UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
MARIA SILVANA TOTTI DA COSTA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS HIDROETANÓLICOS DE Joannesia princeps
(EUPHORBIACEAE)
BAURU
2018
MARIA SILVANA TOTTI DA COSTA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS HIDROETANÓLICOS DE Joannesia princeps
(EUPHORBIACEAE)
Tese apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biologia Oral. Área de concentração: Biologia Oral. Orientação do Prof. Dr. Paulo Henrique Weckwerth e Co- orientação do Prof. Dr. Jorge Kleber Chavasco (in memoriam) e Profa. Dra.
Daniela Cristina de Macedo Vieira.
BAURU
2018
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) de acordo com ISBD Costa,Maria Silvana Totti da
C8373a
Atividade antimicrobiana de extratos hidroetanólicos de Joannesia princeps (Euphorbiaceae) / Maria Silvana Totti da Costa.
-- 2018.
54f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Henrique Weckwerth.
Coorientadora: Profa. Dra. Daniela Cristina de Macedo Vieira.
Tese (Doutorado em Odontologia – Área de Concentração:
Biologia Oral) - Universidade do Sagrado Coração - Bauru - SP 1. Produtos naturais. 2. Joannesia princeps. 3. Atividade antimicrobiana. 4. Citotoxicidade. I. Weckwerth, Paulo Henrique. II.
Vieira, Daniela Cristina de Macedo. III. Título.
Elaborado por Lidyane Silva Lima – CRB-8/9602
MARIA SILVANA TOTTI DA COSTA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS HIDROETANÓLICOS DE Joannesia princeps (EUPHORBIACEAE)
Tese apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biologia Oral. Área de concentração: Biologia Oral. Orientação do Prof. Dr. Paulo Henrique Weckwerth e Co- orientação do Prof. Dr. Jorge Kleber Chavasco (in memoriam) e Profª Drª Daniela Cristina de Macedo Vieira.
Banca Examinadora:
________________________________________________
Prof. Dr. Paulo Henrique Weckwerth Universidade do Sagrado Coração - USC
_______________________________________________
Profa. Dra. Márcia Aparecida Nuevo Gatti Universidade do Sagrado Coração - USC
_______________________________________________
Profa. Dra. Solange de Oliveira Braga Franzolin Universidade do Sagrado Coração - USC
_______________________________________________
Profa. Dra. Karla Panice Pedro Universidade Nove de Julho - UNINOVE
_______________________________________________
Profa. Dra. Patrícia Pinto Saraiva Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE
Bauru, 18 de setembro de 2018
Dedico este trabalho a Deus, fonte de toda sabedoria e proteção na minha vida. Aos meus filhos Josie, José Marcos, Igor e Ivan, genro e noras e aos meus netos Maximilliam, Isabela e Luísa.
AGRADECIMENTOS
Aos docentes e ao pessoal administrativo da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós- Graduação da Universidade do Sagrado Coração USC – Bauru, pela forma ética e respeitosa com que fui acolhida, representados pela Dra Sandra de Oliveira Saes, Pró- Reitora do Programa de Pós-Graduação da USC e Dra Patrícia Pinto Saraiva, Coordenadora do Programa de Mestrado e Doutorado em Biologia Oral.
À Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL-MG, onde trabalho como docente por mais de 30 anos, por permitir meu afastamento e disponibilizar os laboratórios e recursos materiais necessários para a realização desta pesquisa.
Ao Prof. Dr. Jorge Kleber Chavasco (in memoriam), que esteve como docente da UNIFAL-MG por 42 anos, na maior parte como Professor Titular em Microbiologia.
Registro meu agradecimento especial pelo incentivo inicial e a transmissão da segurança e confiança necessárias para me decidir por esse tema. A elaboração do projeto e a fase experimental de pesquisa foi inteiramente orientada e conduzida pelo Prof. Chavasco, como é conhecido.
À Dra Patrícia Pinto Saraiva, Odontóloga, Doutora em Fisiopatologia em Clínica Médica, na ocasião integrante do corpo docente da USC-Bauru, merece meu profundo reconhecimento, uma vez que prontamente se ofereceu para ser minha orientadora e pela forma profissional e compreensiva com que sempre me tratou.
À Dra Daniela Cristina de Macedo Vieira, Farmacêutica, Pós doutora em Biologia Molecular aplicada à Microbiologia, compõe o corpo docente da UNIFAL-MG, que na falta do Prof. Chavasco, em janeiro do corrente ano, não hesitou em aceitar o desafio da co-orientação desta pesquisa. Não foi fácil, mas com seu compromisso e conhecimento científico resgatamos todos os métodos utilizados e os resultados obtidos através de anotações, fotos e vídeos.
Ao Prof. Dr Paulo Henrique Weckwerth, Biólogo, Doutor em Doenças Tropicais e Pós-Doutorado em Ciências Odontológica, integrante corpo docente da USC Bauru, por ter aceitado assumir a orientação desta pesquisa e pela forma sempre assertiva e decisiva com que conduziu as orientações após o impedimento da Dra Patrícia, meu mais sincero reconhecimento e gratidão.
Às diretoras da Escola de Enfermagem, Dra Eliza Maria Rezende Dázio e Dra Maria Betânia Tinti de Andrade e à coordenadora do Curso de Enfermagem Dra Roberta Seron Sanches pela compreensão em viabilizar os afastamentos mensais para o cumprimento de créditos no Programa de Pós-Graduação da USC-Bauru. Agradeço o empenho quanto ao plano de compensação de horas, conciliando as atividades docentes sem o prejuízo dos alunos nas disciplinas sob minha responsabilidade.
À Profa Dra Adriana Olimpia Barbosa Felipe, docente da Escola de Enfermagem da UNIFAL-MG, pela contribuição na fase de busca nas bases de dados de referências atualizadas que fundamentaram este estudo.
Ao Prof. Dr. Leonardo Augusto de Almeida, Chefe do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da UNIFAL-MG, pela autorização do uso do Laboratório de Microbiologia e Imunologia e o consumo dos reagentes e insumos necessários ao desenvolvimento do presente estudo.
Ao Prof. Dr. Luiz Felipe Leomil Coelho, Biólogo, doutor em Ciências Biológicas (Microbiologia) pela orientação na realização dos Testes de Avaliação da Citotoxicidade dos extratos de J princeps sobre cultura de células BHK-21.
Ao Farmacêutico, doutorando Renan Gomes Bastos, do Programa de Pós- Graduação em Farmacologia da UNIFAL-MG e também orientando do Prof. Chavasco, que na ocasião dos testes microbiológicos desenvolvia experimentos laboratoriais com outros extratos vegetais, pelo companheirismo e contribuição no preparo das placas e na leitura dos resultados.
Aos professores Fábio de Souza Terra, Murilo César do Nascimento, Sueli Leiko Takamatsu Goyatá e Zélia Marilda Rodrigues Resck, colegas, professores doutores integrantes do Programa de Pós-Graduação da Escola de Enfermagem da UNIFAL- MG, por estarem sempre disponíveis para sanar quaisquer dúvidas durante todo o desenvolvimento desta tese de doutorado.
RESUMO
A comprovação das atividades antimicrobianas de inúmeros produtos naturais e a necessidade de fármacos economicamente aceitáveis e potentes contra micro- organismos resistentes aos antibióticos sintéticos são necessárias. O uso da fitoterapia é milenar e a utilização de plantas medicinais para tratar doenças tem sido pouco explorada. A planta Joannesia princeps (Euphorbiaceae) apresenta muitas atividades biológicas, sendo suas sementes utilizadas na medicina popular como purgante. Este estudo teve como objetivo, pesquisar a atividade antimicrobiana em extratos hidroetanólicos das folhas, do caule e das sementes de J. princeps sobre diferentes linhagens de micro-organismos, como também desenvolver metodologias laboratoriais utilizadas para testes de avaliação da atividade antimicrobiana. Foi determinada a atividade antimicrobiana, a inibição da formação de biofilme por candidas e a citotoxicidade dos extratos em cultura celular. O extrato das folhas de J. princeps apresentou atividade antimicrobiana para 12 das 21 cepas testadas e se mostrou efetivo contra três leveduras isoladas. O extrato do caule de J. princeps apresentou atividade antimicrobiana apenas contra o M luteus (ATCC 10240), enquanto que o extrato das sementes apresentou ausência de atividade sobre os micro-organismos testados. Os extratos de J. princeps, não inibiram a formação de biofilme por nenhuma espécie de Candida isolada. Os testes mostraram toxicidade dos extratos contra células BHK-21. Este estudo mostrou importante atividade antimicrobiana dos extratos das folhas de J. princeps mesmo numa concentração máxima 12,5 mg/mL, portanto, vale cogitar a realização de outros estudos utilizando concentrações mais elevadas.
Palavras-chaves: Produtos naturais. Joannesia princeps. Atividade antimicrobiana.
Citotoxicidade.
ABSTRACT
Evidence of the antimicrobial activity of innumerable natural products and the need for economically acceptable and potent drugs against microorganisms resistant to synthetic antibiotics are required. The use of herbal medicine is millenarian and the use of medicinal plants to treat diseases has been little explored. The plant Joannesia princeps (Euphorbiaceae) presents many biological activities, being its seeds used in popular medicine like purgative. The objective of this study was to investigate the antimicrobial activity of hydrotheranic extracts of leaves, stem and seeds of J. princeps on different strains of microorganisms, as well as to develop laboratory methodologies used for the evaluation of antimicrobial activity. Antimicrobial activity, the inhibition of biofilm formation by candidas and the cytotoxicity of extracts in cell culture were determined. The extract of the leaves of J. princeps presented antimicrobial activity for 12 of the 21 strains tested and was effective against three isolated yeasts. The extract of the stem of J. princeps presented antimicrobial activity only against M luteus (ATCC 10240), whereas the extract of the seeds showed absence of activity on the microorganisms tested. Extracts of J. princeps did not inhibit biofilm formation by any single Candida species. The tests showed toxicity of the extracts against BHK-21 cells.
This study showed an important antimicrobial activity of leaf extracts of J. princeps even at a maximum concentration of 12.5 mg / mL, so it is worthwhile to consider other studies using higher concentrations.
Keywords: Natural products. Joannesia princeps. Antimicrobian activity. Cytotoxicity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ilustrações da planta Joannesia princeps ... 19
Figura 2 Preparo dos extratos da planta de J. princeps ... 25
Figura 3 Micro-organismos usados na pesquisa... 26
Figura 4 Teste de difusão em ágar ... 28
Figura 5 Leitura dos halos de inibição ... 28
Figura 6 Filtragem dos extratos ... 29
Figura 7 Preparo da microplaca para CIM ... 30
Figura 8 Microplaca preparada para determinação da CIM ... 31
Figura 9 Leitura visual das microplacas de CIM ... 31
Figura 10 Leitura óptica por espectofotometria ... 32
Figura 11 Determinação da Concentração Microbicida Mínima ... 33
Figura 12 Preparo para teste de formação de biofilme ... 34
Figura 13 Lavagem das placas no teste de inibição da formação de biofilme.. 34
Figura 14 Uso do corante Cristal Violeta... 35
Figura 15 Microplaca preparada para cultura de célula BHK-21... 37
Figura 16 Figura 16 Placa de Concentração Microbicida Mínima do M. luteus... 42
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Média e desvio padrão dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano pelo teste de difusão em poço, em mm, dos extratos de Joannesia princeps contra os micro-organismos testes... 39 Tabela 2 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Microbicida
Mínima, em mg/mL, dos extratos de Joannesia princeps sobre micro-organismo... 41 Tabela 3 Resultado da citotoxicidade dos extratos de Joannesia princeps
sobre cultura de células BHK-21 (CC50 em mg/mL)... 43
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 13
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 15
2.1 IMPORTÂNCIA DOS PRODUTOS NATURAIS ... 15
2.2 Joannesia princeps (EUPHORBIACEAE) ... 16
2.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS VEGETAIS ... 19
3 OBJETIVOS ... 22
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 23
4.1 OBTENÇÃO E CADASTRAMENTO DA PLANTA ... 23
4.2 PREPARO DOS EXTRATOS DA PLANTA ... 23
4.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS ... 24
4.3.1 Teste de difusão em ágar ... 26
4.3.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima e Concentração Microbicida Mínima ... 28
4.3.3 Teste de Inibição da formação de biofilme por Candida ... 32
4.4 AVALIAÇÃO DA CITOTOXIDADE DOS EXTRATOS SOBRE CULTURA DE CÉLULAS BHK-21... 35
5 RESULTADOS ... 37
5.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS ... 37
5.1.1 Difusão em ágar ... 37
5.1.2 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Microbicida Mínima. 39 5.1.3 Teste de inibição da formação de biofilme por Candida ... 42
5.2 AVALIAÇÃO DA CITOTOXIDADE DOS EXTRATOS SOBRE CULTURA DE CÉLULAS BHK... 42
6 DISCUSSÂO ... 43
6.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS ... 43
6.1.1 Difusão em ágar ... 43
6.1.2 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Microbicida Mínima 44 6.1.3 Teste de inibição da formação de biofilme por Candida ... 44
6.2 AVALIAÇÃO DA CITOTOXIDADE DOS EXTRATOS SOBRE CULTURA DE CÉLULAS BHK ... 45
7 CONCLUSÃO ... 47
REFERÊNCIAS ... 48 APENDICE A – Autorização para uso do Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Universidade Federal de Alfenas UNIFAL-MG... 54
1 INTRODUÇÃO
Apesar do grande número de medicamentos sintéticos criados continuamente pelo homem em laboratórios e da manipulação constante de novos elementos e inovações tecnológicas, a maior parte dos fármacos tem suas origens diretamente relacionadas ao ambiente natural, sendo o mundo vegetal uma fonte abundante de moléculas e genes extremamente importantes1.
O uso de fitoterápicos tornou-se crescente nos últimos tempos devido à adesão da população aos produtos de origem natural e à insatisfação com relação ao custo e à segurança da medicina convencional2. Desta forma, novas pesquisas objetivando o desenvolvimento de formulações farmacêuticas a partir de matérias- primas vegetais que tenham eficácia e segurança comprovadas, tem sido desenvolvidas por vários pesquisadores1,3,4,5,6.
Sabe-se que, em geral, os micro-organismos tem a habilidade de adquirir e transmitir, geneticamente, resistência às drogas utilizadas como agentes terapêuticos, e que vem crescendo a cada dia o número de micro-organismos multirresistentes. Portanto, a perspectiva para o uso de antibióticos é indefinida7,8. Dessa maneira, o estudo de plantas com possíveis atividades antimicrobianas é de grande importância para sua aplicação na produção de medicamentos, além da exploração sustentável da vasta biodiversidade brasileira9.
A planta Joannesia princeps, mais conhecida popularmente como Cutieira, Boleira e Andá-açu, é uma árvore pertencente à família Euphorbiaceae e gênero Joannesia, de origem no Pará, região sudeste e região nordeste. É também cultivada em regiões tropicais da África e Ásia10.
Os frutos possuem 37% de óleo, sendo úteis para fins medicinais e industriais, como a produção de verniz e lubrificante11. Na medicina popular, as sementes desta planta são usadas como medicamento pelo forte poder purgativo.
Se usadas em maior quantidade podem ser maléficas12.
A presente pesquisa foi proposta considerando a importância de estudos relacionados à comprovação das propriedades medicinais de produtos naturais; a extensa flora medicinal do Brasil; a inegável comprovação das atividades antimicrobianas de inúmeros produtos naturais; a necessidade de fármacos economicamente aceitáveis e potentes contra micro-organismos resistentes aos
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antibióticos sintéticos atuais; a evidência das propriedades antimicrobianas das plantas da família Euphorbiaceae e, principalmente, o fato de haver apenas um estudo relacionado aos efeitos antimicrobianos da planta Joannesia princeps.
Este trabalho procurou proporcionar, conhecimento dos possíveis benefícios de extratos das folhas, caule e sementes de Joannesia princeps sobre o crescimento microbiano, o desenvolvimento de metodologias laboratoriais a serem utilizadas futuramente para testes de atividade antimicrobiana e da avaliação da citotoxicidade.
2 REVISÃO DE LITERATURA
1.1 IMPORTÂNCIA DOS PRODUTOS NATURAIS
A prática de usar plantas, suas partes ou extratos como compostos para fins medicinais são conhecidas desde a antiguidade, tendo sido documentado principalmente em livros e, ultimamente, em uma enorme quantidade de sites2. Plantas medicinais tem sido utilizadas em muitas culturas durante milhares de anos e informações sobre o uso de recursos naturais tem desempenhado um papel vital na descoberta de novos produtos a partir de plantas como agentes terapêuticos.
Uma grande parte da população mundial, especialmente os países em desenvolvimento, depende do sistema tradicional de medicina para o tratamento de uma variedade de doenças infecciosas4.
Arrais et al. (2014)13 reforçam que a descoberta de agentes antimicrobianos para o tratamento de infecções que envolvem micro-organismos resistentes é altamente desejável, no entanto, também é uma tarefa difícil. De fato, embora haja esforços paralelos para resolver as ameaças globais à saúde pública, representada pela resistência antimicrobiana e falta de desenvolvimento de novos agentes, a urgência de resultados mais eficazes é ainda exigida.
As propriedades antimicrobianas de substâncias extraídas de plantas medicinais vêm sendo comprovadas pela ciência, conforme pesquisas realizadas em vários países, entre eles o Brasil. Os compostos derivados do metabolismo secundário de espécies vegetais são importantes para a defesa e funcionamento das plantas e podem ser úteis para o homem como coadjuvante na proteção e cicatrização dos tecidos14.
A avaliação do uso de extratos de plantas tem sido estimulada pelo crescimento mundial da fitoterapia em programas preventivos e curativos, uma vez que apresentam custo mais acessível à população e aos serviços públicos de saúde15, menor toxicidade, maior atividade farmacológica e biocompatibilidade1.
São poucos os profissionais que utilizam a fitoterapia como alternativa para o tratamento das diferentes patologias. Programas de incentivo e capacitação dos profissionais ao uso dos diferentes fitoterápicos deveriam ser metas prioritárias dentro das políticas públicas de cada município, além de programas educativos específicos voltados para o uso consciente e racional das plantas, tanto para
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usuários como para aqueles que as comercializam. A inclusão da fitoterapia como disciplina obrigatória nos diferentes cursos da saúde, também forneceriam subsídios necessários para a expansão dessa nova prática terapêutica16.
Lachkar et al. (2016)17 demonstraram claramente que a alfarroba (Ceratinia siliqua L) exerce propriedades anti-inflamatórias proeminentes que são comparáveis com Indometacina, uma potente droga anti-inflamatória. As vagens maduras de alfarroba fornecem comida para humanos e animais e os extratos são tradicionalmente extraídos com água fervente depois de serem esmagadas. O extrato filtrado é evaporado para uma pasta viscosa e doce. Além de seu valor nutricional, esta pasta tem qualidades anti-inflamatórias tradicionais e comprovadas, especialmente sobre as inflamações.
1.2 Joannesia princeps (EUPHORBIACEAE)
A família Euphorbiaceae, uma das maiores famílias botânicas, oferece grande potencial de aproveitamento, com mais de 1 100 espécies nativas ou aclimatadas no Brasil. As espécies de Euphorbiaceae tem grande destaque na atividade econômica, através da alimentação humana e na medicina a partir do conhecimento popular.
Especialmente por abrigar gêneros como a seringueira (Hevea Aublet), nativa da floresta amazônica de onde se extrai o látex usado para a manufatura de borracha natural e a mandioca (Manihot Mill.), fonte primária de alimento (amido) em boa parte do nordeste brasileiro e sua farinha consumida em larga escala em todo o país18,19.
Inúmeros pesquisadores comprovaram a atividade antimicrobiana de extratos de plantas da família Euphorbiaceae, entre eles Ndam et al. (2016)20 realizaram a análise fitoquímica, antimicrobiana e atividades antioxidantes de Euphorbia golondrina que demonstraram atividade contra micro-organismos de interesse patogênico humano. No entanto, não obeservaram atividade contra Penicilium e Aspergilus e que o extrato também mostrou propriedades antioxidantes significativas, indicativas de seu potencial como fonte para uso medicamentoso.
Estudo de Voukeng et al. (2017)21 sobre as atividades antibacterianas do extrato metanólico, frações e compostos de Elaeophorbia drupifera (Thonn.) encontraram que a fração mais ativada da planta apresentou atividade antibacteriana em 26 bactérias testadas incluindo tanto Gram negativos quanto
Bactérias Gram positivas. Concluiram que essa fração poderia, portanto, ser útil no manejo da infecção bacteriana.
Torna-se relevante mencionar o estudo de Sousa et al. (2018)22 que, em pesquisa de interesse na obtenção de biomaterial alternativo para enxerto ósseo de uso em odontologia, investigaram a influência do poliuretano vegetal granulado (Poliquil®), derivado do óleo de mamona (Ricinus communis - Euphorbiaceae) no processo de reparo de defeitos ósseos. Encontraram nos experimentos, tanto macroscopicamente como microscopicamente, a influência do poliuretano no defeito ósseo, demonstrando a capacidade osteocondutora do produto estudado.
Joannesia princeps (Euphorbiaceae) tem como nomenclatura popular Cutieira, Boleira e Andá-assu. O nome Andá-açu ou Andá-assu, do tupi guarani, significa “fruto grande que dá óleo”. É encontrada desde a Bahia, até o Paraná, principalmente na floresta pluvial da encosta atlântica e ainda em Minas Gerais.
Também é encontrada no paisagismo urbano onde é muito comum. Tem como características: árvore de médio a grande porte, 15 a 30 metros de altura; folhas compostas pinadas, 5 a 6 folíolos, até 20 cm; floração branca, em cachos, muito pequena; fruto com 10 cm de diâmetro, polpa externa relativamente macia e endocarpo resistente, é necessário quebrar o endocarpo e extrair as sementes, contém duas a três sementes por fruto de 2 a 3 cm de diâmetro. Sua perpetuação nos ecossistemas depende de pequeno roedor – a Cutia (Dasyprocta agouti) que abre a planta, come uma das sementes e enterra as outras para comer depois, daí o nome Cutieira10 (Fig. 1).
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Figura 1 - Ilustrações da planta J. princeps
Fonte: Google.com/serch?q=Jannesia+princeps&tbm=isch
Vários autores comprovaram o poder purgativo das sementes de J.
princeps12,23,24,25
. Outras utilidades também foram atribuídas à planta, tais como, o combate a perturbações menstruais, febre perniciosa, sífilis, escrofulose, inchaço, inflamação e atividade antimicrobiana23,26; atividades antinociceptiva e antiedematogênica37. Segundo Trancoso et al. (2014)27 o óleo das sementes melhora o fechamento de feridas cutâneas e Araújo et al. (2016)25 apontam seu o poder cicatricial sobre a mucosa do intestino grosso em camundongos, indicando que pode ser útil no tratamento e prevenção da constipação intestinal.
Sousa et al. (2007)23, em estudo sobre o efeito laxante, inibição de crescimento bacteriano e toxidez das sementes de J. princeps comprovaram o uso popular da semente como laxante, demonstraram o potencial das atividades biológicas e toxidez para A salina. Quanto à atividade antimicrobiana foi observado que todas as amostras bacterianas testadas foram inibidas pelo extrato metanólico e fração residual na concentração de 25 mg/mL. Nesta mesma concentração, verificou-se que as frações hexânica, diclorometânica, em acetato de etila e butanólica foram ativas frente S. aureus. As frações hexânica e diclorometânica também inibiram o crescimento de Streptococcus mutans e Salmonella typhimurium.
Entre os estudos que identificam a constituição química da J. princeps Waibel et al. (2003)28 isolaram neognanos de extratos metabólicos das sementes;
duas unidades de ácido linoléico e uma unidade de ácido oleico nas sementes de J.
princeps foi identificado por Berty, Gonçalves, Silva (2011)29. Sousa et al. (2007)23 encontraram flavonóides, taninos, cumarinas, terpenóides, esteróides e alcalóides no extrato etanólico de J. princeps. E, mais recentemente, pela análise fitoquímica de extratos etanólicos e aquosos de sementes de J. princeps, foram encontrados a presença de alcalóides, triterpenos e esteróides35.
1.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS VEGETAIS
A determinação da atividade antimicrobiana de extratos vegetais é o primeiro passo importante para testar as atividades biológicas da planta. Quando um extrato inteiro é usado, há uma chance de sinergismo entre componentes ativos que podem ser perdidos quando cada um desses componentes está isolado2. Tal sinergismo foi descoberto em vários testes medicinais, incluindo aqueles para atividade anti- inflamatória30,31. No contrário, a mistura de compostos diferentes pode também levar a efeitos inibitórios, ou seja, que um componente pode reduzir a atividade biológica do outro. De acordo com esta suposição, alguns estudos mostraram que a atividade anti-inflamatória de compostos puros (como amentoflavone, pseudo-hiperperina e hiperforina isoladas a partir de extratos de Hypericum perforatum) é maior que a dos extratos32.
A avaliação da atividade antimicrobiana pelo teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um método físico, no qual um micro- organismo é desafiado contra uma substância biologicamente ativa em meio de cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento do micro- organismo desafiado com a concentração da substância ensaiada33.
A aplicação do método de difusão se limita a micro-organismos de crescimento rápido, sendo eles aeróbios ou aeróbios facultativos. A avaliação é comparativa frente a um padrão biológico de referência (controle positivo) e a zona ou o halo de inibição de crescimento é medida partindo-se da circunferência do disco ou poço, até a margem onde há crescimento de micro-organismos34. Como controle positivo, emprega-se um quimioterápico padrão, e como controle negativo o solvente utilizado para a dissolução dos extratos35,36.
20
Os testes laboratoriais de sensibilidade aos antimicrobianos são indicados para qualquer micro-organismo que cause um processo infeccioso e exija uma terapia antimicrobiana associada a ele e o método da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) é o mais indicado. Neste ensaio, que é realizado in vitro, inicialmente são feitas microdiluições sucessivas das amostras a serem analisadas, em meios de cultura sólidos ou líquidos. Em seguida, fazem-se semeaduras do micro-organismo a ser testado e será incubado a temperaturas definidas, para verificar a menor concentração do composto que inibiu o crescimento microbiano. A avaliação é sempre comparada frente a um padrão de referência37.
Após incubação, o crescimento do micro-organismo pode ser determinado de três formas: pela leitura visual direta, leitura turbidimétrica com uso de espectrofotômetro em comprimentos de onda apropriados ou através da análise da viabilidade celular por corantes indicadores, como a resazurina38,39. As vantagens deste método são: proporcionar mais informações quantitativas, poder ser aplicado a uma variedade mais ampla de compostos, requer uma pequena quantidade de amostra, apresenta custo baixo e gerar alta reprodutibilidade e sensibilidade e possibilita um registro permanente40.
Awouafack et al. (2013)41, entre outros autores, relataram que os extratos vegetais ou frações avaliadas usando microdiluição tem promissor potencial inibidor de demonstrar atividade antimicrobiana e serão consideradas fontes promissoras para busca de novas substâncias com ação antimicrobiana.
Outro método usado na avaliação da atividade antimicrobiana de uma substância é a avaliação da capacidade de inibição da formação de biofilmes.
Segundo Wakimoto et al. (2004)42, a inibição do biofilme poderia ser testada utilizando microplacas para cultivo celular juntamente com extratos. Com esta técnica foi testado a inibição da formação do biofilme de espécies de Candida com extratos vegetais da folha, caule e semente de J. princeps.
A técnica do CV (solução Cristal Violeta em meio aquoso) no teste de avaliação da formação de biofilme constitui na lavagem dos poços para remoção das células livres, seguida da adição de 200 μL de metanol para fixação das células aderidas (permanência por 15 minutos), adição de 200 μL do CV, lavagem com água destilada e uso de ácido acético a 33% (200 μL) para leitura de densidade óptica do biofilme43. O inóculo livre de tratamento é o controle positivo (100% de aderência). O CV é um corante básico que se liga a moléculas de superfície e polissacarídeos de
carga negativa presentes na matriz extracelular44. Esta técnica tem a propriedade de mensurar a quantidade de biomassa formada (matriz) e não a viabilidade celular. A intensidade da coloração arroxeada varia de acordo com a quantidade de biomassa aderida, ou seja, quanto mais biomassa, mais intensa a coloração.
Barbieri et al. (2014)45 em seus estudos com extratos de C. urucurana, confirmaram atividade para inibição de biofilme de C. albicans. No entanto, concentrações muito altas foram necessárias para alcançar atividade antiaderente, principalmente para inibir a formação in vitro de biofilme de C. albicans. Entretanto, os micro-organismos que constituem os biofilmes, em geral, apresentam características fenotípicas diferentes, tais como diferenças de sensibilidade aos antifúngicos e maior resistência frente às defesas do hospedeiro.
No processo de desenvolvimento de novas drogas a avaliação da citotoxicidade é uma etapa essencial, pois, permite determinar a concentração a ser utilizada e fornece dados importantes quanto aos possíveis danos celulares. Para ser aprovada no teste de citotoxicidade, a substância analisada não deve provocar a morte das células nem afetar as funções celulares. Por meio da utilização de técnicas de cultura de células, os testes de citotoxicidade podem revelar a ocorrência de danos como lise celular e inibição do crescimento das células46.
É importante calcular a Concentração Citotóxica para 50% das células (CC50), pois a partir deste achado torna-se possível calcular o Índice de Seletividade (IS), que mede o quanto um composto é ativo contra o micro-organismo sem causar dados à viabilidade das células de mamíferos. O IS é obtido, então, dividindo-se o CC50 pelo CIM: quanto maior for esta razão, mais seletiva é a droga sobre o micro- organismo e, consequentemente, menor efeito ela tem sobre a célula hospedeira de mamífero. Valores superiores a um serão considerados promissores para a seleção dos extratos para estudos posteriores47.
22
3 OBJETIVOS
- Pesquisar a atividade antimicrobiana de extratos hidroetanólicos de Joannesia princeps sobre diferentes linhagens de micro-organismos.
- Desenvolver metodologias laboratoriais utilizadas para testes de avaliação da atividade antimicrobiana e de citotoxicidade de extratos vegetais.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 OBTENÇÃO E CADASTRAMENTO DA PLANTA
As amostras de caule, folha e semente do fruto de Joannesia princeps foram coletadas na cidade de Campo Belo Minas Gerais (MG) em 12 de fevereiro de 2012 em Latitude -21.088739 e Longitude 45.598369 (Google Earth). Após a coleta, a planta foi identificada pelo Prof. Dr. Walmir Gomes Ferreira Jr. do Instituto Federal do Sul de Minas – Machado-MG, cadastrada e arquivada no Herbário da Universidade Federal de Alfenas, recebendo o número 1744.
4.2 PREPARO DOS EXTRATOS DA PLANTA
As partes da planta (caule, folha e semente) foram lavadas em água corrente e cortadas manualmente com auxílio de uma faca de metal. Foram preparados extratos hidroetanólicos a 20% (m/v), utilizando álcool etílico a 70% (v/v). Os extratos preparados foram macerados por sete dias e mantidos ao abrigo da luz, com agitação diária. Após maceração, os extratos foram filtrados em filtro de “nylon” e em seguida, em filtro de papel. Posteriormente, os extratos foram submetidos à concentração em rotaevaporador à pressão negativa de 500 mm/Hg e temperatura de 60oC. Após a concentração, foram distribuídos 5 mL em cada frasco de vidro, liofilizados e congelados. Os frascos foram pesados antes da liofilização para determinar a massa do extrato em mg/mL. A concentração foi ajustada a 50 mg/mL (p/v)48 (Fig 2).
24
Figura 2 - Preparo dos extratos de J. princeps: a) Rotaevaporador; b) Liofilizador e c) Amostras do extrato distribuídos em 5 vidro para cada tipo, folha, caule e sementes
Fonte: Da autora
4.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS
Os micro-organismos utilizados neste experimento foram escolhidos por serem responsáveis por várias formas de infecções em humanos e adquirirem, com mais frequência, resistência aos antimicrobianos.
Os testes microbiológicos foram realizados no Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Universidade Federal de Alfenas-MG, UNIFAL-MG (APENDICE A).
Foram utilizadas 14 cepas de bactérias e sete leveduras: Bacillus cereus ATCC 11778, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bordetella bronchiseptica ATCC 4617, Enterobacter cloacae LMI-UNIFAL, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 8739, Kocuria rizophila ATCC 9341, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Micrococcus luteus ATCC 10240, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella tiphymurium ATCC 14028, Serratia marcescens LMI-UNIFAL, Staphylococcus aureus ATCC 0538, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 e Candida albicans ATCC 10231, Candida albicans ATCC 9543, Candida albicans SC 5314, Candida glabrata ATCC 90030, Candida parapsilosis ATCC 22019, Candida tropicalis ATCC 750 e Saccharomyces cerevisae ATCC 6538 (Fig 3).
a b c
Figura 3 - Micro-organismos usados na pesquisa
Fonte: Da autora
Todos os micro-organismos testados fazem parte da coleção microbiana do Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL-MG.
26
4.3.1 Teste de difusão em Ágar
A atividade antimicrobiana foi avaliada por difusão em ágar segundo metodologia definida nos documentos M7A637 para bactérias e M44A249 e M27A350 para leveduras, com algumas modificações propostas por Silva et al. (2010)48. Para as bactérias foi utilizado o Ágar Müeller Hinton (Himedia®) e para as leveduras o Ágar Müeller Hinton (Himedia®) adicionado de 2% de glicose.
Os micro-organismos foram inoculados na superfície do meio de cultura, em placa de Petri (20 por 100 mm), perfuradas para obtenção de poços de aproximadamente de 4 mm de diâmetro e 4 mm de profundidade, depois de padronizados em solução salina com turvação correspondente ao tubo 0,5 da escala de Mac Farland para as bactérias e tubo 1,0 para as leveduras.
Após, 40 µL das amostras dos extratos (na concentração de 50 mg/mL) foram colocados nos poços. Também foram feitos os controles positivo (solução de Clorexidina a 0,12%) e negativo (água destilada).
Após a incubação, foi feita a leitura dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano com o auxílio de uma régua milimetrada. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e o desvio padrão foi calculado.
As figuras 4 e 5 ilustram a sequência da técnica da difusão em poço utilizada no presente estudo para avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos de Joannesia princeps.
Figura 4 - Teste de difusão em ágar: a) Preparo do meio de cultura; b) Meio de cultura e Placas de Petri estéreis; c) Suspensão de micro-organismos; d) Inoculação do M.O. na placa perfurada e identificada para o M.O.
correspondente; e) Extratos, placas e controles e f) Placas em incubação
Fonte: Da autora
Figura 5 - Leitura dos halos de inibição: a) Placas após incubação; b) Medição dos halos de inibição de crescimento
Fonte: Da autora
a b
28
4.3.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima e Concentração Microbicida Mínima
Os extratos foram submetidos ao teste de determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de microdiluição em caldo conforme metodologia proposta nos documentos M27A350, M7A637 e M27-A2151 suplementada por M27- S452. Foram utilizadas placas de 96 poços. Os extratos diluídos em água na concentração de 50 mg/mL, esterilizados em membrana 0,45 µm (Figura 6), foram diluídos no caldo Müeller Hinton em microplaca, a partir da concentração de 12,5 mg/mL até 0,20 mg/mL.
Figura 6 - Filtragem dos extratos: a) Esterilização por filtragem dos extratos em membrana de 45 µm; b) Extratos identificados e esterilizados
Fonte: Da autora
Para o preparo das placas um volume de 100 µL de Caldo Müeller Hinton duas vezes concentrado foi adicionada em cada poço da coluna 1 da microplaca. Os poços das colunas restantes receberam 100 µL de Caldo Müeller Hinton. Após, 100 µL das amostras dos extratos (na concentração de 50 mg/mL) foram colocados nos poços da coluna 1, sendo linha A e B Folha; linha C e D Caule e linha F e G Semente, conforme ilustrado na figura 7 e 8.
a b
Figura 7 - Preparo da microplaca para Concentração Inibitória mínimo (CIM): a) Depósito de Caldo Müeller Hinton; b) Depósito de extrato nos poços da microplaca; c) Microdiluição seriada e d) Adição do micro- organismo.
Fonte: Da autora.
Foram adicionados poços de controle: controle de crescimento, meio de cultura mais inóculo (CC) e controle de esterilidade, meio de cultura mais extrato (CEE) e controle de esterilidade do meio, meio de cultura sem inóculo (CEM). Então, foi iniciada uma série de diluições (1:2) até a sétima diluição (Figura 7c). Foram inoculadas alíquotas de 10 μL da solução de micro-organismo teste em cada poço das placas contendo ágar nutriente (Fig 7d).
Portanto, 100 μL dos extratos a 50 mg/mL foi acrescentado a 100 μL de meio de cultura (2 x concentrado) que já estava no poço. Isto fez com que o extrato ficasse numa concentração de 25 mg/mL. Quando se acrescenta mais 100 μL para a microdiluição seriada, o extrato fica com 12,5 mg/mL na coluna 1.
a b
c d
30
Figura 8 - Microplaca preparada para determinação da CIM: Onde: J1) E. folha; J2) E. sementes; J3) E. caule;
CC) Controle de crescimento; CEM) Controle de Esterilidade do Meio e CEE) Controle de Esterilidade do Extrato
Fonte: Da autora.
As placas foram incubadas por 24 horas, a 37ºC para bactérias e 48 horas a 25oC para as leveduras. Foi realizada a leitura visual, observando a inibição ou crescimento bacteriano pela turvação do meio de cultura (Fig 9).
Figura 9 - Leitura visual das microplacas de CIM: a) Caixa de isopor para leitura visual idealizada pelo Prof. Chavasco (UNIFAL-MG); b) Placa visualizada através da caixa de isopor.
Fonte: Da autora
a b
Após a leitura visual, foram adicionados 15 µL do corante resazurina (0,01%
m/v em solução aquosa esterilizada) para identificar os poços com crescimento bacteriano. Nos poços onde não houve mudança de cor do corante foi considerado ausência de bactérias viáveis. Após 4 h de reincubação, a leitura foi realizada pelo Espectofotômetro (Fig 10).
A resazurina facilita verificar a presença de crescimento microbiano, a coloração azul indica ausência de crescimento microbiano, enquanto a cor vermelha indica a presença de células viáveis em crescimento.
Figura 10 - Leitura óptica por espectofotometria: a) Revelador resazurina e b) Teste Elisa realizado pelo espectofotômetro
Fonte: Da autora
A concentração microbicida mínima (CMM) foi realizada com base nos resultados da CIM, utilizando-se as suspensões provenientes dos poços das placas após leitura visual, antes da adição de resazurina. Alíquotas de 10 μL de cada poço foram inoculadas em placas contendo ágar nutriente. Após a incubação por 24 horas a 37°C, a CMM foi considerada a menor concentração na qual não houve crescimento visível no ágar. Os testes difusão em Ágar, CIM e CMM foram realizados em triplicata (Fig 11).
a b
32
Figura 11 - Determinação da Concentração Microbicida Mínima: a) Preparo da placa e b) Esquema para determinação de CMM
Fonte: Da autora Fonte: Labc - HSP
4.3.3 Teste de inibição da formação de biofilme por espécies de Candida
Foram avaliadas as atividades inibitórias dos extratos hidroetanólicos da folha, semente e caule de J. princeps na formação de biofilme por seis espécies de Candida, são elas: Candida albicans, ATCC 10231, Candida albicans ATCC 9543, Candida albicans SC 5314, Candida parapsilosis ATCC 22019, Candida tropicalis ATCC 750, Candida glabrata ATCC 90030. Os isolados das espécies de Candida foram oriundos de pacientes com candidose eritematosa, mantidos na micoteca do Laboratório de Micologia do Instituto de Ciências Biológicas da USP, em São Paulo.
As amostras foram mantidas em Ágar Sabouraud dextrose.
Para a realização dos testes foram utilizados os extratos previamente preparados, liofilizados e esterilizados da folha, caule e semente de J. princeps.
Estes foram utilizados em concentrações decrescentes em meio de cultura Caldo Sabouraud Dextrose 2 vezes concentrado em microplacas de 96 cavidades próprias para cultivo celular e incubadas juntamente com a amostra da levedura. As diluições foram realizadas na concentração de 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39 e 0,2 mg/mL.
As microplacas foram incubadas a 37ºC por 96 horas em estufa sob agitação (F 12).
a b
Figura 12 - Preparo para teste de inibição da formação de biofilme:
a) Candidas selecionadas para os testes de inibição de formação de biofilme; b) Placas preparadas para incubação; c) Estufa incubadora com agitação
Fonte: Da autora
Após o tempo de incubação o meio de cultura foi removido cuidadosamente e os poços foram lavados com água destilada por duas vezes para remoção de células não aderidas e em seguida lavadas com álcool a 96°GL (Fig 13).
Figura 13 - Lavagem das placas no teste de inibição da formação de biofilme: a) Remoção do meio de cultura; b) Lavagem das placas com água destilada; c) Lavagem das placas com álcool a 96°GL
Fonte: Da autora
b
c a
b c
a
34
Solução de Cristal Violeta (CV) foi adicionada aos poços por 20 minutos. As placas então foram lavadas com água destiladas e foi adicionado álcool a 96°GL em cada poço (Fig 14).
Figura 14 - Uso do corante Cristal Violeta: a) Aplicação de Cristal Violeta (CV);
b) Placas com CV; c) Remoção do CV; d) Lavagem com água destilada;
e) Aplicação de álcool 96ºGL e f) Leitura pelo Espectofotômetro.
Fonte: Da autora
A formação de biofilme foi avaliada em um leitor de ELISA e considerada positiva quando a densidade óptica a 570 nm fosse maior ou igual a 0,248. Paralelamente foram feitos os seguintes controles: esterilidade do extrato, esterilidade do meio de cultura, promoção do crescimento e inibição pela solução de clorexidina a 0,12%.
c
f b
d a
e
4 AVALIAÇÃO DA CITOXICIDADE DOS EXTRATOS SOBRE CULTURA DE CÉLULAS BHK-21
A citotoxicidade foi avaliada por meio do método que se baseia na medida da atividade das enzimas desidrogenases mitocondriais, a qual quando ativa, é capaz de metabolizar o reagente MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2yl) - 2,5-difenil brometo de tetrazolina) em um composto colorido denominado formazan. Neste teste foram semeadas 1x105 da linhagem celular de rim de hamsters neonatos (BHK-21) por poço, em placas de 96 poços contendo meio de cultura MEM, acrescido de 10% de soro fetal bovino e antibióticos.
Após 24 horas de incubação a 37ºC em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 foi observado a formação de monocamada e o meio de cultivo foi removido e adicionado à cultura 0,1 mL de meio MEM contendo 1% de soro fetal bovino com diluições decrescentes dos extratos (5 mg/mL a 0,039 mg/mL).
As microplacas foram incubadas a 37ºC em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 por 48 horas. Após esse período foi acrescentado 10 µL de MTT a uma concentração de 5 mg/mL e incubou-se por 4 h a 37ºC em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 para a incorporação do MTT e formação dos cristais de formazan. Posteriormente foi removido cuidadosamente o meio de cultura e solubilizado os cristais de formazan pela adição de 100 µL de dimetil sulfoxido (DMSO). A figura 15 mostra a microplaca de cultura de células BHK-21 com os extratos de J. princeps.
A análise espectrofotométrica foi realizada em um leitor de microplacas com comprimento de onda de 600 nm. A porcentagem de citotoxicidade foi calculada utilizando a fórmula [ (A-B) / Ax100], onde A e B são valores das densidades ópticas das células controle e tratadas, respectivamente. A concentração citotóxica para 50% das células (CC50) foi estimada a partir de curvas de concentração-efeito após análise de regressão linear47. Os testes foram realizados em duplicata juntamente com o controle da viabilidade celular.
36
Figura 15 – Microplaca preparada para cultura de célula BHK -21
Fonte: Da autora
5 RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS
5.1.1 Difusão em ágar
Os extratos foram testados frente 21 micro-organismos, sendo oito Gram positivos, seis Gram negativos e sete leveduras.
Foram obtidos os resultados apresentados na tabela 1.
38
TABELA 1 - Média e desvio padrão dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano pelo teste de difusão em poço, em mm, dos extratos de Joannesia princeps contra os micro-organismos teste
Micro-organismo
Extratos de J. princeps Soluções Controle
F C S H2O CRD CFC SFT
Gram positivos
B. cereus ATCC 11778 10 ± 1,00 - - - 15,00 ± 1,73 23 24
B. subtilis ATCC 6633 - - - - 13,00 ± 3,60 24 30
E. faecalis ATCC 29212 15 - - - 18 15 20
K. rhizophila ATCC 9341 - - - - 25,00 ± 2,64 35 27
L. acidophilus ATCC 4356 - - - - 18,33 ± 1,53 25 31
M. luteus ATCC 10240 12,66 ± 1,15 - - - 23,33 ± 1,53 25 23
S. epidermidis ATCC 12228 - - - - 19,33 ± 0,57 23 22
S. aureus ATCC 0538 13,67 ± 1,58 - - - 18,67 ± 2,31 24 22 Gram negativos
B. bronchiseptica ATCC 4617 - - - - 12,67 ± 2,08 22 20
E. cloacae LMI-UNIFAL - - - - 12,00 ± 1,00 20 0
E. coli ATCC 8739 - - - - 13,67 ± 1,53 23 26
P. aeruginosa ATCC 9027 9,33 ± 1,15 - - - 19,00 ± 2,64 25 0 S. tiphymurium ATCC 14028 - - - - 11,66 ± 4,16 19 20
S. marcescens LMI-UNIFAL - - - - 14, 00 ± 1,73 20 18
Leveduras
C. albicans ATCC 10231 12,67 ± 1,53 - - - 19,00 ± 1,00 18 NT
C. albicans SC 5314 - - - - 18 15 NT
C. albicans ATCC 9543 - - - - 19 20 NT
C. glabrata ATCC 90030 - - - - 17 20 NT
C. parapsillosis ATCC 22019 10 - - - 27 20 NT
C. tropicalis ATCC 750 - - - - 19 22 NT
S. cerevisae ATCC 6538 12,66 ± 1,15 - - - 18,66 ± 0,58 16 NT Onde: F = Folha; C = Caule; S = Semente; H2O = Água destilada; CRD = Clorexidina 0,12%;
CFC = Cloranfenicol e SFT = Sulfazotrin
NT: não testado; -: não houve inibição Fonte: Da autora
O resultado encontrado no teste de difusão em ágar dos extratos de J.
princeps foi interessante, pois, o extrato das folhas apresentou halos de inibição para quatro bactérias Gram positivas, sendo elas: B. cereus (ATCC 11778), E.
faecalis (ATCC 29212), M. luteus (ATCC 10240) e S. aureus (ATCC 0538); para um bactéria Gram negativa a P. aeruginosa (ATCC 9027) e para as três leveduras testadas, C. albicans (ATCC 10231), C. parapsillosis (ATCC 22019) e S. cerevisae (ATCC 6538). O extrato do caule e das sementes de J. princeps não provocaram inibição do crescimento de nenhum micro-organismo testado (Tab 1).
A maioria das cepas deste estudo que apresentou sensibilidade ao extrato das folhas exibiu halos de inibição entre 9 a 13 mm, considerados ativos37,49. Para o E. faecalis (ATCC 29212) que apresentou halo de inibição de 15 mm e o S. aureus (ATCC 0538) de 13,67 mm o extrato das folhas foi considerado muito ativo. Nenhum dos extratos estudados apresentou inibição superior quando comparado às substâncias controles utilizados.
5.1.2 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Microbicida Mínima
Na avaliação da atividade antimicrobiana também foram feitas a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a determinação da Concentração Microbicida Mínima (CMM) dos extratos de J. princeps para os micro-organismos que apresentaram CIM menor ou igual a 12,5 mg/mL. A CIM corresponde à menor concentração do extrato capaz de inibir o desenvolvimento visível do micro- organismo. Já a CMM é considerada a menor concentração do extrato em que não se observa crescimento celular53.
A determinação da CIM foi realizada pela técnica de microdiluição em caldo, onde foi possível verificar a eficiência dos extratos da planta fresca. Os resultados estão apresentados na tabela 2.
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Tabela 2 – Concentração Inibitória Mínima e Concentração Microbicida Mínima, em mg/mL, dos extratos de Joannesia princeps sobre micro-organismos.
Micro-organismo
Extratos de Joannesia princeps Folha Caule Semente
CIM CMM CIM CMM CIM CMM
Gram positivos
B. cereus ATCC 11778 ND ND ND ND ND ND
B. subtilis ATCC 6633 ND ND ND ND ND ND
E. faecalis ATCC 29212 12,5 ND ND ND ND ND
K. rhizophila ATCC 9341 12,5 ND ND ND ND ND
L. acidophilus ATCC 4356 12,5 ND ND ND ND ND
M. luteus ATCC 10240 1,56 6,25 0,78 3,12 ND ND
S. aureus ATCC 6538 6,25 ND ND ND ND ND
S. epidermidis ATCC12228 12,5 ND ND ND ND ND
Gram negativos
B. bronchiseptica ATCC 46170 ND ND ND ND ND ND
E. cloacae LMI-UNIFAL-MG 12,5 ND ND ND ND ND
E. coli ATCC 8739 ND ND ND ND ND ND
P. aeruginosa ATCC 9027 6,25 ND ND ND ND ND
S. tiphymurium ATCC 14028 ND ND ND ND ND ND
S. marcescens LMI-UNIFAL-MG ND ND ND ND ND ND
Leveduras
C. albicans ATCC 10231 6,25 ND ND ND ND ND
C. albicans SC 5314 ND ND ND ND ND ND
C. albicans ATCC 9543 ND ND ND ND ND ND
C. glabrata ATCC 90030 ND ND ND ND ND ND
C. parapsilosis ATCC 22019 ND ND ND ND ND ND
C. tropicalis ATCC 750 ND ND ND ND ND ND
S. cerevisae ATCC 6538 6,25 ND ND ND ND ND
Valores de mg/mL Fonte: Da autora
ND = CIM > 12,5 mg/mL - Não Detectado na maior concentração testada
O M. luteus ATCC 10240 (Gram positivo) foi o micro-organismo mais sensível aos extratos das folhas, com CIM de 1,56 mg/mL e 6,25 mg/mL para o efeito microbicida. Demonstrou ainda maior sensibilidade ao extrato do caule de J.
princeps com CIM de 0,78 mg/mL e CMM de 3,12 mg/mL (Tab 2 e Fig 16).
Outros micro-organismos que mostraram sensibilidade ao extrato das folhas de J. princeps com CIM de 6,25 mg/mL foram: S. aureus ATCC 6538 (Gram positivo), P. aeruginosa ATCC 9027 (Gram negativo) e duas leveduras, C. albicans ATCC 10231 e S. cerevisae ATCC 6538, no entanto, a CMM foi considerada maior que 12,5 mg/mL (Tab 2).
Na maior concentração testada, 12,5 mg/mL, cinco cepas apresentaram sensibilidade, quatro Gram positivas, E. faecalis (ATCC 29212), K. rhizophila (ATCC 9341, L. acidophilus (ATCC 4356), S. epidermidis (ATCC 12228) e o E. cloacae (LMI-UNIFAL-MG), Gram negativo.
Para os outros micro-organismos testados considera-se que a CIM e CMM sejam maiores que 12,5 mg/mL.
O controle positivo, de esterilidade e de crescimento foram empregados de modo a validar a técnica utilizada neste estudo. A ausência de crescimento bacteriano diante dos controles positivos demonstra a susceptibilidade das amostras frente a um antimicrobiano sintético. Os controles de esterilidade e de crescimento comprovaram, respectivamente, a ausência de contaminação do meio de cultura e a viabilidade das cepas testadas.
No que diz respeito à CMM, os resultados foram negativos para todos os micro-organismos testados com os extratos, exceto para o extrato do caule frente ao M. luteus (ATCC 10240).
Figura 16 – Placa de CMM do M. luteus
42
5.1.3 Teste de inibição da formação de Biofilme em espécies de Candidas
Para comprovação e avaliação do crescimento de biofilme foram feitos testes com seis espécies de Candida. Verificou-se através do leitor de ELISA que em todas seis espécies houve crescimento e formação de biofilme, considerado positivos valores acima de 0,2 de absorbância.
De acordo com as leituras comparadas com o controle de Clorexidina a 0,12% que inibiu a formação de biofilme, verificou-se que esses extratos, na concentração testada, não inibiram a formação de biofilme por nenhum dos isolados testados.
5.2. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DOS EXTRATOS SOBRE CULTURA DE CELULAS BHK-21
Neste estudo a concentração citotóxica para 50% das células (CC50) foi estimada a partir de curvas de concentração-efeito após análise de regressão linear.
A tabela 3 mostra o resultado da citotoxicidade.
Tabela 3 - Resultado da citotoxicidade dos extratos de Joannesia princeps sobre cultura de células BHK-21 (CC50 em mg/mL)
Extrato de J. princeps CC50
Média Desvio Padrão
Extrato de folha 0,213 0,046
Extrato de caule 0,671 0,125
Extrato de semente 3,300 1,382
Valores em mg/mL Fonte: Da autora
Os resultados demonstraram que os extratos de J. princeps apresentaram toxicidade contra as células BHK-21 nas concentrações testadas, sendo os extratos das folhas o mais tóxico, 0,213 mg/mL.
6 DISCUSSÃO
6.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS
Os extratos vegetais com ação antimicrobiana se destacam entre as plantas utilizadas na medicina tradicional devido a sua importância no desenvolvimento e produção de produtos farmacêuticos e cosméticos7,4,40. Atualmente, dada a presença de micro-organismos resistentes aos antimicrobianos e, consequentemente, a necessidade de agentes antimicrobianos com ação eficaz, a triagem de plantas como uma abordagem para a descoberta de agente antimicrobiano pode ajudar na busca de novos compostos8.
6.1.1 Difusão em ágar
Ao observar a Tabela 1 e a Tabela 2 nota-se que, dentre os três tipos de micro-organismos envolvidos (bactérias Gram positivas, bactérias Gram negativas e leveduras), em geral, as bactérias Gram positivas e leveduras apresentaram-se mais sensíveis aos extratos testados. Esta diferença na sensibilidade entre as bactérias Gram negativas e Gram positivas pode estar relacionada à diferença na constituição morfológica destes micro-organismos. As bactérias Gram negativas são citadas por possuírem resistência a muitos dos antibióticos comercializados, sendo a E. coli a mais proeminente. A complexidade das bactérias Gram-negativas as torna menos suscetíveis aos agentes antimicrobianos54. Pinho et al. (2012)55 também observaram que a atividade apresentada somente em um representante do grupo das bactérias Gram negativas, P. aeruginosa, pode estar relacionado à menor susceptibilidade das bactérias Gram negativas a extratos vegetais.
Em relação às leveduras os achados estão em concordância com vários autores que estudaram a atividade antimicrobiana de plantas da família Euphorbiaceae. Alade & Irobi (1993)53 estudaram a planta Acalypha wilkesiana (Euphorbiaceae); Al-Mughrabi et al. (2003)56 mostraram as propriedades inibitórias do extrato de folhas, flores e caules de E. Macroclada, família Euphorbiaceae e Kirbag, Erecevit, Zengin (2013)57 realizaram um estudo de difusão de disco sobre as atividades antifúngicas de oito espécies do gênero Euphorbia (Euphorbiaceae) (E.
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szovitsi, E. aleppica, E. falcata, E. denticulata, E. macroclada, E. cheiradenia, E.
virgata and E. petiolata). Todas essas espécies apresentaram atividade antifúngica contra Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans e Aspergillus flavus, C. albicans, C. tropicalis, e C. glabrata57.
6.1.2 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Microbicida Mínima
O extrato que apresentou maior atividade antimicrobiana foi o das folhas, corroborando com os resultados apresentados no teste de difusão em ágar.
No que diz respeito à Concentração Microbicida Mínima (CMM), os resultados foram negativos para todos os micro-organismos testados com os extratos, exceto para o extrato do caule frente ao M. luteus (ATCC 10240). Isso pode ser devido à natureza e ao nível dos agentes antimicrobianos presentes nos extratos e seu modo de ação em diferentes micro-organismos do teste.
As propriedades antibacterianas observadas podem ser devido à presença de compostos com reconhecida atividade antibacteriana presentes nos extratos da família Euphorbiaceae conforme foi evidenciado por Awoyinka, Balogun, Ogunnowo (2007)58. Braquehais et al. (2016)59 com o extrato etanólico das folhas de Jatropha molíssimo e Anani et al (2016)60, com Acalypha wilkesiana. Arrais et al. (2014)13 em pesquisa com o extrato de Croton pulegioides, encontraram atividade antimicrobiana frente a micro-organismos Gram positivos, por outro lado, todos os extratos foram inativos nas concentrações avaliadas frente às bactérias Gram-negativas utilizadas no estudo.
6.1.3 Teste de inibição da formação de biofilme por Candida
A formação de biofilme é um dos principais fatores de virulência de Candida spp. e tem recebido considerável destaque61. A formação de biofilme de Candida tem uma importante repercussão clínica devido às diferenças observadas entre células planctônicas e células contidas no biofilme microbiano. As células do biofilme são, geralmente, mais tolerantes aos tratamentos antifúngicos e podem persistir no hospedeiro mesmo com um grande influxo de células inflamatórias e células do sistema imune adaptativo62,63.
