UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DIANA MAJOLLI ANDRÉ
PAPEL DA RESISTÊNCIA À INSULINA NA INFLAMAÇÃO PULMONAR ALÉRGICA EM CAMUNDONGOS OBESOS
CAMPINAS 2017
DIANA MAJOLLI ANDRÉ
PAPEL DA RESISTÊNCIA À INSULINA NA INFLAMAÇÃO PULMONAR ALÉRGICA EM CAMUNDONGOS OBESOS
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Farmacologia
ORIENTADOR: EDSON ANTUNES
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNO DIANA MAJOLLI ANDRE E ORIENTADA PELO PROF. DR. EDSON ANTUNES
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
DIANA MAJOLLI ANDRÉ
ORIENTADOR: EDSON ANTUNES
MEMBROS:
1. PROF. DR. EDSON ANTUNES
2. PROF. DR. ALESSANDRA GAMBERO
3. PROF. DR. CARLA BEATRIZ COLLARES BUZATO
4. PROF. DR. RICHARDT GAMA LANDGRAF
5. PROF. DR. JOILSON DE OLIVEIRA MARTINS
Programa de Pós-Graduação em FARMACOLOGIA da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
“Se vi mais longe foi porque estava sobre os ombros de gigantes” Isaac Newton
DEDICATÓRIA
A Deus e sua força maior, por compartilhar comigo todos os momentos e me ajudar a caminhar em frente.
A minha mãe, Aparecida, pela dedicação, carinho, amor em todos os momentos, tornando mais fácil a concretização de mais uma etapa da minha vida. Muito obrigada.
A meu pai, Denis, o meu grande mestre, meu maior exemplo, muito obrigada pelo apoio incansável, dedicação, compreensão, carinho e amor. Minha eterna gratidão a você.
Ao meu querido Romeu, pela compreensão nas minhas ausências e pelo amor, carinho e cuidado que sempre me fortalece.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Edson Antunes meu enorme agradecimento pela oportunidade de realizar este trabalho em seu laboratório e por todo o ensinamento, apoio, incentivo e compreensão.
Ao prof. Dr Gabriel Anhê pela colabaração, incentivo e ensinamentos.
À Dra. Marina Calixto, meu profundo agradecimento pela amizade, apoio, incentivo, acolhimento e toda a sua paciência em passar seus ensinamentos a mim.
A Carolina Solon pela disponibilidade, boa vontade e dedicação nos experimentos de western blotting, seu apoio foi de extrema importância.
A Carolina Naime, pela grande amizade e dedicação em me ajudar na padronização de técnicas.
A Edith Bastos, pela amizade, compreensão e ajuda irrestrita em todos os momentos.
Aos colegas, Camila Mendes, Fabiano, Julio, Eduardo, Mariana, Sandra, Camila e Cristiano pela amizade e convivência durante esse período.
A Dra. Gláucia agradeço imensamente a paciência, amizade, carinho, compreensão e pela bela convivência e, finalmente por tudo que aprendi com você. Meu muitíssimo obrigada!
À querida amiga do departamento de farmacologia, Maria Elisa, pela amizade, carinho e por tornar minha vida bem mais alegre e divertida.
Aos funcionários e responsáveis do biotério, assim como todos os funcionários do Departamento, os seus trabalhos tornaram possível a realização deste estudo.
Aos animais, seres fundamentais para a realização dos protocolos experimentais.
À FAPESP e o CAPES pelo importantíssimo apoio financeiro.
Finalmente agradeço a todos os amigos, da vida acadêmica e pessoal, e aos profissionais que de alguma forma me auxiliaram ao longo deste trabalho. Obrigada a todos!
RESUMO
Obesidade e asma são doenças de grande importância na saúde pública. Nos últimos 30 anos, a incidência de obesidade cresceu de forma dramática em todo o mundo enquanto que a prevalência de asma triplicou. Um número crescente de estudos clínicos e experimentais sugere a existência de uma associação positiva entre a obesidade e asma. Há também elevada prevalência de resistência à insulina em pacientes obesos e asmáticos quando comparados a obesos não asmáticos. É possível que a resistência à insulina associada a obesidade desempenhe papel relevante na asma, o que explicaria, ao menos em parte, a associação entre estas duas doenças. Em vista disso, propomos estudar a sinalização de insulina nos pulmões e sua possível resistência em obesos e asmáticos. De modo geral, propomos avaliar a expressão e ativação de proteínas-chave da sinalização da insulina como AKT, IRβ, IRS-1, JNK e IKK no tecido pulmonar. O papel modulatório do óxido nítrico (NO) na sinalização da insulina foi também investigado neste trabalho. Foram utilizamos camundongos C57BL/6 alimentados com dieta padrão (grupo magro) ou dieta hiperlipídica por 12 semanas para induzir obesidade (grupo obeso). Os animais asmáticos receberam na 10ª. semana desafio intranasal com ovalbumina (OVA). Nossos resultados mostraram que no grupo magro a insulina (1U/animal, iv) foi capaz de aumentar de modo significativo a fosforilação das proteínas IRβ, IRS-1 e AKT no tecido pulmonar. No tecido pulmonar do grupo obeso não detectamos aumento da fosforilação destas proteínas em reposta à insulina. Resultados semelhantes para a fosforilação da AKT foram observados em brônquios isolados; ou seja, a estimulação com insulina aumentou significativamente a fosforilação em camundongos magros, mas não em obesos. Além disso, no grupo obeso houve aumento significativo da fosforilação da JNK e IKK em comparação ao grupo magro. Nos pulmões de obesos houve, ainda, um aumento na nitração de IRβ, IRS-1 e AKT comparado ao grupo magro. Por meio da técnica de imunofluorescência, observamos que maior colocalização de 3-NT e IRβ (e 3-NT e AKT) no tecido pulmonar de obesos comparado com animais magros. Numa próxima etapa, analisamos a sinalização da insulina no tecido pulmonar de animais magros e obesos, tratados com resveratrol (polifenol extraído da uva; 100 mg/kg por duas semanas, gavage) ou aminoguanidina (inibidor seletivo da NO sintase induzível; 20
mg/kg por três semanas na dieta hídrica). O tratamento com resveratrol em camundongos obesos restabeleceu a fosforilação de IRβ, IRS-1 e AKT no tecido pulmonar e/ou brônquios isolados. Os animais obesos tratados com resveratrol reverteram o aumento na nitração de IRβ, IRS-1 e AKT. Este tratamento também normalizou a fosforilação aumentada de JNK e IKK no tecido pulmonar. À semelhança do resveratrol, o tratamento com aminoguanidina em camundongos obesos restabeleceu a fosforilação de IRβ, IRS-1 e AKT em animais obesos comparado aos animais não-tratados, e reverteu o aumento de 3-NT e da nitração de IRβ, IRS-1 e AKT. O tratamento com aminoguanidina normalizou a fosforilação aumentada de JNK e IKK. No conjunto, podemos sugerir que há resistência local à insulina no pulmão de camundongos obesos, causada por eventos nitrosativos, sugerindo que esse fenômeno possa ser um importante elo na exacerbação da asma associada à obesidade. O tratamento com resveratrol restabeleceu a via de sinalização da insulina no pulmão do obeso, sugerindo que este agente possa ser útil para o tratamento da asma em indivíduos obesos resistentes à insulina.
ABSTRACT
Obesity and asthma are diseases of great importance in public health. Over the past 30 years, the incidence of obesity has grown dramatically around the world while the prevalence of asthma has tripled. An increasing number of clinical and experimental studies suggest the existence of a positive association between obesity and asthma. There is also a high prevalence of insulin resistance in obese and asthmatic patients when compared to non-asthmatic obese patients. It is possible that insulin resistance associated with obesity plays a pertinent role in asthma, which would explain, at least in part, the association between these two diseases. Therefore, we propose to study the signaling of insulin in the pulmonary tissue and the possible resistance in obese and asthmatic mice. Overall, we propose to evaluate the expression and activation of key proteins of insulin signaling such as AKT, IRβ, IRS-1, JNK and IKK in lung tissue. The modulatory role of nitric oxide (NO) in insulin signaling was also investigated in this study. We used C57BL/6 mice fed with chow diet (lean group) or a high-fat diet for 12 weeks to induce obesity (obese group). Asthmatic mice received the 10th week intranasal challenge with ovalbumin (OVA). Our results showed that in the lean group the insulin (1U / animal, iv) was able to significantly increase the phosphorylation of IRβ, IRS-1 and AKT proteins in lung tissue. In the lung tissue of the obese group we did not detect an increase in the phosphorylation of these proteins in response to insulin. Similar results in AKT phosphorylation were observed in isolated bronchi; i.e., stimulation with insulin significantly increased phosphorylation in lean, but not in obese mice. Moreover, in the obese group demonstrated a significant increase in the phosphorylation of JNK and IKK compared to the lean group. The lung tissue of obese mice showed an increase in nitration of IRβ, IRS-1 and AKT compared to the lean mice. The immunofluorescence technique showed a higher colocalization of 3-NT and IRβ (and 3-3-NT and AKT) in the lung tissue of obese compared to lean animals. In a next step, we analyzed insulin signaling in the lung tissue of lean and obese animals treated with resveratrol (polyphenol extracted from the grape; 100 mg/kg for two weeks, gavage) or aminoguanidine (a selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase, 20 mg/ kg for three weeks, in the water diet). Treatment with resveratrol in obese mice restored the phosphorylation of IRβ, IRS-1 and AKT in the lung tissue and/or isolated bronchi. Obese animals treated with resveratrol reversed the increase in nitration of IRβ, IRS-1 and AKT. This treatment also normalized the increased phosphorylation of JNK and IKK in lung tissue. Similar to resveratrol,
treatment with aminoguanidine in obese mice restored the phosphorylation of IRβ, IRS-1 and AKT in obese animals compared to untreated animals, and reversed the increase in nitration of IRβ, IRS-1 and AKT. Treatment with aminoguanidine normalized the increase of JNK and IKK phosphorylation. Taken together, we may suggest that there is local resistance to insulin in the lung of obese mice caused by nitrosative events, suggesting that this phenomenon may be an important link in the exacerbation of obesity-associated asthma. Treatment with resveratrol restored the insulin signaling pathway in the lung tissue of obese mice, suggesting that this agent may be useful for the treatment of asthma in obese, insulin-resistant individuals.
LISTA DE ABREVIATURAS
3-NT 3-Nitrotirosina AKT Proteína quinase B
AMPc Adenosina 5’-monofosfato cíclico
AMPK Proteína quinase ativada por adenosina 5’-monofosfato BSA Albumina bovina sérica
CamKKβ Ca2+/
calmodulina protein dependente proteína quinase quinase beta CCL-4 Chemokine (C-C motif) ligand 4
CCL-5 Chemokine (C-C motif) ligand 5 CCL-13 Chemokine (C-C motif) ligand 13 Cys-LTs Leucotrienos cisteínicos
DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol
ECP Proteína catiônica do eosinófilo eNOS Óxido nítrico sintase endotelial EPM Erro padrão da média
EPO Peroxidase eosinofílica EROs Espécies reativas de oxigênio FITC Isotiocianato de fluoresceína GLUT 1 Transportador de glicose 1
GLUT 4 Transportador de glicose 4 IKKβ IkB quinase β
IkB Inibidor do fator nuclear-κB IMC Índice de massa corporal iNOS Óxido nítrico sintase induzível IRβ Receptor de insulina subunidade β IRS-1 Substrato 1 do receptor de insulina IB Imunoblotting
ICAM-1 Intercellular adhesion molecule 1 IL-4 Interleucina 4
IL-5 Interleucina 5 IL-13 Interleucina 13
IP Imunoprecipitação JNK Jun N-terminal quinase LBA Lavado broncoalveolar
LFA-1 Leukocyte function associated antigen-1 L-NAME NG-nitro-L-arginina metil éster
L-NMMA L-N-monometil arginina
Mac-1 Macrophage adhesion molecule-1 MBP Proteína básica principal
M1 Macrófagos pró-inflamatório NF-kB Fator de transcrição nuclear kB nNOS Óxido nítrico sintase neuronal NO Óxido nítrico
NOx Metabólitos do óxido nítrico (nitrito e nitrato) NP-40 Tergitol® solução tipo NP-40
OVA Ovalbumina
PBS Tampão salina-fosfato p-AKT Fosfo-proteína quinase B PDE4 Fosfodiesterase-4
PDE5 Fosfodiesterase-5
PGC-1 Co-ativador receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo 1 p-IKK Fosfo-IkB quinase
p-IRβ Fosfo-receptor de insulina subunidade β p-IRS-1 Fosfo-substrato 1 do receptor de insulina p-JNK Fosfo-Jun N-terminal quinase
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio SIRT1 Sirtuína 1
TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule-1 VLA-4 Very late antigen-4
LISTA DE MATERIAIS
Substância...Procedência
Al(OH)3 Sanofi-synthelabo (RJ, Brasil) Álcool (70% - 100%) Merck (Darmstadt, Alemanha) Anti-β-actina-peroxidase Sigma (St. Louis, MO, EUA) Anti-fosfo-AKT Santa Cruz (Santa Cruz, EUA) Anti-fosfo IRβ Santa Cruz (Santa Cruz, EUA) Anti-fosfo IRS-1 Santa Cruz (Santa Cruz, EUA) Anti-JNK Santa Cruz (Santa Cruz, EUA) Anti-IKK Santa Cruz (Santa Cruz, EUA) Anti-IkB Santa Cruz (Santa Cruz, EUA) Anti-iNOS Cayman (Ann Arbor, EUA) BSA Sigma (St. Louis, MO, EUA) CaCl2.2H2O Merck (Darmstadt, Alemanha) Clarity Western ECL Substrate Bio Rad (Hercules, CA, EUA) EDTA J.T.Baker (Phillipsburg, EUA) Dextrose Merck (Darmstadt, Alemanha) Fluoreto de sódio Sigma (St. Louis, MO, EUA) Fosfato de potássio Merck (Rio de Janeiro, Brasil) H2SO4 Merck (Rio de Janeiro, Brasil) Isoforine Cristália (Itapira, SP, Brasil) Insulina humana regular Eli Lilly (Indianapólis, EUA) KCl Merck (Rio de Janeiro, Brasil)
KH2PO4 Merck (Rio de Janeiro, Brasil) Laemmli Bio Rad (Hercules, CA, EUA)
Metanol Merck (Darmstadt, Alemanha) MgSO4 Merck (Rio de Janeiro, Brasil) NaCl Merck (Rio de Janeiro, Brasil) NaHCO3 Merck (Darmstadt, Alemanha) Nuvilab Quimtia (Colombo, PR, Brasil) Ortovanadato de sódio Sigma (St. Louis, MO, EUA) OVA (grau V) Sigma (St. Louis, MO, EUA) Pirofosfato de sódio Sigma (St. Louis, MO, EUA) Proteína Sefarose A R&D (Minneapolis, EUA)
Solução fisiológica 0,9% Equiplex® (Ap. de Goiânia, Brasil) Tris Sigma (St. Louis, MO, EUA
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema representativo dos tratamentos com resveratrol e
aminoguanidina e protocolo de sensibilização e desafio com ovalbumina (OVA) em camundongos magros e obesos...31
Figura 2. Efeito do tratamento com resveratrol sobre o peso ponderal, peso da
gordura epididimal, glicemia em jejum e curva de tolerância a insulina (ITT) em camundongos obesos e controles (magros)...36
Figura 3. Fosforilação de AKT em tecido pulmonar de camundongos naive
sensibilizados com ovalbumina e estimulado com insulina...37
Figura 4. Fosforilação da subunidade β do receptor de insulina, do substrato do
receptor de insulina 1 e da AKT no tecido pulmonar após estímulo com insulina in vivo em camundongos magros e obesos, tratados ou não com resveratrol...39
Figura 5. Fosforilação de JNK e IKK nos pulmões de camundongos magros e
obesos, tratados ou não com resveratrol...41
Figura 6. Imunoprecipitação da 3-NT e imunoblotting para IRβ, IRS-1 e AKT nos
pulmões de animais magros e obesos, tratados ou não com resveratrol...42
Figura 7. Fotomicrografias representativas da expressão de 3-NT, IRβ e
colocalização de ambas em cortes de pulmões de animais magros e obesos, tratados ou não com resveratrol...44
Figura 8. Fotomicrografias representativas da expressão de 3-NT, AKT e
colocalização de ambas em cortes de pulmões de animais magros e obesos, tratados ou não com resveratrol...45
Figura 9. Efeito do tratamento com aminoguanidina sobre o peso ponderal em
camundongos obesos e controles...46
Figura 10. Expressão de iNOS após tratamento crônico com aminoguanidina nos
pulmões de camundongos magro e obeso...47
Figura 11. Fosforilação de IRβ, IRS-1 e AKT após tratamento crônico com
aminoguanidina e estímulo com insulina in vivo...49
Figura 12. Fosforilação de JNK e IKK nos pulmões de camundongos magros e
obesos, tratados ou não com aminoguanidina...50
Figura 13. Fosforilação da AKT nos brônquios isolados após estímulo com insulina
in vivo em camundongos magros e obesos, tratados ou não com resveratrol...52
Figura 14. Esquema sugestivo mostrando a junção dos resultados dessa tese, e a
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 19
1.1. Obesidade ... 19
1.1.1. Obesidade e resistência periférica à ação da insulina ... 20
1.2. Asma ... 21
1.2.1. A importância dos eosinófilos na asma ... 21
1.2.2. Óxido nítrico (NO) e asma ... 22
1.3. Obesidade e Asma ... 23
1.3.1. Asma e resistência à insulina ... 24
1.4. Resveratrol ... 25
2. OBJETIVO GERAL ... 28
2.1. Objetivos específicos ... 28
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 29
3.1. Animais ... 29
3.2. Indução da obesidade com dieta hiperlipídica ... 29
3.3. Grupos experimentais ... 30
3.4. Sensibilização com ovalbumina (OVA) e desafio intranasal ... 30
3.5. Tratamento com resveratrol ... 31
3.6. Tratamento com aminoguanidina ... 31
3.7. Estímulo do pulmão com insulina ... 32
3.8. Western blotting e imunoprecipitação ... 32
3.9. Imunofluorescência ... 33
3.10. Teste de tolerância à insulina (ITT) e glicose ... 34
3.11. Análise estatística ... 34
4. RESULTADOS ... 35
4.1. Caracterização do modelo experimental ... 35
4.2. Efeito da sensibilização com OVA na fosforilação de AKT no tecido pulmonar de camundongos injetados com insulina ... 36
4.3. Efeito da obesidade sobre a expressão de p-IRβ, p-IRS-1 e p-AKT no tecido pulmonar ... 37
4.4. Efeito da obesidade sobre a expressão de p-JNK e p-IKK no tecido pulmonar ... 40
4.5. Efeito da obesidade na nitração da IRβ, IRS-1 e AKT no tecido pulmonar ... 41
4.6. Colocalização dos resíduos de nitrotirosina, IRβ e AKT no pulmão de camundongos magros e obesos ... 43
4.7. Efeitos do tratamento com aminoguanidina sobre o peso corpóreo ... 45
4.8. Efeitos do tratamento com aminoguanidina sobre a expressão de iNOS ... 46 4.9. Efeito do tratamento com aminoguanidina sobre a expressão de IRβ, IRS-1 e AKT
4.10. Fosforilação de JNK e IKK após tratamento com aminoguanidina ... 50
4.11. Fosforilação de AKT nos brônquios isolados ... 51
5. DISCUSSÃO ... 53
6. SUMÁRIO E CONCLUSÃO ... 61
1. INTRODUÇÃO 1.1. Obesidade
A obesidade é considerada atualmente um dos principais problemas de saúde pública. Nos últimos 25 anos, a incidência da obesidade aumentou dramaticamente em todo o mundo. Dados obtidos até o ano de 2008 indicam a existência mundial de 1,45 bilhões de adultos acima do peso, dos quais 500 milhões são obesos (1). O número de indivíduos com excesso de peso já ultrapassa o número de pessoas desnutridas (2). Por conseguinte, o aumento da obesidade mundial tem gerado uma explosão de problemas de saúde relacionados à resistência à insulina, como diabetes tipo 2, doenças coronarianas, esteatose hepática, câncer, distúrbios do trato urinário, asma, entre outros (3, 4). Dentre as principais causas da obesidade, destacam-se as mudanças alimentares da população com o excessivo consumo energético, composto por alimentos pobres em fibras e ricos em gordura saturada e açúcares, acompanhado de redução da atividade física (2, 5, 6). Além disso, a predisposição genética parece ser fator determinante na suscetibilidade à obesidade (7).
A ênfase atual da obesidade está focada na compreensão das correlações moleculares entre obesidade e doenças metabólicas crônicas. Neste contexto, a inflamação crônica de baixo grau, mediada principalmente por células do sistema imune inato e adaptativo, surgiu como um elo importante entre obesidade e alterações metabólicas (8, 9, 10). Hotamisligil e colaboradores (11) foram os primeiros a identificar as ligações entre obesidade, inflamação e resistência à insulina. Neste trabalho pioneiro, os autores observaram que o tecido adiposo de animais obesos expressa fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), uma citocina pró-inflamatória capaz de promover resistência à insulina através de fosforilação da serina do substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1). Embora essas descrições iniciais tenham lançado as bases moleculares associando a inflamação no tecido adiposo à resistência à insulina, a verdadeira natureza deste processo inflamatório deixou de ser investigada por mais uma década. Posteriormente, Weisberg e colaboradores (12) demonstraram que a obesidade leva a infiltração do tecido adiposo por macrófagos e células do sistema imune, que são os principais elementos responsáveis pela resposta inflamatória neste tecido.
1.1.1. Obesidade e resistência periférica à ação da insulina
A principal forma de entrada de glicose nas células é por difusão facilitada, com participação de proteínas de membrana específicas, como transportadores de glicose GLUT 1 e GLUT 4 (13). Após a ligação da insulina, o receptor sofre autofosforilação em múltiplos resíduos de tirosina, resultando na ativação da quinase do receptor e consequente fosforilação em tirosina de substratos do receptor de insulina (IRS). De forma similar a outros fatores de crescimento, a insulina atua por fosforilação e interações proteína-proteína como modo essencial para transmitir seu sinal. As interações proteína-proteína são fundamentais para transmitir o sinal do receptor em direção ao efeito celular final, tais como translocação de vesículas contendo GLUT4 do pool intracelular para a membrana plasmática, onde captam a glicose circulante para o interior da célula (14, 15).
A resistência dos tecidos metabólicos - tecido adiposo, fígado e músculo - às ações anabólicas da insulina é denominado resistência à insulina, uma característica das disfunções metabólicas induzida pela obesidade (16). A resistência à insulina manifesta-se como disponibilidade de glicose deficiente no músculo esquelético e aumento da lipólise de triglicerídeos no tecido adiposo, podendo resultar em hiperinsulinemia, hiperglicemia e hiperlipidemia (17, 18). A resistência periférica à insulina em tecidos metabólicos induz aumento da secreção de insulina pelas
células beta do pâncreas, um processo denominado hiperinsulinemia
compensatória. No entanto, com o agravamento da resistência à insulina, pode causar a exaustão da célula β, resultando em hiperglicemia prolongada e diabetes tipo 2 (16, 18).
Em geral, vários mecanismos extrínsecos e intrínsecos exibem uma relação de causa e efeito entre o ganho de peso e resistência periférica à insulina (19). As vias intrínsecas incluem disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, estresse de retículo endoplasmático e deposição lipídica ectópica. As vias extrínsecas incluem aumento nos níveis de adipocinas circulantes e de ácidos graxos, assim como a inflamação dos tecidos metabólicos (19, 20). Os macrófagos encontrados no tecido adiposo exibem um fenótipo mesclado, sendo responsáveis pelo aumento das expressões de TNF-α e óxido nítrico sintase induzível (iNOS), que por sua vez
induzem resistência à insulina através da fosforilação inibitória do resíduo de serina do IRS mediada pela IkB quinase β-(IKKβ) e pela jun N-terminal quinase (JNK) (20-22).
1.2. Asma
A asma afeta cerca de 300 milhões de indivíduos no mundo, sendo considerada uma preocupação de caráter mundial (23, 24). Nos últimos 30 anos tem se observado um aumento da prevalência da asma em países industrializados, principalmente nas áreas urbanas (25, 26). A asma é considerada uma doença inflamatória crônica, e, embora não se conheça a natureza exata da doença, acredita-se que envolva interações com fatores externos e genéticos (24). É uma doença complexa, caracterizada por obstrução e inflamação das vias aéreas, e hiperreatividade brônquica a vários estímulos (27). Clinicamente, a asma se manifesta por crises de dispnéia, tosse e sibilos. É uma doença episódica, alternando crises agudas com períodos assintomáticos (28, 29). A fisiopatologia desta doença envolve sobretudo inflamação e disfunção das vias aéreas que se dá, em parte, pela liberação de potentes mediadores inflamatórios e remodelamento da parede das vias respiratórias (27). A asma alérgica é a mais comum, sendo frequentemente associada a histórico familiar de atopia, podendo ser desencadeada por antígenos ambientais (30, 31). A atopia e doenças relacionadas com atopia como a asma, rinite alérgica e dermatite atópica são conhecidas como doenças presentes em tecidos específicos, como pulmão, nariz e pele, respectivamente. Em indivíduos alérgicos, a provocação com alergeno promove uma resposta sistêmica, estimulando a produção de progenitores de células inflamatórias específicas (eosinófilos) na medula óssea, levando a diferenciação precoce de eosinófilos e liberação destas células do compartimento da medula óssea para a circulação (32). Estas células podem ser potencialmente recrutadas para a mucosa respiratória e outros tecidos em indivíduos atópicos (33).
1.2.1. A importância dos eosinófilos na asma
Indivíduos asmáticos têm número elevado de eosinófilos no sangue e no lavado broncoalveolar (LBA) e infiltrado inflamatório pulmonar rico em células
ativadas (mastócitos, monócitos, linfócitos), incluindo eosinófilos (32). A importância dos eosinófilos foi enfatizada por achados que correlacionam o grau de eosinofilia no sangue e no LBA com o grau de hiperreatividade brônquica e gravidade da asma (34). Está bem estabelecido que eosinófilos ativados liberam substâncias citotóxicas que podem intensificar a reação inflamatória (35). Estes mediadores incluem espécies reativas de oxigênio (EROs), proteína básica principal (MBP), proteína catiônica eosinofílica (ECP), peroxidase eosinofílica (EPO), citocinas (interleucinas 4, 5 e 13; IL-4, IL-5, IL-13), quimiocinas (chemokine (C-C motif) ligand 13 (CCL13), chemokine (C-C motif) ligand 4 (CCL4), chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5)) e mediadores lipídicos (leucotrienos cisteínicos (Cys-LTs)). Estudos mostram que os eosinófilos participam da patogênese da asma por meio da liberação de mediadores levando à inflamação crônica pulmonar de perfil TH2 (36- 38). A migração de eosinófilos para o tecido inflamado é um processo complexo regulado por numerosos fatores e interações de moléculas de adesão; interações estas não somente entre células, mas também entre células e elementos da matriz extracelular (39, 40).
As moléculas de adesão são conhecidas por exercer papel importante no acúmulo de leucócitos nas vias aéreas inflamadas. A aderência de eosinófilos às células endoteliais via moléculas de adesão é considerada um evento essencial e inicial para a inflamação alérgica eosinofílica. O primeiro passo para a migração de eosinófilos para o tecido inflamado inicia com o rolamento no endotélio, progredindo para a adesão firme devido às interações das integrinas CD11a (LFA-1), CD11b (Mac-1) e CD49d (VLA-4) na superfície dos eosinófilos com as moléculas de adesão da família das imunoglobulinas, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) e vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) presentes no endotélio (41). As integrinas medeiam a adesão de eosinófilos às vênulas pós-capilares permitindo a migração destas células do sangue para a parede das vias aéreas e para o espaço aéreo (42).
1.2.2. Óxido nítrico (NO) e asma
O NO tem sido apontado como mediador-chave na inflamação asmática (43, 44). Pacientes asmáticos e animais submetidos a desafio alergênico apresentam
níveis elevados de NO no ar exalado (45, 46). Na condição inflamatória, a iNOS parece ser produzida pelas células epiteliais das vias aéreas inferiores (47- 49). Assim, camundongos knockout para a iNOS são parcialmente protegidos da inflamação pulmonar e do infiltrado eosinofílico quando submetidos a desafio alergênico (50). De modo similar, em animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA), o tratamento com L-NMMA ou L-NAME (inibidores não seletivos da NOS) e aminoguanidina (inibidor seletivo da iNOS) inibe o influxo de células inflamatórias para o pulmão. Esses trabalhos apoiam o conceito de que o NO, através da iNOS, exerce um papel importante na migração de eosinófilos no pulmão de indivíduos alérgicos (51- 55).
A aminoguanidina tem sido vastamente empregada como inibidor seletivo de iNOS (56), mas o exato mecanismo molecular e químico pelo qual este agente inibe a iNOS não é totalmente estabelecido. A aminoguanidina compete com o precursor do NO, L-arginina, e assim produz redução dos níveis de citrulina e do NO (57). Além disso, aminoguanidina também reduz a expressão da iNOS por um mecanismo ainda não conhecido (58).
Estudo publicado pelo nosso grupo mostrou que o tratamento com aminoguanidina é capaz de atenuar a inflamação pulmonar alérgica, pois diminuiu significativamente o infiltrado de eosinófilos no tecido pulmonar de camundongos obesos paralelamente à normalização do número de eosinófilos no LBA. Em animais magros, a aminoguanidina atenuou o número de eosinófilos no LBA, sem modificar o infiltrado de eosinófilos no tecido pulmonar (59).
1.3. Obesidade e Asma
A asma e a obesidade são importantes problemas de saúde pública (60). Nos últimos 30 anos, a incidência de obesidade cresceu de forma dramática em todo o mundo enquanto que a prevalência de asma triplicou (61). Dados epidemiológicos indicam um aumento da incidência de asma em adultos e crianças com sobrepeso e obesos (62- 67). Numerosos estudos populacionais conduzidos em todo o mundo indicam que a prevalência de asma é maior em indivíduos obesos em relação a magros. Além disso, diversos estudos prospectivos, tanto em adultos quanto em
crianças, indicam que o risco da incidência de asma aumenta à medida que se aumenta o índice de massa corporal (IMC) (68- 70). A obesidade também piora o controle medicamentoso da asma e a gravidade desta doença (61, 71- 76). As observações que a perda de peso, seja de natureza cirúrgica ou por indução de dieta, proporciona melhora das diversas consequências da asma, incluindo prevalência, gravidade, uso de medicamentos e hospitalizações, reforçam a relação entre obesidade e asma (64, 77- 81). Entretanto, permanece incerto se esta associação é causal ou coincidente, e o maior desafio na compreensão da natureza desta relação entre obesidade e asma tem sido determinar se a obesidade realmente modifica o risco da asma ou o seu fenótipo.
Dados obtidos de modelos animais também sustentam a relação entre obesidade e asma (82- 84). Na tentativa de se avaliar os mecanismos relevantes da associação da obesidade e da asma, camundongos obesos vêm sendo utilizados para descrever os potencias mecanismos por meio dos quais a obesidade possa modular a inflamação das vias aéreas e/ou sua função. Estudo prévio do grupo mostrou que a obesidade induzida por dieta hiperlipídica influencia a eosinopoiese, aumentando o recrutamento de eosinófilos da medula óssea para o tecido pulmonar, retardando posteriormente o trânsito destas células através do epitélio até o lúmen das vias aéreas (85). Estes resultados também foram reproduzidos em camundongos obesos ob/ob, deficientes de leptina (86).
1.3.1. Asma e resistência à insulina
Alguns estudos em pacientes asmáticos mostram que a inflamação associada à obesidade aumenta a propensão para a asma (4, 87, 88). É possível que a resistência à insulina associada à obesidade desempenhe importante papel na asma, o que explicaria, ao menos em parte, a associação entre estas duas doenças (4, 89). Estudos mostram uma alta prevalência de resistência à insulina em pacientes obesos-asmáticos em relação a obesos-não asmáticos (65, 66, 90). Além disso, outro estudo mostrou que a insulina regula a liberação de citocinas pró-inflamatórias nos pulmões de ratos diabéticos (91).
Vale ressaltar que a obesidade abdominal está mais fortemente associada à asma do que a massa corporal geral (92), que por sua vez está também associada à síndrome metabólica secundária à obesidade (15).
Dados do nosso grupo mostraram que tratamento de camundongos obesos com o anti-hiperglicemiante, metformina, corrige tanto a resistência à insulina como a inflamação eosinofílica pulmonar desses animais. O tratamento com metformina também corrige os níveis elevados de TNF-α, eotaxina e NOx, e o aumento da expressão de iNOS no pulmão (59).
A via do NO parece dar suporte experimental à elucidação da associação entre asma e resistência à insulina. A iNOS, expressa em níveis elevados no pulmão de asmáticos, produz níveis elevados de NO, que na presença de EROs conduz à geração de espécies reativas de nitrogênio mais tóxicas, como o peroxinitrito (93). O estresse nitrosativo leva a modificações covalentes e inibição de várias proteínas fundamentais na sinalização da insulina (94, 95). Estudos mostram que o bloqueio crônico do NO em camundongos obesos (ou a deleção do gene da iNOS) diminui a adiposidade induzida pela dieta hiperlipídica, reduz a inflamação do tecido adiposo e “melhora” a sinalização da insulina no músculo esquelético. Estes dados indicam que o NO desempenha papel modulatório importante no desenvolvimento da obesidade e na resistência à insulina (96, 97). Além disso, a resistência à insulina associada à iNOS em camundongos é mediada por S-nitrosilação (94) e nitração (95) das proteínas envolvidas na transdução de sinal de insulina, como receptor de insulina subunidade beta (IRβ), IRS-1 e AKT. Visto que o NO é apontado como mediador-chave na inflamação alérgica, incluindo o recrutamento eosinofílico, e que os níveis de NO estão elevados no LBA de camundongos obesos, torna-se relevante estudar o papel da nitrosilação e nitração no pulmão de camundongos obesos e sensibilizados.
1.4. Resveratrol
O resveratrol é um polifenol extraído da uva, amora e amendoim. Este polifenol reduz a obesidade e a resistência à insulina em roedores alimentados com dieta hiperlipídica (98, 99) e em humanos com diabetes do tipo 2 (100). O resveratrol
é também referido como ativador da sirtuína 1 (SIRT1), proteína envolvida na longevidade, tendo como principal via de ativação a restrição calórica (101). Quando ativada, a SIRT1 retarda o envelhecimento e os declínios funcionais, bem como o início de diversas doenças crônicas que surgem durante o processo de envelhecimento. Ativadores da SIRT1 têm sido desenvolvidos como promissores agentes terapêuticos, sendo que alguns estão em ensaios clínicos para o tratamento de doenças metabólicas, inflamatórias ou cardiovasculares (102). Um importante mediador dos efeitos metabólicos do resveratrol é o co-ativador 1 alfa do receptor ativado por proliferador de peroxisomo (PGC-1α) (103). Em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica, SIRT-1 tem a habilidade de deacetilar e ativar a PGC-1α, e o resveratrol por sua vez aumenta a atividade da SIRT1 e da PGC-1α (99, 104). Além disso, o resveratrol ativa outra importante proteína reguladora do metabolismo corporal, a proteína quinase ativada por adenosina 5’-monofosfato (AMPK) (98, 105, 104). Camundongos deficientes de AMPK são resistentes aos efeitos metabólicos do resveratrol, confirmando que a AMPK é uma proteína-chave mediando os efeitos benéficos produzidos pelo resveratrol (104- 106).
Estudos recentes mostram que o resveratrol também exerce efeitos anti-inflamatórios em modelos de doenças inflamatórias. O resveratrol inibe a inflamação induzida por TNF-α via SIRT1 em fibroblastos (107). Em condrócitos, o resveratrol produz efeito anti-inflamatório através da inibição do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-kB), da expressão da iNOS e da produção de NO (108). O resveratrol reverte a inflamação central e periférica associada à obesidade (109). Em modelos de inflamação pulmonar, o resveratrol atenua a fibrose pulmonar induzida por bleomicina (110) e a inflamação pulmonar induzida por enterotoxina do tipo B de Staphylococcus aureus (SEB), por meio da ativação da SIRT-1 e regulação negativa do NF-kB (111). Além disso, em modelo de asma alérgica murina induzida por OVA, o resveratrol reduz a produção de IgE OVA específica, IL-4 e IL-5, bem como a eosinofilia, hiperreatividade das vias aéreas e hipersecreção de muco (112). Trabalho recente do nosso grupo mostrou que o resveratrol é capaz de reverter a resistência à insulina, diminuir a expressão de iNOS, os níveis de TNF-α e a produção de ânion superóxido no tecido pulmonar de camundongos obesos desafiados com OVA (113).
Entretanto, poucos estudos se preocuparem em investigar a sinalização da insulina no tecido pulmonar (91). No modelo de obesidade induzida por dieta hiperlipídica, procurar abordar esta sinalização e eventual interação com o NO.
Assim, propomos estudar a sinalização de insulina no pulmão e as possíveis vias que levam à resistência. A hipótese deste trabalho é que as vias de sinalização de insulina estão intactas no tecido pulmonar de animais magros, porém, as mesmas estariam prejudicadas nos indivíduos obesos.
2. OBJETIVO GERAL
O presente estudo tem como objetivo geral estudar a existência da sinalização de insulina no tecido pulmonar de camundongos obesos e magros, desafiados com OVA. É nosso objetivo também estudar o papel modulatório do NO nas vias de sinalização de insulina. Ainda, investigamos o efeito do resveratrol sobre a sinalização de insulina no tecido pulmonar como um agente terapêutico alternativo no controle da asma associada à obesidade.
2.1. Objetivos específicos
2.1.1. Avaliação da expressão e ativação de proteínas-chave envolvidas na sinalização da insulina como IRβ, IRS-1 e AKT no pulmão e brônquios isolados de camundongos magros e obesos, estimulados in vivo com insulina;
2.1.2. Avaliação da expressão das proteínas quinases JNK e IKK no pulmão de camundongos magros e obesos;
2.1.3. Avaliação do papel do NO na resistência pulmonar à insulina, por meio de ensaio de nitração de IRβ, IRS-1 e AKT e tratamento dos animais com aminoguanidina;
2.1.4. Avaliação da colocalização do IRβ, AKT e 3-NT no pulmão de camundongos magros e obesos;
2.1.5. Investigação do efeito do tratamento com resveratrol sobre a expressão de AKT, IRβ, IRS-1, JNK e IKK no tecido pulmonar de camundongos magros e obesos.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos machos de 4 semanas de idade da linhagem C57BL/6. Os animais foram fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP e mantidos a 24◦C, com um período de iluminação diária de 12 h, com água e alimentação ad libitum no biotério do Departamento de Farmacologia da FCM/UNICAMP. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) – IB – UNICAMP sob n° 3502-1.
3.2. Indução da obesidade com dieta hiperlipídica
A obesidade foi induzida através da substituição da ração padrão (AIN-93) dos camundongos por dieta hiperlipídica da marca Pragsoluções (composição abaixo), durante 12 semanas. Os grupos magros receberam dieta comercial padrão (10% de lipídeo, 70% de carboidrato e 20% de proteína) para roedores da marca NUVILAB CR-1 irradiada (85, 113).
Composição da dieta hiperlipídica- marca Pragsoluções Peso total dessa aquisição: 15,2kg
Quantidades de cada substância na fórmula
Produto Quantidade prescrita (%) Quantidade do produto (g)
Amido de milho 1,9500 296,400 Caseina 20,0000 3.040,000 Amido dextrinizado 15,0000 2.280,000 Sacarose 15,0000 2.280,000 Banha 35,0000 5.320,000 Oleo de soja 3,0000 456,000 Celulose microcristalina 5,0000 760,000 L cistina 0,3000 45,600
Bitartarato de colina 0,2500 38,000
BHT 0,0028 0,426
Mix mineral ain 93 3,5000 532,000
Mix vitaminico ain 93 1,0000 152,000
3.3. Grupos experimentais
O estudo foi conduzido com os seguintes grupos experimentais:
- não -sensibilizado - sensibilizado
- RESV (sensibilizado / tratado com resveratrol) - INS (sensibilizado / estimulado com insulina)
- INS + RESV (sensibilizado / estimulado com insulina / tratado com resveratrol) - AG (sensibilizado /tratado com aminoguanidina)
- INS + AG (sensibilizado / estimulado com insulina / tratado com aminoguanidina)
- sensibilizado
- RESV (sensibilizado / tratado com resveratrol) - INS (sensibilizado / estimulado com insulina)
- INS + RESV (sensibilizado / estimulado com insulina / tratado com resveratrol) - AG (sensibilizado /tratado com aminoguanidina)
- INS + AG (sensibilizado / estimulado com insulina / tratado com aminoguanidina)
3.4. Sensibilização com ovalbumina (OVA) e desafio intranasal
A sensibilização iniciou na 10a semana de tratamento com a dieta padrão ou hiperlipídica. Cada camundongo (magro e obeso) recebeu injeção subcutânea de OVA (100 g de OVA, 1,6 mg de Al(OH)3 em 0,4 ml de soro fisiológico) no dorso, no
dia zero e no dia 7. Nos dias 14 e 15, os animais foram desafiados com OVA por via intranasal (10 g de OVA em 50 µl de soro fisiológico) por 2 vezes com intervalo de 6 h entre as mesmas. Quarenta e oito horas após o primeiro desafio intranasal, os
MAGRO
animais foram anestesiados, exsanguinados, e submetidos aos procedimentos experimentais para coleta do tecido pulmonar.
3.5. Tratamento com resveratrol
Camundongos obesos e magros foram tratados diariamente com resveratrol (100 mg/kg) por gavage, durante duas semanas (111). O tratamento iniciou concomitantemente à primeira imunização (10ª. semana), terminando após o último desafio com OVA (12ª. semana). A coleta do pulmão foi realizada 48 h após o primeiro desafio, conforme esquema abaixo.
3.6. Tratamento com aminoguanidina
Camundongos magros e obesos foram tratados com aminoguanidina (20 mg/kg/dia), oferecida na dieta hídrica dos animais por 3 semanas, à semelhança do tratamento com resveratrol (59). Veja o esquema representativo a seguir.
Figura 1: Esquema representativo dos tratamentos com resveratrol (100 mg/kg por 14 dias) e aminoguanidina (20 mg/kg por 21 dias), e protocolo de sensibilização e desafio com ovalbumina (OVA) em camundongos magros e obesos.
3.7. Estímulo do pulmão com insulina
Os animais foram anestesiados e a cavidade abdominal foi aberta; em seguida, os animais receberam injeção endovenosa de insulina (Humulin regular; 1 UI por animal na veia cava inferior). Esse protocolo foi adaptado de estudos anteriores dos professores Mário José Abdalla Saad e Lício Augusto Velloso. Após períodos de 1 minuto (para avaliação de IRβ e IRS-1) ou 5 de minutos (para p-AKT), retirou-se os pulmões. Os tecidos foram então homogeneizados em tampão de extração de proteínas. Em seguida, as amostras foram centrifugadas para a remoção do material insolúvel, e parte do sobrenadante foi utilizado para determinação de proteínas. O restante da amostra foi acrescido de tampão Laemmli e armazenado para ensaios de western blotting.
Nos protocolos experimentais concebidos a investigar os brônquios isolados, os camundongos anestesiados (estimulados ou não com 1 U de insulina) foram sacrificados por deslocamento cervical. Os pulmões foram dissecados como um bloco e imediatamente colocados numa placa de Petri contendo solução de Krebs-Henseleit (mM: 117 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgSO4, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3 e
11 glicose). Os brônquios principais esquerdo e direito foram cuidadosamente removidos e aproximadamente 2 mm de anéis foram extirpados e imersos no tampão de extração. As amostras foram armazenadas a -80°C até serem processadas para os ensaios de western blotting para p-AKT.
3.8. Western blotting e imunoprecipitação
Após os tratamentos descritos acima, foram realizadas as técnicas de western blotting e/ou imunoprecipitação para detecção das proteínas contra p-IRS-1 Tyr 632 (diluição 1:1000; Santa Cruz: sc-17196), p-IRβ Tyr 1162/1163 (diluição 1:1000; Santa Cruz: sc- 25103), AKT Ser 473 (diluição 1:1000; Santa Cruz: sc- 7985-R), p-JNK 1/2/3 (diluição 1:1000; Santa Cruz: sc- 135642), p-IKK (diluição 1:1000; Santa Cruz: sc- 23470-R), iNOS (diluição 1:500; Cayman: 160862) e β-actina (diluição 1:10000; Sigma: A3854). Os pulmões e brônquios foram homogeneizados separadamente em tampão de extração de proteínas. Em seguida, as amostras foram centrifugadas para a remoção do material insolúvel e parte do sobrenadante
foi utilizada para determinação de proteínas. O restante da amostra foi acrescido de tampão Laemmli. Após separação por eletroforese em gel (SDS-PAGE), as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e então bloqueadas com uma solução de BSA 5%. Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpos específicos contra as proteínas listadas acima. Após marcação com anticorpo primário, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado à peroxidase, e a posterior revelação foi realizada com uma solução contendo luminol, ácido p-cumárico e H2O2.
Para detecção da nitração em resíduos de tirosina foi realizado ensaio de imunoprecipitação, no qual o tecido pulmonar foi extraído e homogeneizado em tampão de extração. Após centrifugação, o material insolúvel foi removido, os extratos foram ajustados a uma concentração fixa de proteína. As amostras foram incubadas com anticorpo contra 3-nitrotirosina (3-NT) por 2 h e posteriormente incubados com proteína A sefarose, overnight à 4°C. O complexo imune foi lavado três vezes em PBS (pH 7,4) contendo 1% de NP-40 e 2 mmol /l Na3VO4,
ressuspendidos em tampão de Laemmli, e fervida durante 5 min. Os imunocomplexos foram submetidos eletroforese em gel SDS-poliacrilamida e processadas para análise de western blotting, conforme descrito acima.
3.9. Imunofluorescência
Os pulmões foram colocados em lamínulas de vidro. Em seguida, o tecido pulmonar foi lavado duas vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído a 3,5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 15 min à temperatura ambiente e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em PBS. O tecido pulmonar foi emblocado em parafina e cortado em secções de 5-micron. Resumidamente, as seções de tecido foram desparafinadas em duas mudanças de xileno durante 5 min cada, hidratadas em duas mudanças de etanol a 100% durante 3 min cada, mudando-se de 95% a 80% de etanol durante 1 min cada, lavando-se finalmente em água destilada. As seções foram processadas para recuperação antigênica num banho de água contendo tampão de citrato de sódio (ácido cítrico 10 mM, Tween 20 a 0,05%, pH 6,0), à 95-100°C durante 40 min, e depois deixadas esfriar à temperatura ambiente durante mais 60 min. As secções foram lavadas em
PBS-Tween 20, duas vezes durante 2 min cada. As secções foram bloqueadas com BSA a 2% em PBS durante 1 h à temperatura ambiente. As seções foram então incubadas com uma diluição 1:500 do antissoro N-específico primário homólogo (3-NT, IRβ ou AKT) em PBS durante 1 h numa câmara umidificada. Após três lavagens em PBS, as secções foram incubadas com o anticorpo secundário (FITC e rodamina) durante 30 min. Após um ciclo de lavagem adicional, as secções foram montadas com DAPI (Vecta) e vistas sob um microscópio de imunofluorescência (Leica DM 4500 B).
3.10. Teste de tolerância à insulina (ITT) e glicose
Camundongos alimentados com dieta hiperlipídica ou dieta comercial padrão para roedores (magros) e os respectivos animais tratados com resveratrol foram mantidos em jejum por 6 h. Após o jejum, coletou-se o sangue da veia caudal, e o nível de glicose foi avaliado utilizando-se glicosímetro (Accu-Chek Performa, Roche Diagnostics, E.U.A) (59, 133).
Em experimentos separados, após o jejum, os animais receberam uma injeção intraperitoneal de insulina (1 UI/kg). Coletou-se o sangue da cauda dos nos tempos 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 min, para medida dos níveis de glicose. Calculou-se em seguida a taxa de decaimento da glicose através da curva de regressão linear do logaritimo neperiano da glicose versus o tempo. Este valor foi assumido como a constante de decaimento de glicose após o ITT (KITT) e expresso como porcentagem
por minuto (59, 133).
3.11. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão das médias (EPM) de n experimentos. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas utilizando-se análise de variância (ANOVA) para múltiplas comparações seguido pelo teste de Tukey. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos.
4. RESULTADOS
Os dados abaixo foram obtidos a partir de pulmões de camundongos magros e obesos, desafiados ou não com OVA (asmáticos), e tratados ou não com resveratrol. Em alguns grupos experimentos, os animais foram tratados com aminoguanidina.
4.1. Caracterização do modelo experimental
Camundongos C57BL/6J alimentados com dieta hiperlipídica apresentaram ganho ponderal e peso da gordura epididimal significativamente maiores do que animais alimentados com dieta comercial padrão. O peso corporal não foi alterado pelo tratamento com resveratrol, nem no grupo controle nem no grupo obeso (Figura 2A). Contudo, o tratamento com resveratrol diminuiu discretamente (porém de modo significativo) o peso da gordura epididimal nos camundongos obesos (Figura 2B).
Os níveis de glicose em jejum foram maiores no grupo obeso em relação ao controle-magro. O tratamento com resveratrol reduziu significativamente a glicemia de jejum no grupo obeso, não modificam este parâmetro no grupo magro (Figura 2C). A taxa de queda de glicose em resposta a 1 UI/kg de insulina recombinante foi avaliada através do cálculo da constante de captação de glicose (KITT). Este
parâmetro foi menor no grupo obeso em relação ao grupo controle (magro), sendo revertido pelo tratamento com resveratrol. Não existe diferença significativamente nos valores de KITT entre os grupos obeso e magro tratados com resveratrol (Figura
2D). Estes dados indicam que o resveratrol reverte a resistência à insulina induzida pela obesidade. Estes dados da figura 1 foram publicados recentemente (113), e estão aqui reproduzidos para facilitar a apresentação dos dados da presente tese.
A. B. 0 7 14 20 30 40 50 Magro Obeso Magro+RESV Obeso+RESV P e s o ( g ) * Dias C. D.
Figura 2. Efeito do tratamento com resveratrol (RESV) (100 mg/kg/dia) sobre o
peso ponderal (A), peso da gordura epididimal (B), glicemia em jejum (C) e KITT
(D) em camundongos obesos e controles (magros). Cada coluna representa a
média ± E.P.M para n=7-12. *P<0,05 comparado com controle-magro, #P<0,05 comparado com obeso não tratado (113).
4.2. Efeito da sensibilização com OVA na fosforilação de AKT no tecido
pulmonar de camundongos injetados com insulina
A fosforilação da AKT no tecido pulmonar de camundongos naive não-sensibilizados estimulados com insulina foi significativamente maior em comparação ao grupo não-estimulado. A fosforilação da AKT no tecido pulmonar de camundongos desafiados com OVA (asmáticos) e estimulados com insulina foi reduzida em comparação ao grupo não sensibilizado (P<0,05). Os valores basais (ausência de insulina) não diferenciam entre os grupos não-sensibilizados e OVA-sensibilizados (Figura 3). 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 * # G o rd u ra E p id id im a l (g ) Magro Obeso RESV 0 50 100 150 200 * # G li c o s e ( m g /d L ) RESV Magro Obeso 0 2 4 6 8 10 12 * # RESV Magro Obeso K it t (m in -1)%
Figura 3. Fosforilação de AKT em tecido pulmonar de camundongos naive sensibilizados com ovalbumina (OVA) e estimulado com insulina (INS) (A). Os
dados representam a média ± E.P.M (n=6 em cada grupo). *P<0,05 comparado ao respectivo grupo não-sensibilizado; **P<0,05 comparado tanto ao respectivo grupo sensibilizado com OVA e como o grupo não-sensibilizado e estimulado com insulina. O valor da expressão de p-AKT de cada grupo foi normalizado por β-actina e expresso por unidades arbitrárias (UA).
4.3. Efeito da obesidade sobre a expressão de p-IRβ, p-IRS-1 e p-AKT no
tecido pulmonar
Com intuito de se avaliar a existência de resistência à insulina no próprio tecido pulmonar avaliamos inicialmente a fosforilação do IRβ após estímulo in vivo com insulina. A fosforilação do IRβ foi significativamente maior (1 minuto de estímulo com insulina) no pulmão de camundongos magros comparado ao seu respectivo basal (ausência de insulina). Este aumento de p-IRβ pela insulina não foi observado no grupo obeso (Figura 4A). O tratamento com resveratrol aumentou significativamente a fosforilação do IRβ no grupo obeso (Figura 4A). No grupo magro, o tratamento elevou discretamente (porém de modo significativo) a fosforilação do IRβ. 0 1 2 3 4 * ** p -A K T /B -a c ti n a OVA INS - - + + - + - + p-AKT β-actina 60kDa 42kDa
A fosforilação de IRS-1 foi maior no grupo magro (após 1 minuto de estímulo de insulina) comparado ao respectivo basal. O tratamento com resveratrol foi capaz de aumentar a fosforilação de IRS-1 (Figura 4B). No grupo obeso não houve a fosforilação de IRS-1 após estímulo com insulina. Entretanto, após o tratamento com resveratrol, a fosforilação de IRS-1 pela insulina elevou para os mesmos níveis do grupo magro. Não houve diferença entre os grupos magros e obesos tratados com resveratrol (Figura 4B).
Quanto à fosforilação da AKT após estímulo in vivo com insulina (5 minutos), observamos um aumento significativo na fosforilação desta proteína no pulmão de camundongos magros, mas não no pulmão de obesos (Figura 4C). O tratamento com resveratrol aumentou a fosforilação da AKT no grupo obeso, sem entretanto modificá-la no grupo magro. Não houve diferença entre os grupos magro e obeso tratados com resveratrol (Figura 4C).
A. B.
C.
Figura 4. Fosforilação da subunidade β do receptor de insulina (IRβ; painel A), do substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1; painel B) e da AKT (painel C) no tecido pulmonar após estímulo com insulina (INS) in vivo em camundongos magros e obesos, tratados ou não com resveratrol (RESV; 100 mg/kg/dia, 2 semanas). Utilizou-se estímulos com insulina de 5 minutos (AKT) ou de 1 minuto
(IRβ e IRS-1). Os dados representam a média ± E.P.M (n=6 em cada grupo). *P<0,05 comparado ao respectivo controle (basal) magro ou obeso; #P<0,05 comparado ao respectivo grupo controle estimulado com insulina. Os valores da expressão de p-AKT, p-IRβ e p-IRS-1 de cada grupo foram normalizados por β-actina e expressos por unidades arbitrárias (UA).
β-actina p-IRβ 42kDa 95kDa INS - + + - + + RESV - - + - - + 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 p -IR / -a c tin a Magro Obeso * *# * β-actina p-IRS-1 180kDa 42kDa INS - + + - + + RESV - - + - - + 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Magro Obeso # * * * p -I R S -1 / -a c ti n a INS - + + - + + RESV - - + - - + p-AKT β-actina 60kDa 42kDa 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 * Magro Obeso *# * p -A K T / -a c ti n a
4.4. Efeito da obesidade sobre a expressão de p-JNK e p-IKK no tecido pulmonar
Diversos mecanismos inflamatórios estão envolvidos na patogênese da resistência à insulina nos tecidos periféricos. É consenso que alguns dos mecanismos moleculares envolvem alterações na ação de moléculas-chave da via inflamatória JNK, IKK e NF-kB (114, 115). Com intuito de estudar a presença de resistência à insulina no tecido pulmonar (local) e se a mesma seria mediada por alterações na via JNK-IKK, avaliamos a expressão das proteínas envolvidas nessa via, como p-JNK e p-IKK no pulmão de camundongos magros e obesos.
No grupo obeso, observamos aumento significativo na expressão de p-JNK e p-IKK no tecido pulmonar comparado ao grupo magro (Figura 5 A e B). O tratamento com resveratrol reduziu o aumento da expressão da p-JNK e p-IKK no pulmão de camundongos obesos, sem modificá-lo no grupo magro (Figura 5 A e B).
A. B.
Figura 5. Fosforilação de JNK (painel A) e IKK (painel B) nos pulmões de camundongos magros e obesos, tratados ou não com resveratrol (RESV; 100 mg/kg/dia, 2 semanas). Os dados representam a média ± E.P.M (n=6 em cada
grupo). *P<0,05 comparado ao grupo magro; #P<0,05 comparado ao grupo obeso não-tratado. Os valores da expressão de p-JNK e p-IKK de cada grupo foram normalizados por β-actina e expressos por unidades arbitrárias (UA).
4.5. Efeito da obesidade na nitração da IRβ, IRS-1 e AKT no tecido pulmonar
Levando-se em consideração que o NO produzido pela iNOS reage rapidamente com O2- livre, formando ONOO-, o qual interage com proteínas para
formar nitrotirosina, decidimos analisar a presença de modificação em resíduos de tirosina do IRβ, IRS-1 e AKT, que são elementos críticos para a ação da insulina. Assim, realizamos a imunoprecipitação de proteínas contendo resíduos de nitrotirosina utilizando o anticorpo anti-nitrotirosina, após o qual “blotamos” com os anticorpos para IRβ, IRS-1 e AKT.
A análise da figura 5 mostra aumento significativo na nitração de IRβ (painel A), IRS-1 (painel B) e AKT (painel C) em pulmões de camundongos obesos quando comparados com os respectivos grupos magros. O aumento nos níveis de nitração de IRβ, IRS-1 e AKT nos animais obesos foi revertido após o tratamento com resveratrol. No grupo magro o tratamento com resveratrol não modificou de modo significativo a nitração para nenhuma destas proteínas (Figura 6 A, B e C).
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Magro Obeso * # p -J NK / -a c ti n a p-JNK β-actina 42kDa 46kDa RESV - + - + 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 p -I K K / -a c ti n a Magro Obeso * # p-IKK β-actina 42kDa 87kDa RESV - + - +
A. B.
C.
Figura 6. Imunoprecipitação da nitrotirosina e imunoblotting para IRβ (painel
A), IRS-1 (painel B) e AKT (painel C) nos pulmões de animais magros e obesos, tratados ou não com resveratrol (RESV; 100 mg/kg/dia, 2 semanas). Os dados
representam a média ± E.P.M (n= 6 em cada grupo). # P<0,05 quando comparado
ao grupo magro; *P<0,05 comparado ao grupo obeso não-tratado.
Imunoprecipitação (IP); Imunoblotting (IB). 0 1 2 3 # *
Magro Obeso Magro Obeso
IR S -1 N it ra ç ã o e m t ir o s in a RESV - - + + IP: n-tyr IB: n-tyr
IB: IRS-1 180kDa
85kDa 0 1 2 3 # *
Magro Obeso Magro Obeso
# A K T N it ra çã o e m t ir o si n a IP: n-tyr IB: AKT IB: n-tyr 60kDa 85kDa RESV - - + + IP: n-tyr IB: n-tyr
IB: IRβ 95kDa
85kDa RESV - - + + 0 1 2 3 * #
Magro Obeso Magro Obeso
IR N it ra ç ã o e m t ir o s in a
4.6. Colocalização dos resíduos de nitrotirosina, IRβ e AKT no pulmão de camundongos magros e obesos
Com intuito de verificar a localização das proteínas IRβ e AKT no tecido
pulmonar de camundongos magros e obesos, realizamos ensaios de
imunofluorescência. Através desta técnica, analisamos também, de maneira qualitativa, a nitração destas proteínas através da formação de 3-nitrotirosina (3-NT).
A figura 7 mostra que há marcante expressão de IRβ e 3-NT no tecido pulmonar dos animais; porém, com maior concentração na região peribronquiolar de camundongos obesos. Quando avaliamos a colocalização de IRβ e 3-NT (merge) observamos maior nitração do receptor de insulina na região peribronquiolar de camundongos obesos comparados aos magros. O tratamento com resveratrol atenuou a nitração do IRβ em camundongos obesos (Figura 7).
Na figura 8 mostramos que o mesmo ocorre para AKT onde há uma marcante expressão desta proteína na região peribronquiolar dos camundongos obesos, acompanhada de maior nitração da AKT (merge). O tratamento com resveratrol reduziu a nitração de AKT na região peribronquiolar do grupo obeso, sem interferir no grupo magro (Figura 8).
Figura 7. Fotomicrografias representativas da expressão de 3-NT, IRβ e colocalização de ambas em cortes de pulmões de animais magros e obesos, tratados ou não com resveratrol (RESV; 100 mg/kg/dia, 2 semanas). Utilizamos
objetiva de 20 vezes. Os dados estão expressos como média ± E.P.M para n=6.
MAGRO
OBESO
MAGRO+RESV
OBESO+RESV
Figura 8. Fotomicrografias representativas da expressão de 3-NT, AKT e colocalização de ambas em cortes de pulmões de animais magros e obesos, tratados ou não com resveratrol (RESV; 100 mg/kg/dia, 2 semanas). Utilizamos
objetiva de 20 vezes. Os dados estão expressos como média ± E.P.M para n=6.
4.7. Efeitos do tratamento com aminoguanidina sobre o peso corpóreo
Nessa parte do estudo, avaliamos inicialmente o efeito do tratamento com aminoguanidina, por um período de 21 dias, sobre o peso corpóreo de camundongos magros e obesos. Animais alimentados com dieta hiperlipídica tiveram peso corpóreo significativamente maior do que animais alimentados com dieta comercial padrão. O ganho de peso não foi alterado pelo tratamento com aminoguanidina, nem no grupo controle nem no grupo obeso (Figura 9).
OBESO
3- NT AKT Merge
MAGRO
MAGRO+RESV
0 7 14 21 20 30 40 50 Magro Obeso Magro+AG Obeso+AG # Dias P e s o ( g )
Figura 9. Efeito do tratamento com aminoguanidina (AG) (20 mg/kg/dia, 3 semanas) sobre o peso ponderal em camundongos obesos e controles. Cada
coluna representa a média ± E.P.M para n=6. #P<0,05 comparado com grupo magro (dia zero).
4.8. Efeitos do tratamento com aminoguanidina sobre a expressão de iNOS
Para confirmarmos a participação do NO/ONOO- na resistência à insulina no tecido pulmonar de camundongos obesos, avaliamos o efeito da inibição crônica da iNOS, através do tratamento com aminoguanidina (20 mg/kg/dia). Inicialmente, para validar nosso protocolo de tratamento, nós avaliamos a expressão de iNOS.
A expressão da iNOS foi significativamente maior no pulmão dos camundongos obesos comparado aos magros (Figura 10).
O tratamento com aminoguanidina reduziu a expressão de iNOS no tecido pulmonar de camundongos obesos, não modificando a expressão desta enzima no grupo magro (Figura 10).
Figura 10. Expressão de iNOS após tratamento crônico com aminoguanidina nos pulmões de camundongos magro e obeso. A aminoguanidina (AG) foi
admininstrada por 3 semanas na dose de 20 mg/kg/dia (adicionada à ingesta hídrica). Os dados representam a média ± E.P.M para n= 6. *P<0,05 comparado ao grupo magro; #P<0,05 comparado ao grupo obeso não-tratado. O valor da expressão de iNOS de cada grupo foi normalizado por β-actina e expresso por unidades arbitrárias (UA).
4.9. Efeito do tratamento com aminoguanidina sobre a expressão de IRβ,
IRS-1 e AKT
Para mostrar o papel do NO/ONOO- na resistência à insulina no tecido pulmonar de camundongos obesos, avaliamos o efeito do tratamento com aminoguanidina (20 mg/kg/dia) na expressão de p-IRβ, p-IRS-1 e p-AKT.
Nas expressões de p-IRβ e p-IRS-1 a estimulação com insulina no grupo obeso não foi capaz de aumentar a fosforilação dessas proteínas; diferentemente, o grupo magro mostrou aumento na expressão destas proteínas após estímulo com insulina (Figura 11 A e B).
O tratamento com aminoguanidina foi capaz de aumentar a fosforilação de IRβ e IRS-1 no grupo obeso comparado ao grupo não-tratado (Figura 11 A e B).
0.0 0.2 0.4 0.6 * # Magro Obeso iN O S / -a c ti n a iNOS β-actina 42kDa 130kDa AG - + - +
Notamos aumento significativo na expressão de p-AKT em camundongos magros após estímulo com insulina, o qual não foi observado no grupo obeso. O tratamento com aminoguanidina reverteu à expressão reduzida da p-AKT em resposta à insulina no grupo obeso (Figura 11 C). A aminoguanidina não modificou a expressão da p-AKT no grupo magro.
