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MAÍRA NOGUEIRA DE ALMEIDA
CARACTERIZAÇÃO DO PAPEL DO GENE TCP5 NO
DESENVOLVIMENTO FLORAL DE Arabidopsis thaliana
CAMPINAS
2015
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RESUMO
Os fatores de transcrição da família TCP são amplamente distribuídos no reino vegetal e, desde sua primeira descrição em 1999, novas descobertas demonstraram sua importância na evolução e controle do desenvolvimento de plantas. Entre as funções conhecidas dos genes TCP estão: o controle da dominância apical e da simetria de órgãos, bem como da curvatura da superfície foliar e da senescência.
Este trabalho teve como objetivos a caracterização da função do gene TCP5 no desenvolvimento floral de Arabidopsis thaliana, através do estudo de seu padrão de expressão e da caracterização morfológica de plantas transgênicas apresentando alterações da expressão deste gene.
Análises de RT-PCR revelaram a presença de transcritos de TCP5 em inflorescências, indicando um possível papel no desenvolvimento floral. O padrão de expressão espacial e temporal de TCP5 foi analisado através de hibridização in situ. Os transcritos localizam-se em meristemas de inflorescência e meristemas florais, e preferencialmente na região apical dos primórdios de órgãos florais.
Estudos com plantas transgênicas superexpressando TCP5 na epiderme (construção
pATML1:TCP5) revelaram que estas possuem pétalas com comprimento significativamente
maior e com forma distinta do genótipo selvagem. Ainda, a análise destas plantas transgênicas com o uso de microscopia eletrônica de varredura revelou a presença de más-formações no gineceu e germinação ectópica de grãos de pólen. Plantas superexpressando um microRNA artificial (35S:miR-3TCP) que desliga a expressão dos genes do clado TCP5-like (TCP5, TCP13 e TCP17) apresentaram sépalas, pétalas e carpelos maiores do que o tipo selvagem. Juntos, os resultados corroboram a hipótese de que o gene TCP5 atua nos mecanismo de maturação de órgãos florais, determinando tamanho e forma através da regulação dos processos de proliferação e expansão celular.
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ABSTRACT
The TCP family of transcription factors is widely distributed in the plant kingdom, and since its first description in 1999, new discoveries have shown its importance in evolution and control of plant development. Among the known functions of TCP genes are: the control of apical dominance and symmetry of organs as well as the curvature of leaf surface and senescence.
The aims of this study were: to characterize TCP5 gene function in Arabidopsis
thaliana floral development, through the study of its expression pattern and morphological
characterization of transgenic plants with differential expression of the gene.
RT-PCR analysis revealed the presence of TCP5 mRNA in inflorescences, suggesting a possible role in flower development. Spatial and temporal pattern of expression of TCP5 was analyzed by in situ hybridization. Transcripts are located in inflorescence meristem and floral meristems, and preferably in the apical region of the floral organ primordia.
Studies with transgenic plants overexpressing TCP5 in the epidermis (pATML1:TCP5 construction) revealed longer petals than the wild-type. Still, the analysis of these transgenic lines by scanning electron microscopy revealed malformations in the gynoecium and ectopic germination of pollen grains. Overexpression of an artificial microRNA that turns off the expression of TCP5-like clade genes (TCP5, TCP13 and
TCP17) in 35S:miR-TCP plants showed bigger sepals, petals and carpels than the wild type.
Together, these results support the hypothesis that TCP5 gene operates in the mechanisms of floral organ maturation, determining size and shape through the regulation of cell proliferation and expansion processes.
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SUMÁRIO
1. Introdução ... 1
1.1. O desenvolvimento de Arabidopsis thaliana ... 1
1.2. Fatores de transcrição e microRNAs ... 3
1.3. A família TCP de fatores de transcrição ... 4
1.4. TCPs de classe II e suas funções no desenvolvimento vegetal ... 5
1.5. TCP5 e novas perspectivas ... 7 2. Objetivos ... 9 3. Material e Métodos... 10 3.1. Material Vegetal ... 10 3.2. Caracterização da expressão de TCP5 ... 11 3.2.1. RT-PCRs ... 11 3.2.2. Hibridização in situ ... 12 3.3. Caracterização morfológica ... 13
3.3.1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia óptica ... 13
3.3.2. Análises de morfometria geométrica e linear ... 14
3.3.3. Análises de área celular ... 16
4. Resultados e discussão ... 18
4.1. Expressão gênica ... 18
4.1.1. RT-PCRs ... 18
4.1.2. Hibridização in situ ... 19
4.2. Caracterização morfológica ... 25
4.2.1. Análises de morfometria geométrica ... 33
4.2.2. Análises de morfometria linear ... 43
4.2.3. Efeitos da alteração da expressão de TCP5 no tamanho das células da epiderme adaxial de pétalas ...47
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AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo “FAPESP”, que tornou possível a elaboração desta dissertação de mestrado, pela concessão da bolsa de mestrado no país, referente ao processo n° 2012/23385-2.
À Universidade Estadual de Campinas, em especial ao Instituto de Biologia e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal, pela formação acadêmica.
Ao Prof. Dr. Marcelo Carnier Dornelas, pela oportunidade de orientação, pelo trabalho desenvolvido desde a Iniciação Científica ao Mestrado, e pelos aprendizados que este trabalho proporcionou à minha vida acadêmica, pessoal e profissional.
Às professoras da banca examinadora por aceitarem o convite e contribuírem de forma sempre prestativa para o meu aprendizado e enriquecimento do trabalho.
Aos amigos que passaram pelo laboratório e aos que ficaram ao longo desses dois anos, pelo apoio mútuo nos momentos difíceis e pelos bons momentos cheios de cafés, comidas e risadas. Em especial à amiga Natália, pelo trabalho em equipe, pela amizade dentro e fora do laboratório e pela ajuda sempre dedicada, sem esperar nada em troca.
Aos meus amigos, por compartilharem comigo todas as conquistas e frustrações, deixando tudo mais leve, entre sorrisos e abraços, bares e jantares, festas e viagens...
Ao Villa, pelos sete anos de amizade, companhia e amor, e por sempre me ajudar a me sentir segura para seguir em frente.
À minha família, pelo amor incondicional, por me apoiar em todas as escolhas e por ter fornecido todas as bases para que eu pudesse chegar até aqui, me dando os maiores exemplos de educação, trabalho e ternura.
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1. Introdução
1.1. O desenvolvimento de Arabidopsis thaliana
Explicar os mecanismos que deram origem à enorme diversidade morfológica dos seres vivos é um dos grandes desafios da biologia. O estudo do conjunto de eventos que ocorrem ao longo do desenvolvimento – desde a formação do zigoto até a obtenção da forma final dos organismos adultos – torna-se fundamental para obter respostas a respeito do desafio de entender os mecanismos que geram a diversidade da vida. Além disso, o entendimento dos mecanismos moleculares do desenvolvimento dos seres vivos permite entender como diferentes fatores combinam-se para formar uma rede, conectando as proteínas específicas a tecidos particulares e a mudanças que causam nas propriedades celulares, culminando na determinação da forma final dos órgãos (Scott et al. 2000). Além disso, se considerarmos que o desenvolvimento é consequência de padrões espaciais e temporais precisos de expressão gênica, é no contexto do desenvolvimento que a evolução da regulação gênica é mais relacionada à evolução da forma dos organismos (Chen & Rajewsky 2007).
A pesquisa com organismos modelo, como Arabidopsis thaliana, proporcionou valiosos conhecimentos em muitos aspectos da biologia vegetal, e especialmente em biologia do desenvolvimento, com os principais trabalhos envolvendo a identificação dos fatores que determinam a transição para o florescimento (Koornneef et al. 1998) e a construção de modelos para explicar o controle molecular da formação de padrões durante o desenvolvimento floral (Coen & Meyerowitz 1991).
Arabidopsis thaliana é uma pequena planta herbácea, pertencente à família
Brassicaceae, que se tornou o principal organismo modelo para uma série de pesquisas em biologia vegetal (Meinke 1998). Além da facilidade de cultivo, devido a seu tamanho reduzido, tempo curto de geração e alta fecundidade, A. thaliana possui as conveniências de ser facilmente transformada para gerar organismos transgênicos e do tamanho reduzido do genoma, um dos menores dentre as plantas superiores (Koornneef & Scheres 2001). Os conhecimentos existentes atualmente em desenvolvimento de plantas vieram, em grande parte, dos detalhados estudos sobre os eventos que ocorrem desde a embriogênese de A.
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Em plantas, a maior parte das estruturas adultas é derivada de apenas duas regiões que são mantidas após a germinação: os meristemas apicais caulinar e radicular. Em A.
thaliana, o meristema apical caulinar converte-se de um meristema vegetativo, que produz
folhas em padrão espiralado, para um meristema de inflorescência, que produz meristemas florais (e então, flores) também num padrão espiralado (Wolpert et al. 2011).
O desenvolvimento floral pode ser dividido em estágios, de acordo com Smyth e colaboradores (1990). O surgimento dos meristemas florais demarca o estágio 1, e quando estes separam-se do meristema de inflorescência por um sulco, há o início do estágio 2. O início do desenvolvimento dos órgãos florais começa quando há o aparecimento de uma protuberância no meristema floral, causada pelas divisões celulares de camadas internas. Esta protuberância corresponde ao primeiro primórdio, que se tornará uma sépala abaxial. Os primórdios subsequentes de sépalas surgem num padrão cruciforme (estágio 3). No estágio 4, o primeiro primórdio formado (sépala abaxial) começa a recobrir o meristema floral. Os primórdios que formarão pétalas e estames então surgem quase simultaneamente (estágio 5). Neste e no estágio seguinte (estágio 6), os quatro primeiros primórdios começam a tomar identidade de sépalas e os seguintes permanecem indeterminados. O estágio 7 é marcado pelo início da diferenciação das células que formarão os filamentos das anteras nos primórdios de estames. No estágio 8, os primórdios de estames prosseguem o desenvolvimento, formando filetes e anteras; os primórdios de carpelos formam um tubo; enquanto os primórdios de pétalas permanecem com forma e tamanho pouco alterados. Estes começam um crescimento rápido no estágio 9, onde já começam a formar uma lâmina estreita na base. Também nesta fase, inicia-se a formação de tétrades de esporos nas anteras e de óvulos nos carpelos, e o botão, de forma geral, mais do que dobra de tamanho. As pétalas atingem a altura dos estames laterais no estágio 10, mesmo estágio em que ocorre o fechamento do gineceu e a diferenciação dos tipos celulares da epiderme característicos de cada órgão. O aparecimento da papila estigmática marca o estágio 11, juntamente com o inicio da diferenciação em estilete e ovário. Quando as pétalas atingem a altura dos estames mediais, inicia-se o estágio 12. É o último estágio antes da antese, e é quando o desenvolvimento dos gametas se completa.
O controle rígido dos processos que ocorrem durante o desenvolvimento floral é de fundamental importância para a formação correta dos padrões que darão origem à forma
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final dos órgãos. Isto é garantido pela interação entre os componentes das redes regulatórias gênicas. Fatores de transcrição (FTs) e microRNAs (miRNAs) representam os componentes mais abundantes das redes regulatórias de genomas multicelulares (Hobert 2008).
1.2. Fatores de transcrição e microRNAs
Fatores de transcrição (FTs) e microRNAs (miRNAs) são as maiores famílias de moléculas regulatórias em trans (que se ligam a elementos cis-regulatórios): FTs ligam-se a sequências de DNA, e miRNAs ligam-se a mRNAs, cada um controlando dezenas ou centenas de genes-alvo. Além disso, a maioria, se não todos, os genes de um genoma, são controlados não por um, mas por uma combinação de fatores de ação em trans. A cooperação entre múltiplos fatores de transcrição, e de miRNAs entre si, gera a ação combinatória que compõe as múltiplas redes regulatórias gênicas (Hobert 2008).
Fatores de transcrição ligam-se a regiões regulatórias do DNA, ativando ou reprimindo a expressão de genes. A capacidade dos FTs em definir programas de expressão gênica depende do padrão de expressão destes próprios FTs. Além disso, outras camadas de programas regulatórios existem, formando uma rede hierarquizada de reguladores. Por exemplo, sabe-se que 68% dos alvos de miRNAs em A. thaliana codificam FTs (Jones-Rhoades et al. 2006), e que os perfis de expressão destes miRNAs são, por sua vez, amplamente regulados por mecanismos mediados por outros FTs (Hobert 2008). Desta forma, vê-se a complexidade das redes regulatórias, que possuem vários níveis de regulação hierarquizados, além da interligação dos diferentes membros da rede, exemplificados pelos miRNAs e FTs.
Em plantas, os fatores de transcrição alvo de miRNAs têm uma notável propensão a estarem envolvidos na formação de padrões e desenvolvimento. Por exemplo, a regulação de APETALA2 (AP2) e genes AP2-like mediada por miR172 é necessária para a especificação adequada de órgãos durante o desenvolvimento floral. Além disso, a via de sinalização que envolve os fatores de transcrição ARFs, mediadores das respostas à auxina, é amplamente regulada por miRNAs (Jones-Rhoades et al. 2006).
A importância dos miRNAs no desenvolvimento de plantas é evidenciada pelas anormalidades vistas em mutantes ou plantas transgênicas com defeitos ou superexpressão da atividade de miRNAs. Por exemplo, a superexpressão de miR319a causa defeitos na
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forma de folhas, que ficam mais onduladas e com as margens serreadas, dando origem ao fenótipo JAGGED AND WAVY (jaw-D) de A. thaliana. Análises de expressão nestas plantas revelaram a diminuição drástica dos transcritos de 5 genes pertencentes à família TCP de fatores de transcrição (Palatnik et al. 2003).
A família TCP de fatores de transcrição forma um pequeno, porém amplamente distribuído grupo de genes planta-específicos, associados a diversas inovações morfológicas e à diversificação de formas em plantas (Koyama et al. 2011). Os TCPs regulam diversos processos envolvidos no desenvolvimento, tais como a diferenciação de forma e tamanho em órgãos florais e folhas (Cubas 2004; Barkoulas et al. 2007), e padrões de ramificação de órgãos vegetativos (Aguilar-Martínez et al. 2007). As características destes genes e os caracteres que eles controlam os fazem excelentes sistemas para responder algumas questões importantes a respeito da evolução morfológica das angiospermas (Cubas 2002).
1.3. A família TCP de fatores de transcrição
Os genes TCPs compõem uma família gênica conservada em plantas, cujos membros codificam proteínas com o domínio TCP, de 59 aminoácidos, que permite a ligação ao DNA e interações proteína-proteína (um domínio bHLH “basic helix-loop-helix” modificado) (Kosugi & Ohashi 1997; Cubas 2004). Este domínio foi primeiramente identificado em quatro proteínas, das quais o nome TCP foi formado: TEOSINTE-BRANCHED1 (TB1), de plantas de milho (Zea mais); (Doebley et al. 1997); CYCLOIDEA (CYC), de Antirrhinum majus (Luo et al. 1999); e PROLIFERATING CELL FACTORS (PCF), de plantas de arroz (Oriza sativa) (Kosugi & Ohashi 1997). Análises dos mutantes para os genes que codificam estas proteínas evidenciam a diversidade de processos que estão sob o controle dos TCPs: o gene TB1 afeta o crescimento de gemas axilares em milho; o gene CYC controla a simetria floral em Antirrhinum (Luo et al. 1999); e o gene PCF1 está envolvido na regulação de um gene relacionado à replicação e reparo de DNA e ao controle do ciclo celular (Kosugi & Ohashi 1997).
A planta-modelo deste estudo, Arabidopsis thaliana, possui 24 genes da família TCP em seu genoma (Aguilar-Martínez et al. 2007), que podem ser divididos em duas classes, baseando-se em diferenças existentes em resíduos de aminoácidos do domínio TCP
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(Kosugi & Ohashi 2002). A classe I, também chamada de classe PCF, é formada por 13 proteínas, e foi associada à promoção da divisão celular (Kosugi & Ohashi 2002; Li et al. 2005); enquanto a classe II, também chamada de TCP-CIN, é formada por 11 proteínas, e foi associada à promoção da expansão e diferenciação celulares (Nath et al. 2003).
A classe II de TCPs pode ainda ser subdividida em dois clados (Martín-Trillo & Cubas 2010). O primeiro deles, chamado de CYC/TB1 (ou ECE), inclui genes envolvidos principalmente no desenvolvimento de gemas axilares, que dão origem a flores ou ramificações laterais (Howarth & Donoghue 2006). O segundo, chamado de CIN-like (Figura 1), está relacionado ao gene CINCINNATA de Antirrhinum majus. É formado por 8 membros, alguns dos quais estão envolvidos no controle do crescimento de primórdios foliares (Palatnik et al. 2003). O gene TCP5, que será objeto deste estudo, faz parte da classe II, clado CIN-like (fig. 1).
1.4. TCPs de classe II e suas funções no desenvolvimento vegetal
Os TCPs de classe II foram amplamente estudados e caracterizados, e o papel proposto para estes genes, baseado na caracterização de fenótipos de mutantes simples e múltiplos, consiste na prevenção do crescimento e da proliferação celular (Martín-Trillo & Cubas 2010). Assim, mutantes para TCPs de classe II têm fenótipos associados à perda da capacidade de repressão do crescimento e proliferação celular. Mutantes famosos são, por exemplo, os mutantes cyc de Antirrhinum, em que a redução da simetria bilateral de flores é resultado do aumento do crescimento de pétalas dorsais (Luo et al. 1999); além dos mutantes tb1 de plantas de milho, em que o aumento da proliferação celular em gemas laterais causa uma maior ramificação (Doebley et al. 1997). No entanto, os fenótipos relacionados a TCPs de classe II melhor estudados estão relacionados aos genes CIN-like.Primeiramente estudado em Antirrhinum majus, o gene CIN possui a função de coordenar a proliferação celular, o que é necessário para a formação de uma lâmina foliar plana (Nath et al. 2003). Em A. thaliana, a expressão de 5 dos 8 genes CIN-like é regulada por um microRNA denominado miR319/JAW. A superexpressão deste miRNA causa o fenótipo JAGGED AND WAVY (jaw-D), que está relacionado a uma curvatura excessiva das folhas, que ficam com as margens serreadas (Palatnik et al. 2003). Nestas plantas, a proliferação de células foliares é prolongada, originando folhas com mais células, porém
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menores do que as células do tipo selvagem. Os genes CIN-like silenciados no mutante
D são: TCP2, TCP3, TCP4, TCP10 E TCP24, e foram chamados, portanto, de
jaw-TCPs. O clado contendo os genes TCP5, TCP13 e TCP17 não está sob a regulação de miR319/JAW e é chamado de TCP5-like (fig.1). Quando os genes deste clado possuem expressão reduzida artificialmente, o resultado é a produção de plantas com folhas maiores, contendo células menores que as observadas no tipo selvagem (Efroni et al. 2008).
Figura 1. Representação gráfica dos 24 TCPs de Arabidopsis. As sequências completas de
proteínas foram comparadas usando ClustalX. A árvore foi produzida através do TreeView. Os TCPs são divididos em duas classes: classe I (fundo cinza) e classe II. Dentro da classe II, as proteínas pertencentes ao clado like estão destacadas em negrito. A subdivisão do clado CIN-like está indicada na figura (clados jaw-TCPs eTCP5-CIN-like).
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Os genes CIN-like controlam, portanto, o desenvolvimento de folhas (Palatnik et al. 2003; Nath et al. 2003; Koyama et al. 2007; Schommer et al. 2008; Sarojam et al. 2010; Koyama et al. 2010), além de vários aspectos do desenvolvimento, como: diferenciação celular (Sarojam et al. 2010; Sarvepalli & Nath 2011), biossíntese e/ou sinalização de diversos hormônios (Schommer et al. 2008; Koyama et al. 2010; Yanai et al. 2011; Efroni et al. 2013), e também florescimento e desenvolvimento floral (Palatnik et al. 2003; Crawford et al. 2004; Schommer et al. 2008; Koyama et al. 2010; Rubio-Somoza & Weigel 2013). Além disso, as proteínas TCPs interagem com proteínas do relógio biológico (Giraud et al. 2010) e remodeladores de cromatina (Efroni et al. 2013). As funções dos TCPs regulados por miR319 também foram descritas em diferentes plantas com folhas simples e compostas, tais como Antirrhinum (Nath et al. 2003; Crawford et al. 2004) e espécies de Solanaceae (Ori et al. 2007; Shleizer-Burko et al. 2011; Yanai et al. 2011).
Estudos recentes destacaram-se por evidenciar a importância dos TCPs de classe II como reguladores-chave de processos do desenvolvimento. Koyama e colaboradores (2010) demonstraram que TCPs CIN-like possuem papel central no controle da morfogênese de órgãos laterais através do controle negativo da expressão de genes de determinação de fronteiras, nomeadamente, os genes CUC, que controlam a iniciação do meristema apical e a morfogênese de fronteiras entre os órgãos. A regulação negativa dos genes CUC é um processo central na coordenação da diferenciação de células da folha (Koyama et al. 2007). Genes CUC regulam positivamente genes KNOX, que mantêm as células indiferenciadas. Em contraste, os TCPs CIN-like regulam negativamente a expressão de genes CUC, inibindo o estado indiferenciado de células. Esta regulação negativa ocorre de maneira indireta; sendo que ASYMMETRIC LEAVES1, miR164 e genes de resposta à auxina são possivelmente ativados diretamente pelos TCPs (Koyama et al. 2010).
1.5. TCP5 e novas perspectivas
Efroni e colaboradores (2008), a fim de entenderem melhor o papel dos CIN-TCPs produziram diversos mutantes para este grupo de genes em A. thaliana. Mutantes homozigotos para o gene TCP5 não apresentaram fenótipo macroscópico óbvio nas partes vegetativas (Efroni et al. 2008). Mutantes triplos para todos os genes TCP5-like (TCP5,
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do pecíolo. O desligamento de todos os genes CIN-like produziu folhas grandes, com uma maior quantidade de células, menores do que as observadas na planta selvagem. Juntos, os resultados mostram que o papel principal dos CIN-TCPs é a promoção da diferenciação e da expansão celular. A inativação tardia desses TCPs tem efeito muito reduzido ou nulo no desenvolvimento da lâmina foliar. Isso implica que a regulação da maturação é mediada primariamente por uma expressão precoce de CIN-TCPs (Efroni et al. 2008).
Koyama e colaboradores (2011) também estudaram as funções dos genes CIN-like em A. thaliana através da análise de mutantes e do padrão de expressão destes genes. Mutantes quádruplos (tcp3/4/5/10) apresentaram folhas maiores e, apesar de não caracterizarem o fenótipo em detalhes, estes autores mencionam a produção de pétalas onduladas. Em mutantes quíntuplos (tcp3/4/5/10/13) reportou-se a presença de folhas com margens onduladas e pétalas serreadas (Koyama et al. 2011). Estudos de RT-PCR revelaram a presença de transcritos do gene TCP5 em todos os órgãos das plantas, com exceção da raiz (Koyama et al. 2007). Os resultados sugerem o envolvimento dos genes
CIN-like na promoção da diferenciação de folhas, mas também há a possibilidade destes
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2. Objetivos
O objetivo principal do trabalho foi elucidar os possíveis papéis do gene TCP5 no desenvolvimento floral de Arabidopsis thaliana. Para isto, objetivos específicos foram estabelecidos:
A. Caracterizar o padrão global de expressão do gene TCP5 (em raízes, folhas, ápices reprodutivos e frutos), com o uso de RT-PCRs;
B. Caracterizar o padrão de expressão espacial e temporal de TCP5 ao longo do desenvolvimento floral, com o uso de hibridização in situ;
C. Determinar se alterações nos níveis e locais de expressão de TCP5 possuem efeito no desenvolvimento reprodutivo de A. thaliana, caracterizando o desenvolvimento floral das seguintes construções transgênicas:
- superexpressão do gene TCP5 na camada L1 do meristema (pATML1:TCP5); - superexpressão de um miRNA artificial que silencia os genes do clado TCP5-like, a saber: TCP5, 13 e 17 (35S:miR-3TCP);
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3. Material e Métodos
3.1. Material Vegetal
Plantas do tipo selvagem, transgênicas e mutantes de Arabidopsis thaliana (L.) foram cultivadas em câmaras de crescimento do Departamento de Biologia Vegetal do IB, Unicamp, em Campinas, SP. As plantas foram cultivadas em substrato comercial (Plantmax) e mantidas a 21-22 °C em dias curtos (8h de luz) por 2 semanas e depois transferidas para dias longos (16 horas de luz), sob mesmas condições de temperatura. O genótipo considerado “selvagem” é o ecotipo Columbia (Col-0). Todas as linhagens transgênicas ou mutantes utilizadas possuem background Columbia (o mesmo do tipo selvagem). Foram estudadas plantas mutantes simples tcp5 e linhagens de plantas transgênicas expressando em homozigose as construções pATML1:TCP5 e 35S:miR-3TCP.
As plantas de genótipo tcp5 possuem mutação por inserção de T-DNA, e correspondem às linhagens homozigotas. As sementes foram obtidas em colaboração com o grupo do Prof. Gerco Angenent (Universidade de Wageningen, Holanda), assim como as sementes das linhagens pATML1:TCP5 e 35S:miR-3TCP.
O promotor pATML1 – promotor do gene ATML1 (Arabidopsis thaliana meristem L1 layer) – foi usado para expressar TCP5 na epiderme. Estudos anteriores mostram que este promotor possui expressão específica na epiderme durante o desenvolvimento inicial de folhas, inflorescências e embriões (Bai et al. 2010). Neste estudo, foram analisados dois genótipos diferentes desta mesma linhagem, que diferem no local do genoma em que a construção transgênica se inseriu, e que, portanto, podem expressar com intensidades diferentes o transgene, resultando em fenótipos diferentes. Em alguns casos, estes genótipos foram tratados separadamente, com o intuito de determinar qual deles possuiria um fenótipo mais evidente. Serão aqui denominados como os genótipos 4226 e 4227.
As plantas com a construção 35S:miR-3TCP expressam constitutivamente um miRNA artificial que diminui drasticamente o nível de transcritos dos genes do clado
TCP5-like: TCP5, TCP13 e TCP17. O nome desta linhagem será, algumas vezes, abreviado
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3.2. Caracterização da expressão de TCP5
3.2.1. RT-PCRs
As sequências de nucleotídeos dos cDNAs dos genes TCP5, TCP13, TCP17 e
ACTIN 1 foram obtidas no banco de dados público GenBank (NCBI Reference Sequence:
NM_125490.2, NM_180170.2, NM_120889.1 e NM_001036427, respectivamente). Primers específicos foram desenhados em região gene-específica, excluindo-se a região 5’ e o domínio conservado TCP, através do software Primer3 (Rozen & Skaletsky 2000). As sequências dos primers estão relacionadas na tabela 1. Amostras de raízes, folhas, inflorescências (ápices em fase reprodutiva contendo botões florais em diferentes estágios do desenvolvimento), flores em antese e frutos em diversos estágios de desenvolvimento, de plantas do tipo selvagem, foram coletadas em nitrogênio líquido. Em seguida foram maceradas e submetidas à extração de RNAs totais com o uso de Trizol (Life Sciences), de acordo com as instruções do fabricante. Os RNAs totais então obtidos foram submetidos à transcrição reversa com o uso do kit SuperScript III First Strand Synthesis (Life Sciences), de acordo com as instruções do fabricante, e as fitas de cDNA resultantes, utilizadas como molde nas reações de PCR com os primers obtidos acima. As condições de PCR, principalmente a temperatura de anelamento, foram determinadas experimentalmente de acordo com a composição de bases dos primers desenhados. Controles positivos e negativos adequados foram utilizados e réplicas experimentais e biológicas foram feitas. Os produtos de PCR das diferentes amostras, bem como dos controles, foram separados por eletroforese em gel de agarose e os resultados obtidos foram documentados fotograficamente e analisados.
Tabela 1. Sequência de nucleotídeos dos primers específicos desenhados para cada gene estudado.
ACTIN1 foi usado como gene controle.
Gene Primer Forward Primer Reverse
Tamanho do fragmento (pb) TCP5 TTTGCATCCTCCTTCCTCGT ACTCGTATTACCCGGCATCA 211 TCP13 ACCTCCGTTACCTATCTCGC TCTATCGTTTTCTTCGCGGC 163 TCP17 GGTAACGTCACTGTCGCATT GGTCTGGTTGTGAGCTTGTG 157 ACTIN1 TCTTGATCTTGCTGGTCGTG TTGATCTTCATGCTGCTTGG 453
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3.2.2. Hibridização in situ
O material destinado à hibridização in situ consistiu de ápices reprodutivos no início do desenvolvimento, quando ainda não possuem flores em antese ou frutos, contendo botões florais em diversos estágios do desenvolvimento. As amostras foram coletadas de plantas do tipo selvagem (Col-0), fixadas em paraformaldeído a 4% (p/v) em tampão fosfato-salino (PBS) contendo Triton e Tween (0,1%), submetidas a vácuo e mantidas a 4°C por 16h. Em seguida, foram desidratadas em série etílica e mantidas em etanol a 100% a 4°C.
Para a síntese das sondas, fragmentos de TCP5 amplificados com os primers descritos em 3.2.1 foram clonados no vetor pCRII (Life Sciences) e transformados em células competentes DH5α. As bactérias foram crescidas em meio LB líquido suplementado com ampicilina e kanamicina, sob agitação, a 37°C, por uma noite. Os plasmídeos contendo os clones foram isolados com o kit PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit (Life Sciences); em seguida, foram linearizados por 2h a 37°C, com as enzimas de restrição BamHI ou NotI, dependendo do sentido da sonda a ser sintetizada (senso ou antisenso). Então, realizou-se a precipitação dos plasmídeos linearizados com solução contendo acetato de sódio e etanol absoluto, e depois, a centrifugação e a ressuspensão em água DEPC. Os plasmídeos assim obtidos foram dosados com o fluorômetro Qubit® (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante, e então, utilizados como molde para a síntese de RNA in vitro para a produção das sondas marcadas. A transcrição foi feita com as enzimas SP6 e T7, dependendo do sentido da sonda desejada. A reação de transcrição envolveu a marcação com digoxigenina (DIG-UTP), através do DIG RNA Labeling Kit (Roche), de acordo com as instruções do fabricante.
O material vegetal destinado à hibridização in situ foi incluído em xilol e emblocado em Paraplast® (Sigma), seccionado em micrótomo (8µm) e montado em lâminas de vidro aderentes (Perfecta© Adhesion Microscope Slides), que foram armazenadas a 4°C em caixa contendo sílica até o momento de sua utilização.
O pré-tratamento da hibridização in situ consistiu em desparafinar os tecidos com xilol e reidratá-los em série etílica decrescente. As lâminas foram então mantidas em tampão fosfato-salino (PBS) e submetidas à digestão com Proteinase K, com o objetivo de expor o RNA do material para a ocorrência da hibridização. A reação da proteinase foi
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interrompida com glicina, e em seguida os cortes foram novamente banhados em PBS. O tecido foi então fixado em paraformaldeído e lavado duas vezes em PBS. Em seguida, foi realizado tratamento com trietanolamina e anidrido acético, que têm a função de diminuir o ruído de fundo e inativar nucleases. As lâminas foram então banhadas novamente em PBS e submetidas à desidratação em série etílica crescente. A solução de hibridização, que contém a sonda, foi aplicada sobre os cortes já desidratados, que foram cobertos com lamínulas plásticas do tipo HybriSlips (Sigma). As lâminas foram incubadas a 50°C overnight em câmara úmida.
Após a hibridização, os cortes foram lavados com uma série de soluções salinas, com o objetivo de retirar o excesso de sonda, mantendo a estringência da reação. As próximas etapas consistiram em preparar o material para a reação antígeno-anticorpo. Antes da aplicação do anticorpo, tratou-se o material com uma solução de bloqueio, de modo a diminuir ruídos de fundo. O anticorpo anti-DIG (conjugado à fosfatase alcalina) foi então aplicado sobre as lâminas, que permaneceram em câmara úmida por 1h30. Então, aplicou-se o substrato da fosfataaplicou-se alcalina (NBT/BCIP), para a ocorrência da reação colorimétrica. Este material foi mantido à temperatura ambiente e ao abrigo da luz durante uma noite, em seguida, foi observado e fotografado em microscópio.
3.3. Caracterização morfológica
Para entender melhor o papel do gene TCP5 no desenvolvimento floral, foram analisadas linhagens de plantas contendo alterações nos níveis ou locais de expressão do gene. As linhagens foram descritas no item 3.1. Caracterizou-se o fenótipo das primeiras flores em antese presentes na inflorescência (estágio 13 do desenvolvimento de acordo com Smyth et al. 1990), e dos ápices reprodutivos das linhagens transgênicas, comparando-os ao fenótipo do tipo selvagem, de maneira qualitativa e quantitativa (análises morfométricas e de área celular).
3.3.1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia
óptica
O material destinado a MEV e microscopia óptica foi coletado e fixado em paraformaldeído a 4% (p/v) em tampão fosfato-salino (PBS), submetido a vácuo, e mantido
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a 4°C durante a noite. O material para MEV foi desidratado em série etílica, seco ao ponto crítico, dissecado sob lupa binocular, montado em suportes metálicos com fita dupla-face e metalizado com ouro coloidal. As observações foram feitas em microscópio de varredura LEO 435 VP no NAP/MEPA ESALQ/USP, em colaboração com o Prof. Francisco Tanaka (ESALQ/USP), e também em microscópio JEOL modelo JSM5800LV, no Laboratório de Microscopia Eletrônica, no Instituto de Biologia da Unicamp.
As flores em antese fixadas conforme descrito acima e destinadas à microscopia óptica foram transferidas para água destilada e dissecadas de maneira a separar todos seus órgãos, que por sua vez, foram montados com solução de Hoyer (goma arábica, glicerol e hidrato de cloral) em lâminas, observados e fotografados em microscópio ZEISS modelo AXIOVERT 35. As fotos assim obtidas foram utilizadas para a tomada de medidas para as morfometrias linear e geométrica e também para análises de tamanho celular, no caso das pétalas.
3.3.2. Análises de morfometria geométrica e linear
As análises de morfometria geométrica e medições lineares foram realizadas em pétalas, sépalas e pistilos de flores de A. thaliana, coletadas, fixadas e montadas de acordo com o descrito no item 3.3.1. Compararam-se os genótipos: Col-0 (WT), 35S:miR-3TCP (3TCP) e os dois genótipos diferentes de pATML1:TCP5: 4226 e 4227. Foram utilizados na análise 15 indivíduos de cada genótipo, sendo que apenas uma pétala, duas sépalas (uma medial e uma lateral) e um pistilo foram analisados para cada indivíduo.
A tomada de medidas para a morfometria geométrica (medidas vetoriais) foi feita utilizando-se o suíte de programas TPS (versão 2.16; Rohlf & Marcus 1993). Foram marcados 19 pontos homólogos em cada pétala (fig. 2b) com o auxílio do software tpsDig, que digitaliza os pontos, transformando-os em coordenadas cartesianas. Os pares de pontos 1 e 2 (base da pétala) e 13 e 14 (maior largura da pétala) foram considerados landmarks, enquanto os outros pontos foram analisados como semi-marcos (é importante que os landmarks sejam reconhecidos facilmente, de modo que não sejam adicionadas variações, devidas à marcação dos pontos, durante o processo de aquisição das medidas vetoriais). Para as sépalas, foram marcados 13 pontos (fig. 2a), sendo apenas o par 1 e 2 (base) tratado
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como landmark. Para os pistilos, foram marcados 19 pontos, sendo landmarks os pares 1 e 2 (base), 11 e 12 (base do estilete) e 13 e 14 (ápice do estilete) (fig. 2c).
Essas medidas vetoriais foram então analisadas como proposto por Klingenberg (2010) através dos programas TPS (Rohlf & Marcus 1993) e MorphoJ (Klingenberg 2011), sendo o último utilizado para as análises de componentes principais (PCA) e de variáveis canônicas (CVA).
A tomada de medidas lineares foi feita utilizando o mesmo software TPS, nas mesmas imagens geradas para as análises morfométricas descritas acima. Foram utilizadas no estudo as maiores dimensões vertical e horizontal de pétalas, sépalas e pistilos, i.e., comprimento e largura, respectivamente. As dimensões foram comparadas usando ANOVA e pós-teste Fisher’s LSD, com auxílio do software GraphPad Prism, e expressas como médias ± erro padrão.
Figura 2. Representação da localização dos pontos para tomada das medidas vetoriais para as
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3.3.3. Análises de área celular
As células presentes ao longo do eixo apical-basal da epiderme adaxial de pétalas de
A. thaliana possuem formatos distintos. As células da região apical têm formato cônico, e
quando observadas perpendicularmente à superfície, são aproximadamente isodiamétricas. Estas células vão ficando progressivamente mais alongadas em direção à base, sendo possível distinguir três tipos celulares: isodiamétrico (ápice), levemente alongado (centro), e alongado (base) (fig. 3). Alterações no número absoluto, tamanho ou proporção relativa de um destes tipos celulares podem alterar a forma final de pétalas. De modo a investigar melhor a origem celular de alguns fenótipos observados em pétalas dos genótipos 3TCP e 4226, analisou-se a área das células da epiderme adaxial das mesmas, comparando-as com o tipo selvagem.
Para tanto, três indivíduos por genótipo tiveram suas pétalas coletadas, fixadas e montadas de acordo com o descrito no item 3.3.1, sendo analisada somente uma pétala por indivíduo. Fotografou-se no microscópio ZEISS modelo AXIOVERT 35, em aumento de 40x, três regiões de cada pétala (ápice, centro e base), de modo a representar todos os tipos celulares presentes na epiderme adaxial (fig. 3). Cada foto foi impressa com escala em papel sulfite, e o contorno das células de cada seção foi desenhado em acetato posicionado acima da foto. Os desenhos foram escaneados para digitalização das imagens (fig. 3e, f e g). As imagens foram então processadas em editor de imagens (Corel Photo-Paint). Todos os dados foram calibrados de acordo com o aumento do microscópio usado para obter as imagens. As áreas das células foram obtidas através da ferramenta “Analyse Particles” do software ImageJ (Abràmoff et al. 2004).
Os valores obtidos foram comparados segundo um delineamento aninhado (hierárquico): três réplicas aninhadas dentro de indivíduos, e indivíduos aninhados dentro de genótipos. Este procedimento foi feito separadamente para cada região da pétala. Utilizou-se o teste ANOVA aninhada (“nested ANOVA”) para testar se há influência da alteração da expressão de TCP5 (genótipos) no tamanho das células da epiderme adaxial de pétalas; determinando se há variação entre genótipos e entre indivíduos. O teste de Student-Newman-Keuls (SNK) foi usado como pós-teste para determinar especificamente quais pares de genótipos apresentam diferenças significativas no tamanho das células. Além disso, foi feito o cálculo dos componentes da variância com o objetivo de avaliar a
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importância de cada nível hierárquico na variação do tamanho das células, ou seja, a porcentagem da variação que é explicada por cada fator (genótipo e indivíduo).
Figura 3. Representação do método utilizado para as análises de área celular. Em (a) está
representada uma pétala vista sob microscópio óptico e os retângulos brancos correspondem às três áreas representativas usadas para a medição de área celular (ápice, centro e base). (b), (c) e (d) representam as áreas fotografadas em microscópio (objetiva de 40x), respectivamente, ápice, centro e base; sendo (e), (f) e (g) os respectivos desenhos digitalizados e prontos para análise. Barras=50µm.
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4. Resultados e discussão
4.1. Expressão gênica
4.1.1. RT-PCRs
Analisou-se o padrão de expressão dos genes TCP5, TCP13 e TCP17 por RT-PCR em diversos órgãos de A. thaliana de tipo selvagem (fig. 4), utilizando os primers específicos descritos no item 3.2.1.A análise confirmou que estes três genes se expressam diferencialmente em todos os materiais analisados, exceto na raiz, onde se detectou nenhum ou pouquíssimo sinal. Os três genes são expressos em níveis muito baixos em frutos, sob nossas condições experimentais (fig. 4). Dados de expressão destes genes, obtidos por estudos de microarranjos e descritos por Winter et al. (2007), que relatam a ausência de transcritos dos três genes em raízes, apoiam estes resultados. Segundo os mesmos autores, a expressão dos três TCPs em frutos restringe-se aos primeiros estágios de desenvolvimento. A amostra de RNA de frutos estudada aqui foi composta de uma mistura de frutos em vários estágios de desenvolvimento, o que pode ter causado a diluição do número de transcritos, resultando no sinal fraco observado (fig. 4). Os resultados para a expressão de
TCP5 também são corroborados pelo estudo de Koyama e colaboradores (2007), onde se
observa expressão mais acentuada em folhas, nenhuma expressão em raízes, e baixo sinal de expressão em flores e frutos.
Os resultados de RT-PCR corroboram a hipótese de que os genes do clado TCP5-like podem possuir um papel no desenvolvimento floral de Arabidopsis thaliana, já que todos os genes deste clado mostraram resultados de amplificação nas amostras contendo material de inflorescência. Esses genes podem ainda ter papel no desenvolvimento floral inicial, uma vez que, em amostras de flores em antese, o nível de expressão dos genes decai (fig. 4).
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Figura 4. Padrão de expressão de genes TCP5-like em diferentes órgãos. Análise de RT-PCR da
expressão de TCP5, TCP13 e TCP17. ACTIN1 foi usado como gene controle. 4.1.2. Hibridização in situ
Uma vez estabelecido que TCP5 se expressa em inflorescências, realizou-se experimentos de hibridização in situ para determinar o padrão de expressão espacial e temporal do gene ao longo do desenvolvimento floral de A. thaliana.
A figura 5 ilustra o padrão de expressão do gene TCP5 ao longo do desenvolvimento floral de A. thaliana. No início do desenvolvimento, os transcritos localizam-se tanto no meristema de inflorescência como nos meristemas florais em difrerenciação (fig. 5A). Nos primórdios de sépalas, os transcritos de TCP5 encontram-se principalmente nas camadas de células mais externas (fig. 5B e C). Os primórdios de sépalas, ao se desenvolverem um pouco mais, parecem acumular transcritos preferencialmente na região adaxial (fig. 5C). No estágio seguinte, observa-se expressão de
TCP5 no ápice dos primórdios de pétalas e estames (fig. 5D). Também os primórdios de
carpelos concentram transcritos de TCP5 principalmente em sua região apical (fig. 5E e F). Em carpelos mais desenvolvidos, há expressão maior de TCP5 na região que dará origem à placenta (fig. 5G), e posteriormente, nos óvulos (fig. 5G, H e I). Primórdios de pétalas em estágio mais avançado de desenvolvimento continuam expressando TCP5
preferencialmente em sua região apical (fig. 5H).
A figura 6A mostra a hibridização in situ com sonda antisenso em primórdios foliares de A. thaliana em corte transversal. Vê-se sinal forte nas margens das folhas jovens. O mesmo padrão de expressão (marginal) é encontrado nas pétalas quando vistas
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também em corte transversal (fig. 6B e C). Ovários em secção transversal mostram localização específica dos transcritos na região dos primórdios de óvulos (fig. 6B e D).
A figura 7 mostra o experimento de hibridização com sonda senso, que foi usada como controle negativo. Em todos os cortes, não se observou sinal de hibridização acima do background, validando os resultados obtidos com a sonda antisenso.
A expressão de TCP2 e TCP3, outros TCPs de classe II, ao longo do desenvolvimento floral, já foi estudada através de hibridização in situ (Cubas et al. 1999).
TCP2 e TCP3 são majoritariamente expressos durante o desenvolvimento floral – pouco
sinal foi detectado em meristemas vegetativos. Os órgãos com maior expressão de TCP2 e
TCP3 foram pétalas e estames. A expressão também foi mais intensa nos estágios iniciais
do desenvolvimento (Cubas et al., 1999). No presente estudo, verificou-se que TCP5 expressa-se intensamente tanto em meristemas florais como em meristemas vegetativos, e os níveis de expressão são semelhantes para todos os primórdios de órgãos florais. O padrão de expressão aqui encontrado em pétalas é igual ao padrão de expressão de TCP2 e
3: nos ápices e margens dos primórdios (Cubas et al., 1999).
Estudos anteriores também reportam a expressão de TCPs de classe II na porção distal (e exclusão na porção proximal) de órgãos em desenvolvimento. Em A. thaliana,
TCP3 expressa-se na porção apical de cotilédones (Koyama et al. 2007), assim como TCP4,
que também foi encontrado na porção apical de folhas jovens (Palatnik et al. 2003). Padrão semelhante também foi encontrado em primórdios foliares de tomate expressando LA, um fator de transcrição da família TCP que possui sítio de ligação para miR319 (assim como os jaw-TCPs) (Ori et al. 2007). A expressão de um miRNA regulado por TCP4 (miR396b) também segue o padrão apical de expressão ao longo do desenvolvimento foliar. Apesar de não documentar a expressão de TCP4 diretamente, o estudo afirma que, ao produzir uma versão do miRNA insensível à regulação de TCP4, há a ruptura do padrão de expressão de miR396b. Isto indica que TCP4 é um regulador positivo do miRNA e que seus padrões de expressão devem ser sobrepostos (Schommer et al. 2014). Considerando que a região distal é a região que matura primeiramente nos órgãos de plantas (Efroni et al. 2008; Andriankaja et al. 2012), a presença de TCPs de classe II preferencialmente nesta região é consistente com seu papel suposto de promoção da diferenciação celular e dos processos de maturação
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de órgãos (Efroni et al. 2008; Sarvepalli & Nath 2011; Efroni et al. 2013; Schommer et al. 2014).
Apesar de TCP5 ser expresso majoritariamente nas fases iniciais do desenvolvimento, isto não exclui a possibilidade de TCP5, assim como outros TCPs de classe II, possuir papel na maturação de órgãos. Efroni e colaboradores afirmam que a regulação da maturação é mediada principalmente pela expressão inicial de CIN-TCPs, uma vez que a inativação tardia destes tem efeito mínimo ou nenhum no desenvolvimento da lâmina foliar (Efroni et al. 2008).
Considerando que órgãos florais são folhas modificadas e que os TCPs possivelmente controlam múltiplos programas de maturação, tanto no nível de órgãos como de organismos (Sarvepalli & Nath 2011), o padrão de expressão encontrado neste estudo para TCP5 está em concordância com os estudos anteriores que reportam o papel de TCPs de classe II no controle da maturação de órgãos.
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Figura 5. Resultados de experimento de hibridização in situ com sonda antisenso de TCP5 em
cortes longitudinais de botões florais em diferentes estágios de desenvolvimento. (A) Ápice da inflorescência mostrando sinal de hibridização no meristema de inflorescência e nos meristemas
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florais (estágios 1 e 2 do desenvolvimento floral). (B) e (C) Botões florais no estágio 3 do desenvolvimento, mostrando expressão preferencial nas primeiras camadas de células do meristema floral e dos primórdios de sépalas. Em (C) observa-se expressão preferencial na face adaxial dos primórdios de sépalas. (D) Botão em estágio 6 do desenvolvimento floral. A seta indica um primórdio de pétala. Os transcritos de TCP5 acumulam-se principalmente nas regiões apicais dos primórdios. (E) Botão floral evidenciando expressão de TCP5 no ápice dos primórdios de carpelos (setas). (F) Botão floral em estágio 7 mostrando expressão preferencial no ápice dos primórdios de carpelos em desenvolvimento (setas). (G) Botão em estágio 9 mostrando expressão na região que formará a placenta (seta). (H) Botão em estágio 10, mostrando acúmulo maior de transcritos no ápice dos primórdios de pétalas (setas pretas), e nos primórdios de óvulos (seta branca). (I) Botão evidenciando expressão de TCP5 em óvulos. mf: meristema floral, mi: meristema de inflorescência,
se: sépala, est: estame, ca: primórdios de carpelos, ov: ovário. Barras = 50µm.
Figura 6. Resultados de experimento de hibridização in situ com sonda antisenso de TCP5 em
cortes transversais de primórdios foliares (A) e botões florais (B, C e D). (A) Primórdios foliares mostrando expressão de TCP5 localizada em sua região marginal (setas). (B) Botão floral mostrando expressão de TCP5 em pétalas (pe), estames (es) e carpelo (ca). (C) Pétalas em detalhe, mostrando transcritos de TCP5 acumulados principalmente na região marginal da lâmina (setas). (D) Detalhe de carpelo mostrando expressão de TCP5 nos primórdios de óvulos. Barras = 100µm.
ca es es pe pe pe pe
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Figura 7. Resultados de experimento de hibridização in situ com sonda senso de TCP5. (A) Corte
longitudinal de meristema apical caulinar mostrando primórdios de folhas (setas). (B) Corte transversal de botão floral. (C) Corte longitudinal do ápice da inflorescência de A. thaliana, contendo botões florais. Em todos os cortes vê-se sinal abaixo do background. Barras = 100µm.
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4.2. Caracterização morfológica
O fenótipo macroscópico das flores e órgãos florais das plantas transgênicas de A.
thaliana das linhagens pATML1:TCP5, 35S:miR-3TCP e tcp5 foi comparado com o
fenótipo de plantas do tipo selvagem (figs. 7, 8 e 9). O fenótipo mais distinto em relação ao tipo selvagem, dentre todas as construções estudadas, foi o da linhagem pATML1:TCP5 (fig. 7B, fig.8B e C): flores com pétalas mais alongadas do que o tipo selvagem. Em tcp5 e
35S:miR-3TCP não se observou fenótipo macroscópico relevante (fig. 7C e D e fig. 9). Para
a construção pATML1:TCP5, dentre os dois genótipos estudados, 4226 e 4227, o genótipo 4226 apresentou um fenótipo mais evidente, pois possui expressão mais elevada do transcrito (Immink et al, comun. pessoal). As pétalas têm aparência mais alongada do que as pétalas de flores do tipo selvagem (fig. 8C).
Figura 8. Comparação de inflorescências de plantas do tipo selvagem (A), pATML1:TCP5 (B), tcp5
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Figura 9. Comparação macroscópica de flores e órgãos florais de plantas do tipo selvagem (A) e
pATML1:TCP5 (B e C). B e C pertencem a genótipos diferentes da mesma construção, sendo B o genótipo 4227 e C, 4226. Observa-se que as pétalas do genótipo 4226 têm aparência mais alongada do que as pétalas do tipo selvagem. Barras=1mm.
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Figura 10. Comparação macroscópica de flores e órgãos florais de plantas do tipo selvagem (A),
35S:miR-3TCP (B) e tcp5 (C). Não se observam diferenças claras na forma dos órgãos. Barras=1mm.
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As análises de microscopia de varredura corroboram os resultados já apresentados: não foi encontrado fenótipo óbvio nas flores das linhagens tcp5 e 35S:miR-3TCP (fig. 10). As flores de pATML1:TCP5, no entanto, apresentam alteração evidente na forma das pétalas (fig. 10b), que são mais alongadas, e também na forma dos pistilos, que também são maiores neste genótipo. Para as sépalas, por outro lado, não se identificaram diferenças morfológicas claras. Também não foram detectadas diferenças evidentes na morfologia das células que compõem a epiderme dos órgãos florais em todos os genótipos (fig. 10d, e e f).
Estudos anteriores corroboram a ideia de que a construção aqui utilizada (pATML1:TCP5) pode funcionar como uma superexpressão do gene. Por exemplo, a expressão do gene ABS5/T5L1, que codifica um fator de transcrição da família BHLH, na camada L1 de A. thaliana, é suficiente para causar fenótipo igual ao causado pela superexpressão do mesmo gene (An et al. 2014). Além disso, a hiper-ativação de um TCP da classe II (através de sua fusão com o domínio de ativação de VP16, um potente ativador de transcrição), TCP4, possui efeito semelhante ao da expressão de TCP5 na epiderme. As folhas de ambas as construções possuem forma côncava, não plana, com a porção central da lâmina foliar elevada. No entanto, as plantas TCP4:VP16 não apresentaram alteração no desenvolvimento de órgãos florais (Sarvepalli & Nath 2011). Apesar das evidências na literatura apoiarem esta hipótese, não se pode provar que as plantas pATML1:TCP5 possuem o mesmo fenótipo da superexpressão do gene, porque não foram analisadas plantas superexpressando TCP5. Ainda assim, o estudo dos efeitos da expressão na camada L1 dos fatores de transcrição da família TCP, sabidamente envolvidos nos processos de crescimento e maturação de órgãos, podem trazer informações acerca do papel da epiderme nestes dois processos fundamentais.
Os fenótipos extremos observados em pistilos (má-formação de estigma, estilete e má-formação das margens das valvas) e em grãos-de-pólen (germinação ectópica) de
pATML1:TCP5 (fig. 11) podem afetar a reprodução destas plantas; no entanto, parâmetros
da fertilidade não foram avaliados neste estudo. Plantas contendo a construção TCP4:VP16, de hiper-ativação de TCP4, possuem a fertilidade drasticamente reduzida (Sarvepalli & Nath 2011). Isto pode ser resultado da produção defeituosa de giberelinas e jasmonatos, fitormônios que modulam a reprodução e cuja síntese acredita-se estar à montante dos TCPs (Schommer et al. 2008). Um próximo passo que agregaria novas informações no
29
estudo de pATML1:TCP5 seria a caracterização da fertilidade destas plantas, através da contagem do número de sementes viáveis e da avaliação da germinação dos grãos de pólen; além da aplicação de giberelinas ou jasmonatos para determinar se a fertilidade é restaurada.
Koyama e colaboradores sugerem que um dos papéis dos CIN-TCPs no desenvolvimento está na regulação negativa de genes específicos de fronteiras (genes
CUC), que controlam a iniciação do meristema apical caulinar e a formação de fronteiras
entre os órgãos. Além disto, em plantas do tipo selvagem, o acúmulo de transcritos de
TCP3, TCP4 e TCP10 e as atividades dos respectivos promotores não foram observados no
meristema apical caulinar e em fronteiras de órgãos, que são as regiões em que os genes
CUC se expressam (Koyama et al. 2007). Desta forma, a ativação de TCP5 em toda a
camada L1 pode perturbar a expressão correta de genes CUC, e consequentemente, a formação de fronteiras entre os órgãos. Fenótipos como o das plantas cuc (fusão de cotilédones, não iniciação do meristema apical caulinar) não são observados em plantas
pATML1:TCP5 provavelmente porque, dada a redundância funcional dos TCPs, a
expressão ectópica apenas de TCP5 não é suficiente para o rompimento de toda atividade dos genes CUC. No entanto, o fenótipo observado em alguns pistilos de pATML1:TCP5, de má-formação das margens das valvas dos ovários (fig. 11), é também observado no desenvolvimento pós-embrionário de mutantes cuc1-1 e cuc1-2 (Hibara et al. 2006). Isto indica um possível papel de TCP5 na regulação de genes que especificam fronteiras de órgãos.
Outros estudos destacam o papel da camada L1 de células na determinação da forma de órgãos e desenvolvimento das plantas (Savaldi-Goldstein et al. 2007; Savaldi-Goldstein & Chory 2008; Bilsborough et al. 2011). Por exemplo, a expressão de genes para um receptor de brassinosteróide (BR) ou para a enzima de biossíntese de BR na camada L1, com background mutante para os respectivos genes (plantas anãs), restaurou o crescimento normal nestas plantas. Tanto as células da camada L1 como as células das camadas subjacentes apresentaram tamanho celular igual ao tipo selvagem. Isto indica que o crescimento pode ser regulado por sinais que se iniciam na epiderme (Savaldi-Goldstein et al. 2007). Portanto, o entendimento dos efeitos da expressão de TCP5 na epiderme pode ajudar a entender o papel de TCPs no crescimento de órgãos. As diferenças encontradas em
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pATML1:TCP5 sugerem envolvimento de TCP5 nos mecanismos de crescimento de pétalas
e carpelos.
A ausência de fenótipo evidente nas plantas tcp5 pode ser explicada pela redundância funcional dos TCPs CIN-like da classe II, fazendo com que mutações simples nestes genes tenham efeito sutil no crescimento e desenvolvimento de A. thaliana (Koyama et al. 2010).
Para as plantas da linhagem 35S:miR-3TCP, o silenciamento de três TCPs não foi suficiente para causar fenótipo floral evidente. Efroni e colaboradores, quando estudaram a mesma linhagem de plantas, reportaram folhas maiores e expansão proximal da lâmina foliar para o domínio do pecíolo, mas não citaram alterações no desenvolvimento floral (Efroni et al. 2008). A ausência de fenótipo severo nas flores, mesmo em mutantes para múltiplos TCPs, pode ser causada por um maior nível de redundância funcional de TCPs no desenvolvimento floral. Esta ideia é corroborada pelo fato de que quase todos os TCPs
CIN-like (2, 3, 4, 5 10, 13 e 17) apresentaram o mesmo padrão de expressão ao longo do
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Figura 11. Comparação morfológica de flores e órgãos florais entre os genótipos estudados. (a)
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detalhe das células da epiderme abaxial de sépalas, (f) detalhe das células da parede do ovário, (g) sépalas. Barras: (a) (b) (c) (g) 1mm; (d) (e) (f) 100µm.
Figura 12. Fenótipos extremos que possivelmente alteram a fertilidade de pATML1:TCP5. (A)
Pistilos de plantas do tipo selvagem, com desenvolvimento normal de estigma, estilete e margens das valvas (seta). (B), (C) e (D) Pistilos de pATML1:TCP5 com anomalias no desenvolvimento. Notar a ausência da delimitação das margens das valvas. (E) Grãos-de-pólen germinando ectopicamente em estilete de pATML1:TCP5. Setas: tubos polínicos. Barras=100µm em A, B, C e D; 10µm em E.
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4.2.1. Análises de morfometria geométrica
Planos cartesianos com coordenadas posicionais dos pontos anatômicos de sépalas laterais, sépalas mediais, pétalas e pistilos de plantas tipo selvagem (WT), pATML1:TCP5 (genótipos 4226 e 4227), 35S:miR-3TCP (3TCP) e tcp5 foram produzidos conforme descrito no item 3.3.2. A partir disto, foram geradas análises de componentes principais (PCA) e de variáveis canônicas (CVA), representadas por meio de gráficos (figs. 12 a 19).
A análise de componentes principais pode ser usada para examinar as principais características que compõem a variação de forma dentro de uma amostra, além de funcionar como uma análise para ordenar os espécimes no morfoespaço. A análise de variáveis canônicas (CVA) proporciona um tipo diferente de ordenação, que maximiza a separação dos grupos especificados, pelo fato de os grupos serem definidos a priori e porque maximiza a variação entre os grupos em relação à variação dentro dos grupos (Klingenberg 2011). Estas análises multivariadas permitem determinar se, e em quais características, dois grupos de organismos diferem (Strauss 2010).
A comparação das formas das sépalas laterais está representada nas figuras 12 e 13. O resultado das projeções das medidas vetoriais no espaço morfológico da PCA mostrou que não houve variação entre as formas das sépalas amostradas, pois há sobreposição dos pontos pertencentes aos diferentes genótipos (fig. 12). Na CVA, uma melhor resolução dos pontos foi obtida (fig. 13). Os grupos que possuem formas mais distintas entre si neste caso são WT, 4227 e 3TCP. As formas dos pontos extremos dos eixos do gráfico (fig. 13) podem funcionar como estimativa da forma de cada grupo de pontos. Observa-se que a variação de forma mais significativa está no eixo da CV2, que explica melhor a variação entre 3TCP e 4227. Pode-se estimar, então, que as sépalas de 3TCP se aproximam mais da forma do extremo positivo do eixo da CV2, e que 4227 se aproxima mais do extremo negativo; ou seja, as sépalas de 3TCP são mais largas na base do que as sépalas de 4227 (fig. 13). No entanto, a variação de forma é bem pequena.
A comparação entre as formas geométricas das sépalas mediais também não resultou em variação muito significativa (fig. 14 e 15). A sobreposição quase total dos pontos pertencentes aos diferentes genótipos no gráfico da PCA mostra que há pouca variação entre as formas das sépalas amostradas (fig. 14). Novamente, na CVA, obtém-se uma melhor separação entre os genótipos WT, 3TCP e 4226. Ao observar as formas dos pontos
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extremos dos gráficos, vê-se que a variação de forma mais expressiva está no eixo da CV1, onde as sépalas de WT se aproximam mais da forma do extremo negativo, e as sépalas de 4226 aproximam-se mais do extremo positivo (fig. 15).
A comparação entre as formas das pétalas na PCA mostra que não há uma variação muito expressiva entre as formas dos diferentes genótipos (fig. 16). A CVA foi capaz de detectar melhor as diferenças entre os genótipos, sendo que o eixo da CV1 explica melhor a variação entre tcp5 e 3TCP, e o eixo da CV2 explica melhor a variação entre WT e 4227 (fig. 17). A forma de tcp5 aproxima-se à forma do extremo negativo do eixo da CV1, enquanto a forma de 3TCP aproxima-se do extremo positivo. Isto indica que há uma variação na largura da porção distal das pétalas, sendo as pétalas de 3TCP mais largas. A forma de WT aproxima-se à forma do ponto extremo positivo do eixo da CV2, enquanto a forma de 4227 aproxima-se à do extremo negativo. Isto indica que a variação nas formas das pétalas de WT e 4227 está principalmente na sua porção proximal, que se apresenta mais fina nas pétalas de 4227.
Na comparação entre os pistilos também se observou sobreposição quase total dos pontos pertencentes a cada genótipo na PCA (fig. 18). No entanto, quando se realiza a CVA, há uma resolução melhor, indicando que há alguma variação nas formas dos materiais (fig. 19). A CV1 explica melhor a variação entre os grupos formados por
WT-tcp5 e 3TCP-4226-4227. Pistilos um pouco mais largos (extremo negativo da CV1) estão
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Figura 13. Análise de componentes principais das formas de sépalas laterais entre os diferentes
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Figura 14. Análise de variáveis canônicas de formas de sépalas laterais entre os diferentes
genótipos. A CV1 explica 62% da variância e CV2, 22%. As mudanças nas formas ao longo dos eixos estão representadas por meio de gráficos de “wireframe” e representam a deformação extrema (linha azul) comparada com a forma média (linha cinza). (-): forma aproximada do extremo negativo; (+): forma aproximada do extremo positivo.
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Figura 15. Análise de componentes principais das formas de sépalas mediais entre os diferentes
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Figura 16. Análise de variáveis canônicas de formas de sépalas mediais entre os diferentes
genótipos. A CV1 explica 44% da variância e CV2, 33%. As mudanças nas formas ao longo dos eixos estão representadas por meio de gráficos de “wireframe” e representam a deformação extrema (linha azul) comparada com a forma média (linha cinza). (-): forma aproximada do extremo negativo; (+): forma aproximada do extremo positivo.
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Figura 17. Análise de componentes principais das formas de pétalas entre os diferentes genótipos.
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Figura 18. Análise de variáveis canônicas de formas de pétalas entre os diferentes genótipos. A
CV1 explica 47% da variância e CV2, 25%. As mudanças nas formas ao longo dos eixos estão representadas por meio de gráficos de “wireframe” e representam a deformação extrema (linha azul) comparada com a forma média (linha cinza). (-): forma aproximada do extremo negativo; (+): forma aproximada do extremo positivo.
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Figura 19. Análise de componentes principais das formas de pistilos entre os diferentes genótipos.
