Aulas2e3-Organizacaogenicadeprocariotoseeucariotos-genes,cromossomosegenomas

Organização gênica de

procariotos e eucariotos:

genes, cromossomos e genomas

Biomedicina – CMRV Biologia Molecular Profa. Renata Canalle

Árvore filogenética universal, apresentando os três domínios da vida (rRNA 16S)

http://www.unb.br/ib/cel/microbiologia/archaea/archaea.html

PROCARIOTOS: - unicelulares

- ausência de núcleo

- DNA organizado em um único cromossomo; sem histonas

A evolução do conceito de gene

• Classicamente, definido como a porção do cromossomo que determina ou afeta uma característica ou fenótipo

• Palavra criada para denominar os “fatores” propostos por Mendel

Beadle e Tatum (1940)

1 gene = 1 enzima

1 gene = 1 proteína

Mas nem todas as proteínas têm função enzimática; então :

Como muitas proteínas são formadas por várias cadeias polipeptídicas : 1 gene = 1 cadeia polipeptídica

Vários genes não se expressam como proteínas : RNAt, RNAr, snRNA...

Conceito:

uma unidade hereditária.

Conceito em termos moleculares:

uma seqüência de DNA

necessária e suficiente para a síntese de algum produto

funcional (RNA ou proteína), com função estrutural ou

catalítica.

Expressão de um gene

-Transcrição (mRNA)

Promotor

A

B

C

Genes transcritos em uma

unidade transcricional

Seqüências regulatórias

Repressor

Sítio de ligação

do ativador

DNA

mRNA

Transcrito policistrônico

A

B

C

Proteínas

A

B

C

Estrutura dos genes procarióticos

Os genes procarióticos não são interrompidos por

seqüências não-codantes

Um operon é uma unidade funcional do genoma

5’

3’

Sinal de término da transcrição

Estrutura dos genes eucarióticos

Intron

Exon

Exon

Início da

informação

biológica

Término da

informação biológica

5´

3´

A informação gênica é interrompida por sequências não-codantes

Éxon : expressed sequence Íntron : intragenic sequence

Estrutura geral de um gene humano típico

A informação gênica é interrompida por sequências não-codificantes

5’UTR 3’UTR upstream dowstream (TAA) (AATAAA) (ATG)

Estrutura geral de um gene humano típico

A informação gênica é interrompida por sequências não-codificantes

Podem diferir quanto ao número de éxons, pb e elementos seqüências do promotor genes histoespecíficos upstream dowstream

Estrutura geral de um gene humano típico

A informação gênica é interrompida por sequências não-codificantes

5’ 3’

GU GU

PROMOTOR: uma seqüência de DNA situada na extremidade 5’ de um gene, à qual

uma RNA-polimerase se liga de maneira a iniciar a transcrição do DNA em RNA

ÉXON: segmento do DNA ou de um gene que codifica aminoácidos e é mantida no

RNA mensageiro (mRNA), após o processamento do RNA primário (hnRNA)

ÍNTRON: segmento de DNA ou de um gene que se intercala aos éxons e não codifica

aminoácidos, nem é mantido no RNA mensageiro (mRNA), após o processamento do RNA primário (hnRNA)

REGIÃO NÃO-TRADUZIDA (UTR): qualquer região do mRNA que não codifica

proteína

GENE DE MANUTENÇÃO (“housekeeping gene”): gene que se expressa na maioria

das células ou em todas elas, porque seu produto desempenha funções básicas para a manutenção ou metabolismo celular

Cromossomos

As moléculas de DNA :

• São constituídas por genes e por seqüências não-codantes

• São as maiores macromoléculas das células

• São altamente empacotadas em estruturas chamadas

cromossomos

capsídio

DNA

(descompactado)

Bacteriófago T lambda _{Bactérias e vírus : geralmente contêm 1}

cromossomo (maioria circular)

Eucariotos : vários cromossomos (lineares – proteção das extremidades/telômeros)

Conjunto de todos os genes

e DNA intergênico de um

organismo : GENOMA

Genoma viral

Carregam pouca informação genética

Genoma de Procariotos

E. Coli : 1 molécula de DNA dupla fita circular com genes essenciais

Elementos extra-cromossômicos : plasmídeos

4.639.221 pb

Altamente empacotado

4.300 genes

(incluindo

ORF – fase aberta de leitura)

ORF = matriz de leitura aberta (o intervalo entre os códons iniciador e de

Genoma de Procariotos

E. Coli : 1 molécula de DNA dupla fita circular com genes essenciais

Elementos extra-cromossômicos : plasmídeos

oriC

terC

- Replicação bidirecional

- 87,8% = genes que codificam proteínas (ou ORFs)

- 0,8% = genes que codificam RNAs

- 11,4% = seq. regulação, seq. repetidas

Genoma de Procariotos

•

Tamanho pequeno e compacto: quase exclusivamente para codificação de proteínas

•

0,6 x 106 _{pb (Mycoplasma genitalium, parasita intracelular de mamífero) a 9,5} x 106 _{pb (Myxococus xanthus)}

•

Sobreposição de genes: mesma seqüência codifica duas proteínas diferentes

•

Maioria dos genes: cópia única

•

Pouca redundância: genes duplicados que são selecionados positivamente e fixados no genoma – rRNA (7 cópias)

•

Seqüências nucleotídicas curtas (10 a 103 _{pb) e repetidas: 2% do genoma}

•

Elementos genéticos móveis: bacteriófagos, plasmídeos, elementos transponíveis – transferência genética horizontal → plasticidade aos genomas (processo evolutivo)

Densidades Gênicas dos genomas de diferentes organismos

Existe uma correlação inversa entre a complexidade do organismo e sua densidade

gênica: organismos mais

complexos apresentam densidade gênica menor O tamanho do genoma está relacionado com a

complexidade do organismo

(complexidade de um genoma: é a sua extensão total, medida em pb, que é constituída por sequências diferentes)

 Aumento no tamanho do gene  Aumento no DNA entre os genes

Densidades Gênicas dos genomas de diferentes organismos

Existe uma correlação inversa entre a complexidade do organismo e sua densidade

gênica: organismos mais

complexos apresentam densidade gênica menor

 Aumento no tamanho do gene  Aumento no DNA entre os genes

(seqüências intergênicas)

Os genes individuais são mais longos:

1. Organismos mais complexos, significativo aumento nas regiões de DNA

necessárias para direcionar e regular a transcrição – sequências regulatórias 2. Regiões codificantes descontínuas - íntrons

 Frações de DNA repetitivo apresentam baixa complexidade, pois são constituídos por um número relativamente pequeno de seq. diferentes  Fração de DNA não-repetitivo: complexidade elevada

Plasmídeo DNA bacterial Gene de resistência a antibióticos Gene de transferência de DNA

Plasmídeos

 pequenas moléculas de DNA circular: poucas centenas até 105 bases

 Capacidade de auto-duplicação independente

 Geralmente não carregam genes essenciais

 Podem carregar genes de resistência a antibióticos

 alguns promovem a reprodução entre bactérias (conjugação); outros possuem genes que matam outras bactérias

 engenharia genética: vetores de clonagem

Elementos Transponíveis ou de Transposição

São segmentos de DNA que possuem a notável propriedade de mudar de posição dentro do genoma, podendo mover-se de um ponto a outro do mesmo cromossomo, mudar de cromossomo ou, eventualmente, transpor-se do genoma de uma espécie para outra

- Mutação e rearranjo genômico, troca de material genético → fonte de variabilidade genética

- Inserção errada (modifica a estrutura e a expressão do gene - mutação): câncer, doenças hereditárias

- Rearranjos estruturais: deleções, duplicações, inversões e fusões cromossômicas

Relevância: conseqüências sobre o material genético, evolução (parasitas “egoístas” do genoma x fonte de variabilidade), ferramenta

Elementos Transponíveis ou de Transposição

Características comuns:

- Possuem seqüências nucleotídicas muito similares em ambas as extremidades (repetições terminais)

- Carregam um ou mais genes que codificam enzimas capazes de transportá-los - Criam pequenas duplicações do sítio-alvo da inserção

- Existem em cópias múltiplas no genoma

genes para trasposição

3’ 5’

Elementos Transponíveis ou de Transposição

conservativa

replicativa

Classificação geral:

Classe I – se movem via RNA (retrotransposons)

Classe II – se movem como seqüências de DNA (transposons)

Classe III – mecanismo de transposição desconhecido

Elementos Transponíveis em procariotos (classe II)

Seqüências de DNA que codificam enzimas (transposases) capazes de catalisar a sua própria replicação e transferência para outros sítios do genoma → transposição

IS

Elementos Transponíveis

Seqüências de DNA que codificam enzimas (transposases) capazes de catalisar a sua própria replicação e transferência para outros sítios do genoma → transposição

Estruturas terciárias do DNA:

formas de DNA, supertorção,

compactação

Superespiralamento : espiral de uma espiral

Função fundamental na organização do DNA em nucleossomos ou nucleóides: importante em processos como replicação, transcrição e expressão gênica

DNA plasmidial

Formas de superenrolamento

a) Plectonêmico

• Espirais formam estruturas alongadas e estreitas, com pontos

de ramificação; enrolamento sobre si mesma

b) Solenoidal

A espiral esta organizada em voltas apertadas (como mangueira de

jardim enrolada numa carretilha, espiral do fio de telefone)

Pode ser mantida por

proteínas: forma do DNA

enrolado em proteínas,

como as histonas, nos

nucleossomos

Topoisomerases

DNA girase

Topoisomerases

DNA girase

Permitem alterações no grau de

superenrolamento; quebra

transitória de ligações fosfodiéster

importantes na replicação, transcrição, recombinação, remodelagem da cromatina, evitam tensão no DNA (relaxamento)

Compactação do DNA

compactação

Esquema representativo da compactação do DNA num nucleóide bacteriano

40-50 kb de DNA

- 1 cromossomo humano médio : 2 m de DNA/célula

- Cromossomo de E. coli : 1,7 mm (850 vezes o tamanho da célula)

Os cromossomos eucarióticos

Moléculas de ácido nucléico que contém a informação genética;

corpos densamentes corados vistos no núcleo

Característico de células em divisão

Compactação do DNA

Intérfase: cromatina (eucromatina e heterocromatina)

Divisão celular: cromossomos (cromatina muito condensada)

Cromatina

Material cromossômico amorfo e casualmente disperso no núcleo

(cromossomo descondensado)

Consiste em fibras de DNA e proteínas, junto com uma pequena

quantidade de RNA

Cada “conta” : octâmero de histonas – 2 H2A, 2 H2B, 2 H3 e 2 H4

Histonas

• Ricas em lisina e arginina (aa básicos)

• 5 classes de histonas : H1, H2A, H2B, H3 e H4

O nucleossomo está organizado em fibras de 30 nm

O nucleossomo está organizado em fibras de 30 nm

Cristalografia de raio X

Compacta 10.000 vezes

A cromatina ativa

Acetilação de histonas – atividade transcricional (cromatina descompactada) Desacetilação de histonas – ausência de transcrição (cromatina compactada) HATs: acetiltransferases de histonas (coativadores transcricionais)

HDACs: desacetilases de histonas (repressores) Terapia do câncer

Cinética de Renaturação de DNA: detecção de sequências repetidas

 Primeiro detalhamento da frequência e da complexidade das sequências repetidas de DNA em eucariotos resultou de estudos das velocidades de

renaturação do DNA – a 100o_{C desnaturação de DNA}

Velocidade de renaturação dependerá:

(1) concentração de DNA na solução: quanto mais alta a concentração de filamentos únicos na solução, maior a chance de uma colisão entre quaisquer dois deles (complementares)

(2) da complexidade do DNA: é o tamanho total de sequências de pares de nucleotídeos não repetidos no genoma. À medida que a complexidade do DNA aumenta, a proporção de colisões aleatórias entre filamentos únicos de DNA que estão entre filamentos únicos complementares diminuirá → taxa de

renaturação ↓

Grandes genomas (eucariotos) → aumenta número de genes → renaturação lenta

C

₀

t

C

₀

Cinética de Renaturação de DNA: detecção de sequências repetidas

Surpreendentemente, algumas sequências de DNA nos genomas complexos de eucariotos renaturam-se muito rapidamente

Sequências repetidas muitas vezes no genoma (1 milhão de vezes ou

mais): presente em concentração maior que uma sequência de cópia única durante renaturação → ↑ velocidade de renaturação / ↓ C0t

Velocidade de renaturação do DNA é diretamente proporcional ao número de cópias

Hibridação in situ → também usado para localizar sequências diferentes de DNA (principalmente tipos diferentes de sequências de DNA repetitivo em genomas eucarióticos)

Sequências de DNA de Cópia única e repetitivas em Genomas Eucarióticos

As sequências de DNA presentes em eucariotos são comumente agrupadas

em três classes:

1. Sequências únicas, ou de uma só cópia, de DNA – 1 a 10 cópias por

genoma haplóide (maioria dos genes que codificam proteínas) - ↑ C₀t (reassociam-se mais lentamente; componente lento)

2. Sequências de DNA moderadamente repetitivas – 10 a 105 _cópias por genoma haplóide (proteína ribossômica/rRNA, proteínas musculares actina e miosina; que são necessárias em grandes quantidades, e cada uma delas é codificada por vários genes) –

componente intermediário

3. Sequências de DNA altamente repetitivas – mais de 105 _{cópias por} genoma haplóide (não codificam proteínas/nunca foram transcritas: centrômeros, transposons, VNTRs, STRs) - ↓ C₀t (reassociam-se mais rápido; componente rápido)

Genes funcionais,

cópia única DNA repetitivo DNA espaçador

Seqüências sem função conhecida Seqüências funcionais Famílias de genes codificantes (e pseudogenes correlatos) Seqüências funcionais não-codificantes Repetições em heterocromatina centromérica Número variável de repetições em tandem Seqüências transpostas

Transposons _transposons Retro-Famílias de genes dispersos Famílias de genes em tandem

DNA

30.000-40.000 genes Moderadamente

repetitivo Altamente repetitivo

Genoma Humano

5%

5’ 3’

GU GU

Genes funcionais

Seqüências individuais presentes em apenas uma cópia por genoma haplóide Genes estruturais

Distribuição variada entre os diferentes cromossomos Regiões subteloméricas

Codificam polipeptídios que integram enzimas, hormônios, receptores, proteínas estruturais e reguladoras

Organização interna é diferente : quanto maior o gene, menor o conteúdo de éxons, maior o tamanho dos íntrons

Diversidade de tamanho dos genes

Funções dos genes

Genes codificando para proteínas

Expressão, duplicação e manutenção do genoma Transdução de sinais Funções bioquímicas gerais Várias outras atividades celulares

Genes codificando para RNAs

RNAr

RNAr 28S, 5.8S, 5S

RNAr 5 S

Sub-unidade maior do ribossomo

Sub-unidade menor do ribossomo

RNAt

>40 tipos

Reconhecem os códons no RNAm

snRNA

(small nuclear RNA)

U1, U2, U4, U5,

_U6

Spliceossomo

snoRNA

(small nucleolar RNA)

U3, U8

Processamento do RNAr

Outras classes

RNA 7SL

Transporte de proteínas

RNA da telomerase

Os genes não estão distribuídos uniformemente pelo genoma

0,9 Mb - 70 genes

2,4 Mb

Gene da distrofina

Densidade gênica

Agrupamento de ilhas CpG no genoma humano vermelho: ilhas CpG (ricos em genes)

verde: região de replicação tardia (pobres em genes)

Ex.: genes mitocondriais e alguns genes nucleares (ex.: HLA)

Os genes podem estar sobrepostos

Subunidade 8 da ATPase, do nucleotídeo 8366 ao 8569; Subunidade 6 da ATPase , do 8527 ao 9204

Seqüências repetidas funcionais

Famílias de genes dispersos (famílias multigênicas)

De apenas alguns a centenas de genes (Ex. globina, imunoglobulinas, sistema HLA) Muitos genes de funções similares – duplicação seguida de divergência evolutiva Genes que se tornam não-funcionais – pseudogenes (Ψ)

Seqüências repetidas funcionais

Famílias de genes em tandem (famílias multigênicas)

Produtos gênicos necessários em grandes quantidades (Ex. histonas, genes para rRNA, tRNA)

Originados por duplicação

Genes de histona de ouriço-do-mar

Genes de histona da mosca das frutas

Famílias de genes em tandem (famílias multigênicas) Ex.: rRNA 3 17 21 (D e G) Braço Curto (p) Braço Longo (q) p q p q Telômero (TTAGGG) satélite (possui as múltiplas cópias repetidas dos genes para RNA

ribossômico)

Constrição primária

Constrição secundária

Seqüências repetidas funcionais

Não-codificantes

Seqüências teloméricas (TTGGGG em Tetrahymena e TTAGGG em humanos)

Fim do cromossomo

Replicação

e

e

Primer de RNA removido e

ligação dos fragmentos de DNA

Primer de RNA

Seqüências repetidas funcionais

Não-codificantes

Seqüências teloméricas (TTGGGG em Tetrahymena e TTAGGG em humanos)

e

Primer de RNA removido e

ligação dos fragmentos de DNA

Primer de RNA

DNA recém sintetizado

Telomerase

Nucleotídeo Molde de

RNA

DNA altamente repetitivo

• In tandem : DNA satélite, minissatélites e microssatélites – Ex.: ttagttagttag

• Dispersos : elementos transponíveis : LINE, SINE

Localização

Telômero (minissatélite TTAG)

Centrômero (DNA alfóide, β satélite)

Microssatélites (amplamente dispersos pelo genoma) LINE-1

(bandas escuras)

Seqüências sem função conhecida

DNA altamente repetitivo flanqueando o centrômero Banda “satélite” em gradiente de cloreto de césio

Repetições de seqüências curtas com centenas de kb Localizados em regiões heterocromáticas

DNA altamente repetitivo em

Seqüências sem função conhecida

Número variável de repetições em tandem (VNTRs) Seqüências de 1 a 5 kb de 15 a 100 pb repetidos Base do fingerprints de DNA

DNA minissatélite

Sangue corado

suspeitos DNA altamente repetitivo em tandem

DNA – Nuclear – VNTRs

Gene da mioglobina

Éxon 1 Éxon 2 Éxon 3

4 repetições em tandem

Repetições de 33 pb

Cromossomos homólogos

Seqüências sem função conhecida

DNA microssatélite – STRs (repetições curtas em tandem) Repetições em tandem de 2-4 pb

Raramente em seqüências codificadoras

Próximos aos genes associadas a doenças hereditárias: retardo mental ligado ao X frágil

ATACATCACACGTCTGCTGGATGCTTCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGC TGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGC TGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG CTGTTCTGCACCGTTAGTGCTGTCCTGGTA (CTG)₁₀₁ DNA altamente repetitivo em tandem Homem: 100.000 microssatélites

Mecanismos de aumento ou diminuição de repetições

Replicação do DNA

Aumento do número de repetições

Diminuição do número de repetições

primer _{fita nova}

fita molde

Fita nova desliza Nova replicação

primer fita nova

fita molde

Fita molde desliza

Mecanismos de aumento ou diminuição de repetições

Replicação do DNA:

deslizamento das fitas

Mecanismo de variação no número de repetições em tandem

Crossing-over

desigual

Aumenta no _repetições

Diminui no _repetições

Seqüências sem função conhecida

Seqüências transpostas

Elementos repetitivos que se fazem cópias de si mesmos Transposons  que se movem como DNA

Retrotransposons  que se propaga pela ação da transcriptase reversa

LINEs (longos elementos intercalares): de 1 a 5 kb, de 100.000 a 500.000 cópias, L1 SINEs (curtos elementos intercalares): 300 pb, 10% do genoma, repetições Alu

Geram mutações – doenças hereditárias; inativação insercional de genes importantes

50% do genoma

Heterocromatina

centromérica Organizador nucleolar

DNA altamente repetitivo disperso

Transposição através de um DNA intermediário Transposons Não produzem transcriptase reversa Elementos transponíveis Transposição através de um RNA intermediário Produzem transcriptase reversa Família não-viral Pseudogenes processados Ex.: família Alu

(SINE) Família viral Têm LTRs e outros elementos de Retrovírus Ex. HERV Sem LTRs ou outros elementos Retrovírus Ex.: LINE-1

Elementos transponíveis humanos

DNA espaçador

Pouco se sabe sobre

Possivelmente sua única função é espaçar Nenhum estudo realizado

Pequena parte do genoma contém seqüências codantes

DNA – Mitocondrial

DNA Mitocondrial

Circular de cadeia dupla

Não apresenta crossing-over, íntrons e arcabouço de histonas, nem reparo Compacto (16,6 kb)

37 Genes: para rRNA, tRNA e para polipeptídeos necessários para produção de ATP Herança materna; acúmulo de mutações DNAmt – relógio evolutivo

Heteroplasmia: replicação independente do núcleo e distribuição para as células filhas também; variação no número de mitocôndria nas células somáticas e de mutações

GENOMA MITOCONDRIAL

 Conteúdo : 44% G/C

 Fitas com composição diferente

Fita pesada

(heavy)

Fita leve

(light)

Rica em G

Rica em C

Genes mitocondriais

37 genes

28

Fita H

9

Fita L

24 RNA : 22 tRNA, 2 rRNA

13 proteínas da cadeia

Estrutura do genoma mitocondrial

Origem e direção da síntese das fitas pesada (O_H) e leve (O_L) Origem e direção da transcrição das fitas pesada (P_H) e leve (P_L)

Genes RNAr Genes RNAt

Genes codificando proteínas

Genoma Nuclear x Genoma mitocondrial

Nuclear _Mitocondrial Tamanho No _{mol. DNA} diferentes 23 (XX) ou 24(XY), lineares 1, circular No _{total de moléculas}

DNA/cél. 23 (haplóide), 46 (diplóide) milhares Proteínas associadas Histonas e não-histonas Sem proteínas

No _{genes ~ 30 000 37}

Densidade gênica ~ 1/40 kb ~ 1/0,45 kb

DNA repetitivo Grande parte Muito pouco

Transcrição Genes transcritos

individualmente

Transcrição contínua de muitos genes

Íntrons Freqüentes Ausentes

% DNA codante ~3% ~93%