APLICAÇÃO DA PCR PARA INVESTIGAÇÃO DA INFECÇÃO PELO MYCOBACTERIUM LEPRAE EM AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES E SEUS CONTATOS DOMICILIARES

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APLICAÇÃO DA PCR PARA INVESTIGAÇÃO DA INFECÇÃO PELO MYCOBACTERIUM LEPRAE EM AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES E SEUS CONTATOS DOMICILIARES

LUCIANO CAETANO DO AMARAL¹, ISABELA MARIA BERNARDES GOULART², SERGIO ARAÚJO³, ERICA DE MELO REIS⁴, LUIZ RICARDO GOULART⁵

Resumo

Procurando auxiliar no controle da hanseníase foi desenvolvido este estudo sobre epidemiologia molecular para investigação da detecção de DNA do Mycobacterium leprae em amostras de sangue de pacientes com hanseníase e seus contatos domiciliares. A positividade da PCR em amostras de sangue foi correlacionada por testes estatísticos em relação à forma clínica, classificação operacional, baciloscopia, PCR em esfregaço dérmico e em biópsia de pele e resultados do teste intradérmico de Mitsuda e teste sorológico ML-Flow. Foram também analisados os resultados correlacionando sexo, idade e período de exposição estimado do contato ao caso índice. Os resultados gerados com este estudo comprovaram a presença do DNA do M.

leprae em amostras de sangue de pacientes com hanseníase bem como em seus contatos. Essa positividade em contatos pode ser útil para demonstrar a existência de portadores sadios, prováveis infectados subclinicamente e potenciais disseminadores do bacilo em áreas endêmicas, pois, por sua vez, não são tratados. Evidenciado neste estudo subsídios para utilização da poliquimioterapia em contatos domiciliares de pacientes com hanseníase podendo ser estas formas de intervenções adicionais para a redução da transmissão, e conseqüentemente, redução da incidência da hanseníase em áreas endêmica.

Palavras-chave: Hanseníase, Micobacterium lepre, PCR em amostras de sangue.

Abstract

This work performed a molecular epidemiology investigation to detect DNA of the Mycobacterium leprae in peripheral blood samples from leprosy patients and their household contacts with the purpose to auxiliary the leprosy disease. Correlation statistical tests were calculated among all clinical and laboratorial parameters as: M. leprae presence obtained by PCR technique in peripheral blood samples clinical forms; M. leprae presence obtained by PCR technique in slit skin smears and, skin biopsy; operational classification (BP and BM);

baciloscopy; Mitsuda intradermical test; ML-Flow serological test; gender; patient’s age in the diagnosis and estimated exposition time of the contact in relation to the index case. This study demonstrated the M. leprae DNA presence in peripheral blood samples in patients with leprosy and in their household contacts but the correlation statistical tests do not demonstrated association among clinical and laboratorial parameters. The Mycobacterium leprae presences in household contacts demonstrate the existence of healthy carriers. These healthy carriers may be no treated sub-clinical cases and so potential disseminators of the bacilli in endemics areas. M.

leprae DNA PCR in peripheral blood samples supplies tools for multi drug therapy in household contacts of leprosy pacients, assisting in the reduction of the leprosy incidence endemic areas.

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1. Aluno de Ciências Biológicas bolsista do CNPq, Centro de Referência Nacional em

Hanseníase/Dermatologia Sanitária (CREDSH), Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Rua Pará, 1720, Uberlândia, Bloco 2E, sala 24. amaralbio@yahoo.com.br

2. Prfª Dra do Centro de Referência Nacional em Hanseníase/Dermatologia Sanitária (CREDSH), Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Centro de Saúde-Escola Jaraguá Av. Aspirante Mega, 77.

3. Aluno de Ciências Biológicas, Centro de Referência Nacional em Hanseníase/Dermatologia Sanitária (CREDSH), Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Rua Pará, 1720, Uberlândia, Bloco 2E, sala 24.

4. Biomédica do laboratório de Genética Molecular do Centro de Referência Nacional em

Hanseníase/Dermatologia Sanitária (CREDSH), Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Rua Pará, 1720, Uberlândia, Bloco 2E, sala 24.

5. Prf. Dr. do Instituto de Genética e Bioquímica (INGEB), Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Bloco 2E, sala 24.

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INTRODUÇÃO

Hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae, um parasita intracelular obrigatório com tropismo por macrófagos e células de Schwann. O bacilo demonstra preferência para crescimento em regiões mais frias do corpo como extremidades dos membros e da face (HASTINGS et al., 1988).

A eliminação da doença foi definida pela Organização Mundial de Saúde como a redução da prevalência para menos de uma pessoa para dez mil habitantes (WHA, 1991).

Essa ação baseava-se na alta efetividade da Poliquimioterapia (PQT) na redução da infectibilidade dos pacientes, o que gradualmente eliminaria a transmissão e a doença. Mesmo com o impacto da PQT sobre a prevalência, o declínio da incidência não foi observado, uma vez que mais de 515.000 novos casos têm sido detectados a cada ano no mundo (WHO, 2004).

A Hanseníase demonstra uma ampla apresentação clínica, classificada por Ridley e Jopling (RIDLEY; JOPLING, 1966), considerando parâmetros imunopatológicos e de carga bacilar. De acordo com o espectro, os pacientes de hanseníase são classificados em tuberculóides (TT), borderline-tuberculóides (BT), borderline-borderlines (BB), borderline-

lepromatosos (BL), lepromatosos (LL) ou indeterminados (HI) (RIDLEY; JOPLING, 1966).

A variedade das formas clínicas é definida por uma vigorosa resposta imune celular no polo tuberculóide e uma progressiva redução na resposta imune celular em direção ao polo lepromatoso, associada com o aumento na carga bacilar, mais lesões na pele e nervos, e maiores titulações de anticorpos. A classificação da hanseníase borderline compreende os tipos da doença entre os grupos polares tuberculóide e lepromatoso. Um paciente com hanseníase borderline pode desenvolver com o tempo características clínicas, bacteriológicas, e histopatológicas mais semelhantes com a doença tuberculóide, denominado

“upgrading”, enquanto o desenvolvimento de características mais semelhantes com a doença lepromatosa é chamado “downgrading”. A hanseníase indeterminada é considerada um estágio inicial da doença, e possui um desenvolvimento variado. Em aproximadamente três quartos destes pacientes, a doença é curada espontaneamente; alguns casos se mantêm indeterminados por um grande período, e alguns progridem para uma das formas

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estabelecidas da doença (HASTINGS et al, 1988). No Brasil a classificação de Ridley e Jopling teve o espectro renomeado para tuberculóides (T), dimorfo-tuberculóides (DT), dimorfo-dimorfos (DD), dimorfo- virchowianos (DV), virchowianos (V) e indeterminados (I) (BRASIL, 2002).

Para fins de tratamento, foi adotado a classificação operacional da Organização Mundial de Saúde que divide os pacientes em Paucibacilares (PB) e Multibacilares (MB) em concordância com o índice baciloscópico (IB) e pelo número de lesões (WHO, 1982).

O diagnóstico da hanseníase é clínico e é baseado na apresentação de um dos três principais sinais que são: manchas avermelhadas ou hipopigmentadas com perda de sensibilidade, troncos nervosos espessados e presença de BAAR (bacilo álcool-ácido resistente) em esfregaço dérmico ou em amostra de biópsia (WHO, 2000). O exame clínico dermato-neurológico e a baciloscopia ainda são considerados o padrão ouro de diagnóstico em hanseníase, e seu resultado é importante para identificar os pacientes de maior carga bacilar e com maior risco de recidivas. Esse exame procede da coleta de material nos lóbulos auriculares, cotovelos e de áreas infiltradas, e após a realização de procedimentos laboratoriais, o resultado é negativo quando nenhum bacilo é encontrado

em cem campos e é positivo quando se encontra mais de dez bacilos em cem campos.

Como na coloração de BAAR são necessários no mínimo 100.000 bacilos por grama de tecido para detecção confiável (SHEPARD;

McRAE, 1968), a sensibilidade é baixa, principalmente em pacientes PB, com características tuberculóides da doença, onde os bacilos são raros ou ausentes.

Embora a hanseníase seja uma doença infecciosa crônica ela também pode ser considerada uma doença imunológica, uma vez que as reações do sistema imune são de grande importância na defesa contra a infecção (RIDLEY & JOPLING, 1966). O tipo e a intensidade da resposta imune ao Mycobacterium leprae podem ser estimados por meio do teste de Mitsuda e pelo teste do Fluxo Lateral (ML-flow) para anticorpos anti- PGL-1 (SAAD et al., 1991).

O teste de Mitsuda baseia-se principalmente na reatividade do paciente à injeção intradérmica com lepromina, uma suspensão de bacilos Mycobacterium leprae mortos pelo calor. A reação tardia à lepromina é medida em aproximadamente 4 semanas e reflete a indução da resposta imune celular frente ao Mycobacterium leprae, manifestada pela formação de um granuloma celular epitelial organizado (HARBOE, 1885). A injeção intradérmica com 0,1 ml da lepromina

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é realizada na superfície de flexão do antebraço direito, 4 cm abaixo da dobra antecubital, considerando como resultado, a medida do diâmetro da induração local, registrada em milímetros (mm). A reatividade à lepromina possui quase nenhum valor de diagnóstico, mas estabelece o perfil imunológico do indivíduo frente ao Mycobacterium leprae, e portanto, possui valor de prognóstico (HASTINGS et al., 1988).

Entre os métodos alternativos de diagnóstico e estudo da infecção, o exame sorológico baseado na detecção de anticorpos anti-PGL1 do Mycobacterium leprae, demonstra que a presença desses anticorpos é diretamente proporcional a intensidade de exposição, expressando títulos maiores para MB e menores para PB (BÜHRER-SÉKULA et al., 2003; DOUGLAS et al., 2004), porém não representa todas as infecções, sendo que pacientes PB podem não apresentar resposta humoral detectável e também novos casos de hanseníase são detectados em grupos soro- negativos (CHO et al., 2001). Anticorpos anti- PGL-1 refletem a carga bacteriana num individuo, indicando uma infecção subclínica ou doença (HARBOE, 1985). O teste do Fluxo Lateral do Mycobacterium leprae(ML-flow) para detecção de anticorpos anti-PGL-1 em pacientes de hanseníase e seus comunicantes

objetiva a classificação correta das formas clínicas destes pacientes para um tratamento adequado, evitando recidivas. O resultado negativo é indicado pela ausência de uma linha na zona de teste e a presença de uma linha de controle, e o resultado positivo, por sua vez, é indicado pela presença de uma linha acentuada, a qual varia de +1 a + 4, na zona de teste e por uma linha na zona de controle.

O DNA do Mycobacterium leprae é encontrado em secreções nasais de pacientes de hanseníase, principalmente na forma lepromatosa, e também já foi encontrado em amostras de swab nasal de comunicantes e indivíduos saudáveis em regiões endêmicas, o que sugere maior freqüência de infecção subclínica do que anteriormente se pensava (HATTA et al., 1995; RAMAPRASAD et al., 1997; GOULART et al., 2001).

Nos últimos anos também aumentou o número de amostras clínicas nas quais se utiliza a amplificação do DNA específico do bacilo por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), incluindo biópsias de pele, linfa, sangue, bulbos capilares, secreção nasal e concha nasal inferior (SANTOS et al., 2001;

TORRES et al., 2003; PATROCÍNIO et al., 2005). Estudos têm demonstrado por meio da PCR, a existência de portadores temporários e até infecção subclínica (PATTYN et al., 1993;

IZUMI, 1999; GOULART et al., 2001;

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GOULART et al., 2002a; ALMEIDA et al., 2004), e que indivíduos infectados passam por uma fase transitória de excreção nasal, indicando que a micobactéria é altamente infecciosa (HATTA et al., 1995).

Em estudos anteriores foi relatado que, contatos domiciliares, vizinhos e contatos sociais de pacientes têm um maior risco de contrair a doença e podem ser a maior fonte de disseminação do bacilo (VAN BEERS et al., 1999), apesar de que, em regiões endêmicas, existe um alto nível de exposição (VAN BEERS et al., 1994). Também foi relatada a possibilidade de transmissão subclínica de portadores temporários do bacilo para pessoas não protegidas (HATTA et al., 1995;

RAMAPRASAD et al., 1997).

O avanço nas ferramentas moleculares e imunológicas juntamente com investigação da transmissão e infectividade têm permitido a implicação da quimioprofilaxia como ação complementar para o controle da hanseníase (VIJAYAKUMARAN et al., 2000).

Amostras da micobactéria, mesmo que mortas, contêm DNA, e em amostras não invasivas como swab, não podemos distinguir entre DNA amplificado de micobactérias vivas ou mortas (VAN BEERS et al., 1994;

RAMPRASAD et al., 1997 ). O Mycobacterium leprae é um parasita intracelular obrigatório de células de Schwann

e células do sistema fagocítico mononuclear e possui longo período de incubação e replicação (HASTINGS et al., 1988).

Mediante isto e considerando a curta meia- vida de células fagocíticas do sangue parece pouco provável a amplificação de DNA de bacilos mortos em amostras sanguíneas e o encontro do DNA nessas amostras poderia demonstrar real infecção com bacilos viáveis, uma vez que os bacilos já se encontram na circulação (SANTOS et al., 2001).

Apesar da hanseníase ser uma das mais antigas doenças registradas na história da humanidade, esta continua como um grande problema de saúde pública e ainda há lacunas substanciais no conhecimento da transmissão e epidemiologia do Mycobacterium leprae.

Estudos que possam determinar os fatores que influenciam a transmissão do bacilo, a infectividade e patogenicidade são de grande relevância para subsidiar ações e avaliar o impacto das intervenções no controle da doença (VISSCHEDIJK et al, 2000).

A utilização de ferramentas moleculares como a PCR no diagnóstico da infecção pelo Mycobacterium leprae tem permitido identificar portadores sadios e com infecção subclínica que poderiam estar envolvidos na disseminação do bacilo em áreas endêmicas e grupos com maior risco de

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adoecer, levando à detecção precoce de novos casos.

O estudo da epidemiologia molecular do Mycobacterium leprae poderá elucidar novas formas de transmissão e infecção, além de proporcionar bases para a utilização de novas estratégias de controle, podendo levar à adoção de quimioprofilaxia de grupos de risco, como uma ação adicional para o controle da hanseníase.

O presente estudo teve como objetivo utilizar marcadores moleculares específicos do Mycobacterium leprae para detectar a presença de DNA em pacientes com hanseníase e seus comunicantes atendidos no Centro de Referência Nacional em Dermatologia Sanitária/Hanseníase do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia (CREDESH/HCU/UFU) visando identificar os possíveis portadores sadios e/ou infectados subclínicamente com o bacilo entre os contatos de pacientes com hanseníase, para seguimento periódico pela equipe de saúde do CREDESH/HCU/UFU, procurando avaliar o risco de adoecer nesse grupo e subsidiar novas estratégias para o controle da hanseníase.

CASUÍSTICA E MÉTODOS

A – CASUÍSTICA

1. Seleção de pacientes

Foram convidados a participar do estudo em torno de 111 pacientes com hanseníase, virgens de tratamento, atendidos no CREDESH/HCU/UFU, em suas duas unidades: Ambulatório Central do HCU e Centro de Saúde-Escola (CSE) Jaraguá – UFU. Nestes, foram retiradas amostras de sangue periférico em tubos Vacutainer de 4 ml, nas quais foi realizado o teste para detecção do DNA do Mycobacterium leprae por PCR.

2. Seleção dos comunicantes

Foram convidados a participar do estudo em torno de 434 contatos domiciliares de pacientes com hanseníase atendidos no CREDESH/HCU/UFU, em suas duas unidades: Ambulatório Central do HCU e Centro de Saúde-Escola (CSE) Jaraguá – UFU. Nestes, foram retiradas amostras de sangue periférico em tubos Vacutainer de 4 ml, nas quais foi realizado o teste para detecção do DNA do Mycobacterium leprae por PCR.

Segundo o Ministério da Saúde, considera-se comunicante de paciente de hanseníase os contatos intradomiciliares que

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residam ou tenham residido com o doente nos últimos 5 anos (período médio de incubação da doença).

3. Aspectos Éticos

Este projeto está incluído no projeto temático intitulado “Caracterização Imunológica e Molecular de Pacientes com Hanseníase e seus Comunicantes para Identificação de Grupo de Risco”, que recebeu parecer favorável do Comitê de Ética em Pesquisa - UFU sob o n^o 099/2003 e financiado pela FAPEMIG sob o Convênio CDS800/2004. Foi assinado um Termo de Consentimento Esclarecido, no qual os voluntários que concordaram em participar da pesquisa poderiam desistir de fazê-lo a qualquer momento, sem prejuízo próprio.

B – MÉTODOS

1. Protocolo para coleta de sangue periférico para realização da PCR

Foi feita assepsia do local com algodão embebido em álcool iodado, seguida por punção da veia braquial e coleta com sistema Vacutainer de um tubo de 4ml com EDTA de sangue venoso periférico dos pacientes e

contatos domiciliares de pacientes com hanseníase.

2. Protocolo para extração de DNA

Para a extração do DNA do Mycobacterium leprae foi pipetado 500 µl de sangue total, adicionado 250 µl de Tris-HCl 1M (pH=8,0) e 500 µl de Fenol, homogeneizado e deixado em repouso por 5 minutos. Em seguida os tubos foram centrifugados a 12.000 rpm por dez minutos.

Foi retirado então o sobrenadante e depositado em um tubo limpo, completado com etanol absoluto e deixado overnight a –20ºC.

Posteriormente o material foi centrifugado a 15.000 rpm por 15 minutos a 4ºC, descartado o sobrenadante, o pellet lavado com etanol 75% e novamente centrifugado a 15.000 rpm, dessa vez por 10 minutos. O sobrenadante foi novamente descartado e o pellet deixado para secar. O pellet foi então diluído em 50 µl de água mili-Q e adicionado aos reagentes da PCR.

3. Protocolo para pesquisa de DNA de Mycobacterium leprae por PCR nas amostras de sangue periférico

Para qualificar as amostras de sangue quanto à presença de DNA de Mycobacterium

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leprae, foram utilizados primers (forward: 5’

GCA CGT AAG CAT GTC GGT GG 3’ e reverso: 5’ CCG CGG CGC TAA CAA CTA TC 3’) que amplificam um fragmento de DNA de 130 pares de base (pb) da seqüência RLEP3 (X17153) do Mycobacterium leprae que apresenta alta sensibilidade e especificidade, conforme os estudos de Yoon (YOON et al, 1993). Além dos primers selecionados com base nas seqüências alvo a serem analisadas, um par de primers que amplifica um fragmento de 200 bp de um gene constitutivo humano (NRAMP) foi adicionado em cada reação, como um padrão interno para analisar a presença de inibidores nas reações.

O DNA do Mycobacterium leprae e o gene NRAMP foram amplificados em tubos separadamente e simultaneamente para verificar se havia ou não competição dos primers na reação. As reações de PCR foram executadas nas seguintes condições: 1.0 U de Taq Platinum DNA polymerase, 1X PCR buffer, 1.5 mM MgCl₂, 200 µM dNTPs, 10.0 pM de cada primer, e 200 ng de DNA genômico, em um volume final de 25 µL, completado com água ultrapura. A PCR foi realizada em um termociclador MJ Research, Inc., de acordo com as seguintes condições:

desnaturação inicial a 95°C por 5 min, 35 ciclos de amplificação a 95°C por 40 s, 57°C por 40 s, e 72°C for 1 min. A extensão final

foi feita a 72°C por 10 min. Os produtos de PCR foram detectados em eletroforese em gel de agarose 2,0% corado com 2µl de brometo de etídeo e fotografados sob luz UV em um sistema de vídeo documentação (Image Master VDS, Amersham Biosciences)

4. Análises Estatísticas

Todas as análises estatísticas foram realizadas pelo software Statistica 99 Edition Software (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, 1999).

Análises de regressão múltipla e os coeficientes de correlação foram obtidos entre a positividade da PCR e os seguintes parâmetros: classificação clínica e operacional, índice baciloscópico (IB) do esfregaço dérmico e de biópsia de lesão de pele, PCR do esfregaço dérmico e de biópsia de lesão de pele, teste de Mitsuda e teste ML- Flow, sexo, idade e tempo de exposição estimado do contato ao caso índice, com significância de p<0,05.

O teste para diferença de proporções (Z) foi aplicado para todas as comparações pareadas, combinando dados de dois parâmetros por vez, incluindo positividade da PCR em sangue, classificação operacional, formas clínicas, IB de esfregaço dérmico e de biópsia de lesão de pele, PCR de esfregaço

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dérmico e de biópsia de lesão de pele, teste de Mitsuda, teste ML-Flow, sexo, idade e tempo de exposição estimado, com significância de p<0,05.

RESULTADOS

Neste estudo foram analisados cento e onze pacientes com hanseníase virgens de

tratamento atendidos no CREDESH/HC/UFU.

Entre esses, 58,6% eram multibacilares (MB) e 41,4% paucibacilares (PB) (Tabela 1).

Foram observados 18 pacientes na forma clínica T (16,2%), 48 pacientes na forma clínica DT (43,3%), 12 pacientes na forma clínica DD (10,8%), 13 pacientes na forma clínica DV (11,7%), 20 pacientes na forma clínica V (18,0%).

Tabela 01: Distribuição dos pacientes com hanseníase segundo classificação operacional e forma clínica, CREDESH/HC/UFU.

Classificação Operacional

Forma Clínica PB MB Total

N % N % N %

T 18 16,2 0 0,0 18 16,2 DT 28 25,2 20 18,0 48 43,3 DD 0 0,0 12 10,8 12 10,8 DV 0 0,0 13 11,7 13 11,7 V 0 0,0 20 18,1 20 18,0 Total 46 41,4 65 58,6 111 100,0

Número total de indivíduos (N total) = 111 pacientes.

Nos pacientes foi verificada uma positividade geral para a PCR em amostras de sangue de 19,8%, sendo que entre os positivos 59,1% eram MB e 40,9% PB. Entre os pacientes MB e PB, a detecção do DNA do Mycobacterium leprae em amostras de sangue foi de 20% e 19,6%, respectivamente. Nos pacientes positivos para a PCR em amostras de sangue, ocorreu uma prevalência de

pacientes com as formas clínicas DT (41,0%) e V (27,3%) (Tabela 2). Análises de regressão geraram um gráfico que não apresentou correlação linear significante entre as formas clínicas dos pacientes e a positividade da PCR em amostras de sangue, sendo a menor positividade encontrada entre os pacientes DV (Gráfico 01).

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Tabela 02: Resultados da PCR em amostras de sangue de pacientes relacionados com a forma clínica de pacientes com hanseníase atendidos no CREDESH/HC/UFU.

PCR Sangue

Forma Clínica Negativo Positivo Total

N % N % N % T 15 13,5 3 2,7 18 16,2

DT 39 35,2 9 8,1 48 43,3 DD 9 8,1 3 2,7 12 10,8 DV 12 10,8 1 0,9 13 11,7

V 14 12,6 6 5,4 20 18,0 Total 89 80,2 22 19,8 111 100,0

7,7

30,0

16,7 18,8

25,0

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0

T DT DD DV V

Formas Clínicas da Hanseníase Positividade da PCR em amostras de sangue (%)

Gráfico 01: Porcentagem de positividade para a PCR em amostras de sangue de pacientes segundo formas clínicas da hanseníase.

Com referência à baciloscopia do esfregaço dérmico foi verificada uma porcentagem de positividade para a PCR de sangue de 23,9%

(11/46) entre os pacientes com índice

baciloscópico de esfregaço dérmico positivo (IB), contra 17,5% (11/63) entre os pacientes com IB negativo no esfregaço dérmico, porém não houve diferença estatística significativa

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entre estes valores (p>0,05). A concordância entre o exame baciloscópico de esfregaço dérmico e a PCR para detecção de DNA de Mycobacterium leprae em amostras de sangue de pacientes com hanseníase foi de 57,8%

(Tabela 3).

Quanto à baciloscopia da biópsia de pele foi verificada uma maior porcentagem de positividade da PCR em sangue entre os pacientes com IB negativo em biópsia de lesão

(22,9%, 8/35), contra 17,7% (12/68) entre os pacientes com IB de biópsia positiva (p>0,05).

Naqueles pacientes com PCR de sangue negativa, 67,5% (56/83) apresentaram IB positivo em biópsia e 32,5% (27/83) IB negativo, uma diferença estatisiticamente significante (p<0,05). A concordância entre a baciloscopia de biópsia de pele e a PCR em amostras de sangue de pacientes com hanseníase foi de 37,8%(Tabela 4).

Tabela 03: Resultados da PCR em amostras de sangue de pacientes com hanseníase segundo resultado da baciloscopia de esfregaço dérmico, CREDESH/HC/UFU.

PCR Sangue

IB de Esfregaço Negativo Positivo Total

Dérmico N % N % N %

Negativo 52 47,7 11 10,1 63 57,8 Positivo 35 32,1 11 10,1 46 42,2 Total 87 79,8 22 20,2 109 100,0

Tabela 04: Resultados da PCR em amostras de sangue de pacientes com hanseníase, segundo baciloscopia de biópsia de lesão de pele, CREDESH/HC/UFU.

PCR Sangue

IB de Biópsia Negativo Positivo Total

de Pele N % N % N %

Número total de indivíduos (N total) = 103 pacientes

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Pacientes com PCR positiva em sangue apresentavam porcentagem de positividade e negatividade semelhantes na PCR em esfregação dérmico (p>0,05) (Tabela 05). Foi verificada uma maior porcentagem de pacientes com PCR de esfregaço dérmico positivo (38/67, 56,7%) entre os pacientes com PCR de sangue negativa (p>0,05). Dos pacientes com PCR de esfregaço dérmico positiva, 22,4% (11/49) apresentavam PCR de sangue positiva. A concordância entre as duas PCRs, de esfregaço dérmico e de sangue de pacientes com hanseníase foi de 45,5%.

A análise comparada dos resultados da PCR em biópsia de lesão de pele e em sangue de pacientes com hanseníase demonstrou que, entre os pacientes com PCR de biópsia positiva, 21,3% (13/61) eram também

positivos para PCR de sangue, contra 78,7%

(48/61) que eram negativos para PCR em sangue (p<0,05) (Tabela 06).

Do total de pacientes positivos para PCR em sangue (18), 72,2% (13/18) apresentavam positividade à PCR de biópsia de lesão de pele (p>0,05). A concordância entre as PCRs, de biópsia de pele e em sangue de pacientes com hanseníase, foi de 41,1%.

Com relação à medida da resposta imune celular, uma análise comparada dos resultados do teste de Mitsuda e da PCR em sangue mostrou que, entre os pacientes com PCR positiva em sangue periférico (20), 55%

apresentavam Mitsuda de 0 a 3 mm (11/20), sendo que apenas 15% (3/20) estavam entre aqueles com Mitsuda ≥ 8mm (Tabela 07).

Também foi verificado que dos

Tabela 05: Resultados da PCR em amostras de sangue de pacientes segundo resultados da PCR de esfregaço dérmico de pacientes com hanseníase atendidos no CREDESH/HC/UFU.

PCR Sangue

PCR Esfregaço Negativo Positivo Total

Dérmico N % N % N %

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Tabela 06: Resultados da PCR em amostras de sangue de pacientes segundo resultados da PCR de biópsia de pele de pacientes com hanseníase atendidos no CREDESH/HC/UFU.

PCR Sangue

Negativo Positivo Total

PCR Biópsia

de Pele _{N % N % N}_%

Tabela 07: Resultados da PCR em amostras de sangue de pacientes com hanseníase, segundo os resultados do teste Mitsuda, CREDESH/HC/UFU.

PCR Sangue

Mitsuda N % N % N %

0 a 3 30 34,1 11 12,5 41 46,6 4 a 7 17 19,3 6 6,8 23 26,1 8 a 10 17 19,3 2 2,3 19 21,6

> 10 4 4,6 1 1,1 5 5,7 Total 68 77,3 20 22,7 88 100,0

pacientes que estavam entre aqueles com reação de Mitsuda < 8 mm, 26,5% (17/64) apresentavam positividade na PCR de sangue, 0 a 3 mm, (26,8%, 11/41) e 4 a 7 mm (26,1%, 6/23).

Em relação aos resultados do teste ML-Flow e da PCR em sangue foi possível verificar uma porcentagem de positividade para a PCR em sangue de 10,1% em pacientes com ML-Flow negativo, e de 11,1% em pacientes com ML-Flow positivo (Tabela 08).

Apesar da porcentagem de positividade para a PCR em sangue pelo número total de pacientes serem próximas para ambos negativos e positivos para o teste ML-Flow, quando analisado apenas o número total de pacientes negativos para o teste ML-Flow foi encontrado uma porcentagem de positividade de 25,6% (10/39), e quando analisados apenas o número total de pacientes positivos para o teste ML-Flow foi encontrado uma porcentagem de positividade de 18,3%

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(11/60). Entre todos os pacientes negativos para a PCR em amostras de sangue, ocorreu uma maior porcentagem de pacientes ML- Flow positivos (62,8%, 49/78), em relação aos que pacientes ML-Flow negativos (37,2%,

29/78), uma diferença estatisticamente significante (p<0,05). A concordância entre o teste ML-Flow e a PCR em amostras de sangue pacientes com hanseníase foi de 40,4%.

Tabela 08: Resultados da PCR em amostras de sangue de pacientes com hanseníase segundo o resultado do teste ML-Flow, CREDESH/HC/UFU.

PCR Sangue

ML-Flow N % N % N %

Quanto ao sexo, a distribuição dos pacientes foi de 56,2% homens e 43,8%

mulheres, com prevalências das formas MB em homens (63,1%). Considerando os pacientes com PCR em amostras de sangue positiva, 63,6% eram homens e 36,4%

mulheres, uma diferença estatística não significativa (p>0,05). Homens classificados como paucibacilares apresentaram maior positividade para a PCR em amostras de sangue do que mulheres também PB, no entanto mulheres MB apresentaram maior positividade para PCR em amostras de sangue do que homens também MB (Gráfico 02). Entre as formas clínicas, homens apresentaram positividade da PCR maior do

que mulheres em todas as formas clínicas, exceto na forma clínica virchowiana (V) (Gráfico 03).

A idade variou de 03 a 88 anos, com maior freqüência de pacientes entre 31 a 60 anos de idade (66,4%). Entre os pacientes positivos para a PCR em amostras de sangue, uma maior porcentagem de positividade foi observada em pacientes na faixa etária de 31 a 60 anos (59,1%), mas não houve diferença estatisticamente significante com as outras faixas etárias (p>0,05). Quando analisados somente os pacientes em uma determinada faixa etária, foi observada uma maior positividade em pacientes na faixa etária com mais de 60 anos (Gráfico 04).

(16)

12,5

27,3

20,8 19,5

0 5 10 15 20 25 30

Sexo Feminino Sexo Masculino Positividade da PCR em amostras de sangue (%)

PB MB

Gráfico 02: Porcentagem de positividade para a PCR em amostras de sangue e classificação operacional segundo sexo dos pacientes.

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0

T DT DD DV V

Formas Clínicas da Hanseníase

Positividade da PCR em amostras de sangue (%) Sexo Feminino

Sexo Masculino

Gráfico 03: Porcentagem de positividade para a PCR em amostras de sangue por sexo segundo forma clínica dos pacientes.

(17)

17

0,0

20,0

27,3

13,0

19,4 21,1

59,6

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0

0 a 10 11 a 20 21 a 30 31 a 40 41 a 50 51 a 60 > 60 Faixa Etária (anos)

Positividade para a PCR em amostras de sangue (%)

Gráfico 04: Porcentagem de positividade para a PCR em amostras de sangue segundo faixa etária dos pacientes.

Entre os contatos domiciliares de pacientes com hanseníase atendidos no CREDESH/HC/UFU, 28,6% eram contatos de pacientes PB e 71,4% eram contatos de pacientes MB. A positividade geral da PCR em amostras de sangue de contatos foi de 10,1%. Entre os contatos positivos, 68,2%

eram contatos de pacientes MB e 31,8%

eram contatos de pacientes PB (p<0,05) (Tabela 09). Entre somente os contatos de pacientes MB, 9,7% apresentaram PCR em amostras de sangue positiva, e entre somente os contatos de PB, 11,3% apresentaram PCR em amostras de sangue positiva, no entanto sem diferença estatística significativa (p>0,05).

Tabela 09: Resultados da PCR em amostras de sangue de contatos de pacientes com hanseníase segundo a classificação operacional dos casos índices, CREDESH/HC/UFU.

PCR Sangue Contatos

Classificação Operacional

Caso Índice N % N % N %

PB 110 25,4 14 3,2 124 28,6 MB 280 64,5 30 6,9 310 71,4 Total 390 89,9 44 10,1 434 100,0

Número total de indivíduos (N total) = 434 contatos de pacientes.

(18)

não foi encontrada uma diferença estatística significativa para a positividade da PCR em amostras de sangue entre contatos de pacientes com diferentes formas clínicas (p>0,05).

Foi verificada uma maior porcentagem de contatos de pacientes positivos para a PCR em amostras de sangue com caso índice nas formas clínicas DT (3,7%) e T (2,6%) (Tabela 10), e também

índice multibacilar. No estudo foram avaliados um número superior de contatos de pacientes DT, T e MB, e na porcentagem de contatos positivos por cada forma clínica e classificação operacional dos casos índice, não houve diferença estatística significante, e as maiores positividades ocorreram em contatos de pacientes com forma clínica DD e DT (Gráfico 05).

Tabela 10: Resultados da PCR em amostras de sangue de contatos de pacientes segundo a forma clínica do caso índice dos contatos de pacientes com hanseníase atendidos no CREDESH/HC/UFU.

PCR Sangue

Forma Clínica

Caso Índice _{N % N % N}_%

T 77 17,9 11 2,6 88 20,5 DT 116 27,0 16 3,7 132 30,8 DD 56 13,1 6 1,4 62 14,4 DV 49 11,4 5 1,2 54 12,6 V 89 20,8 4 0,9 93 21,7 Total 387 90,2 42 9,8 429 100,0

(19)

19

4,3 9,7

12,1 12,5 9,3

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0

T DT DD DV V

Gráfico 05: Positividade da PCR em amostras de sangue de contatos segundo formas clínicas dos casos índice.

Uma análise comparada dos resultados do teste de Mitsuda e da PCR em amostras de sangue foi notada uma maior porcentagem de contatos de pacientes com

hanseníase positivos para a PCR em sangue com reação de Mitsuda de 4 a 7 mm (6,2%) (Tabela 11).

Tabela 11: Resultados da PCR em amostras de sangue segundo os resultados do teste Mitsuda de contatos de pacientes com hanseníase, CREDESH/HC/UFU.

Mitsuda Contatos _{N % N}_%_N_%

0 a 3 23 6,0 3 0,8 26 6,7 4 a 7 155 40,1 24 6,2 179 46,4 8 a 10 116 30,0 11 2,8 127 32,9

> 10 52 13,5 2 0,5 54 140 Total 346 89,6 40 10,4 386 100,0

No entanto quando analisados como total somente os contatos com reação

similar, verificamos uma positividade para a PCR em amostras de sangue de 13,4%

(20)

reação de Mitsuda de 0 a 3 mm. Uma correlação inversa foi obtida entre a PCR em amostras de sangue de contatos e os resultados do teste de Mitsuda, isto é, quanto maior a leitura em milímetros da pápula intradérmica, menor a positividade da PCR em amostras de sangue (Gráfico 06).

Quando analisados os resultados da PCR em amostras de sangue e os resultados dos testes ML-Flow em contatos de pacientes com hanseníase, notou-se uma maior porcentagem de positividade para a PCR em amostras de sangue de 8,7% em contatos negativos para o teste ML-Flow. Também há uma maior porcentagem de pacientes

(Tabela 12).

No entanto, quando analisados contatos somente negativos para o teste ML- Flow verificamos uma porcentagem de positividade para a PCR em sangue de 10,0%

(35/350), e quando analisados contatos somente positivos para o teste ML-Flow verificamos uma porcentagem de positividade de 15,4% (8/52). Entre os 10,7% (43/402) dos contatos domiciliares com PCR em amostras de sangue positivas, 18,6% (8/43) são ML- Flow positivos, sendo 50% (4/8) contatos de MB. A concordância entre a PCR em amostras de sangue e o teste ML-Flow de contatos de pacientes com hanseníase foi de 80,4%.

y = -2,81x + 16,35 R² = 0,7398 0

2 4 6 8 10 12 14 16

0 a 3 4 a 7 8 a 10 > 10 Mitsuda estratificado (mm)

Positividade PCR em amostras de sangue (%)

Gráfico 06: Porcentagem de positividade da PCR em amostras de sangue segundo resultado estratificado do teste de Mitsuda (mm).

(21)

21

Tabela 12: Resultados da PCR em amostras de sangue, relacionados com os resultados do teste ML-Flow de contatos de pacientes com hanseníase, CREDESH/HC/UFU.

ML-Flow Contatos _{N % N % N}_%

Negativo 315 78,4 35 8,7 350 87,1 Positivo 44 10,9 8 2,0 52 12,9

Total 359 89,3 43 10,7 402 100,0

Entre os 434 contatos, 41,9% eram do sexo masculino e 58,1% do sexo feminino. Entre os 10,1% de contatos com PCR em amostras de sangue positivas, 59,1% eram mulheres e 40,9% homens, sem diferença estatisticamente significante para estes parâmetros (p>0,05).

Quando analisada a positividade para a PCR

em amostras de sangue entre somente contatos do sexo masculino verificamos uma porcentagem de 9,9% (18/182), similar a verificada entre somente contatos do sexo feminino de 10,3% (26/252), sem diferença estatística significante (p>0,05) (Gráfico 07 e 08 ).

10,8

11,9 10,2

8,9

0 2 4 6 8 10 12 14

Sexo Feminino Sexo Masculino Positividade de PCR em amostras de sangue (%)

PB MB

Gráfico 07: Porcentagem de positividade para a PCR em amostras de sangue e classificação operacional do caso índice segundo sexo dos contatos.

(22)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

T DT DD DV V

Sexo Feminino Sexo Masculino

Gráfico 08: Porcentagem de positividade para a PCR em amostras de sangue por sexo dos contatos segundo forma clínica do caso índice.

A idade dos contatos variou de 0 a 82 anos, sendo que 59,2% estavam na faixa dos 0 aos 30 anos. Considerando a positividade da PCR em amostras de sangue por faixa etária, 26,4% dos contatos com PCR positiva encontravam-se na faixa etária de 0 a 20 anos,

com maior positividade de 11 a 20 anos (15,7%) (Gráfico 09). Entre os contatos negativos para a PCR de sangue ocorreram significantemente mais contatos na faixa etária de 21 a 30 anos do que contatos na faixa etária de 51 a 70 anos (p<0,05).

10,7

15,7

9,5

4,7

9,4

5,3

9,8

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0

0 a 10 11 a 20 21 a 30 31 a 40 41 a 50 51 a 60 > 60 Faixa Etária (anos)

Positividade da PCR em amostras de sangue (%)

Gráfico 09: Positividade da PCR em amostras de sangue segundo faixa etária dos contatos.

(23)

Considerando o tempo de exposição estimado dos contatos ao caso índice, a positividade da PCR em amostras de sangue dos contatos para os períodos de exposição de

0 a 24 meses e 25 a 60 meses foi respectivamente de 30,1% e de 13,1%

(Gráfico 10), independentemente se eles eram contatos de pacientes PB ou MB

11,2

18,9

8,0

5,1

7,5

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0

0 a 12 13 a 24 25 a 36 37 a 60 > 60 Tempo de Exposição (meses)

Positividade PCR em amostras de sangue (%)

Gráfico 10: Porcentagem de positividade da PCR em amostras de sangue de contatos segundo tempo estimado de exposição ao caso índice.

DISCUSSÃO

Apesar do Mycobacterium leprae ser um dos primeiros microrganismos associados com uma doença humana específica, ainda pouco se sabe sobre a transmissão, patologia e epidemiologia da hanseníase (VISSCHEDIJK et al., 2000).

Nos últimos anos diversos estudos têm procurado validar diferentes indicadores para a epidemiologia e controle da hanseníase como métodos moleculares e imunológicos para a detecção do Mycobacterium lepraee a definição de portadores sadios e infecção

subclínica, no entanto, demonstrando resultados variados devido à alta complexidade da doença e metodologias utilizadas.

A utilização de marcadores moleculares como a específica detecção de DNA do Mycobacterium leprae pela PCR, oferece uma ferramenta que permite identificar portadores sadios e com infecção subclínica que podem estar envolvidos na disseminação do bacilo em áreas endêmicas, uma vez que fica difícil de explicar uma verificada exposição generalizada sem a existência de outras formas de transmissão

(24)

além dos pacientes MB (HATTA et al., 1995;

PATROCÌNIO et al., 2005; RAMAPRASAD, 1997).

Pouco ainda se sabe sobre os fatores epidemiológicos e de risco para a hanseníase e este estudo propôs uma nova abordagem utilizando a detecção do DNA do Mycobacterium leprae em amostras de sangue de pacientes com hanseníase e seus contatos domiciliares, em uma tentativa de elucidar aspectos da infectividade e patogenicidade do Mycobacterium leprae.

Neste estudo, a PCR foi utilizada para amplificar fragmentos de 130pb de uma seqüência repetitiva (RLEP3) do genoma do Mycobacterium leprae em amostras de sangue de pacientes com hanseníase e seus contatos domiciliares. Devido a já demonstrada importância das vias aéreas superiores na transmissão e infecção do Mycobacterium leprae, com a detecção de DNA do Mycobacterium leprae na mucosa nasal (PATTYN et al., 1993; HATTA et al., 1995;

ALMEIDA et al., 2004), e posterior detecção de DNA do Mycobacterium leprae em biópsias de corneto nasal (PATROCÌNIO et al., 2005), indicando uma provável rota inicial de entrada e saída do bacilo, a detecção do DNA do Mycobacterium leprae em amostras de sangue indicaria uma provável seqüência da infecção pelos capilares da concha nasal e

posterior liberação na corrente sanguínea, após a invasão da mucosa nasal. Além disto, é possível que amostras não invasivas, como a coleta de swabs, possam apresentar interpretações duvidosas, uma vez que a mucosa nasal é o primeiro local de contato com o microrganismo, mesmo sem o estabelecimento de infecção (VAN BEERS et al., 1994; RAMAPRASAD et al., 1997).

Apesar da PCR da biópsia de corneto nasal demonstrar uma real invasão da mucosa pelo Mycobacterium leprae, sua coleta é dificultosa, necessitando de um profissional capacitado, e é de grande desconforto para o paciente e de pouca indicação de ser realizada em contatos sadios de pacientes. A coleta de sangue demonstra-se então uma amostra clínica alternativa simples e mais viável, sendo que sua realização é um procedimento padrão em diversos exames.

Este trabalho sobre epidemiologia molecular é pioneiro na investigação da detecção de DNA do Mycobacterium leprae em amostras de sangue de pacientes com hanseníase e seus contatos domiciliares correlacionando com a forma clínica, classificação operacional, baciloscopia e PCR em esfregaço dérmico e em biópsia de pele, resultados do teste intradérmico de Mitsuda, teste sorológico ML-Flow, sexo, idade e

(25)

25

período de exposição estimado do contato ao caso índice.

Os resultados gerados com este estudo promoveram evidência da presença do DNA do Mycobacterium leprae em amostras de sangue de pacientes com hanseníase e de contatos de pacientes com hanseníase.

A presença do DNA em uma amostra não demonstra se este organismo encontra-se vivo ou morto, tão pouco indica sua viabilidade (VAN BEERS et al., 1994;

RAMAPRASAD et al., 1997). Porém devido ao Mycobacterium leprae ser um parasita intracelular obrigatório de células de Schwann e células do sistema fagocítico mononuclear e possuir um longo período de incubação e replicação (HASTINGS et al., 1988), e considerando a curta meia-vida de células fagocíticas do sangue é mais provável que o DNA amplificado seja de bacilos vivos (SANTOS et al.,2001), uma vez que os componentes celulares de bacilos mortos, incluindo o DNA, são rapidamente eliminados pela excreção (PARKASH, 2004) .

O presente estudo apesar de não verificar que a porcentagem de positividade da PCR em amostras de sangue de pacientes com hanseníase está diretamente associada ao downgrading das formas clínicas no espectro de classificação de Ridley & Jopling (1966), se relevados os resultados do grupo DV, que

provavelmente por deficiência na amostragem ou comportamento diferencial não se enquadra no padrão, foi possível demonstrar uma correlação linear diretamente proporcional entre o aumento da porcentagem de positividade e o downgrading das formas clínicas no espectro de classificação de Ridley

& Jopling (1966).

A maior porcentagem de pacientes positivos para PCR de sangue entre todos os pacientes de uma das formas clínicas foi de 30%, e foi encontrada entre os 20 pacientes da forma clínica V, uma forma anergica da hanseníase com ausência de resposta celular específica frente ao Mycobacterium leprae e com grande quantidade e proliferação de bacilos (RIDLEY; JOPLING, 1966). Apesar da falta de entendimento do mecanismo da resposta imune celular defasada em pacientes com forma clínica V, e um possível papel dos macrófagos na anergia, a incapacidade do macrófago matar ou inibir o Mycobacterium leprae é uma característica da forma virchowiana da doença (HASTINGS et al., 1988), denotando a probabilidade de que o DNA detectado seja de bacilos vivos provenientes de estágios de estabelecimento e avanço de uma infecção ativa.

A grande porcentagem de positividade para a PCR de sangue encontrada em relação aos pacientes T e DT, formas clínicas da

(26)

doença com avançada resposta imune mediada por célula (RIDLEY; JOPLING, 1966), também pode indicar um constante combate e dano ao Mycobacterium leprae resultando na liberação de vários componentes bacterianos, incluindo DNA, na corrente sanguínea (PARKASH, 2004).

Não foi possível encontrar correlação entre a detecção do DNA do Mycobacterium leprae em amostras de sangue de pacientes e a baciloscopia, sendo que em pacientes com IB de esfregaço dérmico positivo foi encontrada uma maior porcentagem de positividade para a PCR em sangue, e no IB de biópsia de lesão de pele uma maior porcentagem de positividade para a PCR em sangue foi encontrada entre pacientes com IB negativo.

O presente trabalho procurou comparar os resultados encontrados na PCR para detecção do Mycobacterium leprae em sangue de pacientes com os resultados da PCR em esfregaços dérmicos e em biópsias de lesão de pele, utilizados no auxilio da classificação e diagnóstico em doentes. Não foi encontrada qualquer diferença estatística significativa entre os resultados da PCR em esfregaço dérmico e os resultados da PCR em amostras de sangue de pacientes com hanseníase. Na PCR em biópsia de lesão de pele de pacientes foi verificada uma maior positividade para a PCR em sangue de pacientes também

positivos para a PCR em biópsia de pele.

Apesar da não significância estatística dos resultados, a maior porcentagem de positividade de pacientes positivos para ambos os exames, de PCR de biópsia de pele e de sangue, pode estar relacionada com o estabelecimento e a disseminação do bacilo para novas áreas do corpo (RIDLEY; JOB, 1985).

Testes imunológicos contribuem na pesquisa dos aspectos de proteção e patologia na resposta do paciente à doença. O teste de Mitsuda baseia-se principalmente na reatividade do paciente à injeção intradérmica com lepromina, uma suspensão de bacilos Mycobacterium leprae mortos pelo calor. A reação tardia à lepromina é medida em aproximadamente quatro semanas e reflete a indução da resposta imune celular frente ao M.

leprae, manifestada pela formação de um granuloma celular epitelial organizado (HARBOE, 1885). A reatividade à lepromina possui quase nenhum valor de diagnóstico, mas estabelece o perfil imunológico do indivíduo frente ao Mycobacterium leprae e, portanto possui valor de prognóstico (HASTINGS et al., 1988). Neste estudo notou-se uma correlação com os dados já existentes, sendo que maiores porcentagens de positividade à PCR em amostras de sangue foram encontradas em indivíduos com reação

(27)

27

de Mitsuda de 0 a 3 mm, considerado um resultado duvidoso, ou de 4 a 7 mm, considerado um resultado positivo fraco (HARBOE, 1885). Portanto em indivíduos com menor resposta imune celular é possível encontrar mais bacilos, e conseqüentemente apresentar uma melhor resposta a PCR de sangue.

Por ser um parasita intracelular, a resposta imune humoral é provavelmente menos importante na resistência ao Mycobacterium leprae. Em geral, há uma correlação inversa entre a titulação de anticorpos anti-Mycobacterium leprae de um paciente e a potencialidade de sua resposta imune celular frente ao Mycobacterium leprae (HARBOE, 1985; HASTINGS et al., 1988).

Neste estudo não foi verificada qualquer correlação significativa entre os teste ML- Flow com a PCR em amostras de sangue de pacientes com hanseníase (p>0,05), e foi encontrada uma maior porcentagem de positividade para a PCR em sangue de pacientes entre os negativos para o teste ML- Flow.

Apesar de relatos na literatura sobre a maior freqüência de homens do que mulheres afetados pela hanseníase, principalmente em formas do pólo mais bacilífero (NOORDEEN, 1985), no presente estudo foi verificada uma maior positividade para a PCR em sangue de

pacientes mulheres MB e na forma clínica V.

Em relação à idade dos pacientes a maior positividade da PCR para detecção DNA do Mycobacterium leprae foi verificada em amostras de sangue de pacientes na faixa etária de 31 a 60 anos, de acordo com relatos descritos de um aumento e um plateau na incidência da doença nas idades de 30 a 60 anos (NOORDEEN, 1985). Estes são pacientes com grande capacidade de migração e contatos, o que favorece a transmissão e corrobora com a importância do diagnóstico precoce e tratamento com a poliquimioterapia (PQT). A maior positividade para a PCR em sangue, quando analisados somente os pacientes em uma determinada faixa etária, foi encontrada entre pacientes com idade superior a 60 anos, o que pode estar relacionado ao grande período de incubação ou latente da doença, e também à probabilidade da doença ser resultado de re-infecção ou super-infecção de indivíduos previamente infectados e cuja capacidade de reação à infecção e defesa imunológica tornou-se menos eficiente no decorrer da idade (NOORDEEN, 1985).

Em contatos domiciliares de pacientes com hanseníase a porcentagem de positividade da PCR foi de 10,1%, pouco mais da metade encontrada em pacientes nesta investigação, sendo que outro trabalho encontrou uma positividade de 1,7% (2/119) (ALMEIDA,

(28)

2004). As diferenças de positividade podem ter ocorrido tanto pelo tamanho reduzido das amostras, quanto pela diferença na padronização da coleta de amostras, método de extração e otimização da PCR desta outra investigação.

Nos contatos domiciliares de pacientes com hanseníase, foi estabelecida uma correlação inversa entre a positividade da PCR em sangue e os resultados do teste de Mitsuda, isto é, quanto maior a leitura em milímetros da pápula intradérmica, menor a positividade da PCR em amostras de sangue. Isto poderia indicar uma possível proteção contra a infecção do bacilo conferida pelo aumento da positividade ao teste de Mitsuda, ou seja, pela imunidade celular do indivíduo (HARBOE, 1985).

Neste estudo não foi verificada qualquer correlação significativa entre os teste ML-Flow e a PCR em amostras de sangue de contatos de pacientes com hanseníase, e uma maior porcentagem de positivos para a PCR em sangue foi encontrada entre contatos ML- Flow negativo, o que parece indicar que a maioria dos contatos com PCR positiva no sangue são portadores sadios. A positividade para a PCR em amostras de sangue encontrada em contatos ML-Flow positivos sugere a probabilidade de infecção subclínica, que pode ser caracterizada pelo aumento na

titulação de anticorpos anti-Mycobacterium leprae (HARBOE, 1985).

Entre os contatos domiciliares de pacientes com hanseníase foi verificada uma maior positividade para a PCR em sangue em mulheres do que homens com caso índice MB, e em homens do que mulheres com caso índice PB. Em relação à forma clínica do caso índice, mulheres apresentaram positividade superior do que homens nas formas clínicas T, DD e DV, e homens apresentaram porcentagens superiores do que mulheres nas formas clínicas DT e V, porém não ocorreu diferença estatística significativa entre estes valores.

Na correlação da idade dos contatos domiciliares de pacientes com hanseníase, nota-se que a maior positividade da PCR em amostras de sangue foi encontrada na faixa etária de 0 a 20 anos, o que pode ser explicado pela exposição prolongada à descarga nasal do doente, sendo que indivíduos nessa faixa etária são geralmente filhos e dependentes que coabitam o mesmo domicílio que o doente a vários anos (VAN BEERS et al., 1999). Entre os contatos negativos para a PCR de sangue ocorreram significantemente mais contatos na faixa etária de 21 a 30 anos do que contatos na faixa etária de 51 a 70 anos, o que poderia ser explicado pela maior capacidade de reação à infecção por pessoas jovens com defesa

(29)

29

imunológica mais eficiente (NOORDEEN, 1985).

Quando analisado o tempo de exposição estimado dos contatos ao caso índice, foi verificada uma maior positividade para a PCR em amostras de sangue dos contatos nos períodos de exposição de 0 a 24 meses, o que pode estar relacionado a um período de contato inicial do contato com o M.

leprae, e não significa conseqüente desenvolvimento da doença. A maioria das pessoas resiste efetivamente à infecção pelo Mycobacterium lepraemesmo em áreas altamente endêmicas. É calculado que mais de 200 indivíduos são infectados pelo Mycobacterium lepraepara cada indivíduo que desenvolve a doença e é detectado. Para aqueles indivíduos que não conseguem resistir à infecção pelo M. leprae, o período de incubação varia, mas é normalmente de 2 a 4 anos (HASTINGS et al., 1988). Esta observação, e a provável existência de pessoas assintomáticas e com infecção subclínica, sugerem a utilização da PCR em sangue na identificação de casos de difícil diagnóstico conjuntamente com a avaliação clínica e outras técnicas, na definição de grupos com maior risco de desenvolver a doença, e na pesquisa de novas fontes de transmissão e infecção do Mycobacterium leprae.

A resposta imune do organismo envolve primariamente, o reconhecimento do patógeno e a elaboração de uma reação dirigida a este elemento, a fim de eliminá-lo do organismo (HARBOE, 1985). Um grupo importante de leucócitos está envolvido na resposta imune do organismo contra o M.

leprae, e estas são células fagocitárias e constituem-se de monócitos, macrófagos e neutrófilos polimorfonucleares, populações celulares que reconhecem bacilos invasores através de um padrão inato de reconhecimento de receptores (VAN de VOSSE et al., 2004).

Estas células ligam-se ao microrganismo, o englobam e o destrói. Alguns fagócitos podem capturar antígenos e apresentá-los aos linfócitos T num processo denominado apresentação de antígeno (GOULART et al., 2002b). Provavelmente macrófagos infectados com micobactérias são menos eficientes em expressar antígenos micobacterianos em sua superfície, permitindo à micobactéria sobreviver e se esconder no interior de macrófagos (HASTINGS et al., 1988).

É relatado na literatura que a resposta imune frente ao M. leprae, sua eliminação ou estabelecimento da doença, está intimamente ligada aos padrões de citocinas, relacionado à quantidade, período de produção e disponibilidade no sítio da infecção, e devido

(30)

a interações entre o Mycobacterium leprae e células fagocitárias, está também ligada à incapacidade de secreção no interior do fagossomo de agentes microbicidas, como os reativo intermediários do oxigênio (ROI), e a escassez de reações citotóxicas e apoptose (GOULART et al., 2002).

O principal meio de entrada e saída do Mycobacterium lepraeé a mucosa nasal. Além de trabalhos relatando a presença de DNA de Mycobacterium lepraeem swab nasal de pacientes, contatos de pacientes e pessoas sadias (PATTYN et al, 1993; HATTA et al, 1995; ALMEIDA et al, 2004), foi descrito também a detecção de DNA em amostras de biópsia de corneto nasal de pacientes e contatos (PATROCÌNIO et al, 2005), determinando uma provável rota inicial de infecção. Após a infecção na mucosa, provavelmente células apresentadoras de antígenos infectadas migram através dos vasos linfáticos aferentes para o paracortex dos linfonodos drenantes, onde interagem com muitos linfócitos, desencadeando uma resposta imune adequada (HARBOE, 1985).

O sangue periférico não constitui um ambiente adequado ao desenvolvimento e sobrevivência do Mycobacterium lepraedevido ao crescimento preferencial em partes com temperaturas menores que a temperatura corporal central (HASTINGS et

al, 1988). É provável que o DNA do Mycobacterium lepraeseja somente detectado no sangue em um breve período no qual células infectadas migram para os linfonodos ou troncos nervosos periféricos onde a micobactéria se desenvolve (RIDLEY; JOB, 1985), mas o exato período de tempo no qual isto ocorre não foi possível de ser deduzido com este estudo.

Os resultados obtidos através da aplicação da PCR em amostras de sangue de pacientes com hanseníase e seus contatos, apresentam conjuntamente com outros exames, uma possibilidade de determinação de um grupo de risco, no qual poderia ser administrada a quimioprofilaxia, a fim de auxiliar nas medidas de contensão da doença e redução da incidência.

CONCLUSÃO

Com este estudo foi possível detectar a presença do DNA do Mycobacterium leprae em amostras de sangue de pacientes com hanseníase e seus contatos domiciliares, e demonstrou que a presença do DNA de Mycobacterium lepraeem amostras de sangue não está restrita somente a pacientes com hanseníase. Foi possível também correlacionar este teste com os demais testes utilizados na pesquisa da hanseníase, e elucidar prováveis

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utilizações deste teste na caracterização e investigação da epidemiologia molecular da hanseníase.

Pode-se dizer que o contato com uma fonte de infecção seja ela um doente, portador sadio, animal ou ambiente, pode levar à contaminação, na qual a positividade na PCR de swab nasal pode ser uma conseqüência (GOULART et al., 2001); posteriormente à contaminação pode ocorrer a infecção, na qual a positividade na PCR de biópsia de corneto nasal pode ser uma expressão (PATROCÍNIO et al., 2005); e subseqüentemente à infecção pode ocorrer o estabelecimento, disseminação ou reação imunológica ao Mycobacterium leprae, que podem ser expressos pela positividade na PCR em amostras de sangue.

Sabe-se que apenas um pequeno número de pessoas infectadas desenvolve a doença. A transição da contaminação, para a infecção, e para a doença é provavelmente determinada por vários fatores como a intensidade e freqüência de contato com o patógeno, debilidades imunológicas do indivíduo, inseridas também as predisposições genéticas individuais na suscetibilidade ou resistência à infecção e disseminação do Mycobacterium leprae(GOULART et al., 2002b).

A utilização da PCR para detecção do DNA de Mycobacterium lepraeem amostras de sangue de contatos domiciliares de

pacientes com hanseníase foi útil para demonstrar a existência de portadores sadios, e prováveis infectados subclinicamente. Nota- se que os contatos apresentam pouco mais da metade da porcentagem de positividade à PCR em amostras de sangue daquela encontrada em pacientes, o que poderia indicar que os contatos também são portadores e potenciais disseminadores do bacilo em áreas endêmicas pois, por sua vez, não são tratados.

A positividade à PCR em amostras de sangue para detecção do DNA de Mycobacterium lepraeevidenciada neste presente estudo, estabelece subsídios para utilização da quimioprofilaxia em contatos domiciliares de pacientes com hanseníase como uma das intervenções adicionais para a redução da transmissão, e conseqüentemente, redução da incidência da hanseníase em países endêmicos.

São necessários maiores estudos com relação à detecção do DNA do Mycobacterium lepraeem amostras de sangue de pacientes com hanseníase e seus contatos, e também na população sadia de áreas endêmicas, para que possa ser melhor avaliada a presença do bacilo no sangue e suas prováveis implicações na infecção, no desenvolvimento da doença e na sua transmissão.

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