha e Aghajanian, 1982; Rocha e cols., 1998; Adell e Artigas, 1998, 1999; Adell e cols., 2002) e, possivelmente envolveu a participação de receptores β2 adrenérgicos;

4. Os receptores adrenérgicos presentes em neurônios serotonérgicos do MR, podem modular a atividade de descarga em áreas de projeção envolvidas com a regulação do comportamento ingestivo; reduzindo a ingestão alimentar pela antecipação da conclusão dos episódios de alimentação (processo de saciação); 5. Que os neurônios (possivelmente serotonérgicos) presentes na RL podem

participar de maneira decisiva sobre a circuitaria envolvida com o fenômeno da saciação; pois como observado, interfere com a duração da ingestão e reduz a quantidade de alimento ingerido sem alterar a latência para o primeiro episódio de ingestão alimentar;

6. Que em conjunto, os itens citados acima, suportam a idéia que os sinais relacionados a saciação e saciedade possam ser integrados primariamente fora de áreas hipotalâmicas, muito provavelmente no mesencéfalo e incluem a participação do NTS;

7. A estimulação simultânea de diferentes receptores sobre o mesmo local pode resultar em efeito ou afinidade alterados, em função do balanço final de influências e mecanismos intracelulares específicos (somados, contrapostos ou independentes), o que justificaria a ausência de resultados expressivos para a dose menor e maior de AD utilizadas neste trabalho;

8. Que a região dos NP não parece ser influenciada por catecolaminas, tão pouco parece estar relacionado à atividade serotonérgica envolvida com o comportamento ingestivo;

9. Que as respostas de comportamentos não ingestivos, alteradas após os tratamentos utilizados, parecem estar associadas à descarga de neurônios serotonérgicos, porém parecem utilizar mecanismos distintos e não interferentes com o comportamento ingestivo, ou ainda podem ser atribuídos a uma influência

adicional de neurônios não serotonérgicos, já que doses que alteraram comportamentos não ingestivos falharam em provocar hipofagia.

Enfim, nosso estudo representa um esforço para aumentar nosso entendimento sobre a circuitaria neural e os complexos mecanismos envolvidos na regulação do comportamento ingestivo. Partindo dele, estudos com a utilização de diferentes concentrações de agonistas e antagonistas centrais, bem como uma investigação detalhada da RL, podem prover subsídios irrefutáveis e inéditos para a comunidade científica; já que, até onde sabemos, esse é um trabalho pioneiro na investigação do papel dos receptores adrenérgicos localizados sobre o MR e seus efeitos sobre o comportamento ingestivo e também, por fornecer fortes indícios da participação da RL na regulação do comportamento ingestivo.