UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
VÍCTOR ULIAN ANTUNES
DIFERENCIAÇÃO DE ISÔMEROS ORGANOFLUORADOS POR RMN APLICANDO A METODOLOGIA 19F MAD (MATRIX-ASSISTED DOSY)
CAMPINAS 2016
VÍCTOR ULIAN ANTUNES
DIFERENCIAÇÃO DE ISÔMEROS ORGANOFLUORADOS POR RMN APLICANDO A METODOLOGIA 19F MAD (MATRIX-ASSISTED DOSY)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Química Orgânica.
Orientador: Prof. Dr. CLÁUDIO FRANCISCO TORMENA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO VÍCTOR ULIAN ANTUNES, E ORIENTADA PELO PROF. DR. CLÁUDIO FRANCISCO TORMENA.
CAMPINAS 2016
Dedico esta dissertação ao meu filho, Miguel de Sousa Antunes, por tornar meus dias e noites mais felizes e animados.
AGRADECIMENTOS
À minha família, pela base e apoio incondicional durante toda a vida, em especial, aos meus pais, Amaury e Marisa, pelo amor e dedicação.
Ao meu irmão Rodrigo, pelo companheirismo e amizade durante esses vinte e poucos anos vividos.
Ao meu filho Miguel, por me proporcionar momentos únicos.
Á Fran, pelo carinho e compressão durante esses anos que estamos juntos.
Aos amigos do LFQO, professor Robeto Rittner, Borghi, Bart, Maiara, Lucas, Renan, Thais, Amanda, Carol, Angelita, Kahlil, Rodrigo, Claudimar, Uenifer, Monique e Wesley pelas discussões e experiências compartilhadas.
Ao Cláudio, pela orientação e amizade.
Aos meus amigos, por estarem sempre presentes nos momentos importantes.
Ao Instituto de Química da UNICAMP, pelo suporte durante o período de mestrado, em especial, aos funcionários da secretaria e aos técnicos da sala de RMN.
RESUMO
Essa dissertação apresenta uma estratégia moderna, pela técnica RMN DOSY, para análise de misturas isoméricas de organofluorados, utilizando como matriz um surfactante catiônico.
A metodologia MAD, como o próprio nome sugere, se baseia na aplicação de uma matriz em solução com o propósito de interagir de forma particular com as espécies da mistura, diferenciando-as na dimensão da difusão molecular, onde, quando somada à escolha de um núcleo com maior sensibilidade ao deslocamento químico, como o 19F, apresenta uma abordagem interessante minimizando as limitações dos
experimentos de DOSY (sobreposição de sinais e a não diferenciação de moléculas com massa molecular semelhantes).
Assim, a técnica DOSY correlaciona os coeficientes de difusão com os respectivos deslocamentos químicos resultando em uma separação virtual orientada pelos tamanhos das espécies químicas presentes na mistura.
Neste trabalho avaliou-se a eficiência do surfactante CTAB como matriz de separação de uma mistura de isômeros de fluorofenois e fluoroanilinas, otimizando as condições de concentrações de surfactante/soluto, temperatura e pH.
Os resultados mostram que a diferenciação dos compostos fluorados pela matriz ocorre por um somatório de variáveis, como o caráter lipofílico das espécies, momento de dipolo e o caráter ácido e básico de cada composto, tal como, a quantidade na qual essas espécies se encontram ionizadas em solução, o que torna o sistema complexo sugerindo que tais variáveis poderiam ser moduladas, a fim de se obter boas separações.
Para uma melhor compreensão sobre os mecanismos de diferenciação, foram realizados experimentos baseados no efeito nuclear Overhauser nos quais se evidenciou que as interações matriz/soluto ocorrem por toda extensão do surfactante, apresentando uma preferência pela cadeia carbônica.
ABSTRACT
This work is related to separation of mixtures applying 19F MAD (Matrix-Assisted
DOSY) as a modern strategy applying NMR spectroscopy as a tools to differentiate isomeric forms of fluorinated molecules in a mixture using a cationic surfactant as matrix. The application of this methodology, dubbed MAD, is based on addition of a matrix to a solution containing fluorinated isomers with the purpose to produce a difference in the strength of interaction between each isomer and the matrix leading to a differentiation of the isomers on the diffusion dimension. It is well known that signals overlap is a common problem in 1H NMR DOSY, in this way 19F NMR was applied to
avoid such problems, since the great sensitivity of the 19F chemical shift to local
environment leads to a very well-dispersed spectra. In this context, in the present study it was evaluated the CTAB surfactant efficiency as a differentiation agent (matrix) of a mixture containing fluorophenol and fluoroaniline isomers. The surfactant: analyte ratio was investigated as well as temperature and pH. The results showed that CTAB surfactant can be used to differentiate fluorinated species and the efficiency involves parameters such as, lipophilicity and pKa of the fluorinated species leading to a complex system to be understandable, but the experimental conditions (pH, temperature and concentration) can be tuned to get the bestest differentiation between fluorinated isomers as possible. NMR experiment based on nuclear Overhauser effect was applied to evaluate the interaction sites between solute and micelles responsible for the observed differentiation among isomers. This experiments suggest that interaction occurs in more extension in the carbon chain, instead of head polar group.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. RMN de 1H DOSY (499,87 MHz, D2O, 25 ºC) de uma mistura de
aminoácidos: Fenilalanina, treolina, glicina e água ... 16
Figura 2. Sequência eco de spin com gradiente de campo pulsado (PFGSE). ... 18
Figura 3. Esquema da magnetização na presença da difusão em um experimento de PFGSE. ... 18
Figura 4. Gráfico da intensidade dos sinais em função da força de gradiente realizado em uma mistura de aminoácidos. ... 19
Figura 5. Sequência eco estimulado (PFGSTE)...;;...20
Figura 6. Sequência Oneshot e Oneshot45. ... 21
Figura 7. Representação de um surfactante...25
Figura 8. Representação de algumas formas de agregação dos surfactantes: Esférica, Cilíndrica, Lamelar e Micela gigante...26
Figura 9. Representação esquemática da dupla camada elétrica de um surfactante catiônico: Núcleo da micela, Camada de Stern e Camada de Gouy-Champman...27
Figura 10. Estruturas dos compostos que estão sendo estudados. ... 28
Figura 11. Sequências de pulso utilizadas: (a) Oneshot para 19F e (b) Oneshot45 .. 30
Figura 12. Coeficientes de difusão (19F) em função do tempo para uma amostra contendo 5 mM de cada fluorofenol na presença de 50 mM de CTAB...31
Figura 13. Coeficiente de difusão (1H) em função do inverso da concentração do CTAB ... 32
Figura 14. Coeficientes de difusão (19F) em função da concentração de CTAB (a) para amostras contendo 5 mM de cada fluorofenol e (b) para amostras contendo 5 mM de cada fluoroanilina. ... 33
Figura 15. Espectros de 19F{1H} DOSY (470,29 MHz, D2O, 30 ºC) para a amostra com 5 mM de cada fluorofenol a) sem CTAB e b) com 50 mM de CTAB...34
Figura 16. Espectro de 19F{1H} DOSY (470,29 MHz, D2O, 30 ºC) para a amostra com 5 mM de cada fluoroanilina a) sem CTAB e b) com 50 mM de CTAB...35
Figura 17. a) Espectro de RMN 19F{1H} DOSY (470,29 MHz, D2O, 30 ºC) para a amostra com os 5mM de cada isômero de fluorofenol e 5 mM de fluoroanilina na ausência (contorno preto) e presença de 50mM de CTAB (contorno colorido) e b) Espectro de RMN 1H DOSY (600,17 MHz, D2O, 30 ºC) para a mesma amostra usada no 19F{1H} DOSY...37
Figura 18. Coeficientes de difusão (19F) em função da concentração de fluorados em
50 mM de CTAB: (a) variando a concentração dos isômeros de cada fluorofenol e (b) variando a concentração dos isômeros de cada fluoroanilina. ... 38 Figura 19. Ampliação dos espectros de RMN de 1H (499,87 MHz, D2O, 30 ºC) para
mistura de 50 mM de CTAB variando a concentração dos isômeros de fluorofenol...39 Figura 20. Ampliação dos espectros de RMN de 1H (499,87 MHz, D2O, 30 ºC) para
mistura de 50 mM de CTAB variando a concentração dos isômeros de fluoroanilina...40 Figura 21. Tempos de relaxação T1 e T2 versus tempo de correlação (Ƭc) ... 41
Figura 22. Coeficiente de difusão (1H) em função do inverso da concentração do
CTAB. ... 43 Figura 23. Coeficientes de difusão (19F) em função da potência do desacoplador para
uma amostra de 5 mM de cada fluorofenol na presença de 50 mM de CTAB. ... 47 Figura 24. Equilíbrio em meio ácido e básico dos fluorofenois e das fluoroanilinas . 49 Figura 25. Coeficiente de difusão (19F) em função do pH para amostras com 5 mM de
cada fluorofenol e com 50 mM de CTAB. ... 50 Figura 26. Coeficiente de difusão (19F) em função do pH para amostras com 5 mM de
cada fluoroanilina e com 50 mM de CTAB. ... 50 Figura 27. Espectros de RMN de 19F{1H} DOSY (470,29 MHz, D2O, 30 ºC) para as
amostras a) com 5 mM de cada fluorofenol e 50 mM de CTAB em pH 11,7 e b) com 5 mM de cada fluoroanilina e 50 mM de CTAB em pH 1,8...51 Figura 28. Mapas de potencial eletrostáticos das estruturas otimizadas e valores de momento de dipolo (µ) calculados no nível de teoria M062x/aug-cc-pVTZ para as formas desprotonadas dos isômeros de fluorofenol e as formas protonadas dos isômeros de fluoroanilina. ... 53 Figura 29. Espectros de RMN de 19F{1H} DOSY (470,29 MHz, D2O, 30 ºC), com o
espectro (topo) de 19F 1D menos atenuado, para as amostras: a) com 5 mM de cada
fluorofenol em pH 8,8 e b) com 5 mM de cada fluoroanilina em pH 3,2 sem surfactante...54 Figura 30. Espectros de RMN de 19F{1H} DOSY (470,29 MHz, D2O, 30 ºC), com o
espectro (topo) de 19F 1D menos atenuado, para as amostras: a) com 5 mM de cada
fluorofenol e 50 mM de CTAB em pH 8,8 e b) com 5 mM de cada fluoroanilina e 50 mM de CTAB em pH 3,2... 55
Figura 31. Variação de pH em função da concentração de CTAB em uma amostra com 5 mM de cada fluorofenol, outra com 5 mM de cada fluoroanilina sem fluorado...59 Figura 32. Variação de pH em função da concentração de: a) fluorofenois sem e com 50 mM de b) fluoroanilinas sem com 50 mM ... 60 Figura 33. Coeficientes de difusão (19F) em função da temperatura para amostra
contendo 50mM de CTAB e 10mM de cada fluorofenol. ... 61 Figura 34. Esquema da estrutura dos surfactantes alquiltrimetilamônios. Os mais comuns são o DTAB (n = 8), o TTAB (n = 10) e o CTAB (n = 12). ... 61 Figura 35. Coeficientes de difusão (19F): a) dos fluorofenois e b) das fluoroanilinas
em função do tamanho da cadeia do surfactante. ... 62 Figura 36. Intensidade do NOE/ROE em função do logaritmo do produto da frequência de Larmor (ωo) pelo tempo de correlação (τc). ... 64
Figura 37. Espectro de RMN de 1H ROESY seletivo (600,17 MHz, D2O, 30 ºC) para
a amostra de: a) 15 mM de o-fluorofenol e 50mM de CTAB (pH 6,0), b) 15 mM de m-fluorofenol e 50mM de CTAB (pH 6,5) e c) 5 mM de p-m-fluorofenol e 50mM de CTAB (pH 6,7)...65 Figura 38. Esquema de interação do CTAB com os fluorfenois ... 65 Figura 39. Espectro de RMN de 1H ROESY seletivo (600,17 MHz, D2O, 30 ºC) para
a amostra de: a) 15 mM de o-fluoroanilina e 50mM de CTAB (pH 8,0), b) 15 mM de m-fluoroanilina e 50mM de CTAB (pH 7,5) e c) 15 mM de p-m-fluoroanilina e 50mM de CTAB (pH 7,9) ...66 Figura 40. Grupos hidrofílicos e lipofílicos das moléculas em estudo...67 Figura 41. Espectro de RMN de 1H ROESY seletivo (600,17 MHz, D2O, 30 ºC) para
a amostra de: a) 15 mM de o-fluorofenol (pH 11,8) e 50mM de CTAB, b) 5 mM de m-fluorofenol e 50mM de CTAB (pH 12,1) e c) 5 mM de p-m-fluorofenol e 50mM de CTAB (pH 12,0) ... 67 Figura 42. a) Ampliação dos espectros de RMN de 1H (600,17MHz, D2O,30 ºC), b)
pulso seletivo e c) Espectro de RMN de 1H NOESY seletivo para a amostra de 15 mM
de m-fluorofenol. Seguido da d) Ampliação do espectro de RMN de 1H (600,17 MHz,
D2O, 30 ºC), e) do pulso seletivo e f) do espectro de 1D NOESY seletivo para a amostra de 15 mM de m-fluoroanilina sem surfactante. ... 69
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Coeficientes de difusão da amostra com 5mM de cada fluorofenol e 5 mM de cada fluoroanilina sem CTAB e com 50 mM de CTAB. ... 35 Tabela 2. Valores de constante de partição (log P) obtidos através do programa ACD/labs. ... 36 Tabela 3. Coeficientes de difusão (1H) do CTAB para experimento com variação da
concentração de fluorados. ... 41 Tabela 4. Fração molar complexada em função da concentração de CTAB para amostras contendo 5 mM de cada fluorofenol e para amostras contendo 5 mM de cada fluoroanilina. ... 44 Tabela 5. Fração molar complexada em função da concentração de cada fluorofenol e fluoroanilina com 50 mM de CTAB. ... 45 Tabela 6. Valores de coeficientes de difusão da amostra com 5 mM de cada fluorofenol com 50 mM de CTAB em tubos de 3 mm e 5 mm. ... 47 Tabela 7. Valores de constante de ionização (pKa) obtidos do CRC Handbook of chemistry and physics para os isômeros de fluorofenois e fluoranilinas. ... 48 Tabela 8. Coeficientes de difusão (19F) de amostras com 5 mM de cada fluorofenol e
50 mM CTAB e 5 mM de cada fluoroanilina e 50 mM CTAB em função do pH. ... 56 Tabela 9. Valores de deslocamento químico e meia altura para as amostras de fluorofenois ... 57 Tabela 10. Valores de deslocamento químico e meia altura para as amostras de fluoroanilinas...58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CL/EM/RMN - Cromatografia líquida acoplada à Espectrometria de massa e RMN CL/RMN – Cromatografia líquida acoplada à RMN
CTAB - Surfactante brometo de cetiltrimetilamônio D - Coeficiente de difusão
D2O – Água deuterada
DOSY - Diffusion ordered spectroscopy
DTAB - Surfactante brometo de dodeciltrimetilamônio FA - Fluoroanilina
FF - Fluorofenol
G1 - Pulso de gradiente de incremento campo
Gp - Pulso de purga
HCPD - 1H Composite pulse decoupling
m - Isômero meta
MAD - Matrix-assisted DOSY MM – Massa molar
nOe - Overhauser spectroscopy effect NOESY - Nuclear Overhauser spectroscopy o - Isômero orto
p - Isômero para
PFGSE - Sequência eco de spin com gradiente de campo pulsado PFGSTE - Sequência eco estimulado com gradiente de campo pulso RF - Pulso de radiofrequência
RMN - Ressonância magnética nuclear
rOe - Rotating-frame Overhauser spectroscopy effect ROESY - Rotating-frame Overhauser spectroscopy T1 - Tempo de relaxação longitudinal
T2 - Tempo de relaxação transversal
TTAB - Surfactante brometo de tetradeciltrimetilamônio α – Fator de desbalanceamento
δ – Duração do pulso de gradiente Δ – Tempo de difusão
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 15
1.1.ASPECTOS TEORICOS DA TÉCNICA DOSY ... 15
1.2.19F DOSY ... 22
1.3.MATRIX-ASSISTED DOSY ... 23
1.4.SURFACTANTES E AGREGADOS ESTRUTURADOS ... 25
2. OBJETIVO ... 27
3. PARTE EXPERIMENTAL ... 28
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 31
4.1.OTIMIZAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES MICELA/SOLUTO ... 33
4.1.1.EXPERIMENTO DE VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CTAB .... 33
4.1.2.EXPERIMENTO DE VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS ISÔMEROS FLUORADOS ... 38
4.1.3.ESTUDO DE ALGUNS PARÂMETROS DE INTERAÇÃO SURFACTANTE/COMPOSOTOS FLUORADOS ... 42
4.2.INVESTIGAÇÃO DOS EFEITOS DA CONVECÇÃO NOS EXPERIMENTOS DE DIFUSÃO ... 45
4.3.EXPERIMENTO DE VARIAÇÃO DO pH...48
4.3.1.MEDIDAS DE pH...58
4.4.OUTRAS INVESTIGAÇÕES...60
4.4.1.EXPERIMENTO DE VARIAÇÃO DE TEMPERATURA...60
4.4.2.EXPERIMENTO DE VARIAÇÃO DO TAMANHO DA CADEIA CARBÔNICA DO SURFACTANTE CATIÔNICO ... 61
4.5.ESTUDO DO SÍTOS INTERAÇÃO SURFACTANTE/COMPOSOTOS FLUORADOS ... 62
5. CONCLUSÃO ... 70
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 72
1. INTRODUÇÃO
1.1. ASPECTOS TEORICOS DA TÉCNICA DOSY
A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de alta resolução é uma técnica espectroscópica amplamente difundida para a compreensão de fenômenos físico-químicos e elucidação estrutural, tendo um papel importante no desenvolvimento da ciência moderna.1 Quando a abordagem é a análise de misturas, a técnica de difusão
por RMN DOSY (do inglês, Diffusion Ordered Spectroscopy) se destaca, apresentando uma série de bons resultados.2,3,4
Esta, quando comparada com técnicas acopladas bem difundidas como por exemplo, CL/RMN, CL/EM/RMN entre outras que promovem a caracterização de misturas a partir de métodos físicos de separação de compostos, mostra-se vantajosa em inúmeros aspectos como preparo de amostra, baixo tempo de análise e estudo de espécies em equilíbrio.5,6
Os experimentos de DOSY correlacionam as frequências dos sinais de ressonância com os coeficientes de difusão das diferentes espécies existentes, viabilizando a análise e a caracterização de misturas, como pode ser visto, no RMN de 1H DOSY da mistura de L-aminoácidos (Figura 1), onde se pode dizer que as
Figura 1. RMN de 1H DOSY (499,87 MHz, D
2O, 25 ºC) de uma mistura de L-
aminoácidos: (■)Fenilalanina (MM = 165,19 g.mol-1), (■) treonina (MM = 119,12 g.mol -1), (■) glicina (MM = 75,07 g.mol-1) e (■)água (MM = 18,01 g.mol-1).
O conceito de difusão molecular ou a autodifusão é definido como o movimento aleatório ou movimento browniano de uma espécie em um fluido, devido à energia térmica do sistema. Em uma solução a difusão molecular (D) pode ser entendida como uma relação entre o deslocamento quadrático médio (𝑍2) de uma
partícula, durante um período de tempo (t) (Equação 1).9
< 𝑍
2>= 2 𝐷 𝑡
(1)
Este conceito, como Adolf E. Fick descreveu em seus postulados, também pode ser entendida como um fluxo de matéria (J), quantidade de matéria (c) por unidade de área, em função da posição da partícula e do tempo (Equação 2).
𝐽
(𝑥,𝑡)= 𝐷
𝛿𝑐𝛿𝑥(𝑥,𝑡)(2)
Em experimentos de determinação da difusão por RMN de estado líquido, os movimentos detectáveis são os provenientes do movimento translacional das
moléculas, que podem ser estimados através dos valores de coeficiente de difusão (D).
Este parâmetro é dependente de variáveis como a temperatura (T), viscosidade () e o raio hidrodinâmico (RH) que são correlacionados pela relação de
Stokes-Einstein conforme apresentada pela equação 3, onde k é a constante de Boltzmann.10 Esta equação apesar de não descrever de forma mais apropriada o
coeficiente de difusão para moléculas pequenas, por se pautar, em considerações onde as espécies descritas devem ser esferas solvatadas em um meio continuo, esta apresenta boas aproximações e é usualmente aplicada com sucesso.11
𝐷 =
𝑘 𝑇
6 ƞ 𝜋 𝑅
𝐻 (3)As medidas dos coeficientes de difusão por RMN são fundamentadas em sequências de pulsos de radiofrequência e de gradientes de campo pulsado, com o objetivo de gerar ecos estimulados que, por sua vez, atuam modulando a magnetização e possibilitando a análise dos efeitos difusivos. Apesar dos muitos avanços que ocorreram no desenvolvimento de novas sequências para o estudo da difusão de um sistema de interesse, estas podem ser entendidas através de dois blocos de sequências modelos, as de eco de spin com gradiente de campo pulsado (PFGSE) e eco de spin estimulado (PFGSTE).12
Detalhando melhor a PFGSE e seus processos de transferência de magnetização, esta sequência consiste em um bloco de ecos de spin (𝜏 - 180º - 𝜏), somados a dois pulsos de gradiente de campo, um antes e outro depois do pulso de 180o (Figura 2) que tem por finalidade investigar a atenuação do sinal quando esta é
submetida a variação da amplitude do campo.
Nesta sequência, primeiramente um pulso de radiofrequência de 90º transfere a magnetização para o plano xy, onde é codificado por um pulo de gradiente evoluindo por um tempo 𝜏 até a aplicação de um pulso de 180º que refocaliza a magnetização (eco) e, com a aplicação do segundo pulso de gradiente ocorre a decodifica da magnetização possibilitando a análise do movimento translacional das espécies pela variação da intensidade do sinal com a variação da amplitude do gradiente.13
Figura 2. Sequência eco de spin com gradiente de campo pulsado (PFGSE).
Em uma condição hipotética onde não se tem presente o efeito da difusão e desconsiderando os efeitos de relaxação e convecção, após o segundo tempo 𝜏, tem-se a total focalização do offset e do acoplamento escalar resultando em sinais sem perdas de intensidades. Já na presença da difusão, esta atua sobre a magnetização à ser detectada, ocorrendo a refocalização parcial da magnetização, o que resulta na atenuação da intensidade dos sinais (Figura 3).14
Figura 3. Esquema da magnetização na presença da difusão em um experimento de PFGSE.
Como resultado tem-se uma série de espectros 1D onde as variações nas intensidades dos sinais são dependentes da variação na amplitude do gradiente de campo utilizado, como pode ser visto na Figura 4 para uma mistura de aminoácidos.
Figura 4. Gráfico da intensidade dos sinais em função da força de gradiente realizado em uma mistura de aminoácidos.
Sendo que, através da equação de Stejskal-Tanner (Equação 4), é possível traçar um perfil da intensidade do sinal pela amplitude do gradiente de campo aplicado, possibilitando o cálculo do coeficiente de difusão.
𝐼 = 𝐼
0
𝑒
−𝐷𝛾
2𝛿
2𝑔
2(𝛥−
𝛿3−
𝜏2
)
(4)
Esta equação além de correlacionar os valores de intensidade do sinal (𝐼) e intensidade do sinal inicial (𝐼0) com o coeficiente de difusão (D), também
correlaciona, a razão magnetogírica do núcleo (𝛾), duração do pulso de gradiente (𝛿), amplitude do gradiente de campo (𝑔) e o tempo da difusão (Δ). 15
As sequências de eco de spin com gradiente de campo pulsado, apesar de determinarem com uma certa eficiência os valores de coeficientes de difusão, apresentam uma série de desvantagens como, perdas de magnetização por relaxação transversal, principalmente para macromoléculas onde o T2 é curto, a existência de
artefatos oriundos das correntes de vórtice (Eddy currents) gerados pelos gradientes de campo pulsado, efeitos de J-modulation, entre outros.13
Assim, uma variação das sequências de eco de spin (PFGSE) são as sequências de eco de spin estimulado que também atuam refocalizando a magnetização atenuada para determinação dos efeitos difusivos, porém, agora através de três pulsos duros de 90º onde o segundo é responsável por transferir a magnetização para o eixo z (paralelo ao campo magnético B0), onde vai se difundir
por um tempo 𝜏, até a aplicação do terceiro pulso de 90º que somado ao segundo gradiente G1 vai transferir a magnetização para o plano xy refocalizando o
acoplamento e o offset (Figura 5).
Uma das principais vantagens desta sequência, quando comparada com as PFGSE, é a redução das perdas de sinais pela relaxação spin-spin (T2), pelo fato
da magnetização permanecer no eixo z durante o tempo de difusão (Δ) e a minimização dos J-modulation.
Figura 5. Sequência eco estimulado (PFGSTE).
Atualmente, a grande maioria dos experimentos de medidas de difusão por RMN são baseados nas sequências Oneshot (Figura 6), onde é possível realizar medidas de difusão aplicando um único transiente para cada amplitude de gradiente utilizada. 16
Estas são constituídas por dois blocos de eco estimulado, somados a gradientes de campo pulsados onde, como nas sequências de PSGTSE, evoluem suas magnetizações no eixo z durante o tempo de difusão minimizando as perdas por T2. A sequência Oneshot ainda apresenta como vantagens sobre as demais
sequências descritas, a minimização das correntes de vórtice com o emprego de gradientes de campo pulsados com polaridade invertida, bem como, o fato de não precisarem de ciclagem de fase para realizar a seleção dos caminhos de coerência, apresentando baixos tempos de experimento, usualmente 20 minutos.17
Esta sequência também apresenta uma diminuição dos artefatos gerados nos experimentos de difusão, por fazer uso de um pulso de purga (Gp), durante o
tempo Δ, e dois pares de pulsos bipolares de gradiente (G1), aplicados de forma
desbalanceada entre o pulso de 180º (1 - α e 1 + α), onde, ambos, têm por finalidade eliminar as magnetizações residuais que não são refocalizadas pelos pulsos duros de 90º e 180º, respectivamente, melhorando a qualidade dos espectros obtidos. Outros
pulsos importantes são os de balanceamento (2α), que tem como principal função reestabelecer o sinal do LOCK perdido durante a aplicação dos pulsos bipolares desbalanceados.
Figura 6. Sequência Oneshot e Oneshot45.
Apesar das vantagens citadas, estas sequências apresentam, assim como as demais, efeito de J-modulation, o que é extremamente indesejável para os experimentos de difusão, por promover imprecisões na determinação dos coeficientes de difusão.Neste contexto, A. Botana e colaboradores propuseram a adição de um pulso duro de 45º imediatamente antes da aquisição, com a finalidade de anular os termos antifásicos, que contribuem para geração dos efeito de J-modulation, dando origem a sequência adaptada denominada Oneshot45.18
Entretanto, à utilização desta sequência Oneshot45 só se faz interessante para amostras que apresentarem sinais próximos no espectro de RMN caso contrário é preferível a utilização da sequência convencional pelo fato de ser mais sensível.
Quando se trata de aplicações da técnica DOSY, esta vem se apresentando como uma poderosa e frutífera ferramenta, para determinação do tamanho de moléculas e agregados,19,20,21 estudo do grau de empacotamento de
macromoléculas,22 investigação de interações intermoleculares23 e estudo de
dinâmica molecular.24 Além da aplicabilidade para o estudo de misturas auxiliando na
caracterização de compostos.25,26 Porém, esta última ainda apresenta uma série de
1.2. 19F DOSY
Ainda hoje, uma das limitações da técnica DOSY para análise de misturas que prejudica na exatidão de determinação dos coeficientes de difusão e, muitas vezes, a inviabiliza é a sobreposição de sinal. Uma estratégia para resolver este problema é a escolha de sequências com desacoplamento homonuclear, como as sequências de pure-shift.27
Essas são particularmente interessantes pelo fato de simplificarem os espectros, trazendo apenas uma única frequência (singleto) para cada núcleo de 1H
por exemplo, eliminando as sobreposições dos sinais oriundas do acoplamento escalar homonuclear e, por consequência, evitando ou reduzindo a sobreposição de sinais.28,29 Porém, as mesmas ainda apresentam algumas limitações, como baixa
sensibilidade, geração de artefatos para sistemas fortemente acoplados e a não diferenciação de hidrogênios geminais.30
Outra alternativa é a escolha de outros núcleos ativos em RMN, como por exemplo o 19F, que além de possuir momento angular de spin nuclear (𝐼⃗) diferente de
zero, também tem a vantagem de ser um núcleo com absoluta abundancia natural, 100%.
Outras características relevantes para a utilização de 19F como alternativa
para experimentos de 1H DOSY é a ampla faixa de deslocamento químico observado
para o núcleo de 19F, que é da ordem de 400 ppm, sendo muito superior à faixa
utilizada para 1H, que é da ordem de 15 ppm. Além disso, o núcleo de 19F possui um
valor alto de (25.18x107 rad T-1 s-1) tornando a codificação do processo de difusão
mais eficiente, uma vez que a variação da difusão depende de , como visto na equação Stejskal-Tanner descrita acima (Equação 4).31
Em suma, pelas vantagens citadas, somada à crescente presença do átomo de flúor em diversas áreas da química, destacando-se no desenvolvimento de novos fármacos (classe que representa 25% dos fármacos comercializados atualmente32), a técnica de 19F DOSY pode ser uma estratégia poderosa para análise
de misturas fluoradas, contribuindo na geração de conhecimento, para que se estabeleçam procedimentos modernos33 para os estudos de degradação34 e controle
Outra limitação da técnica DOSY para separação de compostos em mistura, é quando se têm espécies com raios hidrodinâmicos semelhantes, como no caso de isômeros de posição e diastereoisômeros. Estes, por possuírem tamanhos e formas semelhantes, apresentam coeficientes de difusão semelhantes não sendo possível a separação na dimensão da difusão, o que interfere na eficiência dos experimentos. Neste cenário, uma interessante estratégia é o emprego da metodologia de DOSY assistida por matriz (MAD), a qual é objeto de estudo no presente projeto.
1.3. MATRIX-ASSISTED DOSY
Em misturas reais, podemos ter espécies químicas, como por exemplo, isômeros de posição, que possuem coeficientes de difusão bem próximos, prejudicando a separação e, por consequência, a resolução dos experimentos.36
Neste cenário uma estratégia que vem sendo cada vez mais empregada é a adição de uma matriz ao meio, com a função de interagir com esses compostos alterando os respectivos raios hidrodinâmicos e modificando seus coeficientes de difusão.A essa abordagem se dá o nome de MAD (do inglês, Matrix-Assisted DOSY).37,38
Essa matriz é comumente uma espécie de peso molecular médio (acima 200 g mol-1), que pode ser escolhida ou modulada, determinando seus padrões de
substituição, conforme as características do seu analito (solubilidade, tamanho, forma, pKa, entre outros) e do tipo de interação desejada (interações hidrofílicas, lipofílicas, enantioespecífica, entre outras).39 Estas podem ser de naturezas diversas, tais como,
surfactantes,40 supramoleculas,41 polímeros,2 nanocompostos,42 sílica sol43 e agente
estrogênico.44
Atualmente, a metodologia MAD é aplicável a uma diversidade de analitos onde pode-se exemplificar alguns trabalhos como a diferenciação de isômeros de posição pela adição de surfactantes como relatado por Tormena e colaboradores45 e
até a separação virtual de epímeros utilizando a β-ciclodextrina como matriz.41 Outras
matrizes no qual podem ser visto trabalho utilizando a metodologia são em mistura de produtos naturias40 e análise de uma mistura racêmica 2-metilpiperidina utilizando
Neste trabalho, nos aprofundaremos nos estudos e discussões da aplicação de espécies anfifílicas, como os surfactantes, para as análises de isômero de posição para sistemas aromáticos contendo o átomo de flúor, empregando medidas de difusão.
Os surfactantes, quando acima da sua concentração micelar crítica (CMC) formam micelas que interagem diferentemente com cada componente da mistura. Essa interação ocorre através de um equilíbrio dinâmico entre micela, soluto e solvente alterando a mobilidade das espécies e, por consequência, tornando possível a separação destas na dimensão da difusão. Quanto maior a interação da micela com o soluto, maior será a variação dos processos difusivos referentes ao soluto (ou espécies em estudo), o que reflete, nos coeficientes de difusão.46
Assim o coeficiente de difusão observado (𝐷𝑜𝑏𝑠.) vai ser uma relação do equilíbrio dos coeficientes das espécies solvatadas (𝐷𝑠𝑜𝑙𝑣. ) pelo das espécies complexadas (𝐷𝑐𝑜𝑚𝑝. ) onde 𝑓𝑏 é a fração molar complexada. Tal relação é dada pela Equação 5. 47
𝐷
𝑜𝑏𝑠= ( 1 − 𝑓
𝑏) 𝐷
𝑠𝑜𝑙𝑣+ 𝑓
𝑏𝐷
𝑐𝑜𝑚𝑝 (5)Através desta relação, pode-se inferir alguns parâmetros termodinâmicos da interação micelar como: a fração molar complexada (fb) e a constante de
complexação ou associação (𝐾𝑐𝑜𝑚𝑝.), dadas pelas equações 6 e 7, respectivamente.48
Onde, [𝑠𝑢𝑟𝑓𝑎𝑐𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒] e [𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜]é a concentração do surfactante e do soluto respectivamente.
𝑓
𝑏=
𝐷𝑜𝑏𝑠.− 𝐷𝑠𝑜𝑙𝑣.𝐷𝑐𝑜𝑚𝑝.− 𝐷𝑠𝑜𝑙𝑣. (6)
𝐾
𝑐𝑜𝑚𝑝.=
𝑓𝑏[(1 − 𝑓𝑏) ([𝑠𝑢𝑟𝑓𝑎𝑐𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒] − 𝑓𝑏 . [𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜]) (7)
Este equilíbrio é dependente da temperatura, pressão, concentração das espécies e variação de pH, sendo de extrema importância o conhecimento do ambiente químico em questão, para a obtenção de espectros com resolução
adequada e sucesso nas análises. Essas variáveis podem ser trabalhadas buscando a otimização da interação do surfactante com as espécies da mistura, aumentando a eficiência da separação.49
Além do que já foi abordado acima, a escolha do núcleo de 19F somado a
técnica MAD se faz interessante pelo fato do surfactante não possuir átomos de flúor e, por consequência, não apresentaria sinais de background nos espectros evitando a sobreposição de sinais.50
1.4. SURFACTANTES E AGREGADOS ESTRUTURADOS
Os surfactantes são espécies anfifílicas que, quando acima de sua CMC, se auto associam, através de interações hidrofóbicas, formando agregados estruturados denominados, micelas. Em específico, os surfactantes iônicos são constituídos por uma parte polar, hidrofílica, onde se concentra uma densidade de carga negativa (para os surfactantes aniônicos) ou positiva (para surfactantes catiônicos) e uma cadeia carbônica apolar, com características hidrofóbicas.
Figura 7. Representação de um surfactante iônico.
Os surfactantes podem assumir diversas morfologias (Figura 8), de acordo com parâmetro de empacotamento crítico, o CPP (do inglês, Critical Packing
Parameter), que correlaciona o volume ocupado (𝑣𝑐.𝑝𝑜𝑙𝑎𝑟) pela cadeia apolar versus a
área da cabeça polar (𝑎𝑐.𝑝𝑜𝑙𝑎𝑟) vezes o comprimento da cadeia apolar ( 𝑙𝑐.𝑎𝑝𝑜𝑙𝑎𝑟).
𝐶𝑃𝑃 =
𝑣𝑐.𝑝𝑜𝑙𝑎𝑟𝑎𝑐.𝑝𝑜𝑙𝑎𝑟 𝑙𝑐.𝑎𝑝𝑜𝑙𝑎𝑟 (8)
O CPP para surfactante iônicos é diretamente ligado à força iônica do meio e às características dielétricas do solvente, assim, quanto maior o CPP maior a
tendência de a micela assumir agregações cilíndricas (Figura 8B) e lamelares (Figura 8C).51
Surfactantes catiônicos, em particular, também podem assumir uma estrutura singular denominada micela gigante (Figura 8D). Estas são estruturas cilíndricas alongadas e flexíveis, com características viscoelasticas particulares, que podem se formar quando se tem a adição de co-solutos ou aumento da força iônica do meio. Os co-solutos atuam diminuindo a repulsão eletrostática das cabeças polares, favorecendo o alongamento desta agregação. 52,53
Figura 8. Representação de algumas formas de agregação dos surfactantes: A) Esférica, B) Cilíndrica, C) Lamelar e D) Micela gigante. adaptado de54,55
Em surfactantes iônicos, a distribuição da densidade de carga no meio micelar pode ser descrito pelo modelo da dupla camada elétrica (Figura 9), onde se tem o núcleo micelar (A), seguido da camada de Stern, que é composta pela cabeça polar e seus contraíons (B) e a camada de Gouy-Champman ou camada difusa (C).
Na camada de Stern, tem-se a predominância de íons de carga oposta à cabeça polar, que se encontram fortemente ligados a esta superfície carregada, já na camada de Gouy-Champman, tem-se os íons distribuídos segundo Boltzmann. Em outras palavras, na região C os íons se encontram em equilíbrio com a solução por já não sentirem tanto o efeito da superfície carregada.56
Figura 9. Representação esquemática da dupla camada elétrica de um surfactante catiônico: A) núcleo da micela, B) Camada de Stern e C) Camada de Gouy-Champman.Adaptado de51
2. OBJETIVO
O presente trabalho tem por objetivo desenvolver uma metodologia, pela técnica 19F Matrix-Assisted DOSY, para análise de misturas de compostos
organofluorados, através do estudo de misturas de fluorofenois e fluoroanilinas, utilizando um surfactante catiônico, brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), como matriz.
Figura 10. Estruturas dos compostos estudados.
3. PARTE EXPERIMENTAL
As amostras foram preparadas a partir de compostos comerciais de orto-, meta- e para-fluorofenol, orto-, meta- e para-fluoroanilina e o surfactante CTAB sem prévia purificação, utilizando como solvente água deuterada. A escolha dos isômeros de fluorofenois (ácidos fracos) e fluoroanilinas (bases fracas) foram realizadas como modelo de compostos aromáticos fluorados.
Primeiramente, foram preparadas soluções estoques em água deuterada de cada composto fluorado, bem como do surfactante catiônico sendo estes posteriormente misturados diretamente em um tubo de RMN com 5 mm de diâmetro (com exceção dos estudos de convecção que também foram utilizados tubos de 3 mm), nas concentrações específicas de cada experimento mantendo quantidades
equimolares para as espécies fluoradas e um volume constante de 0,8 mL. As amostras foram preparadas sem adição de referência interna, que no caso de água deuterada é usualmente utilizado o TMSP-d4 (2,2,3,3-d4-3-(trimetilsilil)propionato de
sódio), para evitar interferências no equilíbrio dinâmico do sistema micelar, sendo assim, a homogeneidade do campo foi ajustada pelo sinal da água.
As amostras foram agitadas em um vortex e aquecidas em banho maria (30
oC), para assegurar uma maior homogeneidade do sistema, sendo analisadas no
mínimo 12 horas depois do preparo. Pelo fato da temperatura Krafft do CTAB ser de 26,46 oC (para uma concentração de 137 mM)57, escolheu-se trabalhar na
temperatura 30 oC, para garantir a formação das micelas58.
Para os estudos com variação de pH, foram preparadas soluções estoque em água deuterada de hidróxido de sódio e ácido bromídrico, com as respectivas concentrações de 185,36 mM e 247,10 mM. As medidas de pH foram realizadas com um pHmetro SP1800, da marca Sensoglass, acoplado a um eletrodo de membrana modelo Spintrode, da marca Hamilton, onde esperou-se um tempo de 2 min. para estabilização do equipamento. As medidas de pH, com exceção do experimento específico de medidas do pH do CTAB, foram determinadas antes da adição do surfactante.
Os espectros de 1H, 19F, 1D ROESY seletivo, 1D NOESY seletivo, 1H DOSY e 19F DOSY foram realizados nos espectrômetros Bruker Avance-III de 11,74 Tesla com
uma sonda BBO SmartProbe e Bruker Avance-III de 14,08 Tesla com sonda TBI para o núcleo de 1H e TBO para o núcleo de 19F ambos equipados com uma bobina de
gradiente-z gerando um gradiente nominal máximo de 55 G cm-1.
Com relação aos parâmetros de aquisição dos experimentos de difusão, foram fixados os parâmetros de duração do pulso de purga (p19) e o delay para recuperação do gradiente (d16) respectivamente em 0,2 e 0,6 ms, tal como o número de scans (ns) maior que 16.59 Também se teve a preocupação em manter a potência do
desacoplador (plw12) em 0,1 W para minimizar os efeitos de convecção.
Nos experimentos de 19F DOSY foi utilizada a sequência Oneshot adaptada
para a detecção em 19F (Figura 11a),60,61,62 já para os experimentos 1H DOSY foi
utilizada a sequência Oneshot45 (Figura 11b),Erro! Indicador não definido. que elimina os feitos de J-modulation gerados pelos termos antifásicos durante o tempo de eco (), como descrito acima.
Para a aquisição dos espectros de ROESY e NOESY foram calibrados, para cada amostra, o pulso duro de 90° e os seletivos de 180º (pulso gaussiano de inversão, Gaus1_180i.1000), garantindo a seletividade do experimento. Estes foram otimizados realizando aquisições com variação dos valores de tempo de mistura (do inglês, mixing time), onde se encontrou a melhor condição fixando o parâmetro em 400 ms, tanto para os fluorofenois quanto para as fluoroanilinas.
Nos experimentos de ROESY seletivo, por se utilizar uma sequência com trava de spins (ou do inglês, spin lock), o qual são conhecidos por levar ao aquecimento da amostra, teve-se a preocupação de adquirir 32 varreduras as quais foram descartadas (dummy scans), antes de iniciar a coletas das varreduras de interesse, objetivando garantir que o sistema alcançasse o equilíbrio térmico.
Figura 11. Sequências de pulso utilizadas: a) Oneshot para 19F e b) Oneshot45 para
1H.
Os dados de 1H e 19F DOSY foram processados com dois zeros filling, uma
largura de linha (Lb) de 5 Hz e 10 Hz, respectivamente, sem deconvolução pela referência (do inglês, reference deconvolution) utilizando o programa DOSYtoolbox.63
Os erros apresentados foram estimados pelo fitting da curva da intensidade do sinal pela amplitude do gradiente calculado pelo software, onde, considerou-se que as espécies estavam separadas quando os coeficientes de difusão somados com seus respectivos erros estáticos não se sobrepunham. Para os espectros de 1H, 19F,
ROESY seletivo e NOESY seletivo foi utilizado o programa TopSpin 3.1 da Bruker. Neste trabalho, também foram determinados, teoricamente, os valores de momentos de dipolo, tal como, os mapas de potenciais eletrostáticos das estruturas otimizadas de fluorofenois e fluoranilinas (formas neutras e ionizadas), utilizando o
software Gaussian 0964, no nível de teoria e base M062x/aug-cc-pVTZ. Estes valores
foram utilizados para fundamentar os resultados experimentais de variação de pH.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Para a avaliação da eficácia do CTAB como uma matriz de separação para os experimentos de MAD, foram realizados uma série de estudos, variando a concentração do surfactante, concentração de co-solutos, temperatura, basicidade e acidez do meio.
Como uma etapa da otimização do preparo de amostras, se avaliou a difusão em função do tempo de uma mistura de 5 mM de cada fluorofenol na presença de 50 mM de CTAB e constatou-se que o sistema micelar atinge o equilíbrio termodinâmico após as primeiras horas de experimento apresentando variações sutis que não interferem na ordem dos valores dos coeficientes de difusão das espécies (Figura 12). Esta análise foi realizada sem tirar o tubo do espectrômetro Bruker Avance-III de 11,74 Tesla adquirindo experimentos de difusão inicialmente de hora em hora, passando a adquirir de seis em seis horas depois das doze primeiras horas. A etapa de preparo da amostra até a primeira aquisição foi de 35 min.
Figura 12. Coeficientes de difusão (19F) em função do tempo para uma amostra
contendo 5 mM de cada fluorofenol na presença de 50 mM de CTAB. (vide valores de coeficiente no Anexo 28).
Posteriormente, utilizando medidas de difusão por RMN, determinou-se experimentalmente, pelo gráfico do inverso da concentração versus a difusão do surfactante, a CMC do CTAB (Figura 13). Esta análise, utilizando o inverso da concentração para determinação do CMC, é usualmente realizada para facilitar a observação do ponto crítico.65
Figura 13. Coeficiente de difusão (1H) em função do inverso da concentração do
CTAB.
Apesar dos erros de processamento se encontrarem na segunda casa decimal o valor do CMC, obtido pela intersecção das (1,07 mM) corrobora com a literatura (1,04 mM para temperatura de 30 oC)Erro! Indicador não definido..
Como mencionado na parte experimental, para garantir a formação de micela os estudos foram realizados bem acima da CMC e da temperatura krafft, os quais podem ser ainda menores com a adição de co-solutos. Outra informação relevante sobre o CTAB é que esse surfactante forma micela com aproximadamente 80 monômeros57, correspondendo um raio hidrodinâmico de aproximadamente de 3
4.1. OTIMIZAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES MICELA/SOLUTO
4.1.1. EXPERIMENTO DE VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CTAB
Primeiramente, avaliou-se a variação do efeito da concentração da espécie anfifílica no meio, realizando-se uma serie de experimentos de 19F DOSY aumentando
a concentração molar de CTAB em amostras com concentrações constantes de 5 mM de cada fluorofenol (Figura 14a) e 5 mM de fluoroanilina (Figura 14b).
Nas amostras com alta proporção molar micela/soluto (acima de 75 mM) ocorre diminuição na eficiência da diferenciação entre as espécies, o que pode ser provocado pelo efeito de saturação do meio. Para os experimentos com as fluoroanilinas, tem-se uma boa separação durante toda faixa de concentração analisada.
Figura 14. Coeficientes de difusão (19F) em função da concentração de CTAB a) para
amostras contendo 5 mM de cada fluorofenol e b) para amostras contendo 5 mM de cada fluoroanilina.
Como esperado pela equação de Stokes-Einstein (Equação 3), os isômeros de fluorofenois livres, por possuírem raios hidrodinâmicos semelhantes, apresentaram coeficientes de difusão bem próximos, não sendo possível a diferenciação entre as espécies na dimensão da difusão (Figura 15a). Já em experimentos com a adição de 50 mM de CTAB na solução (Figura 15b) é verificado que a matriz interage diferentemente com ambos isômeros modificando a difusão dos mesmos.
Como pode ser observado pelo espectro de 19F DOSY, essa interação
soluto/micela ocorre de maneira diferente para cada fluorofenol. Sendo a interação mais forte (m-FF > p-FF > o-FF) a que origina a seguinte tendência (Tabela 1) para os coeficientes de difusão (Dorto > Dpara > Dmeta).
Figura 15. Espectros de 19F{1H} DOSY (470,29 MHz, D
2O, 30 ºC), com o espectro
(topo) de 19F 1D menos atenuado, para a amostra com 5 mM de cada fluorofenol a)
sem CTAB e b) com 50 mM de CTAB.
O CTAB também se mostra eficaz como um agente de separação para uma mistura de isômeros de fluoroanilinas, porém interagindo de forma diferente com as
especies (m-FA > o-FA > p-FA), o que pode ser visto, pelos coeficientes de difusão (Tabela 1) da Figura 16 (Dpara > Dorto > Dmeta).
Figura 16. Espectro de 19F{1H} DOSY (470,29 MHz, D2O, 30ºC), com o espectro (topo)
de 19F 1D menos atenuado, para a amostra com 5 mM de cada fluoroanilina a) sem
CTAB e b) com 50 mM de CTAB.
A Tabela 1 apresenta os valores dos coeficientes de difusão medidos e os erro, os quais confirmam que antes da adição de CTAB não havia separação entre as especies.
Tabela 1. Coeficientes de difusão da amostra com 5 mM de cada fluorofenol e 5 mM de cada fluoroanilina sem CTAB e com 50 mM de CTAB.
Fluorofenois
D / 10-10 m2 s-1
Fluoroanilinas
D / 10-10 m2 s-1
Isômeros Sem CTAB Com CTAB Sem CTAB Com CTAB
orto 8,89 ± 0,09 2,58 ± 0,04 9,12 ± 0,08 4,15 ± 0,04
meta 8,71 ± 0,08 2,03 ± 0,02 9,44 ± 0,08 3,31 ± 0,03
para 8,72 ± 0,08 2,29 ± 0,02 9,15 ± 0,08 4,46 ± 0,03
É digno de citação, que esta tendência de interação, tanto para os fluorofenois quanto para as fluoranilinas (Tabela 2), refletem os valores de constante de partição (𝐾𝐷𝑜) que é comumente relatado como log P, onde, quanto maior o log P
ou o caráter lipofílico atribuído às espécies, maior vai ser a preferência de interação com a micela do que solvatação pela água.
Tabela 2. Valores de constante de partição (log P) obtidos através do programa
ACD/labs.1
Isômeros Fluorofenois Fluoroanilinas
orto 1,71 1,27
meta 1,93 1,39
para 1,77 1,15
Este parâmetro, a constante de partição, é definida como a razão da atividade de uma espécie em duas fases em equilíbrio (Equação 8), uma orgânica (org.) e a outra aquosa (aq.)67, sendo bem difundida na área de química medicinal por
correlacionar as propriedades estruturais e físico-químicas de um compostos com solubilidade e permeabilidade dos mesmo em sistema biológicos podendo, por consequência, ser usado para fazer predições sobre a atividade farmacológica dessas espécies auxiliando no desenvolvimento de novos drogas.68, 69
𝐾
𝐷𝑜=
𝑎𝑎𝑜𝑟𝑔.𝑎𝑞. (8)
Quando se compara os valores relativos dos coeficientes de difusão das moléculas organofluorados sem e com a adição de matriz, pode-se inferir que os isômeros de fluorfenois apresentam maior interação com a as espécies anfifílica do que as fluoranilinas, maior diferença entre os coeficientes, o que respeita a correlação com os valores de lipofilicidade.
Em um segundo momento, aqui neste trabalho, extrapolou-se a metodologia 19F MAD para o estudo de uma mistura com os 6 isômeros na presença
de CTAB (Figura 17a) constatando as mesmas tendências de separação das espécies de quando analisadas separadamente (vide valores dos coeficientes no Anexo 33).
1 Estes valores podem ser tanto calculados por programas, como o ACD/labs, que usam aproximações
pelos parâmetros de Hansch-Fujita quanto experimentalmente através de uma partição do composto de interesse entre dois líquidos imiscíveis, usualmente octanol e água. Como a determinação desses valores não são objetos de estudo deste trabalho sendo utilizados como aproximações para a explicação da tendência de separação dos experimentos de MAD optou-se por utilizar valores calculados.
Os principais pontos do experimento 19F MAD a serem ressaltados é que, apesar do
aumento da complexidade na dinâmica das interações, se observou uma boa resolução do espectro, tal como, a diferenciação das espécies no âmbito da difusão, o que permite se inferir sobre quantos compostos estão presentes em solução atribuindo-os pelo tipo e força de interação com a matriz anfifílica. Esse tipo de avaliação seria praticamente impossível de ser feita empregando experimentos de RMN de 1H DOSY (Figura 17b), sem e com a adição da matriz CTAB, pelo fato da
região dos aromáticos (entre 6 e 8 ppm em 1H) apresentarem muita sobreposição de
sinais.
Figura 17. a) Espectro de RMN 19F{1H} DOSY (470,29 MHz, D
2O, 30 ºC), com o
espectro (topo) de 19F 1D (sem surfactante) menos atenuado, para a amostra com os
5mM de cada isômero de fluorofenol e 5 mM de fluoroanilina na ausência (contorno
preto) e presença de 50mM de CTAB (contorno colorido) e b) Espectro de RMN 1H
DOSY (600,17 MHz, D2O, 30 ºC), com o espectro (topo) de 1H 1D (sem surfactante)
menos atenuado, para a mesma amostra usada no 19F{1H} DOSY.
Associações semelhantes que correlacionam as interações observadas nos experimentos de MAD com valores de log P foram relatadas por Tormena e colaboradores, onde se descreveu, através de uma correlação linear entre valores de difusão e o log P, a eficiência de um surfactante aniônico, o dodecil sulfato de sódio (SDS), como matriz de separação de amostras contendo isômeros de metóxi-fenol, butanol e pentanol.70 Apesar da necessidade de maiores investigações para
deste parâmetro para previsão das separações entre isômeros de posição empregando a metodologia MAD.
4.1.2. EXPERIMENTO DE VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS ISOMEROS FLUORADOS
Afim de investigar melhor o sistema em questão variou-se a concentração de fluorofenois e fluoroanilinas com uma concentração constante de 50 mM de CTAB. Neste experimento observou-se uma boa separação virtual na dimensão da difusão nas concentrações de 5 mM e 10 mM para casa um dos fluorofenois e para toda a faixa testada para as fluoroanilinas (Figura 18).
Figura 18. Coeficientes de difusão (19F) em função da concentração de fluorados em
50 mM de CTAB: a) variando a concentração dos isômeros de cada fluorofenol e b) variando a concentração dos isômeros de cada fluoroanilina.
A saturação do meio micelar pelo aumento das concentrações de organofluorados favorece o equilíbrio dos fluorofenois e fluoroanilinas na sua forma livre o que justificaria o aumento dos coeficientes de difusão observado, já que essa constante é a somatória da difusão solvatadas com a difusão complexada.
Algo a se ressaltar, nos dois experimentos (tanto para as fluoranilinas quanto para os fluorfenois), é a mudança das tendências de interação quando se têm concentrações acima de 50 mM de cada um dos 3 isômeros de posição, totalizando 150 mM. Isso se dá, provavelmente, pela mudança do estado de agregação dos surfactantes que quando em altas concentrações do soluto, esses atuam diminuindo a repulsão eletrostática entre as cabeças polares aumentando o grau de
empacotamento das micelas, CPP, o que poderia afetar a força de interação fluorados/micela71.
Uma evidência desse fenômeno pode ser vista pela mudança do perfil dos sinais do surfactante em amostra com aumento da quantidade de fluorofenois nas respectivas ampliações dos espectros de RMN de 1H (Figura 19).
Figura 19. Ampliação na região do surfactante dos espectros de RMN de 1H (499,87
MHz, D2O, 30ºC) para mistura de 50 mM de CTAB variando a concentração dos
isômeros de fluorofenol.
Este alargamento também pode ser observado nos sinais referentes ao CTAB, para as amostras com aumento de fluoroanilinas (Figura 20), onde se observa um perfil espectral muito parecido, se comparado às condições equivalentes como em 10 mM e 50 mM de cada fluorado.
Figura 20. Ampliação na região do surfactante dos espectros de RMN de 1H (499,87
MHz, D2O, 30ºC) para mistura de 50 mM de CTAB variando a concentração dos
isômeros de fluoroanilina.
Em RMN, sinais alargados acontecem quando se tem tempos de relaxação transversal (T2) curtos que, por sua vez, são atribuídos a moléculas com peso
molecular grande, ou devido ao aumento da viscosidade do meio (Figura 21), sendo que essas duas características o sistema poderia estar assumindo.72
Comparando com a literatura, um trabalho que poderia fundamentar a hipótese foi o desenvolvido por W. Zhang e colaboradores onde se mostrou que em experimentos com o aumento da concentração de KBr a uma concentração fixa de CTAB os raios hidrodinâmicos e de giro (determinado por medidas de espalhamento de luz) aumentam resultando no alargando os sinais do surfactante nos espectros de
Figura 21. Tempos de relaxação T1 e T2 versus tempo de correlação (Ƭc).Adaptado de 74
Outro resultado curioso observado neste experimento de variação da concentração de fluorados foi o aumento do valor de coeficiente de difusão do CTAB, determinado por 1H DOSY, após a concentração de 25 mM de cada isômero de
fluorofenol e cada isômero de fluoroanilina (Tabela 3). O que, a princípio, vai contra a hipótese que a mudança da ordem de interação estaria associada ao aumento do raio hidrodinâmico da micela.
Tabela 3. Coeficientes de difusão (1H) do CTAB para o experimento com variação da
concentração de cada um dos isômeros de fluorofenois e o experimento com variação da concentração de cada um dos isômeros de fluoroanilinas
Concentração de cada isômero fluorado
Fluorofenois D / 10-10 m2 s-1 Fluoroanilinas D / 10-10 m2 s-1 5 mM 0,48 ± 0,01 0,58 ± 0,01 10 mM 0,26 ± 0,01 0,57 ± 0,01 25 mM 0,12 ± 0,01 0,51 ± 0,01 50 mM 0,20 ± 0,01 0,61 ± 0,01
Salve as limitações da relação de Stokes-Einstein, que considera que as espécies são esferas contínuas, observa-se que as moléculas de CTAB estão
assumindo um regime de menor mobilidade de 5 mM para 25 mM de cada fluorado, porém em 50 mM observa-se uma inversão neste comportamento.
Uma possível justificativa, encontrada na literatura, para este desvio é que a saturação do meio micelar, pela adição de co-soluto, poderia orientar a formação de micelas gigantes que, posteriormente, com quantidades maiores deste co-soluto no meio micelar, se teria a formação de estruturas globulares, por exemplo, poderia ser favorecida, o que afetaria nos valores de difusão.75
Em suma, pelo exposto conclui-se que em 50 mM tem-se, tanto para amostras com fluorofenois quanto para as fluoroanilinas, um sistema diferente das demais concentrações, o que resulta em outros tipos de interações afetando a ordem de separação pela metodologia MAD, mas em toda a faixa de concentrações estudadas a metodologia se mostrou eficiente na diferenciação entre as espécies na dimensão da difusão, o que mostra seu alto potencial como ferramenta, para se determinar quantas e quais são as espécies químicas presentes na mistura.
4.1.3. ESTUDO DE ALGUNS PARÂMETROS DE INTERAÇÃO SURFACTANTE/COMPOSOTOS FLUORADOS
Pensando-se nas interações surfactante/co-soluto algumas informações interessantes que podem ser extraídas dos valores de difusão, como descrito na sessão introdutória, são os parâmetros de fração de complexação (𝑓𝑏), constante de complexação (𝐾𝑐𝑜𝑚𝑝.) e a estimativa das quantidades de moléculas presentes na micela (n). Para isso, além dos coeficientes difusão observados (𝐷𝑜𝑏𝑠.) e das espécies
solvatadas (𝐷𝑠𝑜𝑙𝑣) é necessário o valor da autodifusão da micela (𝐷𝑐𝑜𝑚𝑝).
Assim, em vias práticas, este valor de autodifusão pode ser aproximando pela regressão linear do gráfico do coeficiente de difusão em função do inverso da concentração do surfactante. Para o CTAB, esse valor obtido pela técnica DOSY é de 0,46 x10-10 m2 s-1 (Figura 22).
Figura 22. Coeficiente de difusão (1H) em função do inverso da concentração do
CTAB.
Assim, pela equação 6, é possível calcular os valores de fração molar complexada com o surfactante através dos coeficientes de difusão experimentais medidos de uma solução com os três isômeros fluorados em água deuterada sem surfactantes, para os coeficientes de difusão das espécies solvatadas (𝐷𝑠𝑜𝑙𝑣), o valor de 0,46 x10-10 m2 s-1, para o valor da autodifusão da micela (𝐷
𝑐𝑜𝑚𝑝), como descrito
acima, e as soluções com os isômeros fluorados na presença de CTAB nas concentrações de 25 mM, 50 mM, 75 mM e 100 mM, para os coeficientes difusão observados (𝐷𝑜𝑏𝑠.),
Como era de se esperar, o aumento da concentração de CTAB, aumenta a quantidade de sítios disponíveis para interação dos isômeros resultando no aumento na fração molar de fluorados complexado com a micela, como pode ser visto na (Tabela 4).
Avaliando este parâmetro podemos dizer que os fluorofenois interagem mais fortemente com o CTAB do que a fluoroanilinas, em outras palavras, temos uma maior quantidade de moléculas de fluorofenois complexadas com a micela do que de fluoroanilinas quando comparamos concentrações equivalentes.
Tabela 4. Fração molar complexada em função da concentração de CTAB para amostras contendo 5 mM de cada fluorofenol e para amostras contendo 5 mM de cada fluoroanilina.
Para o experimento de aumento das quantidades dos compostos fluorados com a concentração de CTAB constante se observa uma diminuição da razão complexada indicando que a saturação da micela, tanto para os fenóis quanto para as anilinas, leva as moléculas preferirem a fase aquosa depois da concentração de 50 mM (Tabela 5).
Concentração de CTAB
o-fluorofenol m-fluorofenol p-fluorofenol
25 0,57 0,65 0,60 50 0,75 0,82 0,79 75 0,86 0,90 0,87 100 0,89 0,92 0,90 Concentração de CTAB
o-fluoroanilina m-fluoroanilina p-fluoroanilina
25 0,40 0,48 0,38
50 0,59 0,67 0,58
75 0,66 0,76 0,65
Tabela 5. Fração molar complexada em função da concentração de cada fluorofenol e fluoroanilina com 50 mM de CTAB.
Calculando os valores de constante de complexação (𝐾𝑐𝑜𝑚𝑝.) para a condição ótima de 5 mM de cada fluoro isômero na presença de 50 mM de CTAB observa-se mais uma vez que, para os isômeros dos fenóis, o para está interagindo mais fortemente com o composto meta, segui do para e do orto apresentando as respectivas constante de complexação, 132,84; 107,13, 84,92, para as fluoranilinas o CTAB interage mais com o meta seguido do orto e posteriormente com o para fluoranilinas vide os respectivas constantes, 199,54; 143,88 e 138,11.
4.2. INVESTIGAÇÃO DOS EFEITOS DA CONVECÇÃO NOS EXPERIMENTOS DE DIFUSÃO
Uma investigação realizada concomitantemente com a otimização das concentrações micela/soluto, descrita acima, foram estudos de caráter qualitativo para a avaliação dos efeitos da convecção nos sistemas micelares abordados neste projeto.
A convecção, em vias gerais, pode ser entendida como um processo de transmissão de calor e matéria em que a energia térmica se propaga através do transporte de matéria, devido a uma diferença de densidade e a ação da gravidade.76
Este processo, segundo Swan e colaboradores, se faz presente em todos os
Concentração de fluorofenois
o-fluorofenol m-fluorofenol p-fluorofenol
5 0,77 0,88 0,83 10 0,76 0,84 0,80 25 0,64 0,70 0,66 50 0,48 0,53 0,49 Concentração de fluoroanilinas
o-fluoroanilina m-fluoroanilina p-fluoroanilina
5 0,57 0,69 0,56
10 0.54 0,65 0,53
25 0,50 0,57 0,48
experimentos de RMN para amostras em solução, cabendo a nós entendê-los, a fim de minimizá-los, ou simplesmente para considerarmos seus efeitos nas análises dos estudos por RMN. 77
Especificamente em experimento de DOSY, pelas medidas de difusão serem estritamente ligadas à mobilidade das espécies, este fenômeno pode introduzir consideráveis distorções nas análises, inserindo artefatos e superestimando os valores dos coeficientes de difusão.78
Uma das formas de se determinar este efeito é medindo a velocidade de convecção para o sistema em estudo, considerando os parâmetros do espectrômetro (sonda e sistema de controle de temperatura) e os parâmetros da amostra (temperatura, viscosidade do solvente, tipo de tubo e volume utilizado), porém esta abordagem quantitativa não se encontra no escopo do projeto tendo se restringindo aos efeitos da convecção que levaria a alteração no processo de diferenciação dos isômeros pela matriz. Assim, duas investigações realizadas foram a comparação dos experimentos de 19F DOSY em tubos de 3 mm (conhecidos por apresentarem efeitos
de convecção mínimos)77 e de 5 mm e experimentos variando a potência do
desacoplador (uma das principais fontes de inserção de gradientes de temperatura quando se tem experimentos desacoplados).
Nas medidas variando o diâmetro do tubo de amostra observa-se que os valores de coeficientes de difusão no tubo de 3 mm de diâmetro é relativamente menor do que no tubo 5 mm (Tabela 6), indicando efeitos de convecção maiores no tubo de 5 mm como esperado, porém, em contrapartida, não se tem a alteração da ordem de diferenciação, ou seja, a difusão aparente é a mesma, dos isômeros pela matriz, o que nos leva a pensar que a convecção atua de forma semelhantes para os 3 isômeros não prejudicando na análise da ação do surfactante sobre os compostos fluorados. Ressalta-se então que as conclusões inferidas sobre os coeficientes de difusão devem ser comparativas e não absolutas.
