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MARCELO CARDOSO DE LIMA
EXPRESSÃO DE RECEPTORES DE ANGIOTENSINA II EM
UM MODELO DE RESTRIÇÃO PROTÉICA GESTACIONAL:
EFEITOS NO CONSUMO DE ÁGUA, PRESSÃO ARTERIAL
E FUNÇÃO RENAL.
Campinas
2012
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
EXPRESSÃO DE RECEPTORES DE ANGIOTENSINA II EM
UM MODELO DE RESTRIÇÃO PROTÉICA GESTACIONAL:
EFEITOS NO CONSUMO DE ÁGUA, PRESSÃO ARTERIAL
E FUNÇÃO RENAL.
Marcelo Cardoso de Lima
Tese de Doutorado apresentada à Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Campinas - UNICAMP para obtenção do título de Doutor em Ciências. Sob Orientação do Prof. Dr. José Antonio Rocha Gontijo.
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vii DEDICO EM ESPECIAL
Aos meus pais,
Racine Cardoso de Lima e Aimeé Machado de Lima
Com toda gratidão e amor, pelo exemplo de vida, de caráter, pelo incentivo em todas as horas que precisei, pelos conselhos e carinho nos momentos de difíceis decisões em minha vida, pela participação constante em minhas alegrias como tristezas, pelo esforço e dedicação que tornou possível a realização de meus estudos e principalmente, pelo que vocês sempre foram e são.
A minha esposa e ao meu filho,
Marina Bonatelli de Lima e Marcos Vinícius Bonatelli de Lima
Pela pureza e simplicidade, pelo amor, carinho e ternura, pela coragem e valentia que sempre demonstram nos momentos difíceis, pela vontade de vencer e viver de maneira digna, pela força e confiança que depositam em mim, por saber ser esposa e filho, por fim, sempre nobres em minha vida.
Aos meus irmãos,
Patrícia, Racine Jr, Eduardo (eterno para sempre), Rodrigo e Maria Eloísa
Pela personalidade, pela sinceridade, pelo carinho e amizade, pelo exemplo de serem batalhadores e conquistadores na vida e sobre tudo por sempre acreditar que eu venceria esta etapa.
AMO VOCÊS, MEU ETERNO RECONHECIMENTO
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ix AGRADEÇO SINCERAMENTE:
À FAPESP pelo apoio financeiro no qual permitiu o desenvolvimento e a realização deste projeto assim como o meu envolvimento de maneira integral com o trabalho na área de pesquisa.
À Universidade Estadual de Campinas e à Faculdade de Ciências Médicas, especialmente ao Programa de Fisiopatologia Médica e ao Núcleo de Medicina e Cirurgia Experimental.
À equipe de pesquisa do Laboratório Hidro-Salino (LHS): Flávia F. Mesquita, Luiz Fernando Bossignolo, Noemi Roza, Amanda Almeida, Vinícius Rodrigues, Rafael Borges, Sonia Rachel, Rafael de Holanda, Benito, Vinícius Canale, Silmara Ciampone, Adrianne Palanch, Carmen Mir, Nelson Lutaif, Daniel Bueno, Ize de Lima, Elisabeth Cambiucci, Dioze Guadagnini, pela amizade e ajuda nos momentos em que mais precisei, principalmente quando relacionados à discussão de trabalhos científicos e a realização de experimentos.
Ao futuro mestre o doutor Augusto Henrique Custódio pelos incansáveis dias, semanas e meses de trabalho que foram incorporados em sua vida para a iniciação da pesquisa e o fortalecimento da nossa amizade.
Aos estagiários que passaram pelo LHS disponibilizando suas horas de estágio e seu precioso tempo nos ajudando.
Aos funcionários do Núcleo de Medicina e Cirurgia Experimental: Sr. José, Sr. Antonio, Sr. Luiz, Sr. Marcio, Sr. Marino, Carol, Joyce, Willian, Miguel, Dito, Ana, Roberto, Edilene, Jorge, Erasmo por toda colaboração e amizade construída neste período experimental.
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Aos colegas de outros laboratórios pela colaboração quanto aos protocolos, uso de equipamentos e discussão científica.
A Profa. Dra. Adriana Zaparolli pela boa vontade em ajudar no projeto, com sua experiência cirúrgica e neurociência.
À toda Família Bonatelli, principalmente aos meus queridos, Márcio e Márcia, Edinson e Viviane, Karina e Thiago pelo extremo carinho e ajuda nos momentos de dificuldades.
Aos meus animais por tão grande significado na vida, inclusive aos que não puderam ser utilizados, mas de alguma maneira proporcionaram algum tipo de conhecimento e desenvolvimento científico em prol da humanidade.
Enfim, à todos que colaboraram de maneira direta ou indireta para a realização deste trabalho, dedico meus sinceros agradecimentos.
Aprender é descobrir aquilo que você já sabe. Fazer é demonstrar que você sabe. Ensinar é lembrar aos outros que eles sabem tanto quanto você.
Vocês são todos aprendizes, fazedores, professores".
xi AGRADEÇO DE FORMA ESPECIAL Ao Prof. Dr. José Antonio Rocha Gontijo
Por ser verdadeiramente um Mestre, saber ver as pessoas na sua forma mais bruta e principalmente por saber lapidá-las. Pelo seu profissionalismo, pelo caráter, pela dedicação e paciência que me guiou e transmitiu seus conhecimentos, obrigado pelo que sou agora.
À Profa. Dra. Patricia Aline Boer
Mulher corajosa e inovadora. Agradeço pela co-orientação, amizade e disponibilização do seu tempo precioso. Serei eternamente grato pelos seus ensinamentos e pela oportunidade de sempre.
Ao amigo e irmão José Eduardo Scabora
Pelo companheirismo, pelo grande incentivo e estimável colaboração na realização deste trabalho. Amigo, fique sabendo que ao longo dessa trajetória, eu perdi um irmão e ganhei outro com o mesmo nome, você.
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original".
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xiii RESUMO
O presente estudo avaliou a repercussão da restrição protéica gestacional sobre os receptores da Angiotensina II (AT1R e AT2R) no sistema nervoso central e seu impacto na programação da hipertensão arterial na vida adulta. Os resultados deste estudo demonstraram que o ambiente intrauterino inadequado, desencadeou nos animais do grupo hipoprotéico (LP), um baixo peso ao nascimento, uma expressão significativamente menor de receptores AT1R no extrato de tecido hipotalâmico aos 12 dias de idade e não significativa na 16a semana de vida quando comparados com os animais do grupo normoprotéico (NP). Inversamente, foi observado uma maior e significativa expressão de receptores AT2R no estrato total de hipotálamo de animais do grupo LP com 12 dias de vida, permanecendo nos animais com 16 semanas de vida, quando comparados ao grupo NP. Adicionalmente, observou-se a redução na resposta dipsogênica frente à administração Intracerebroventricular (i.c.v.) de Angiotensina II (AngII) nos animais LP em comparação com os animais do grupo NP. Estes resultados podem estar relacionados à expressão diminuída de vasopressina (AVP) hipotalâmico, demostrada aqui pela imunohistoquímica, na prole submetida à restrição protéica gestacional. A presente investigação também demonstrou uma menor expressão de receptores mineralocorticóide (MR) e glicocorticóide (GR) associada a uma elevação de propiomelanocortina (POMC) e hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), assim sugerindo uma participação de mineralocorticoides e glicocorticóides como resposta compensatória ao longo da vida para atenuar as alterações na fisiologia renal comprovadas pela queda acentuada na excreção fracional de sódio urinário (FENa+) nos animais do grupo LP sem ocorrer alteração na filtração glomerular estimada pelo clearance de creatinina (CCr). O Clearance de lítio demonstrou que esta excreção urinária aumentada foi devida à perda da capacidade reabsortiva do néfron proximal a despeito do aumento na reabsorção pós-proximal. Estes efeitos foram associados com um significativo aumento na pressão arterial no grupo LP, mas, o mecanismo exato destes fenómenos permanecem desconhecidos.
Palavras-chave: Desnutrição protéica; Hipertensão arterial; Sistema renina-angiotensina; Sistema nervoso central; Teste de função renal
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xv ABSTRACT
Recent studies have shown that the central nervous system, during development, can be influenced by alterations in the intrauterine environment. This organizational phenomenon is termed ‘early-life programming’. Here, in maternal protein-deprived offspring model, we focus on adult hypertension development, hypothalamic changes and renal function disorders as an outcome and confirm the hypothalamus as a structure in which there are early and permanent changes that underlie the developing hypertension. The present study shows that LP male pup body weight was significantly reduced when compared to that of NP pups. However, the body masses at 12-days-old and 16-wk-old were similar to observed in NP age-matched group. Furthermore, the immunoblotting analysis in the current study demonstrated a significantly decreased expression of type 1 AngII receptors in the entire hypothalamic tissue extract of LP rats at 12 days of age and unaltered expression in16-wk-old rats, compared to that observed in NP offspring. The unchanged AT1R expression by blotting in the whole hypothalamic extract of 16-wk LP rats may results of uneven expression of protein, revealed by immunohistochemistry, of different analyzed hypothalamic structures. Conversely, the expression of the type 2 AngII receptors in 12-days and 16-wk-old LP hypothalamus was significantly increased, when compared with the NP age-matched group. The current data shows the influence of central AngII administration on spontaneous water consumption in a concentration-dependent fashion, but also demonstrated that the water intake response to graded AngII concentrations was strikingly attenuated in 16-wk-old LP, compared with age-matched NP controls. These results may be related with decreased brain AVP expression showed in maternal protein-restricted offspring. The present investigation also shows an early and pronounced decrease in fractional urinary sodium excretion in maternal protein-restricted offspring. It also shows a decreased central expression of MR and GR associated, reciprocally, with enhanced immunoreactivity to POMC e ACTH. The decreased FENa was
accompanied by a fall in FEPNa and occurred despite unchanged CCr and an
enhanced FEPPNa. All these effects was associated with a significant enhance in
arterial blood pressure in the LP group but, the precise mechanism of these phenomena remains unknown.
Keywords: Maternal protein restriction; Hypertension; Renin-Angiotensin system;
xvi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
11β HSD2 – 11-beta-hidroxiesteróide-dehidrogenase tipo 2 3V – Terceiro ventrículo
3Vd – Terceiro ventículo dorsal
ACTH – Hormônio adrenocorticotrófico ADH – Hormônio anti-diurético
ADP – Núcleo pré-óptico antero-dorsal AngII – Angiotensina II
AT1R – Receptor de angiotensina tipo 1 AT2R - Receptor de angiotensina tipo 3 AT4R – Receptor de angiotensina tipo 4 AVP – Vasopressina
BBB – Barreira hemato-liquórica BE – Beta-endorfina
CC – Corpo Caloso
CCr – Clearance de creatinina CHv – Comissura hipocampal ventral CVLM – Bulbo ventro-lateral caudal
ECA – Enzima conversora da angiotensina EMT – Estria medular do tálamo
ESO – Episupraóptico
FEK+ – Fração de excreção de potássio FENa+ – Fração de excreção de sódio
xvii
FEPNa+ – Fração de excreção proximal de sódio FEPPNa+ – Fração de excreção pós-proximal de sódio
GR – Receptor de glicocorticóide HA – Hipotálamo anterior
HHA- Eixo hipotálamo-hipófise-adrenal HP – Hipotálamo posterior
IAP-1 – Inibidor e ativador de plasminogênio
IUGR (intrauterine growth restriction) – restrição de crescimento intra-uterino JAK2 - Janus kinase
LP – Hipoprotéico
MmPO – Núcleo pré-óptico mediano MR – Receptor de mineraloglicocorticóide NHdm – Núcleo hipotalamico dorso medial NHm – Núcleo habenular medial
nHP – Núcleo hipotálamo posterior NMDV – Núcleo motor dorsal do vago NP – normoprotéico
nPV – Núcleo paraventrilar
nPVH – Núcleo parvocentricular do hipotálamo NTS – núcleo trato solitário
OCV – Órgão circuventricular
OVLT – Órgão vasculoso da lamina terminal PAC – Pressão arterial caudal
xviii
pCRH – Hormônio adrenocorticotrófico de origem placentaria PoMC – Propiomelanocortin
PPVN – Neurônios parvocelulares PV – Núcleo talâmicos paraventricular
rSON – Porção retroquiasmática do núcleo supra-óptico RVLM – Bulbo ventro-lateral rostral
SFO – Subfornical órgão
SNC – Sistema nervoso central SNS – Sistema nervosa simpatico
SOCS – Suppressor of cytokine signalling SON – Núcleo supra-óptico
SRA – Sistema renina-angiotensina
SRAA – Sistema renina-angiotensina-aldosterona STAT – Signal transducer and activator of transcription TuHL – Região tuberal do hipotálamo lateral
xix
LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Encéfalo de rato, notar o hipotálamo (em vermelho) e algumas
estruturas vizinhas. FONTE: CAPPAERT, N. (2012). ... 43 Figura 2 - O hipotálamo é um conjunto complexo de núcleos (em diferentes
cores) e feixes (em verde). Os núcleos em vermelho fazem parte da coluna periventricular, aqueles em azul constituem a coluna medial, e a grande área em marrom é a coluna lateral. Observe, em particular, que o feixe prosencefálico medial não é verdadeiramente medial. Ele foi chamado assim em referência ao encéfalo como um todo, já que com referência ao hipotálamo ele ocupa uma posição lateral. FONTE: LENT,
2010. ... 44 Figura 3 - Controle hipotalâmico da hipófise posterior ou neuro-hipófise. A
hipófise posterior armazena e libera hormônios vasopressina e ocitocina – que, na realidade, são produzidos nos neurônios dos núcleos supra-ópticos e paraventriculares do hipotálamo. Esses hormônios são transportados para a hipófise posterior
por axônios no trato hipotálamo-hipofisário. FONTE: Fox, 2007. ... 47 Figura 4 - A regulação do eixo HHA e as mudanças drásticas na gestação
com implicações para a mãe e o feto. Adaptado de Sandman
et al., 2011. ... 52 Figura 5 - Sistema-renina-angiotensina-aldosterona. AT1R: receptor tipo 1
de angioensina; AT2R: receptor tipo 2 de angiotensina; AT3R:
receptor tipo 3 de angiotensina; AT4R: receptor tipo 4 de
angiotensina; AP: aminopeptidases; CP: carboxipeptidases; ECA: enzima conversora de angiotensina; Mas-R: receptor Mas; NaCl: Cloreto de sódio; S.N.S: sistema nervoso simpático; Subst.P: substância P. FONTE: Acta Médica
xx
Figura 6 - O diagrama do cérebro de ratos mostra algumas vias neurais que podem influenciar no controle cardiovascular relacionado à vasopressina (AVP) e a sede. FONTE: Adaptado de McKinley
et al, 2003. ... 62 Figura 7 - Resumo do delineamento experimental ... 69 Figura 8 - Caixa de aquecimento para aferimento de pressão arterial ... 73 Figura 9 - Aparelho de plestimografia, notar animal posicionado na câmara
para aferição da pressão arterial. ... 73 Figura 10 - Ganho de peso (g) ao longo das 3 semanas de gestação de
ratas Wistar Hannover submetidas à dieta normoprotéica
(17%) e hipoprotéica (6%). ... 85 Figura 11 – Massa corporal dos machos com 1 dia de vida submetidos à
dieta com 17% e 6% de proteína durante período gestacional,
n= 10. ... 86 Figura 12 – Massa corporal dos animais machos com 12 dia de vida
submetidos à dieta com 17% e 6% de proteína durante período
gestacional, n=10. ... 87 Figura 13 – Massa corporal dos animais machos com 16 semanas de vida
submetidos à dieta com 17% e 6% de proteína durante período
gestacional n= 6. ... 87 Figura 14 – Massa corporal dos animais machos a partir da 16ª semana de
vida submetidos à dieta com 17% e 6% de proteína durante
período gestacional, n= 6. ... 88 Figura 16 - Efeito da injeção i.c.v. de Ang II sobre a resposta dipsogênica.
Os ratos foram canulados e receberam 2.0 µl de solução salina ou 2.0 µl de solução contendo Ang II. Em ambos os grupos, normoprotéico (NP) e hipoprotéico (LP), o consumo de água foi
mensurado após 30 minutos. n= 5 animais. ... 89 Figura 17 - Imunoistoquímica para localização do receptor AT1 em corte
transversal de encéfalo de animal de 16 semanas (2.04 mm caudal em relação ao bregma). Comparativamente ao grupo
xxi
NP (A e C) a expressão deste receptor parece diminuída no grupo LP (B e D). Em A e B temos regiões circunjacentes ao terceiro ventrículo dorsal (3V). Em C e D observamos a parte posterior da área hipotalâmica anterior (HA) ao lado do terceiro ventrículo (3V). A direita, esquema representativo da área
observada (Paxinos e Watson, 2005). ... 91 Figura 18 - Immunobloting para expressão de receptores de AT1R em
hipotálamo de ratos NP e LP com uso de anticorpo AT1 (N-10)
SC-1173 – Rabbit Polyclonal IgG. ... 91 Figura 19 - Imunoistoquímica para localização do receptor AT1 em corte
transversal de encéfalo de animal de 16 semanas (3.36 mm caudal em relação ao bregma). Comparativamente ao grupo NP (A e B) a expressão deste receptor parece diminuída no grupo LP (B, D e F). Em A e B temos regiões circunjacentes ao ventrículo lateral (VL) e o plexo coróide (PC). Em C e D observamos, ao lado do terceiro ventrículo dorsal (3Vd), o núcleo habenular medial (NHm). Observe que o PC apresenta-se com marcação significativamente mais intensa no grupo NP. Em E e F observamos, ao lado do terceiro ventrículo (3V), o núcleo hipotalâmico posterior (nHP). A direita, esquema
representativo da área observada (Paxinos e Watson, 2005). ... 92 Figura 20 - Imunoistoquímica para localização do receptor AT1 em corte
transversal de encéfalo de animal de 16 semanas. Em A e B detalhe do núcleo supra-óptico (SON). Comparativamente ao grupo NP (A), o grupo LP (B) não parece apresentar diferença na intensidade da marcação. Já no órgão subfornical (SFO) é patente o aumento na expressão deste receptor no grupo LP (D) comparativamente ao grupo NP (C). À direita, esquema
representativo da área observada (Paxinos e Watson, 2005 ... 93 Figura 21 - Imunoistoquímica para localização do receptor AT2 em corte
xxii
3 (NP) e B1 , 2 e 3 (LP) temos montagem de 3 imagens paralelas. Em LP temos expressão aumentada do receptor AT2 na comissura hipocampal ventral (CHv), na parte anterior do núcleo talâmico paraventricular (PV) e na estria medular do tálamo (EMT). Repare que na base do epitélio ependimário (setas), ao redor do terceiro ventrículo dorsal (3Vd), também observamos aumento de expressão. Entretanto, o que mais chama atenção é o significativo aumento na expressão deste receptor no órgão subfornical (SFO). Acima, esquema
representativo da área observada (Paxinos e Watson, 2005). ... 95 Figura 22 - Immunobloting para expressão de receptores de AT2R em
hipotálamo de ratos NP e LP com uso de anticorpo AT2 (C-18)
SC-7420 – Rabbit Polyclonal IgG. ... 96 Figura 23 - Imunoistoquímica para localização do receptor AT2 em corte
transversal de encéfalo de animal de 16 semanas. No grupo LP (B) verificar o aumento na expressão deste receptor tanto nas regiões peri quanto nos núcleos paraventriculares comparativamente ao grupo NP (A). Reparar o aumento de expressão na base das células ependimárias que revestem o terceiro ventrículo (3V). À direita, esquema representativo da
área observada (Paxinos e Watson, 2005). ... 96 Figura 24 - Imunoistoquímica para localização do receptor AT2 em corte
transversal de encéfalo de animal de 16 semanas. No grupo LP (B) verificamos aumento na expressão deste receptor na comissura hipocampal ventral (CHv), no corpo caloso (cc) e na base do epêndima (setas) que reveste o ventrículo lateral (VL) comparativamente ao grupo NP (A). A expressão deste receptor também está aumentada nos núcleos supra-óptico (SON) e episupraóptico (ESO). A direita, esquema
xxiii
Figura 25 - Imunoistoquímica para localização do receptor AT2 em corte transversal de encéfalo de animal de 16 semanas. No grupo LP (B) verificamos aumento na expressão deste receptor. No núcleo habenular medial (NHm), no plexo coróide (PC) e no epêndima (seta) que reveste o terceiro ventrículo dorsal (3V). Acima, esquema representativo da área observada (Paxinos e
Watson, 2005). ... 98 Figura 26 - Imunoistoquímica para localização do receptor AT2 em corte
transversal de encéfalo de animal de 16 semanas. No grupo LP (B) verificamos aumento na expressão deste receptor no núcleo hipotalâmico posterior (HP) e no epêndima (seta) que reveste o terceiro ventrículo (3V). Acima, esquema
representativo da área observada (Paxinos e Watson, 2005). ... 99 Figura 27 - Imunoistoquímica para localização de vasopressina em corte
transversal de encéfalo de animal de 16 semanas (2.52 mm caudal em relação ao bregma). Nas montagens (A e B) podemos observar que comparativamente ao grupo NP (A) a expressão de vasopressina parece diminuída no grupo LP (B). Detalhes em maior aumento demonstram estas diferenças nos núcleos hipotalâmicos dorsomediais (NHdm: A1,2 e B1,2), na região tuberal do hipotálamo lateral (TuH: A3 e B3) e na porção retroquiasmática do núcleo supra-óptico (rSO: A4 e
B4). ... 100 Figura 28 - Imunoistoquímica para localização de ACTH em cortes da
adeno-hipófise de animal de 16 semanas. Em A e C vemos células cromófilas basófilas marcadas positivamente para ACTH dispersas ou ao redor de capilares (cabeças de seta). Em B e D vemos aglomerados de células epiteliais adjacentes a capilares fenestrados constituindo os plexos capilares secundários. Os animais do grupo LP (C e D) parecem ter maior expressão de ACTH quando comparados aos animais do
xxiv
grupo NP (C e D). Acima temos um esquema ilustrando a vascularização da hipófise com a formação de um plexo capilar
secundário (Kierszenbaun, 2008. ... 102 Figura 29 - Imunoistoquímica para localização de POMC em cortes da
adeno-hipófise de animal de 16 semanas. Em A e B animais do grupo NP e C e D animais do grupo LP. A marcação de POMC se apresenta no citosol de grande quantidade de células e, no grupo LP é mais intensa. Em B e D temos plexos capilares secundários delimitados pela linha descontínua. Observe a grande concentração de células positivas para POMC no
interior destes plexos. ... 103 Figura 30 - Imunoistoquímica para localização de receptores de
mineralocorticóide (MR) em cortes da adeno-hipófise de animal de 16 semanas. Em A e B animais do grupo NP e em C e D animais do grupo LP. Embora esteja distribuído por todo o parênquima hipofisário este receptor se encontra mais densamente localizado na região central dos plexos capilares
secundários. Em LP sua expressão está bastante reduzida. ... 104 Figura 31 - Imunoistoquímica para localização de receptores de
glicocorticóide (GR) em cortes da adeno-hipófise de animal de 16 semanas. Em A animal do grupo NP e em B animal do grupo LP. Este receptor tem localização citosólica ou nuclear. Repare que em A tanto a coloração do citosol quanto a nuclear está mais intensa. Estes receptores situam-se preferencialmente em células ao redor das capilares
fenestrados dos plexos capilares secundários. ... 105 Figura 31 - Pressão arterial sistólica (mmHg) ao longo da idade em
semanas ... 106 Figura 32 - Taxa de filtração glomerular estimada pelo clearance de
creatinina ... 108 Figura 33 - Excreção fracional urinária de sódio (FENa+) ... 108
xxv
Figura 34 - Fração de excreção proximal de sódio (FEPNa+) ... 109
Figura 35 - Fração de excreção pós-proximal de sódio (FEPPNa+) ... 109
xxvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Principais núcleos hipotalâmicos e suas funções ... 45 Tabela 3 - Ingredientes da ração 6% (LP) ... 71 Tabela 2 - Ingredientes da Ração com 17% de Proteínas (NP) ... 71
xxvii SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 31 2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS ... 37 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 40 2.1 PROGRAMAÇÃO FETAL ... 40 2.2 ESTUDO 1 - Em um modelo de restrição protéica gestacional existem alterações no funcionamento do eixo HHA? ... 42 2.2.1. O EIXO HIPOTÁLAMO-HIPÓFISE-ADRENAL FETAL (HHA) E A PROGRAMAÇÃO FETAL ... 42 2.2.2 A PROGRAMAÇÃO FETAL E O SISTEMA NEUROLÓGICO. ... 50 2.3 ESTUDO 2 - Em um modelo de restrição protéica gestacional existem alterações no SRA cerebral e na resposta dipsogênica? ... 53 2.3.1 O SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA-ALDOSTERONA ... 53 2.4. ESTUDO 3 - Em um modelo de restrição protéica gestacional existem alterações na função renal e na pressão arterial? ... 58 2.4.1 O SISTEMA NERVOSO CENTRAL NO CONTROLE DA PRESSÃO ARTERIAL .. 58 2.4.2 CONTROLE RENAL DA PRESSÃO ARTERIAL ... 63
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 69
3.1 ANIMAIS ... 70 3.2 MASSA CORPORAL TOTAL ... 72 3.3 PRESSÃO ARTERIAL CAUDAL (PAC) ... 72 3.4 ESTERIOTAXIA E INDUÇÃO DE SEDE PELA ANGIO II I.C.V. ... 74 3.4.1 Protocolo anestésico ... 74 3.4.2 Implante da cânula intracerebroventricular ... 74 3.4.3 Procedimento experimental ... 75 3.5 COLETA, IMUNOPRECIPITAÇÃO E IMUNOBLOTING ... 76 3.6 IMUNOISTOQUíMICA ... 78 3.7 ESTUDO DA FUNÇÃO RENAL: ... 79
xxviii
3.8 DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE SÓDIO, LÍTIO, POTÁSSIO E CREATININA PLASMÁTICA E URINÁRIAS ... 80 3.8.1 Fórmulas para cálculo do clearance e de fração de excreção ... 81 3.8.1.1 Clearance de Creatinina (CCr) ... 81 3.8.1.2 Fração de Excreção de Sódio (FENa) ... 81 3.8.1.3 Fração de excreção de Potássio (FEk) ... 82 3.8.1.4 Fração de excreçao proximal de sódio (FEPNa) ... 82 3.8.1.5 Fração de excreção pós-proximal de sódio (FEPPNa): ... 82 3.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS DOS RESULTADOS ... 83
4. RESULTADOS ... 85 4.1 ESTUDO 1 - Em um modelo de restrição protéica gestacional existem alterações no funcionamento do eixo HHA? ... 85 4.1.1 ACASALAMENTO E LAVADO VAGINAL ... 85 4.1.2 COMPILAÇÃO DOS DADOS REFERENTE AO GANHO DE PESO DURANTE A GESTAÇÃO ... 85 4.1.3 COMPILAÇÃO DOS DADOS REFERENTE MASSA CORPORAL DE MACHOS, NASCIDOS DE MÃES SUBMETIDAS À DIETA NORMOPROTÉICA 17% E HIPOPROTÉICA 6% DURANTE A GESTAÇÃO ... 86 4.2 ESTUDO 2 - Em um modelo de restrição protéica gestacional existem alterações no SRA cerebral e na resposta dipsogênica? ... 88 4.2.1 ESTERIOTAXIA E INDUÇÃO DE SEDE PELA ANGIO II I.C.V. ... 88 4.2.2 WESTERN BLOTTING E IMUNOISTOQUÍMICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DO RECEPTOR AT1 NO ENCÉFALO TOTAL E HIPOTÁLAMO DE ANIMAIS DE 16 SEMANAS DE VIDA. ... 90 4.2.3 WESTERN BLOTTING E IMUNOISTOQUÍMICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DO RECEPTOR AT2 NO ENCÉFALO E HIPOTÁLAMO ISOLADO DE ANIMAIS DE 16 SEMANAS DE VIDA. ... 94 4.2.4 IMUNOISTOQUÍMICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DO RECEPTOR DE VASOPRESSINA NO ENCÉFALO DE ANIMAIS DE 16 SEMANAS DE VIDA. ... 100
xxix
4.2.5 IMUNOISTOQUÍMICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DO RECEPTOR DE ACTH NA ADENO-HIPÓFISE DE ANIMAIS DE 16 SEMANAS DE VIDA. ... 101 4.2.6 IMUNOISTOQUÍMICA PARA IDENTIFICAÇÃO DO RECEPTOR DE MINERALO (MR) E GLICOCORTICÓIDENA ADENO-HIPÓFISE DE ANIMAIS DE 16 SEMANAS DE VIDA. ... 104 4.3 ESTUDO 3 - Em um modelo de restrição protéica gestacional existem alterações na função renal e na pressão arterial? ... 106 4.3.1 PRESSÃO ARTERIAL CAUDAL (PAC) ... 106 4.3.2 FUNÇÃO RENAL ... 107
5. DISCUSSÃO ... 112
6. CONCLUSÃO ... 126
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ... 128
30
31 1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, um conjunto crescente de evidências tem sustentado a idéia de que distúrbios ocorridos em períodos críticos do desenvolvimento fetal podem determinar alterações permanentes ou “adaptativas” de longo prazo na fisiologia ou morfologia de um determinado órgão (ASHTON, 2000). O conceito de “programação fetal” também pressupõe que o feto ao ser programado durante o desenvolvimento intra-uterino pode desenvolver doenças na idade adulta. A desnutrição pré-natal é o modelo mais extensamente estudado de programação fetal que tem sido utilizado como uma das chaves para entender a fisiopatologia de doenças metabólicas e cardiovasculares (LANGLEY-EVANS, 1998; EDWARDS et al., 2001).
De acordo com essa teoria, alterações no estado nutricional maternas, refletidas pelo peso ao nascer da prole e a níveis de glicocorticóide perinatais (LANGLEY-EVANS, 1997), seriam o prenúncio da elevação da pressão sanguínea durante a infância, adolescência e ao estado hipertensivo no adulto (BARKER et al., 1989; LAW et al., 1991; WILLIAMS et al., 1992).
O primeiro relato da associação de eventos precoces perinatais com o desenvolvimento posterior de doença cardiovascular foi feita em 1977, por Forsdahl. Na população estudada, a mortalidade por doença cardiovascular e cerebrovascular se correlacionou com as taxas de mortalidade infantil da mesma população. Em seguida, uma série de investigações epidemiológicas demonstrou correlações entre as modificações da pressão sanguínea materna e de sua prole, sugerindo ser este, um fator determinante. Vários modelos de subnutrição fetal
32
foram desenvolvidos, nos quais o baixo peso da prole ao nascer era associado à elevação pressórica na idade adulta (PERSSON e JANSSON, 1992; WOODALL et al, 1996; PRENTICE 1991; GODFREY et al, 1996).
Posteriormente, BARKER (1995; 1997; 1998) mostrou a associação entre o peso ao nascer e o desenvolvimento de doenças cardiovasculares no adulto, onde foi sugerida a hipótese de que o retardo do crescimento fetal aumenta o risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares na fase adulta.
As maiores evidências acerca das influências fetais na programação de doenças cardiovasculares, surgiram a partir de trabalhos que empregaram métodos de manipulação da dieta materna de ratos durante a gestação, como meio de induzir restrição protéica materno-fetal. Variações no conteúdo de proteína da dieta foram planejadas para produzir restrição leve (12% de caseína), moderada (9%) e severa (6%) (LANGLEY-EVANS, 1996). Esses experimentos resultaram em alterações variáveis no peso dos recém-natos e no tamanho das placentas. Os animais desenvolveram hipertensão arterial a partir da quarta semana de vida e mantida até a idade adulta (LANGLEY-EVANS, 1994; 1995). A restrição protéica materna anterior à gestação não afetou os resultados e mesmo períodos curtos (1 semana) de restrição protéica gestacional foram suficientes para induzir alterações na pressão arterial (LANGLEY-EVANS, 1996). Estes resultados se revestem de grande importância quando correlacionados com os achados epidemiológicos em humanos. Achados de baixo peso ao nascer, relacionados à desnutrição materna e ao desenvolvimento futuro de hipertensão arterial são inteiramente compatíveis com a “hipótese de Barker”.
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Atualmente tem sido dada ênfase ao papel do SNC (Sistema Nervoso Central), este classicamente considerado como sendo o modulador em curto prazo da pressão arterial (ABBOUD, 1982; CAMPESE, 1985; OPARIL, 1986). Contudo algumas pesquisas sugerem que o sistema nervoso também contribui em longo prazo para a regulação da pressão arterial, podendo apresentar papel significativo na elevação crônica da pressão arterial em alguns pacientes hipertensos (ESLER, 1995).
Muitos investigadores têm demonstrado que as funções de diferentes áreas do SNC tais como hipotálamo posterior (NOVAKOVA e STEVENSON, 1971), o tronco encefálico (WISE e GANONG, 1960) e de áreas próximas ao terceiro ventrículo (DORN et al. 1970), modificam a excreção renal de sódio e potássio. Está demonstrada também a participação colinérgica do hipotálamo lateral sobre o controle da excreção tubular de íons e água (SAAD et al. 1975; SILVA-NETO et al., 1976; GONTIJO et al., 1990, 1992). Entretanto, os mecanismos pelos quais estas diferentes regiões influenciam na função renal não estão bem esclarecidos. Dentre alguns fatores que associam a baixa ingestão protéica materna à elevação da pressão sanguínea da prole está à elevada atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) (O’DONNELL et al, 1994; PLOTSKY e MEANEY, 1993; PROVENCHER et al., 1995; GARDNER et al., 1997) e a diminuição da 11-β diidroxiesteroide desidrogenase tipo 2 placentária (11-βHSD-2) (BENEDIKTSSON et al., 1993; STEWART et al 1995; EVANS et al., 1996; LANGLEY-EVANS, 1997). A restrição protéica, acarretando diminuição na 11-β HSD
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placentária, causa aumento da exposição fetal à corticosteróides endógenos maternos (LANGLEY-EVANS et al., 1996).
O eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA), é extremamente suscetível à programação da sobrevivência no desenvolvimento fetal e neonatal (WELBERG e SECKL, 2001). Para tanto, Matthews (2002), comprovou a função integrativa do eixo HHA com a programação e a sobrevivência de populações de humanos e animais, quando mecanismos adaptativos são transmitidos ao feto resultando em maior habilidade de sobrevivência após o nascimento.
Em ratos, existem evidências de que a função pós-natal do eixo HHA pode ser alterada por eventos pré-natais. Tais alterações podem ocasionar, no adulto, a exposição cronicamente aumentada de glicocorticóides (GC) causando uma resposta exacerbada ao estresse. Essas alterações são atribuídas a modificações das alças de realimentação de esteróides, condicionado, em parte, pelo nível de expressão de genes para receptores de GC (incluindo receptores glicocorticóides e mineralocorticóide em diferentes regiões hipotálamo hipofisárias). Paralelamente, ocorrem alterações em outros neurotransmissores em varias outras regiões cerebrais (WELBERG, 2001). O controle do metabolismo hidrossalino é realizado por mecanismos neurais e humorais e, tem como efetor principal, os rins. O cérebro possui papel importante na regulação homeostática do sistema cardiovascular, particularmente a partir de sensores periféricos, os barorreflexos. Na maioria das regiões cerebrais para as quais aferem os sensores periféricos, (núcleos hipotalâmicos e medula oblonga) parte da modulação é realizada pela angiotensina. Embora, até o momento não tenha sido identificada a expressão de renina nestas áreas, genes que codificam toninas tem sido aí
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identificados. As toninas podem clivar o angiotensinogênio em Ang I e esta na presença de abundante concentração da enzima conversora de angiotensina (ECA) produz angiotensina II. O receptor do tipo 1 da angiotensina (AT1R) é altamente expresso no hipotálamo, cérebro, medula oblonga e em regiões envolvidas na regulação da pressão sanguínea e do balanço de fluido e eletrólitos (MCKINLEY et al., 1986; ALLEN et al., 1987).
A ação mais conhecida da Ang II é exercida através do receptor AT1, um receptor acoplado à proteína G que induz a ativação de Janus quinase 2 (JAK-2) (MARRERO et al, 1995). JAK-2 é uma quinase intracelular que direciona informações ao núcleo via ativação de proteínas transdutoras e ativadoras da transcrição (STATs) (MARRERO et al, 1995, SCHINDLER e DARNELL 1995). Esta sinalização, dentre outras vias, induz a expressão de SOCS-3, que, retornando ao citoplasma celular, se associa a JAK inibindo a ligação JAK/STAT e as ativações subseqüentes da via induzida pela ligação da Ang II ao seu receptor específico (KREBS e HILTON, 2000). Várias áreas do SNC expressam receptores para Ang II as quais têm relevante papel sobre o controle do balanço hidroeletrolítico. Tem sido encontrada alta concentração de receptores AT1 em pericários do órgão subfornical (SFO), núcleo paraventricular hipotalâmico (PVN), núcleo lateral pré-óptico medial (MPOL), núcleo pré-óptico ântero-dorsal (ADP) e órgão vascular da lâmina terminal (OVLT) (BUNNEMAN et al, 1992). Neurônios do núcleo supra-óptico (SON) também expressam receptores AT1, mas em menor concentração. Estudos têm comprovado que Ang II, quando administrado centralmente, induz a sede pela ativação de receptores AT1 em neurônios das áreas pré-ópticas (MPOL e ADP) e no OVLT (FERGUSON, 2001).
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37 2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Tendo em vista a fundamentação apresentada acima o desenvolvimento do presente trabalho se JUSTIFICA pela:
- Elevada prevalência e morbidade da hipertensão arterial sistêmica em populações humanas;
- Existência de modelos fisiopatológicos específicos que atendem ao estudo e a compreensão etiopatológica de doenças humanas, tais como a hipertensão arterial e doenças metabólicas;
- Repercussão pré-natal de eventos que influenciam diretamente a manifestação futura de doenças metabólicas e cardiovasculares;
- Prevalente desnutrição materno-infantil, com evidentes repercussões futuras sobre a saúde de populações e, a merecida preocupação para o desenvolvimento de políticas de saúde publica que minimizem os efeitos desta em países desenvolvidos e em desenvolvimento;
- Conhecida repercussão fetal da desnutrição materno-infantil em períodos críticos do desenvolvimento ontogênico, vinculada à manifestação programada de alterações no desenvolvimento morfológico e funcional de órgãos e sistemas;
- Evidências que tais alterações estão relacionadas a modificações definitivas da modulação do sistema nervoso central eixos neuro-humorais, em particular sobre hipotálamo-hipófise-adrenal e a
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expressão e ação de componentes do sistema renina-angiotensina-aldosterona;
Tais evidências têm estimulado o desenvolvimento de experimentos que buscam elucidar os mecanismos biológicos e moleculares envolvidos na gênese destas alterações descritas acima.
Assim, são OBJETIVOS do presente trabalho:
1. Estudar a repercussão do tratamento de ratas prenhes com dieta hipoproteíca sobre a pressão arterial da prole adulta, comparando-a com um grupo controle;
2. Estudar a resposta intracerebroventricular de Angiotensina II sobre a ingestão hídrica e a excreção renal de sódio.
3. Estudar a expressão e localização hipotalâmica de: - AT1R
- AT2R
- VASOPRESSINA
4. Estudar a expressão e localização hipofisária de:
- Receptores MINERALOCORTICÓIDES E GLICOCORTICÓIDES - POMC
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40 2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 PROGRAMAÇÃO FETAL
Durante as últimas décadas, a comunidade científica vem apresentando resultados relevantes com relação a genética molecular de diferentes organismos. As variantes genéticas estão cada vez mais associadas com fenótipos específicos e a susceptibilidade à doença. Em paralelo, estudos sobre fatores de suscetibilidade genética e as condições ambientais (Genética × Ambiente) têm apresentado grande progresso. Estudos recentes mostram que fatores de risco à saúde humana estão vinculados à interações genética (G) e o ambiente (A) durante períodos perinatais repercutindo na idade adulta (FORSDAHL, 1977; BARKER, 2004). Essa interação genético-ambiental, permite a sobrevivência dos indivíduos a fatores inóspitos futuros, mas quando não apropriada, pode ter decisivo impacto sobre a saúde do individuo.
Lucas (2004) foi o primeiro a definir o conceito de “programação fetal” como uma resposta permanente do organismo a estímulos ou insultos durante períodos críticos do desenvolvimento ontogênico. No de 1964, Rose descreveu que a incidência de doença isquêmica cardíaca era o dobro em indivíduos que possuíam irmãos natimortos ou que haviam morrido na infância por baixo peso.
Barker (1995) foi pioneiro em sugerir em estudo científico, que o baixo peso ao nascer poderia estar ligado ao surgimento de diversas doenças no adulto. Ele sugeriu que a redução de 1 quilograma do peso ao nascer poderia representar a
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elevação de aproximadamente 6 mmHg na pressão arterial aos 60 anos de idade. Desta forma, a “hipótese de Barker” sugere que a desnutrição materna promove durante a ontogênese um retardo no crescimento fetal, manifestando baixo peso ao nascimento ou desproporção corporal (menor circunferência da cabeça em relação ao corpo) estando estas alterações relacionadas às doenças futuras. Mais recentemente, Sahajpal e Ashton (2005) também relataram que a restrição protéica gestacional pode aumentar a pressão arterial na prole de animais adultos em 20 a 30 mmHg. Especificamente, estes achados mostram que durante a gestação, uma dieta materna com reduzido teor protéico, induz no feto adaptações dentre as quais incluem permanentes alterações no número celular de órgãos chaves e, subsequente modulação da expressão genética (LANGLEY-EVANS, 2001). Este conceito determinou o fenótipo conhecido como “thrifty phenotype” (fenótipo econômico), segundo o qual, sob condições de pobreza ou nutrição desequilibrada, o feto faz adaptações, incluindo redução no tamanho somático, com o objetivo de manter a sua sobrevivência (HALES e BARKER, 2001).
Atualmente a desnutrição é um problema mundial, não se restringindo somente aos países em desenvolvimento, mas ocorrendo também em países desenvolvidos, onde a ingestão de dieta não equilibrada, com os níveis protéicos inadequados ocorre frequentemente. Dados da Organização Mundial de Saúde indicam que no Brasil 10% das crianças nascem com baixo peso (< 2500 g), e em outras regiões do mundo este nível chega a 31%.
O baixo peso ao nascimento pode ser atribuído a restrição de crescimento intra-uterino (intrauterine growth restriction, IUGR) ou nascimento prematuro.
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Quando associado à IUGR, pode refletir mecanismos de estresse intra-uterino no período tardio da gestação, dentre os quais a restrição de alimentos ou o baixo fluxo placentário. Diferentemente do baixo peso decorrente dos mecanismos citados acima, na prematuridade, o peso é apropriado ao tempo gestacional , mas inadequado quando comparado a gestação de tempo normal. O baixo peso relacionado à IUGR está intimamente associado ao desenvolvimento de doenças na idade adulta (ZANDI-NEJAD et al., 2006).
Em modelos experimentais, com restrição protéica ou a restrição global de nutrientes durante a gravidez tem sido correlacionado os elevados níveis séricos de corticosterona materna e fetal, ao baixo peso ao nascimento, intolerância à glicose na idade adulta (DAHRI et al 1991. LANGLEY et al 1994), resistência à insulina (DAHRI et al 1991), elevação da pressão arterial (LAW et al., 1993; LANGLEY & JACKSON, 1994) e disfunção da vasomotricidade de leitos vasculares (HOLEMANS et al 1999. BRAWLEY et al, 2002a).
2.2 ESTUDO 1 - Em um modelo de restrição protéica gestacional existem alterações no funcionamento do eixo HHA?
2.2.1. O EIXO HIPOTÁLAMO-HIPÓFISE-ADRENAL FETAL (HHA) E A PROGRAMAÇÃO FETAL
O hipotálamo (figura 1) ocupa a porção mais ventral do diencéfalo. O
mesmo engloba a região coberta pelo quiasma óptico e se estende para trás até a borda do mesencéfalo. Logo atrás do quiasma emerge uma haste de tecido neural em forma de funil que conecta o hipotálamo com a hipófise: o chamado
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infundíbulo. Atrás do infundíbulo fica uma pequena elevação de tonalidade acinzentada, chamada tuber cinéreo, e a seguir duas saliências esféricas que são os corpos mamilares (Lent, 2010).
Figura 1 – Encéfalo de rato, notar o hipotálamo (em vermelho) e algumas estruturas vizinhas. FONTE: CAPPAERT, N. (2012).
Como o hipotálamo ocupa um volume relativamente pequeno, mas possui um grande número de agrupamentos neuronais distintos (figura 2), pode-se subdividi-lo em três colunas longitudinais de cada lado. A que fica mais próxima da linha média e a coluna periventricular, assim chamada porque margeia o terceiro ventrículo, cavidade diencefálica que forma uma ponta bem ventral até o infundíbulo. Seguem-se sucessivamente o hipotálamo medial e hipotálamo lateral. De modo geral, pode-se considerar que a coluna periventricular reúne os neurônios do hipotálamo que se relacionam com o sistema endócrino e o sistema
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imunitário, enquanto as colunas lateral e medial “conversam” mais ativamente com outras regiões do sistema nervoso, e participam da coordenação dos comportamentos motivados.
Figura 2 - O hipotálamo é um conjunto complexo de núcleos (em diferentes cores) e feixes (em verde). Os núcleos em vermelho fazem parte da coluna periventricular, aqueles em azul constituem a coluna medial, e a grande área em marrom é a coluna lateral. Observe, em particular, que o feixe prosencefálico medial não é verdadeiramente medial. Ele foi chamado assim em referência ao encéfalo como um todo, já que com referência ao hipotálamo ele ocupa uma posição lateral. FONTE: LENT, 2010.
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Lent (2010) relata também que se pode subdividir o hipotálamo na dimensão rostro-caudal, surgindo então quatro grupos nucleares (tabela 1). O mais rostral é a área pré-óptica, quase no mesmo plano do quiasma óptico. Segue-se o hipotálamo anterior ou quiasmático, depois a região tuberal e finalmente o hipotálamo posterior ou mamilar (figura 2).
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O hipotálamo tem apenas conexões eferentes com a hipófise, que são feitas através dos tratos hipotálamo-hipófise e túbero-infundibular. O trato hipotálamo-hipofisário é formado por fibras que se originam nos neurônios grandes (magnocelulares) dos núcleos supra-ópticos, paraventriculares, e terminam na neuro-hipófise (figura 3) O trato túbero-infundibular (ou túbero hipofisário) é constituído de fibras neurossecretoras que se originam em neurônios pequenos (parvocelulares) do núcleo arqueado e áreas circunvizinhas do hipotálamo tuberal e terminam na eminência mediana e na haste infundibular. A hipófise é composta de adeno-hipófise e neuro–hipófise, as idéias de que o hipotálamo teria relação importante com a neuro- hipófise surgiu a propósito da doença conhecida como diabetes insípido devido à diminuição dos níveis sanguíneo de hormônio antidiurético (ADH) ou vasopressina (AVP), (MACHADO, 2006).
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Figura 3 - Controle hipotalâmico da hipófise posterior ou neuro-hipófise. A hipófise posterior armazena e libera hormônios vasopressina e ocitocina – que, na realidade, são produzidos nos neurônios dos núcleos supra-ópticos e paraventriculares do hipotálamo. Esses hormônios são transportados para a hipófise posterior por axônios no trato hipotálamo-hipofisário. FONTE: Fox, 2007.
A vasopressina é um hormônio com efeito antidiurético e vasoconstritor. Também possui ação hemostática e efeitos na termorregulação. A vasopressina é um nonapeptídeo liberado das terminações axonais dos neurônios magnocelulares no hipotálamo, em resposta a elevação da osmolaridade plasmática, hipovolemia grave e/ou hipotensão. Provoca vasoconstricção pela interação com receptores V1 presentes na musculatura lisa vascular, e exerce efeito antidiurético pela ativação de receptores V2 presentes nos ductos coletores renais. Em baixas concentrações plasmáticas, promove vasodilatação coronariana, cerebral e na circulação pulmonar (UGRUMOV, 2002).
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As glândulas adrenais são órgãos adjacentes aos rins e ficam posicionados nos pólos superiores. Cada adrenal é constituída por um córtex externo e por uma medula interna que atuam como glândulas separadas. As diferenças de funções do córtex e medula estão relacionadas com as diferenças de suas origens embrionárias. A medula da adrenal deriva do ectoderma da crista neural embrionária, enquanto que o córtex deriva do mesoderma. Como consequência de sua origem embrionária, a medula secreta hormônios catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) na corrente sanguínea em reposta à estimulação pelas fibras nervosas simpáticas pré-ganglionares. O córtex da adrenal não recebe inervação neural e, por essa razão, é estimulado por hormônios adrenocorticotróficos (ACTH) secretado pela adeno-hipófise. O córtex da adrenal secreta hormônios esteróides denominados corticosteróides, ou simplesmente corticóides. Existem três categorias funcionais de esteróides adrenais: (1) mineralocorticóides, que regulam o equilíbrio do Na+ e do K+; (2) os glicocorticóides, que regulam o metabolismo da glicose e de outras moléculas orgânicas; e (3) os esteróides sexuais (FOX, 2007).
Nos últimos anos foi proposto que a programação perinatal do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) no útero pode estar ligada ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, resistência à insulina e diabetes na vida adulta. (BARKER e OSMOND, 1986; BARKER, 1995; HUXLEYM et al., 2000; GOLFREY e BARKER, 2001). Uma gama considerável de evidências durante o desenvolvimento fetal tem sido demonstrada como associada a modificações permanentes do desenvolvimento e da função subsequente do eixo HHA em filhotes recém-nascidos, jovens e adultos de muitas espécies. Dentre estas
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incluem-se os primatas, cobaias, ovelhas, gado, cabras, porcos, ratos e camundongos. Em termos gerais, estas alterações durante a ontogênese podem ser subdivididas em: natal e pós-natal. Como exemplos de alterações pré-natais podemos citar: o estresse, a exposição a glicocorticóides sintéticos e restrição de nutrientes. Já as principais alterações dentre as pós-natais imediatas incluem-se a persistente privação materna de nutrientes e movimentação, a exposição a glicocorticóides sintéticos e a infecções durante este período (KAPPOR, et al., 2006).
McMillen et al., (2008) relataram que o eixo HHA também controla o as atividades do sistema neuroendócrino. Este representa um sistema filogeneticamente antigo de sinalização que permite ao feto adequar o seu desenvolvimento as condições ambientais prevalecentes. A atividade adequada e as vezes precoce do eixo HHA fetal é importante para permitir a sobrevivência fetal em condições ambientais adversas. Contudo, o estresse induzido durante o desenvolvimento fetal do eixo HHA causa um custo ao recém-nato , a despeito de seu caráter adaptativo, levando a alterações morfológicas e fisiológicas e consequentemente à doenças, na primeira infância ou vida adulta.
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2.2.2 A PROGRAMAÇÃO FETAL E O SISTEMA NEUROLÓGICO.
A placenta expressa os genes para grande parte dos hormônios envolvidos na resposta ao estresse tais como, hormônio liberador de corticotrofina (CRH) (hCRHmRNA) e proopiomelanocortina (PoMC), o precursor de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e beta-endorfina (BE). Todos esses hormônios aumentam à medida que avança a gravidez, particularmente os níveis de CRH plasmático de origem placentária (pCRH) que atingem níveis semelhantes aos observados no sistema portal hipotálamo-hipofisário durante situações de estresse fisiológico. (SANDMAN, 2011).
Em contraste com a regulação da secreção de CRH hipotalâmico por feedback, a secreção de corticosterona estimula a expressão de hCRHmRNA placentária estabelecendo um ciclo de retroalimentação positiva que causa o simultâneo aumento de pCRH, ACTH, BE, e corticosterona ao longo da gestação. Esta diferença no comportamento do gene do CRH na placenta e no hipotálamo é devido à expressão de diferentes fatores de transcrição, coativadores e co-repressores nestes dois tecidos (KING, et al., 2002). O aumento da pCRH especialmente nas últimas semanas de gestação humana desempenha um papel fundamental na organização e no desenvolvimento do sistema nervoso fetal (SANDMAN et al., 1999) e na adaptação materna durante a gravidez, influenciando, inclusive, o início do trabalho de parto (MCLEAN et al., 2002; SMITH et al., 2002).
Os efeitos do estresse sobre o eixo HHA e os hormônios placentários (figura 4) são modulados pelas atividades de proteínas de ligação e enzimas.
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Durante o aumento simultâneo de pCRH, ocorre a elevação das concentrações séricas de proteína de ligação do CRH “CRH-binding-protein” sendo que subsequentemente, estes níveis caem abruptamente ao final da gestação (MCLEAN et al., 2002). Os níveis da proteína plasmática de ligação para corticosterona “globulina-cortisol-binding” (CBG) também modifica-se durante a gravidez. A CBG é estimulada pelo estrogênio, e os níveis aumentam progressivamente com o avanço da gestação, declinando-se também ao final desta (HO et al., 2007). Os níveis de 11β-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 2 placentário (11β-HSD-2) (que oxida cortisol para sua forma inativa, cortisona) em condições normais apresenta uma ascensão ao decorrer da gestação acompanhada de virtiginosamente queda, antecedendo a maturação pulmonar, do sistema nervoso central (SNC) e de outros sistemas e órgãos (DANIELSON et al., 2005; EDWARDS et al., 1999; MCMILLEN et al., 2001).
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Figura 4 - A regulação do eixo HHA e as mudanças drásticas na gestação com implicações para a mãe e o feto. Adaptado de Sandman et al., 2011.
A subnutrição materna e a exposição à glicocorticóides estão associadas a um mecanismo comum que dá inicio a programação fetal. A restrição de proteína na dieta durante a gravidez em modelos experimentais comprovaram uma atenuação significativa e seletiva da atividade da 11β-HSD-2, mas aparentemente não para outras enzimas da placenta (LANGLEY-EVANS et al, 1996; BERTRAN et al, 2001; LESAGE et al, 2001). De fato, as mudanças endócrinas materno-fetal são adaptáveis e importantes para a maturação fetal, no entanto, a atividade da enzima 11β-HSD-2 quando reduzida elevando os níveis de corticosterona fetais,
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afeta a trajetória do desenvolvimento fetal. Evidências comprovam que a placenta coleta informações de seu hospedeiro materno para preparar o feto para a sobrevivência pós-natal. Se a unidade feto-placentária detecta sinais de estresse do ambiente materno (por exemplo, elevação dos níveis séricos de corticosterona), o "sensor placentário" acelera a ativação da região promotora do gene CRH iniciando a síntese placentária de pCRH. O rápido aumento sérico de pCRH inicia uma cascata de eventos que resulta na excitabilidade do miométrio elevando o risco de parto prematuro. Modificações paralelas no desenvolvimento fetal voltadas a garantir a sobrevivência do neonato, são na maioria das vezes, associadas ao comprometimento de regiões encefálicas associadas à redução volumétrica e o volume de massa cinzenta (DAVIS, et al., 2011; PETERSON et al., 2003; NOSARTI et al., 2002).
2.3 ESTUDO 2 - Em um modelo de restrição protéica gestacional existem alterações no SRA cerebral e na resposta dipsogênica?
2.3.1 O SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA-ALDOSTERONA
A atividade do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) caracteriza-se por estar associada a uma cascata de eventos envolvidos no controle da pressão arterial e do equilíbrio hidroeletrolítico. A disfunção do SRAA desempenha um papel importante na patogênese de doenças renais, cardiovasculares e na hipertensão arterial (GIESTA, et al., 2010).
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Os principais elementos da cascata englobam o angiotensinogênio, a renina, a angiotensina I (AngI), a enzima conversora de angiotensina (ECA) e a angiotensina II (AngII).
De acordo com a literatura já conhecida, quando a pressão e fluxo sanguíneos estão reduzidos na artéria renal, um grupo de células especificas do aparelho justaglomerular secretam renina na corrente sanguínea. Essa enzima cliva o decapeptídio angiotensinogênio que dará origem a angiotensina I. Quando a angiotensina I passa pelos capilares dos pulmões e de outros órgãos, uma enzima conversora da angiotensina (ECA) remove dois aminoácidos, formando um octapeptídio denominado angiotensina II. Em resumo, condições de privação de sal, volume sanguíneo baixo e hipotensão arterial provocam o aumento da produção de angiotensina II no sangue (FOX, 2007).
A angiotensina II é um potente vasoconstritor fortemente relacionado à regulação da pressão sanguínea, homeostasia, reabsorção de sódio e água no túbulo proximal renal, aumenta a liberação de hormônio vasopressina (AVP) na neuro-hipófise e aldosterona no córtex da supra-renal (CONTRA et al., 2008; SANTOS; SAMPAIO, 2002; RIBEIRO e FLORÊNCIO, 2000; GUYTON, 2006). É considerada um octapéptideo [Ang(1-8)] biologicamente ativo. Tem origem no pulmão e localmente em vários tecidos (rins, coração, cérebro, adrenais e vasos). A sua meia-vida é curta (aproximadamente 2 minutos) devido à rápida clivagem em AngI II e IV, através da remoção de aminoácidos da porção N-terminal por aminopeptidases. Recentemente foi demonstrado a existência de um heptapeptídeo [Ang(1-7)] formado a partir da AngI pela clivagem da porção C-terminal da AngII, por ação de carboxipeptidases, enzima como alta homologia
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estrutural com a ECA, designada ECA2. Ao contrário da ECA, esta enzima leva à formação de Ang[1-7], com efeitos predominantemente vasodilatadores, e que exercem efeito aumentando a sensibilidade barorreceptora e elevada vasodilatação periférica (CASTRO et al., 2005; LAGRANHA et al., 2007; GIESTA, et al., 2010), (figura 5).
Figura 5 - Sistema-renina-angiotensina-aldosterona. AT1R: receptor tipo 1 de
angioensina; AT2R: receptor tipo 2 de angiotensina; AT3R: receptor tipo 3 de
angiotensina; AT4R: receptor tipo 4 de angiotensina; AP: aminopeptidases; CP:
carboxipeptidases; ECA: enzima conversora de angiotensina; Mas-R: receptor Mas; NaCl: Cloreto de sódio; S.N.S: sistema nervoso simpático; Subst.P: substância P. FONTE: Acta Médica Portuguesa, 2010.
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A angiotensina II uma vez liberada, ativa mecanismos intracelulares que estimulam a proteína G. Consequentemente, ocorre aumento da fosfotidilinositol-3 (PI3) com mobilização Ca2+ e diacilglicerol (DAG) ativando, desse modo, a proteína quinase-C (PKC). Em seguida, através de uma cascata de transcrição nuclear ocorre a expressão de calciuneurina/NF-AT3 e Ras/Raf/MAPK. Por outro lado, a AngII fosforila JAKs via tirosina, resultando na transcrição das STATs e, posteriormente, à hipertrofia cardíaca (SANTOS; SAMPAIO, 2002).
O mecanismo de ação da AngII ocorre através de sua ligação com receptor específico. Esse processo promove acoplamento com a proteína G que estimula a fosfolipase beta. Uma vez estimulada, ela induz a formação de trifosfato de inositol e DAG, liberando Ca2+ citoplasmático ao passo que ativa PKC e adenil-ciclase (CONTRA et al., 2008; CARVALHO-FILHO et al., 2007; ARAÚJO et al., 2004). Após essa ligação, a angiotensina II estimula a musculatura vascular lisa através vias de sinalização, como a fosfolipase C, fosfolipase A2 e fosfolipase D. Além disso, participa da ação de inúmeras quinases, tais como tirosinaquinases, proteína quinase ativada por mitógenos (MAPKs). A Ang II também aciona a proteína ativadora-1, ativadores de transdução e transcrição (ESTEBAN, et al., 2008; ARAÚJO et al., 2004).
Os efeitos vasoconstritores da AngII devem-se à sua ligação aos receptores tipo 1, porém, já foram identificados outros quatro tipos diferentes de receptores de angiotensina. Os receptores tipo 1 (AT1-R) medeia à maioria dos efeitos fisiológicos e patofisiológicos atribuídos a Ang II. A ligação à estes receptores, amplamente distribuídos pelo organismo, resulta em vasoconstrição,
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inflamação, estresse oxidativo, transcrição de fatores de crescimento responsáveis pela proliferação celular, transtornos cardiovasculares (aterogenicidade; aumento da contratilidade miocárdica; hipertrofia ventricular; aumento das arritmias), estimulação da atividade do sistema nervoso simpático (SNS). A ligação de AngII a seus receptores do tipo 1, também promove aumento da reabsorção de sódio no tubo proximal; inibição da libertação da renina; vasoconstricção arteriolar renal, preferencialmente da arteríola eferente, com consequente aumento da taxa de filtração glomerular e redução do fluxo sanguíneo renal), liberação de AVP na neuro-hipófise, efeitos no córtex da supra-renal com libertação de aldosterona na zona glomerular e retenção de sódio e água em nível do tubo distal.
O receptor AT2, por sua vez, é super expresso no período fetal com decadência no período pós-natal e são encontrados em maior quantidade nas artérias aorta e coronária, tendo uma densidade menor na supra-renal. Seus efeitos fisiológicos são antagônicos aos do receptor AT1 e incluem diversas ações, tais como vasodilatação através da liberação de óxido nítrico e bradicinina, diminuição da síntese, secreção e liberação de renina, apoptose da musculatura vascular lisa, bloqueio das ações dos radicais livres, diminuição da expressão do receptor AT1, menor apoptose em miócitos, aumento da diferenciação celular no endotélio e sistema nervoso, reparação dos tecidos, inibição do crescimento e proliferação celular (CIAMPONE, 2009).
De acordo com Giesta, (2010), a função dos receptores tipo 3 (AT3-R) não está bem esclarecida, mas os receptores tipo 4 (AT4-R) induzem a libertação do inibidor ativador de plasminogênio (IAP-1) através da ligação da AngII e seus
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peptídeos N-terminais (AngIII e IV), e estão relacionados aos mecanismos de ansiedade e memória.
McKinley et al., (2003) demonstraram que AngI, AngII, AngIII e Ang [1-7] foram identificados no tecido cerebral, embora os dois últimos foram encontrados em concentrações muito baixas. Lind, Swanson, Bruhn & Ganten (1985); Oldfield, Ganten & McKinley (1989) identificaram através da técnica de imunohistoquímica a presença de AngII e AngIII em regiões específicas do cérebro de ratos, principalmente em fibras e nervos terminais (CHAPPELL et al., 1987, 1989).
2.4. ESTUDO 3 - Em um modelo de restrição protéica gestacional existem alterações na função renal e na pressão arterial?
2.4.1 O SISTEMA NERVOSO CENTRAL NO CONTROLE DA PRESSÃO ARTERIAL
O primeiro relato sobre a influência do SNC no controle da pressão arterial foi realizado por McDonald et al., (1983) utilizando fetos suínos decapitados e não decapitados entre 35 e 112 dias de gestação (termo 114 dias). Essas observações demonstraram que a regulação da pressão arterial no porco pode variar com a idade gestacional e as mudanças que ocorrem no SNC no período final de gestação. No estudo destes aspectos, o SRA cerebral tem atraído grande atenção principalmente na avaliação do controle homeostático cardiovascular fetal (XU et al., 2003).
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O sistema nervoso central (SNC) ajusta a atividade dos eferentes autonômicos simpático e parassimpático, o que juntamente com componentes hormonais, possibilita ao animal um melhor desempenho frente a diferentes situações cotidianas. Adicionalmente, existe uma íntima correlação entre o funcionamento do sistema cardiovascular e o balanço dos líquidos corporais, pois mudanças em um deles, geralmente implicariam em ajustes do outro. A manutenção adequada do equilíbrio hidroeletrolítico depende da presença de um íon importante, cuja quantidade está diretamente ligada ao volume plasmático, o sódio. O controle do balanço entre o ganho (através da ingestão) e perda (através da excreção) de água e sódio no organismo evita modificações no volume de líquido extracelular que poderiam refletir de modo negativo nas funções cardiovasculares e eventualmente na função celular. Modificações do volume plasmático alteram a atividade dos receptores periféricos (pressorreceptores e receptores cardiopulmonares) que promovem ajustes nos mecanismos neuroendócrinos de controle da pressão arterial (VIEIRA et al., 2006).
Os pressorreceptores controlam a pressão arterial momento a momento. Estes receptores são terminações nervosas localizados em duas regiões do seio carotídeo. Quando são estimulados enviam impulsos através dos nervos Hering e glossofaríngeo para o núcleo do trato solitário (NTS) na área bulbar do tronco cerebral. Eles também se encontram no arco aórtico onde transmitem seus impulsos nervosos através do nervo vago para o NTS fazendo assim sua primeira sinapse (ACCORSI-MENDONÇA et al., 2005; GUYTON, 2006).
A resposta dos barorreceptores ocorre através de sua distensão. A estimulação dos barorreceptores estimula a via parassimpática pela excitação dos
