UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
MARIA LAIR SABÓIA DE OLIVEIRA LIMA
SONDAS FLUORESCENTES: SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÕES BIOLÓGICAS
CAMPINAS 2017
MARIA LAIR SABÓIA DE OLIVEIRA LIMA
SONDAS FLUORESCENTES: SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÕES BIOLÓGICAS
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências
Orientadora: Profa. Dra. Anita Jocelyne Marsaioli
Coorientadora: Profa. Dra. Caroline da Costa Silva Gonçalves (UNILA)
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA MARIA LAIR SABÓIA DE OLIVEIRA LIMA, E ORIENTADA PELA PROF(A). DR(A). ANITA JOCELYNE MARSAIOLI.
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Anita Jocelyne Marsaioli (Orientadora)
Profa. Dra. Cíntia Duarte de Freitas Milagre (IQ-UNESP-Araraquara)
Profa. Dra. Sonia Rodriguez Giordano (CNE/UdelaR-Uruguai)
Prof. Dr. Fábio Cesar Gozzo (IQ-UNICAMP)
Profa. Dra. Ljubica Tasic (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da Tese de Doutorado defendida pela aluna MARIA LAIR SABÓIA DE OLIVEIRA LIMA, aprovada pela Comissão Julgadora em 7 de março de 2017.
“Não explicar a ciência me parece perverso. Quando alguém está apaixonado, quer contar a todo o mundo”
AGRADECIMENTOS
Aos meus amados pais, Elza e Ronaldo, e à minha querida irmã, Layane, pelo imenso prazer em fazer parte desta família tão pequenina, mas que transborda amor, virtudes e bênçãos... Muito obrigada por me mostrarem sempre que, não importa o tamanho do nosso coração, ele sempre pode ser maior, melhor e mais compreensivo com aqueles que amamos... E, mais do que isto, obrigada por estarem sempre presentes e por serem os maiores incentivadores que Deus poderia ter me dado... A Ele, agradeço a cada dia por ter vocês! Mais do que minhas, minhas conquistas são de vocês!
Aos meus avós: Manoel, Izabel e Maria Lair. Vocês são meus maiores exemplos de sabedoria e dedicação!
Aos queridos: Tio Luiz, Avelino, Aline, Ian (meu sobrinho querido), Maria de Lourdes (minha afilhada), Tia Neide, Alyson, Fernando, Maraisa, Susane, Gabriela Araújo, Jéssica, Patrícia e Fernanda Matoso. Vocês são pessoas maravilhosas as quais sempre quero ter por perto! À minha família que me acolheu sempre com muito carinho: Tio Wilson, Andréia, Alana, Ananda, Andressa, Tio Alfredo, Lucas, Tio Reizinho, David, Kena, Tio Marcos, Glendinha, Vinícius, Tia Tati, Dudinha, Filho, Tia Jesus, Camila, Tio Elias, Ana, Mikael, Anderson, Cicinho, Bernardo e Carol. Obrigada pelos momentos tão especiais que disfrutamos juntos!
Ao Ramon: meu companheiro, meu amigo e meu amor... Você é um exemplo de dedicação e de humanidade!
Aos amigos e companheiros de laboratório: Katherine, Bruna, Michel, Matheus, Eraldo, Ricardo, Lucas Said e Duda. Obrigada pelo companheirismo e pela paciência.
Aos amigos e antigos colegas de grupo: Mariana, Gabriel Nattan, Priscila, Marília, Renato, André, Jonas, Júlia, Raphael Ricci, Dani, Adriana Pianaro, Francine, Felipe, Thiagão, Diana, Fabiana e Haleem. Aprendi coisas maravilhosas com cada um de vocês!
À Carol, pela amizade, carinho e paciência desde que nos conhecemos! Você é uma amiga e tanto, uma pesquisadora maravilhosa e merece tudo de melhor nessa vida!
Aos amigos: Fábio, Jú, Arnaldo, Simone bonitona, Silvão, Gih, Rômulo, Luelc, Amanda, Zé Tiago, Paula, Adriana Pires, Janaína, Lucas, Thiaguin, Irlene e Lilian Braga. Obrigada pelas boas conversas regadas com risos, café/vinho/cerveja..!
À Profa. Anita pela oportunidade de desenvolver esta tese e pela sua orientação durante o período de mestrado e doutorado em seu laboratório.
Ao Prof. Fernando Cossío, da EHU/UPV, pela oportunidade de desenvolver meu estágio de doutorado sanduiche em seu laboratório. Foi gratificante e estimulante vivenciar o seu amor pela pesquisa.
A los amigos tan especiales que conocí en Donostia/San Sebastián: Arlette, Francisco, Maddalen, Míkel, Aitziber, Miquel, Andrea, Maria de Graci, Tamara, Juán Luís, Nerea, Iosune, Amaia y Javier! Vosotros tenéis un sítio muy muy muy especial en mi corazón! Los quiero mucho!
Ao Prof. Igor Jurberg pelos ensinamentos e pela ótima convivência durante o PED de QO-I. Aos professores: Paulo Miranda, Cátia Ornelas, Luciana Gonzaga e Ronaldo Pilli pelas contribuições em meus exames de qualificação geral e de área durante meu doutorado. Aos professores: Cintia Milagre (UNESP-Araraquara), Sonia Giordano (CNE/UdelaR-Uruguai), Ljubica Tasic (IQ-UNICAMP) e Fábio Gozzo (IQ-UNICAMP) pelas excelentes discussões durante a defesa desta tese.
Ao CNPq (140741/2013-5) e a CAPES (PDSE/BEX: 010181/2014-08) pelas bolsas concedidas no Brasil e na Espanha.
Aos funcionários do Instituto de Química da UNICAMP e da Universidad del País Vasco por todos os serviços prestados.
A todos que, de alguma maneira, contribuíram para realização deste trabalho, o meu muito obrigada!
RESUMO
A síntese de novos compostos com propriedades fluorescentes é uma ferramenta importante para o estudo das atividades químio-enzimáticas nos mais variados modelos celulares. Estas aplicações variam desde a marcação de regiões celulares específicas (como organelas, membranas, e material nuclear) até o estudo do perfil enzimático, que pode ser investigado através de sondas fluorogênicas que revelam a presença de uma dada atividade enzimática relacionada a um determinado fenômeno. Neste contexto, esta tese apresenta-se dividida em 3 capítulos, que abordam desde a síntese e caracterização de novos compostos fluorescentes (Capítulo I), a aplicações biológicas direcionadas de sondas fluorogênicas que utilizam a umbeliferona (Capítulo II) e a resorufina (Capítulos II e III) como sensores na detecção de diferentes atividades enzimáticas. Assim, no Capítulo I são apresentadas diferentes etapas sintéticas para obtenção de derivados de imidazopiridinas e de imidazopirimidinas com interessantes propriedades fluorescentes. No total, 12 compostos foram sintetizados, com caracterizações fotofísicas inéditas na literatura. Já no Capítulo II, aplicações biológicas mais específicas passam a serem discutidas. Este capítulo foca, principalmente, na implementação de uma metodologia para detecção simultânea de hidrolases em micro-organismos, com sondas que apresentam diferentes fluoróforos (resorufina e umbeliferona) e grupos funcionais (epóxido e éster) que, após ação enzimática, culminam na mesma cascata química de liberação do fluoróforo. A esta metodologia, denominamos triagem multienzimática. Neste capítulo, prosseguimos com a aplicação de sondas fluorogênicas na investigação dos excessos enantioméricos (ee) e conversões das reações enzimáticas, utilizando sondas enantiomericamente enriquecidas derivadas da umbeliferona, com uma metodologia implementada por nosso grupo de pesquisas, a qual denominamos de Quick-ee. Ainda no contexto biológico, o Capítulo III apresenta a elucidação de uma cascata enzimática presente em células tumorais de mama e de próstata humana, envolvendo PSTP (proteínas serina/treonina fosfatases) e ADH (álcool desidrogenases), importantes enzimas associadas à atividade tumoral.
ABSTRACT
New fluorescent compounds are important chemo-enzymatic tools to reveal enzymatic activities in vitro and in vivo environments. These applications can reveal organelles, membranes, nucleus and enzymatic activities with fluorogenic probes, signaling the presence of specific enzymes. In this context, this thesis is presented in 3 chapters, which cover the synthesis and characterization of new fluorescent compounds (Chapter I), to direct biological applications of fluorogenic probes using umbelliferone (Chapter II) and resorufin (Chapters II and III) as sensors in the detection of different enzymatic activities. Thus, Chapter I shows different synthetic steps to obtain imidazopyridines and imidazopyrimidines derivatives with interesting fluorescent properties. In total, 12 compounds were synthesized, with novel photo physical characterizations in the literature. In Chapter II, more specific biological applications are discussed. This chapter focuses mainly on the implementation of a methodology for the simultaneous detection of hydrolases in microorganisms, with probes that present different fluorophores (resorufin and umbelliferone) and functional groups (epoxide and ester) that, after enzymatic action, culminate in the same chemical cascade of fluorophore release. This methodology is called multiplex screening. In this chapter, we proceed with the application of fluorogenic probes in the investigation of enantiomeric excesses (ee) and conversions of enzymatic reactions, using enantiomerically enriched umbelliferone derivatives probes with a methodology implemented by our research group, named Quick-ee. Also in the biological context, Chapter III presents the elucidation of an enzymatic cascade present in breast and prostate human tumor cells, involving PSTP (serine / threonine phosphatases) and ADH (alcohol dehydrogenases), important enzymes associated with tumor activity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação dos diferentes fenômenos de a) absorção molecular, b) relaxação não-radiativa e c) de fluorescência (Adaptado de Holler, Skoog e Crouch, 2009 [6]). ... 23 Figura 2. Exemplos de sondas moleculares com aplicações biológicas [1, 4, 8]... 25 Figura 3. Exemplo de ensaio utilizando uma sonda fluorogênica específica para
determinação da atividade enzimática. Imagens de microscopia confocal para (A) células não tumorais de próstata e (B) células tumorais de próstata após tratamento com a sonda. Em (C), representação da reação enzimática intracelular (exc = 490 nm ; em = 560 nm). (Adaptado de Jiang et al., 2012 [15]) ... 26
Figura 4. Derivados imidazopiridínicos e imidazopirimidínicos com aplicações biológicas [18-23]. ... 28 Figura 5. Células de neurônio de rato coradas com DAPI (em azul) obtidas por
microscopia confocal (Adaptado de Thermofisher [30]). ... 29 Figura 6. Marcação de DNA – Imagens obtidas para o cicloaduto correspondente,
derivado de uma imidazo[1,2-a]pirimidinas. A canal azul; B luz visível (Adaptado de Aginagalde, 2012 [31]). ... 30 Figura 7. Representação de a) uma reação eletrocíclica, b) de um rearranjo
sigmatrópico e c) de uma reação de cicloadição (Adaptado de Merlo, 2012 [38]). ... 34 Figura 8. Representação das interações do tipo a) supra-supra e b) supra-antara dos
orbitais de fronteira para reações do tipo 4n e 4n+2 (Figura elaborada com base nas definições da literatura [39, 40]) ... 35 Figura 9. Sistema de reação em reator de micro-ondas: a) representação do
alinhamento e desalinhamento de moléculas com um dipolo permanente, provocado por um campo elétrico oscilante; b) representação real da modificação dos sistema reacional após a reação em micro-ondas do composto 3a sob luz visível e sob luz UV 354 nm; c) CCD (sob luz UV 354 nm) do material de partida (3a, seta vermelha) e da mistura reacional com formação do composto 5a (seta azul) utilizando acetato de etila/hexano 1:1 como fase móvel. (Imagens: Maria Lair Sabóia de O. Lima). ... 36 Figura 10. Estrutura e espectros de absorção e emissão obtidos para o sulfato de
Figura 11. Espectros de excitação e emissão para os a) compostos imidazopiridínicos e b) imidazopirimidínicos, mostrando o considerável incremento de fluorescência após a adição da cadeia alquílica. Em c), uma representação de soluções dos compostos 3c e 4c (1 mM em DMSO) sob radiação UV de 354 nm com suas respectivas CCD reveladas sob radiação UV de 254 nm, mostrando visualmente o incremento de fluorescência após adição da cadeia alquílica. ... 46 Figura 12. Espectros de emissão e excitação da resorufina (7) e da umbeliferona (8)
em tampão borato pH 7,8. ... 55 Figura 13. Representação real de um ensaio de triagem multienzimática para a
bactéria Bacillus cereus. Em a) e b), representação de um mesmo ensaio com as sondas 9 e 11a, observado sob luz visível e sob luz UV 354 nm, respectivamente. Em c) e d), o mesmo ensaio com as sondas 9 e 11b observado sob luz visível e sob luz UV 354 nm, respectivamente. ... 59 Figura 14. Gráficos das detecções simultâneas das sondas 9 e 11a e das sondas 9 e
11b nos ensaios realizados com os micro-organismos Bacillus cereus (CCT – 4060), Rhodotorula glutinis (CCT – 2182) e Curvularia lunata (CCT – 5628). ... 60 Figura 15. Representação de uma reação enzimática com um substrato
enantiomericamente enriquecido na presença de um composto competidor. Nestes modelos de ensaios, o competidor comporta-se como o enantiômero correspondente [64, 65]. ... 61 Figura 16. Percentuais de conversões obtidos nos ensaios com as a) enzimas e com
os b) micro-organismos. Condições: tampão borato (pH 7,8), sonda fluorogênica 11a (100 μmol/L), células/enzimas (0,1 mg/mL), BSA (2,0 mg/mL), NaIO4 (8
mmol/L). ... 62 Figura 17. Representação de um ensaio onde cada enantiômero é avaliado
individualmente frente a um biocatalisador. Nesta representação, não há competição entre os substratos pelo sítio ativo [63]. ... 64 Figura 18. Intensidades relativas de fluorescência (RFU) obtidas nos ensaios com a
enzima lipase de Aspergillus a) sem competição e com o micro-organismo
Pseudomonas fluorescens b) sem competição, mostrando as preferências frente
ao enantiômero (S)-11a. ... 64 Figura 19. Avaliação das intensidades de fluorescência do competidor não
fluorogênico 15, do ânion umbeliferona (8) e do produto de hidrólise do competidor (álcool competidor 16) durante 24 horas, demonstrando que assim
como o competidor, seu produto de hidrólise também não apresenta fluorescência. ... 66 Figura 20. Representação de um ensaio onde cada enantiômero é avaliado
individualmente frente a um biocatalisador na presença do competidor. Nesta representação, há competição entre os substratos pelo sítio ativo. ... 67 Figura 21. Intensidades relativas de fluorescência (RFU) obtidas nos ensaios com a)
a enzima Lipase de Aspergillus na presença do competidor 15 e b) com o micro-organismo Pseudomonas fluorescens também na presença do competidor 15, mostrando as preferências frente ao enantiômero (S)-11a. ... 68 Figura 22. Cromatogramas obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
para os padrões a) (R)-12, b) (S)-12 e c) 11a e 12. Condições de análise: coluna quiral CHIRALPAK-IC (Daicel: 25 cm×0.46 cm); fase móvel: etanol/hexano (6:4), volume de injeção - 20 µL, vazão - 1,0 mL min-1 e abs=320 nm. ... 69
Figura 23. Cromatogramas obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para a a) Lipase de Aspergillus e para o b) micro-organismo Pseudomonas
fluorescens. Condições de análise: coluna quiral CHIRALPAK-IC (Daicel: 25
cm×0.46 cm); fase móvel: etanol/hexano (6:4), volume de injeção - 20 µL, vazão - 1,0 mL min-1 e
abs=320 nm. ... 70
Figura 24. Curva de calibração de fosfato inorgânico e verde de Malaquita. ... 80 Figura 25. a) Representação do sítio ativo de uma ADH equina, mostrando,
supostamente, a posição do cofator em relação ao substrato e o papel do íon Zn2+
na estabilidade do substrato para que ocorra a catálise (Adaptado de Hammes-Schifer e Benkovic, 2006 [89]). b) Produto (18) da reação de oxidação da ADH-ER. ... 82 Figura 26. Experimentos de microscopia confocal para as linhagens (A) PC3 e (B)
RWPE-1 tratadas com a sonda 16 após 3 horas de incubação (C) controle da linhagem PC-3, não tratada com sonda; (D) controle da linhagem RWPE, não tratada com sonda. N = núcleo e Nu = nucléolo. Escala: bar 20 µm. ... 86 Figura 27. Experimentos de microscopia confocal para as linhagens (A) PC3 e (B)
RWPE-1 tratadas com a sonda 17 após 3 horas de incubação. N = núcleo e C = citoplasma. Escala: bar 20 µm. ... 87 Figura 28. Gráficos de emissão do Sulfato de quinino excitado em diferentes
comprimentos de onda de excitação. Em a), excitado em 337 nm, em b), excitado em 317 nm e em c), excitado em 306 nm. ... 92
Figura 29. Representação de um ensaio multienzimático com avaliação simultânea das sondas 9 e 11a e das sondas 9 e 11b para 6 micro-organismos diferentes em uma mesma microplaca de 96 poços. ... 107 Figura 30. Representação de um ensaio em microplaca para o micro-organismo
Pseudomonas fluorescens e para a enzima lipase de Arpergillus. ... 115
Figura 31. Cromatograma dos dióis quirais R e S (CHIRALPAK-IC, Daicel: 25 cm x 0,46 cm, utilizando EtOH:Hexano 6:4 como fase móvel; volume de injeção de 20 μL, fluxo de 1,0 mL/min e λabs = 320 nm). ... 117
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Representação das etapas de sínteses dos derivados imidazopiridínicos e imidazopirimidínicos sintetizados neste capítulo. ... 32 Esquema 2. Representação da síntese de um 2-aril-indol via reação de Bischler-Möhlau. ... 33 Esquema 3. Representação da síntese das imidazo[1,2-a]piridinas (pirimidinas)
segundo Hand e Paudlaner. (Adaptado de Hand e Paudlaner, 1982 [34]). ... 33 Esquema 4. Formação in situ do benzino [43]. ... 37 Esquema 5. Esquema representativo de cicloadição [8+2] por via térmica para
formação dos compostos 5a-b [31, 32]. ... 37 Esquema 6. Representação da síntese de Willamson para os compostos 4a,b,c,d e
6a,b. ... 38 Esquema 7. Cascata químio-enzimática esperada para os compostos sintetizados. ... 47 Esquema 8. Representação dos ensaios de Quick-E realizados por Kazlauskas e
colaboradores empregando substratos cromogênicos. (Adaptado de Janes e Kaslauskas, 1997 [62]). ... 52 Esquema 9. Representação de um ensaio de detecção multienzimática, utilizando
duas sondas fluorogênicas que apresentam a resorufina (7) e a umbeliferona (8) como sensores das atividades enzimáticas [63, 66]. ... 56 Esquema 10. Representação das etapas de síntese para a sonda 9. ... 56 Esquema 11. Representação das etapas de catálise enzimática com posterior
liberação do fluoróforo para detecção da atividade enzimática. Note que o competidor 15 não é fluorogênico (Adaptado de Lima et al., 2015 [65]). ... 66 Esquema 12. Cascata enzimática entre a PSTP e a ADH, com as sondas 16 e 17, e
geração do sinal de fluorescência (Adaptado de Gonçalves et al., 2016 [2]). .... 76 Esquema 13. Etapas de sínteses da sonda fluorogênica 17 (Adaptado de Gonçalves
et al. 2016 [2]). ... 78
Esquema 14. Representação da reação enzimática entre a Calcineurina, uma PSTP, e a sonda 16, com um grupo fosfato como um sítio de reconhecimento para a Calcineurina. Esta reação de hidrólise produz fosfato inorgânico (detectado por absorbância – abs = 615 nm – com verde de Malaquita) e o álcool correspondente
Esquema 15. Representação da cascata quimio-enzimática de uma ADH em presença de BSA para a sonda 17. ... 81 Esquema 16. Representação das etapas da reação em micro-ondas. Em a) está
reapresentada a etapa inicial, com a mistura de reagentes sem e com radiação UV 354 nm; Em b) tem-se o equipamento devidamente fechado, com a reação em andamento; Em c), mostra-se o término da reação, onde nota-se a mudança de coloração da mistura reacional visualmente, sob radiação UV 354 nm e em CCD (Acetato de etila/Hexano 1:1); Em d), tem-se o produto da reação após purificação por cromatografia, sob luz visível. (Fotos: Maria Lair Sabóia de Oliveira Lima) ... 96
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Espectros de excitação e emissão para os compostos 3a,b,c,d obtidos utilizando H2O como solvente. ... 41
Tabela 2. Espectros de excitação e emissão para os compostos 4a,b,c,d obtidos utilizando H2O como solvente. ... 42
Tabela 3. Espectros de excitação e emissão para os compostos 5a,b e 6a,b obtidos utilizando H2O como solvente. ... 43
Tabela 4. Parâmetros fotofísicos e estudo teórico dos compostos 3a,b,c,d, 4a,b,c,d, 5a,b e 6a,b [48, 50, 51, 52]. ... 44 Tabela 5. Relação entre as intensidades de fluorescência dos compostos sintetizados
com e sem a cadeia alquílica com notável aumento na intensidade de fluorescência após adição da cadeia. ... 45 Tabela 6. Percentuais de conversões (%) das reações enzimáticas entre os micro-organismos e cada sonda avaliada individualmente após 24 horas de ensaio. . 58 Tabela 7: Valores de E obtidos em ensaios sem competição (Eestimado) e com
competição (Quick-E), ambos monitorados por fluorescência, a partir da relação entre as velocidades iniciais (V0) de cada enantiômero. ... 71
Tabela 8. Valores de ee para ensaios sem competição (eeestimado), com competição
(Quick-ee), obtidos por fluorimetria, e de eereal, obtidos por CLAE. ... 71
Tabela 9. Atividades enzimáticas in vitro da sonda 17 após 24 horas ensaio. ... 81 Tabela 10. Atividades enzimáticas in vitro das sondas 16 e 17 após 24 horas ensaio. ... 83 Tabela 11. % de células marcadas analisadas por citometria de fluxo. ... 85
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ACN Acetonitrila
ADH Álcool-desidrogenase
ATR Attenuated Total Reflectance
ATCC American Type Culture Colection
BSA Bovine Serum Albumin
CAS Chemical Abstracts Service
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CCT Coleção de Culturas Tropicais
CDCl3 Clorofórmio Deuterado
CH2Cl2 Diclorometano
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CG Cromatografia a gás
DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol (marcador de DNA)
DMEN Meio de cultura: Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
E Enantiosseletividade
Ee Excesso Enantiomérico
EI Electron Ionization
FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy
abs Comprimento de onda de absorção
em Comprimento de onda de emissão
ex Comprimento de onda de excitação
MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization
m-CPBA Ácido meta-cloroperbenzóico
MEA Meio de cultura: malte, extrato de malte e ágar
NA Meio de cultura: ágar nutriente
YMA Meio de cultura: malte, extrato de levedura e ágar
RFU Relative Fluorescence Units
RMN de 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
PBS Phosfate Buffer Saline
PSTP Phosphatase Serine Threonine Protein
RPMI Meio de cultura: Roswell Park Memorial Institute
SUMÁRIO
Introdução ... 22
Capítulo I Síntese e propriedades luminescentes de derivados piridínicos e pirimidínicos ... 27
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS ... 28
2. OBJETIVOS ... 31
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 32
3.1. Sínteses dos fluoróforos ... 32
3.1.1. Imidazo[1,2-a]piridinas (pirimidinas) ... 32
3.1.2. Síntese dos compostos 5a e 5b via cicloadições [8+2] ... 33
3.1.3. Síntese dos éteres 4a-d e 6a-b ... 37
3.2. Determinação dos parâmetros fotofísicos dos compostos 3a-d, 4a-d, 5a-b e 6a-5a-b ... 38
3.2.1. Determinação dos comprimentos de onda de excitação e de emissão (teóricos e experimentais) e obtenção dos rendimentos quânticos de fluorescência ... 38
3.2.2. Estudo do incremento de fluorescência após adição da cadeia alquílica ... 45
3.3. Testes enzimáticos com enzimas comerciais para detecção de álcool-desidrogenases (ADH) ... 46
4. CONCLUSÕES ... 48
Capítulo II Sondas fluorogênicas: da detecção da atividade à determinação do excesso enantiomérico das reações enzimáticas ... 49
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS ... 50
2. OBJETIVOS ... 54
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 55
3.1. Triagem multienzimática em micro-organismos ... 55
3.1.1. Sínteses das sondas fluorogênicas empregadas nos ensaios ... 56
3.1.2. Triagem dos micro-organismos com as sondas fluorogênicas avaliadas individualmente ... 57
3.2. Avaliação rápida dos excessos enantioméricos das reações enzimáticas:
Quick-ee ... 61
3.2.1. Seleção dos micro-organismos e enzimas para implementação do Quick-ee ... 62
3.2.2. Ensaios qualitativos para avaliação de ee: eeestimado. ... 63
3.2.3. Ensaios quantitativos para determinação de ee: ... 65
Quick-ee ... 65
3.2.4. Análise comparativa entre as metodologias utilizadas nos ensaios ... 70
3. CONCLUSÕES ... 72
Capítulo III Perfil enzimático de células tumorais e não tumorais humanas: uma cascata enzimática ... 73
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS ... 74
2. OBJETIVOS ... 77
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 78
3.1. Sínteses das sondas fluorogênicas ... 78
3.2. Testes enzimáticos in vitro ... 78
3.2.1. Avaliação da sonda 16 frente à uma PSTP comercial ... 79
3.2.2. Avaliação da sonda 17 frente a enzimas ADH comerciais ... 80
3.2.3. Ensaio multienzimático in vitro ... 82
3.3. Testes enzimáticos in celullo ... 84
3.3.1. Ensaios de citometria de fluxo ... 84
3.3.2. Microscopia confocal ... 85
4. CONCLUSÕES ... 88
Materiais e Métodos ... 89
Procedimentos gerais de síntese e caracterização adotados nesta tese ... 89
1. Capítulo I: ... 91
1.1. Métodos espectroquímicos de análises: Infra-vermelho (IV), rendimento quântico e estudo do incremento de fluorescência após adição da cadeia ... 91
1.2. Procedimentos sintéticos ... 93
1.2.1. Sínteses das aminopiridinas (pirimimidinas) 3a,b,c,d ... 93
1.2.2. Sínteses dos cicloadutos 5a,b ... 95
1.2.3. Sínteses dos derivados 4a,b,c,d e 6a,b ... 97
2. Capítulo II: ... 101
2.1. Procedimentos gerais adotados no laboratório de Biocatálise ... 101
2.2. Micro-organismos e enzimas utilizados nos ensaios de biocatálise ... 101
2.3. Cultivo dos micro-organismos ... 102
2.4. Ensaios de triagem em microescala monitorados por fluorescência .... 103
2.4.1. Preparo das suspensões e soluções ... 103
2.4.2. Ensaios de espectrofotometria de fluorescência em microescala ... 105
3. Capítulo III: ... 118
3.1. Ensaios in vitro ... 118
3.1.1. Enzimas utilizadas ... 118
3.1.2. Ensaios de espectrofotometria de absorbância e de fluorescência em microescala ... 119
4.1. Ensaios in cellulo ... 122
4.1.1. Procedimentos gerais adotados durante a manipulação das linhagens celulares ... 122
4.1.2. Linhagens utilizadas nos ensaios ... 122
4.1.3. Citometria de fluxo ... 123
4.1.4. Microscopia confocal ... 124
4.2. Síntese da sonda fluorogênica para detecção de ADH in vitro e in cellulo ... 125
ANEXOS ... 127
Introdução
A compreensão de fenômenos relacionados aos mais diversos sistemas biológicos está intimamente associada com a nossa habilidade em visualizar eventos no ambiente celular [1, 2, 3]. Neste contexto, a fluorescência apresenta-se como um fenômeno-chave, onde tanto as análises qualitativas quanto as quantitativas são permitidas, com dependência direta da técnica e do fluoróforo empregados. Assim, mais um elo entre a química sintética e a biológica é estabelecido, a partir da síntese de novos compostos com propriedades fluorescentes que visam aplicações biológicas direcionadas [2, 4].
O interesse em se trabalhar com a fluorescência em sistemas biológicos está relacionado com a sensibilidade das técnicas que se utilizam da emissão de fluorescência como fator de resposta [5]. No entanto, para real entendimento deste fenômeno, é necessário compreender os processos de relaxações vibracionais necessários para que a emissão de fluorescência seja observada. Consideremos uma molécula hipotética, onde 3 níveis de energia são apresentados: sendo E0 o estado
fundamental e E1 e E2 estados eletrônicos de maior energia (Figura 1). Assim, uma vez
excitada para quaisquer um dos estados E1 ou E2, processos que acarretam em perda
de energia podem ocorrer, sendo os dois mais importantes a relaxação não radiativa e a relaxação radiativa com emissão de fluorescência [6].
Figura 1. Representação dos diferentes fenômenos de a) absorção molecular, b) relaxação
Dentre os processos de relaxação não radiativa (Figura 1b), podemos destacar a relaxação vibracional, que envolve a transferência de energia de uma espécie excitada vibracionalmente para as moléculas do solvente; e a conversão interna, definida como um tipo de relaxação não radiativa, que ocorre entre níveis vibracionais mais baixos de um dado estado eletrônico, para níveis vibracionais mais altos de outro estado eletrônico. Já a fluorescência (Figura 1c), fenômeno de foco desta tese, caracteriza-se como um processo de relaxação radiativa que ocorre a partir da emissão de energia originada devido à relaxação que ocorre de um estado eletrônico excitado mais baixo (E1) para os vários níveis vibracionais de E0 [5, 6].
Assim, se considerarmos as perdas de energia que ocorrem em processos de relaxação não radiativa, temos que a energia observada na emissão de fluorescência é menor do que a energia inicialmente utilizada para excitação. Logo, em fluorescência, os comprimentos de onda de emissão (em) observados são
maiores que os comprimentos de onda de excitação (ex) utilizados, uma vez que a
Energia é inversamente proporcional ao comprimento de onda, como apresentado na equação de Planck:
𝐸 =
ℎ. 𝑐
λ
Onde E é energia, h a constante de Planck (6,626 x 10-34 J.s), c a velocidade
da luz no vácuo e o comprimento de onda.
Ainda ressaltando a sensibilidade das técnicas que envolvem a fluorescência, nestes experimentos há o uso de menores concentrações de substrato (o que pode remeter a uma menor toxicidade) e a possibilidade de miniaturização de ensaios, permitindo a realização de trabalhos em microescala, com sistemas biológicos mais sensíveis (como células tumorais e não tumorais humanas) [2]. Assim, no contexto biológico, o uso de compostos fluorescentes ou capazes de gerar fluorescência (fluorogênicos) tem sido aplicado para marcações específicas de organelas, material genético e membranas, por exemplo, até mesmo para estudos detalhados do comportamento químio-enzimático destes sistemas [7].
Quando se trata da investigação do perfil enzimático de sistemas biológicos, o uso de sondas baseadas em um fluoróforo ancorado a grupos funcionais (ou a sequências peptídicas) específicos (Figura 2), é uma ferramenta importante para revelar o metabolismo celular [1, 4, 8]. Estes compostos auxiliam desde a triagem de
novos biocatalisadores oriundos dos mais diferentes habitats (como petróleo [9, 10], pele [11] e rejeitos de mineração [12, 13]), até o estudo comportamental de sistemas celulares mais complexos.
Figura 2. Exemplos de sondas moleculares com aplicações biológicas [1, 4, 8].
Assim, em organismos mais simples (como bactérias, leveduras e fungos), a fluorescência é aplicada, principalmente, no monitoramento da atividade enzimática, com ensaios em micro-escala [9 - 13]. Estes ensaios são alternativos à biocatálise convencional (principalmente quando há uma grande quantidade de amostras a ser avaliada), não necessitando de técnicas como CG-EM (Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas), CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) ou RMN (Ressonância Magnética Nuclear) para monitoramento das atividades enzimáticas, uma vez que apenas o sinal de fluorescência é considerado. Já para uma avaliação da atividade enzimática em células mais complexas, é necessário o uso de metodologias que empregam a microscopia confocal (Figura 3) e de fluorescência, além da citometria de fluxo [7, 14, 15], com fluoróforos adequados à técnica empregada e ao parâmetro a ser avaliado. Por conseguinte, estas metodologias contribuem de maneiras distintas para compreensão do processo avaliado, uma vez que a microscopia nos mostra onde a reação ocorre e a citometria, o quanto esta reação se processou.
Figura 3. Exemplo de ensaio utilizando uma sonda fluorogênica específica para determinação
da atividade enzimática. Imagens de microscopia confocal para (A) células não tumorais de próstata e (B) células tumorais de próstata após tratamento com a sonda. Em (C), representação da reação enzimática intracelular (exc = 490 nm ; em = 560 nm). (Adaptado de
Jiang et al., 2012 [15])
Neste contexto, este trabalho apresenta a síntese de uma família de compostos fluorescentes derivados de imidazopiridinas e imidazopirimidinas, bem como diferentes aplicações biológicas de sondas fluorogênicas baseadas na umbeliferona e na resorufina (sintetizadas em nosso grupo de pesquisas). Estas aplicações seguem desde a triagem e investigação do perfil enantiosseletivo de enzimas e de células microbianas, ao estudo de uma cascata intracelular, proposta neste trabalho, presente em células tumorais e não tumorais da mama e da próstata humanas.
Capítulo I
Síntese e propriedades luminescentes de derivados piridínicos e
pirimidínicos
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Os heterociclos nitrogenados (N-heterociclos) representam um grupo de moléculas conhecidas por apresentarem diferentes propriedades físicas e biológicas [16]. Após a descoberta destes compostos na natureza, a química sintética tem se empenhado no desenvolvimento de diferentes rotas que sejam eficientes na obtenção de compostos naturais e de seus derivados, contribuindo para uma expansão significativa do número de moléculas pertencentes a este grupo e que apresentem promissoras aplicações [17]. Neste contexto, a descoberta das diferentes propriedades dos compostos imidazopiridínicos e imidazopirimidínicos tem gerado um elevado interesse na síntese de derivados com aplicações farmacêuticas, (como atividade ansiolítica [18, 19], analgésica [20], anti-hipertensiva [21], neuroléptica [22]) e biológicas, como atividade antiproliferativa em células tumorais humanas [23] (Figura 4).
Figura 4. Derivados imidazopiridínicos e imidazopirimidínicos com aplicações biológicas
[18-23].
No entanto, além dessas aplicações, as propriedades fotofísicas (como rendimento quântico de fluorescência, bandas de emissão e de excitação e tempo de vida) dessas famílias de moléculas indicam um interessante campo a ser explorado, com um elevado número de novos fluoróforos promissores às mais diferentes aplicações [24, 25, 26, 27]. Um exemplo de composto de base estrutural semelhante
e que apresenta propriedades fotofísicas que permitem aplicações em sistemas biológicos é o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), um composto fluorescente (ex = 358 nm; em = 461 nm) utilizado especificamente para marcação de DNA (ácido desoxirribonucleico) em estudos onde a visualização do núcleo por fluorescência se faz necessária [28]. A estrutura do DAPI (Figura 5) permite com que ele permeie as membranas celulares (sem danificar a célula), alcançando o núcleo. Neste ponto, ele se liga fortemente a regiões do DNA ricas nas bases nitrogenadas adenina (A, base púrica) e timina (T, base pirimídica), aumentando consideravelmente a emissão de fluorescência (Figura 5). Consequentemente, a especificidade do DAPI, atrelada a um rendimento quântico elevado (Φ = 0,58, em DMSO) [29], despertou o interesse na síntese de outros núcleos fluorescentes similares, como derivados imidazopiridinicos e imidazopirimidínicos, explorados neste capítulo.
Figura 5. Células de neurônio de rato coradas com DAPI (em azul) obtidas por microscopia
confocal (Adaptado de Thermofisher [30]).
Inspirados na estrutura do DAPI, Aginagalde et al. [31, 32] propuseram uma rota sintética, assistida por radiação em micro-ondas, que permitisse a preparação de derivados imidazopiridínicos (pirimidínicos) utilizando, para tanto, imidazo[1,2-a] piridinas e imidazo[1,2-a]pirimidinas como blocos de construção em reações de cicloadições do tipo [4n+2]. Estes cicloadutos, assim como o DAPI, mostraram-se promissores quando a serem possíveis novos marcadores de DNA (Figura 6).
Rendimento quântico em CH2Cl2: 53%
Figura 6. Marcação de DNA – Imagens obtidas para o cicloaduto correspondente, derivado
de uma imidazo[1,2-a]pirimidinas. A canal azul; B luz visível (Adaptado de Aginagalde, 2012 [31]).
Em outro trabalho, Velázquez-Olvera et al. [33] sintetizaram uma variedade desses derivados e relataram uma propriedade fluorescente interessante: um aumento na intensidade de fluorescência quando uma cadeia alquílica é acoplada ao sistema aromático, quando em comparação com o material de partida utilizado. Esta propriedade sugere uma possível aplicação destes compostos como sensores biológicos, uma vez que, assim como o DAPI [28, 29], ao ligarem-se covalentemente (ou através de fortes ligações de hidrogênio) a um sistema de aceitabilidade adequada, esperaria-se orbservar um incremento na intensidade de fluorescência que permitiria a visualização de um dado fenômeno biológico.
Neste contexto, este capítulo apresenta a síntese de 12 derivados imidazopiridínicos e pirimidínicos, do quais, até o presente momento, 9 são inéditos na literatura. Além disso, o estudo de seus parâmetros fotofísicos foi também realizado, tanto em nível teórico quanto experimental, o que permitirá uma pré-avaliação da aplicabilidade dos mesmos.
2. OBJETIVOS
Objetivos gerais
Como objetivos gerais, este capítulo propõe sintetizar derivados de núcleos aromáticos imidazopiridínicos (pirimidínicos) e atribuir-lhes suas caracterizações quanto aos parâmetros fotofísicos em níveis teórico e experimental.
Objetivos específicos
Além dos objetivos gerais acima citados, têm-se como objetivos específicos:
• Sintetizar núcleos fluorescentes via síntese de Bischler-Möhlau;
• Sintetizar derivados imidazopiridínicos (pirimidínicos) via cicloadições do tipo
[4n+2], com uso de aquecimento por micro-ondas;
• Investigar as propriedades fotofísicas através de cálculos teóricos, a fim de
prever os deslocamentos nos comprimentos de onda de excitação e emissão provocados pelo aumento da conjugação;
• Comparar os parâmetros teóricos e experimentais;
• Estudar a influência da adição de uma cadeia contendo 3 carbonos e um OH
terminal à porção fenólica dos compostos sintetizados;
• Investigar suas aplicabilidades como sondas fluorescentes para detecção de
álcool-desidrogenases.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As etapas de sínteses e o estudo teórico dos compostos apresentados neste capítulo foram realizados em colaboração, na Universidad del País Vasco – San Sebastián/Donostia – Espanha, sob supervisão do Prof. Fernando Cossío, de 01/maio/2015 a 31/out/2015, correspondente ao período de doutorado sanduiche nesta instituição. O estágio foi financiado pelo programa Ciência sem Fronteiras (CAPES - PDSE / BEX: 010181/2014-08) e resultou na síntese de 12 derivados imidazopiridínicos e imidazopirimidínicos (Esquema 1).
Esquema 1. Representação das etapas de sínteses dos derivados imidazopiridínicos e
imidazopirimidínicos sintetizados neste capítulo.
Os testes enzimáticos e caracterizações fotofísicas foram realizadas no Brasil, em colaboração com a Dra. Bruna Zucoloto da Costa, sob supervisão da Profa. Anita Marsaioli.
3.1. Sínteses dos fluoróforos
3.1.1. Imidazo[1,2-a]piridinas (pirimidinas)
As sínteses das imidazo[1,2-a]piridinas (pirimidinas) (compostos 3a-d) consistiu na reação direta entre a 2-aminopiridina (pirimidina) e as α-bromo-acetofenonas correspondentes (1a e 1b), segundo metodologia descrita por Hand e Paudlaner, em 1982 [34], uma adaptação da síntese de 2-aril-indóis descrita por Bischler-Möhlau [35, 36] (Esquema 2).
Esquema 2. Representação da síntese de um 2-aril-indol via reação de Bischler-Möhlau.
A reação inicia com o ataque nucleofílico do par de elétrons livres do átomo de nitrogênio do anel piridínico (pirimidínico) ao carbono α da α-bromo-acetofenona (1a-b), via mecanismo SN2, liberando brometo e formando o intermediário 1. Em
seguida, a carbonila sofre um ataque nucleofílico do N*, originando o intermediário 2. Após sucessivas etapas de transferência de próton e de perda de água, as imidazo[1,2- a]piridinas (pirimidinas) são finalmente formadas (Esquema 3), dando origem aos 4 primeiros fluoróforos apresentados neste trabalho [31, 34].
Esquema 3. Representação da síntese das imidazo[1,2-a]piridinas (pirimidinas) segundo
Hand e Paudlaner. (Adaptado de Hand e Paudlaner, 1982 [34]).
3.1.2. Síntese dos compostos 5a e 5b via cicloadições [8+2]
A frequência de absorção de um composto está diretamente relacionada com a diferença de energia entre os orbitais de fronteira HOMO (orbital molecular ocupado de mais alta energia) e LUMO (orbital molecular desocupado de mais baixa energia). Portanto, alterações estruturais, como a inserção de um sistema com geometria favorável a conjugar com o sistema de origem alteram estas transições eletrônicas, gerando assim compostos capazes de absorver/excitar em maiores comprimentos de onda (efeito batocrômico) [5, 6, 37]. Assim, com o intuito de obter fluoróforos que absorvam em comprimentos de onda maiores, os compostos 3a e 3c foram submetidos a reações de cicloadições do tipo [8+2] com o benzino (gerado in
situ) [31, 32], formando os cicloadutos que darão origem aos compostos 5a e 5b
apresentados neste trabalho.
As cicloadições, em conjunto com os rearranjos sigmatrópicos e as reações eletrocíclicas, pertencem ao grande grupo das reações pericíclicas (Figura 7) e, portanto, ocorrem como processos concertados, onde o estado de transição cíclico envolvido no processo se dá sem a participação de intermediários durante a transformação química. Neste contexto, as reações eletrocíclicas (Figura 7a), caracterizam-se pelo fechamento ou ruptura de um ciclo de modo intramolecular, com conversões de ligações (pi) em ligações (sigma) e vice-versa; já os rearranjos sigmatrópicos (Figura 7b) são definidos pela reorganização concertada de elétrons
que migram o grupo conectado de uma extremidade a outra de um sistema conjugado , onde os elétrons deste sistema migram concomitantemente com a transferência do grupo; por fim, as cicloadições ocorrem quando um sistema com m elétrons reage com outro sistema que contém n elétrons, formando duas novas ligações e, como consequência, originam um produto cíclico correspondente (cicloaduto) (Figura 7c) [38, 39, 40].
Figura 7. Representação de a) uma reação eletrocíclica, b) de um rearranjo sigmatrópico e c)
de uma reação de cicloadição (Adaptado de Merlo, 2012 [38]).
Por conseguinte, as reações do tipo [8+2] se enquadram nas cicloadições do tipo [4n+2] [31, 32, 38] e, portanto, quando por via térmica, ocorrem com interações
nº de elétrons
envolvidos via térmica via fotoquímica
4n + 2 supra-supra supra-antara
4n supra-antara supra-supra
8+2 = 4n+2 supra-supra supra-antara
Figura 8. Representação das interações do tipo a) supra-supra e b) supra-antara dos orbitais
de fronteira para reações do tipo 4n e 4n+2 (Figura elaborada com base nas definições da literatura [39, 40])
Uma alternativa à via térmica convencional (aquecimento por convecção) consiste no aquecimento por radiação de micro-ondas, também denominado aquecimento dielétrico. Este aquecimento ocorre quando a energia eletromagnética é transformada em calor. O principal mecanismo que explica este fenômeno é chamado rotação de dipolo e está relacionado ao alinhamento das moléculas. Assim, quando um campo elétrico é aplicado, as moléculas que apresentam dipolos permanentes ou induzidos alinham-se de acordo com o campo. Quando este campo é removido, as moléculas desordenam-se e a energia que foi utilizada para orientação dos dipolos é então dissipada na forma de calor (Figura 9 a) [41, 42]. A frequência com que oscila o campo elétrico (2,45 GHz) faz com que o campo oscile 2,4 x 109 vezes por segundo,
acarretando em um pronto aquecimento das moléculas do sistema. Devido à praticidade da técnica, esta foi aplicada como fonte de energia térmica para as cicloadições [8+2] (Figura 9 – b, c).
Figura 9. Sistema de reação em reator de micro-ondas: a) representação do alinhamento e
desalinhamento de moléculas com um dipolo permanente, provocado por um campo elétrico oscilante; b) representação real da modificação dos sistema reacional após a reação em micro-ondas do composto 3a sob luz visível e sob luz UV 354 nm; c) CCD (sob luz UV 354 nm) do material de partida (3a, seta vermelha) e da mistura reacional com formação do composto 5a (seta azul) utilizando acetato de etila/hexano 1:1 como fase móvel. (Imagens:
Maria Lair Sabóia de O. Lima).
Para entendermos com clareza o mecanismo que rege essas cicloadições, é necessário que analisemos a reação por partes. Primeiramente, temos a formação
in situ do benzino e, para isso, um ataque nucleofílico do fluoreto ao átomo de silício
do 2-(trimetilsilil)-fenil triflato (um precursor do benzino) se faz necessário. Isto é possível devido ao Si apresentar orbitais d vazios, propícios a um ataque nucleofílico (Esquema 4– d) [43]. Logo, para aumentar a disponibilidade dos íons fluoreto no meio
reacional e, consequentemente, favorecer a formação do benzino, utilizou-se o poliéter 18-coroa-6 [44] que, em teoria, ancorar-se-ia aos íons Cs+ provocando um
deslocamento de equilíbrio no sentido da produção de fluoreto no meio reacional (Esquema 4– a, b, c) [31, 32].
Esquema 4. Formação in situ do benzino [43].
Com o benzino formado, seus orbitais de fronteira interagem, por via térmica, de modo supra-supra com os orbitais da molécula onde ocorrerá a cicloadição. Isto acarreta na formação de um cicloaduto com 2 hidrogênios na posição
cis que, após perda de H2, origina os compostos 5a e 5b, apresentados neste trabalho
(Esquema 5).
Esquema 5. Esquema representativo de cicloadição [8+2] por via térmica para formação dos
compostos 5a-b [31, 32].
3.1.3. Síntese dos éteres 4a-d e 6a-b
Além dos deslocamentos dos comprimentos de onda de absorção/excitação, outro ponto a ser explorado é como a intensidade de fluorescência de uma espécie pode ser alterada, de acordo com os substituintes envolvidos. Assim, Velázquez-Olvera et al. [33] realizaram estudos com derivados imidazopiridínicos e imidazopirimidínicos (semelhantes aos empregados neste trabalho) e constataram um aumento considerável na intensidade da fluorescência quando uma cadeia alquílica era adicionada a estrutura.
Por conseguinte, os compostos 3a-d e 5a-b (com o grupo OH para e meta substituído) foram submetidos a reações de Willamson [45, 46] para formação de
éteres, utilizando catalisadores de transferência de fase (Esquema 6). Nesta via sintética, o 18-coroa-6 atua como o catalisador, interagindo com os íons K+ presentes
no meio (Esquema 6 – b). Esta interação provoca um deslocamento de equilíbrio no sentido dos produtos (Esquema 6 – c), aumentando a disponibilidade de íons carbonato (base) no meio reacional [47]. Isto favorece a formação do fenóxido (Esquema 6 – d), gerado in situ. Por fim, o fenóxido formado realiza um ataque nucleofílico, via SN2,ao 1-bromo-3-propanol, originando assim os compostos 4a-d, 6a
e 6b apresentados nesta tese.
Esquema 6. Representação da síntese de Willamson para os compostos 4a,b,c,d e 6a,b.
3.2. Determinação dos parâmetros fotofísicos dos compostos
3a-d, 4a-d, 5a-b e 6a-b
3.2.1. Determinação dos comprimentos de onda de excitação e de
emissão (teóricos e experimentais) e obtenção dos
rendimentos quânticos de fluorescência
Além da caracterização estrutural, obtida através de técnicas como a RMN, a Espectrometria de Massas, o Infra-vermelho e a difração de Raios-X, por exemplo, outras técnicas que permitam conhecer o comportamento espectroquímico dos compostos (como as bandas de absorção, de excitação e de emissão e o rendimento quântico de fluorescência (Ф)) devem ser empregadas [37], uma vez que, de posse destas informações, é possível visualizar diferentes possibilidades de aplicações dos compostos sintetizados.
O rendimento quântico de fluorescência (Ф) [5] é dado pela relação entre o número de fótons emitidos e o número de fótons absorvidos:
Ф = número de fótons emitidos número de fótons absorvidos
Este parâmetro pode ser obtido por métodos primários (que utilizam superfícies espalhadoras para calibrar o sistema detecção/excitação) e por métodos secundários, que utilizem espécies com rendimentos quânticos conhecidos em condições padrões de análise [48]. A metodologia com uso de padrões é bastante utilizada devido à simplicidade de operação e ao fácil manuseio de equipamento. Nesta metodologia, o rendimento quântico de fluorescência é obtido através da equação:
Ф𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 = (Ф𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜)(Á𝑟𝑒𝑎 𝐴)(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑃)(𝜂 𝐴) (Á𝑟𝑒𝑎 𝑃)(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐴)(𝜂 𝑃)
Onde Ф𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 é o rendimento quântico da amostra a ser determinada, Ф𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 é o rendimento quântico de fluorescência do padrão utilizado, Á𝑟𝑒𝑎 𝐴 é a área do gráfico de emissão correspondente ao comprimento de onda de excitação utilizado, Á𝑟𝑒𝑎 𝑃 é a área do gráfico de emissão do padrão quando excitado no mesmo comprimento de onda de excitação da amostra a ser determinada, 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐴 é a absorbância da amostra (que deve ser > 0,05), 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑃 é a absorbância do padrão no mesmo comprimento de onda da amostra, 𝜂 𝐴 o índice de refração do solvente no qual a amostra foi dissolvida e 𝜂 𝑃 o índice de refração do solvente onde o padrão foi preparado [48, 49, 50].
Neste contexto, foram realizados experimentos para obtenção dos comprimentos de onda ótimos de excitação e de emissão dos compostos 3a,b,c,d, 4a,b,c,d, 5a,b e 6a,b (Tabela 1,Tabela 2 e Tabela 3) para, posteriormente, se obter os valores de rendimentos quânticos de fluorescência (Tabela 4).
De posse dos comprimentos de onda de excitação e emissão otimizados para cada composto, é possível escolher o padrão mais adequado para atribuição dos valores de Ф para cada fluoróforo. Tal informação não é trivial, uma vez que é necessário excitar o padrão no mesmo comprimento de onda que o composto a ter seu valor de Ф determinado, o que resulta nas áreas de emissão (Á𝑟𝑒𝑎 𝑃 e Á𝑟𝑒𝑎 𝐴) a
serem aplicadas no cálculo. Assim, neste trabalho, escolhemos o sulfato de quinino (1 ppm, em H2SO4 0,5 mol/L e Ф = 0,54) [48] como padrão, uma vez que seus
espectros de excitação e de emissão apresentam regiões que se sobrepõem a dos compostos sintetizados (Figura 10, Tabela 1,Tabela 2 eTabela 3).
Sulfato de Quinino 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 RFU comprimento de onda () nm espectro de emissao espectro de excitaçao
Figura 10. Estrutura e espectros de absorção e emissão obtidos para o sulfato de quinino.
Como sugerido na literatura [5], quando se comparam os comprimentos de onda de excitação e emissão experimentais dos pares de compostos 3a e 5a, 3c e 5b, 4a e 6a e 4c e 6b, observa-se um aumento considerável nos comprimentos de onda de excitação à medida que o sistema se torna mais conjugado (Tabela 4). Isto foi também previsto através de cálculos teóricos realizados pelo Dr. Miquel Torrent Succart e pelo doutorando Míkel Odriozola, sob supervisão do Prof. Fernando Cossío, na Universidad del País Vasco. Para os cálculos teóricos, eles utilizaram a teoria do funcional de densidade (B3LYP) com a função de base 6-311+G(d,p) através do programa Gaussian09, obtendo-se, assim, as energias teóricas dos orbitais de fronteira (Tabela 4) [51, 52]. Como esperado, tanto em nível experimental quanto em nível teórico, quanto mais conjugada for a molécula, menor a diferença de energia entre o HOMO e o LUMO e, portanto, maiores os comprimentos de onda de absorção/excitação observados [5, 6, 37].
Tabela 1. Espectros de excitação e emissão para os compostos 3a,b,c,d obtidos utilizando H2O como solvente. (3a) ex: 250 e 320 nm em: 393 nm 250 300 350 400 450 500 550 600 0 100 200 300 400 500 600 700 RFU comprimento de onda () nm espectros de emissao espectros de excitaçao (3b) ex: 245 e 314 nm em: 381 nm 200 240 280 320 360 400 440 480 520 0 100 200 300 400 500 600 RFU comprimento de onda () nm (3c) ex:250 e 342 nm em: 456 nm 250 300 350 400 450 500 0 20 40 60 80 100 120 140 160 RFU comprimento de onda () nm (3d) ex: 246 e 337 nm em: 432 nm 200 250 300 350 400 450 500 0 50 100 150 200 250 RFU comprimento de onda () nm
Tabela 2. Espectros de excitação e emissão para os compostos 4a,b,c,d obtidos utilizando H2O como solvente. (4a) ex: 250 e 312 nm em: 407 nm 200 250 300 350 400 450 500 550 600 0 100 200 300 400 500 600 700 800 RFU comprimento de onda (nm) espectro de emissao espectro de excitaçao (4b) ex: 240 e 306 nm em: 379 nm 250 300 350 400 450 500 0 100 200 300 400 500 RFU comprimento de onda () nm (4c) ex:250 e 342 nm em: 456 nm 200 250 300 350 400 450 500 550 600 0 150 300 450 600 750 900 1050 RFU comprimento de onda () nm (4d) ex: 240 e 334 nm em: 427 nm 200 250 300 350 400 450 500 550 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 RFU comprimento de onda () nm
Tabela 3. Espectros de excitação e emissão para os compostos 5a,b e 6a,b obtidos utilizando H2O como solvente. (5a) ex: 258, 316, 389 e 411 nm em: 423 e 446 nm 0 250 300 350 400 450 500 50 100 150 200 250 300 350 400 RFU comprimento de onda () nm espectro de emissao espectro de excitaçao (5b) ex: 244, 275, 332, 421 e 445 nm em: 462 e 487 nm 0 250 300 350 400 450 500 550 600 100 200 300 400 500 600 RFU comprimento de onda () nm (6a) ex: 258, 317, 389 e 411 nm em: 423 e 447 nm 250 300 350 400 450 500 550 600 0 50 100 150 200 250 300 RFU comprimento de onda () nm (6b) ex: 242, 275, 330, 421 e 445 nm em: 462 e 487 nm 250 300 350 400 450 500 550 600 0 50 100 150 200 250 300 350 RFU comprimento de onda () nm
Tabela 4. Parâmetros fotofísicos e estudo teórico dos compostos 3a,b,c,d, 4a,b,c,d, 5a,b e 6a,b [48, 50, 51, 52]. Composto ex (nm) em (nm) Deslocamento de Stokes Experimental b Energia a Diferença entre LUMO e HOMO (eV) a ϕ (%) c HOMO (eV) LUMO (eV) 3a Teórico a 329 372 73 -5.68 -1.43 4.25 5,4 Experimental b 320 393 5a Teórico a 386 416 12 -5.72 -2.03 3.69 12,5 Experimental b 411 423 3c Teórico a 353 405 114 -5,85 -1,93 3,91 0,54 Experimental b 342 456 5b Teórico a 405 432 17 -5,91 -2,42 3,48 12,0 Experimental b 445 462 4a Teórico a 333 374 95 -5,60 -1,39 4,21 20,8 Experimental b 312 407 6a Teórico a 388 420 12 -5,65 -1,99 3,66 18,0 Experimental b 411 423 4c Teórico a 359 408 114 -5,75 -1,89 3,86 42,0 Experimental b 342 456 6b Teórico a 408 435 17 -5,83 -2,38 3,45 18,0 Experimental b 445 462 3b Teórico a 324 371 67 -5,88 -1,51 4,36 19,5 Experimental b 314 381 3d Teórico a 344 403 95 -6,07 -2,01 4,07 1,7 Experimental b 337 432 4b Teórico 324 371 73 -5,83 -1,46 4,37 38,5 Experimental b 306 379 4d Teórico 348 405 96 -5,93 -1,92 4,02 13,5 Experimental b 331 427
a valor teórico b valores experimentais – experimentos realizados utilizando água como solvente. c Rendimento quântico calculado - padrão utilizado: solução de sulfato de quinino, 1ppm, em H2SO4 0,5 mol/L
3.2.2. Estudo do incremento de fluorescência após adição da
cadeia alquílica
Quando analisamos o efeito da adição da cadeia contendo 3 carbonos e um OH terminal, notamos um perfil geral para todos os compostos: um aumento considerável da intensidade de fluorescência (RFU) após a adição da cadeia (Tabela 5, Figura 11); assim como relatado por Velázquez-Olvera et al. [33] em estudos envolvendo compostos semelhantes aos apresentados neste trabalho. Por conseguinte, isto sugeriu uma possível aplicação dos compostos como sondas fluorescentes para detecção de álcool-desidrogenases (ADH), importantes enzimas associadas aos mais diversos fenômenos do metabolismo celular (como será posteriormente discutido no Capítulo III desta tese).
Tabela 5. Relação entre as intensidades de fluorescência dos compostos sintetizados com e
sem a cadeia alquílica com notável aumento na intensidade de fluorescência após adição da cadeia.
Composto Intensidade de Fluorescência (u.a.) a
Razão entre as intensidades de fluorescência b 3a 12023 1:1,67 4a 20134 3b 6707 1:2,28 4b 15306 3c 495 1:39,29 4c 19449 3d 618 1:53,39 4d 32999 5a 4675 1:2,28 6a 10640 5b 9430 1:3,26 6b 30747
a unidades arbitrárias b razão: (intensidade de fluorescência sem grupo alquil /
intensidade de fluorescência com grupo alquil).
Condições: 10 µM de substrato em Tampão Tris/HCl, 50 mM, pH 7
300 350 400 450 500 550 600 0 4000 8000 12000 16000 20000 24000 RFU emissao (nm) 3a 4a 3b 4b 5a 6a a) 350 400 450 500 550 600 0 4000 8000 12000 16000 20000 24000 RFU emissao (nm) 5b 6b 3d 4d 3c 4c b) c)
Figura 11. Espectros de excitação e emissão para os a) compostos imidazopiridínicos e b)
imidazopirimidínicos, mostrando o considerável incremento de fluorescência após a adição da cadeia alquílica. Em c), uma representação de soluções dos compostos 3c e 4c (1 mM em DMSO) sob radiação UV de 354 nm com suas respectivas CCD reveladas sob radiação UV de 254 nm, mostrando visualmente o incremento de fluorescência após adição da cadeia alquílica.
3.3. Testes enzimáticos com enzimas comerciais para detecção
de álcool-desidrogenases (ADH)
O design dos compostos sintetizados apresenta um espaçador alquil de 3 carbonos e isto permite a investigação de aplicações destes fluoróforos como sondas fluorescentes para investigação de ADH [2]. Assim, esperar-se-ia que, após oxidação do OH terminal, via ADH, o aldeído formado sofreria uma -eliminação culminando na liberação do produto não fluorescente (Esquema 7). Este mecanismo em cascata de clivagem de sondas para detecção de atividade enzimática já é relatado na literatura e tem sido aplicado por nosso grupo de pesquisas no desenvolvimento de sondas para o monitoramento de diferentes enzimas [2, 9, 10, 12] (como será posteriormente
discutido nos Capítulos II e III desta tese, com sondas que utilizam a resorufina e a umbeliferona como sensor).
Esquema 7. Cascata químio-enzimática esperada para os compostos sintetizados.
Para os testes enzimáticos, elencaram-se os compostos 3c-4c, 3d-4d e 5b-6b, uma vez que estes apresentaram o maior valor de incremento de fluorescência, como apresentado na Tabela 5. Os ensaios foram realizados de acordo com um protocolo padrão de análises já utilizado pelo nosso grupo de pesquisas (ver item 1.3, pág. 99, dos Materiais e Métodos).
Não foram observadas diminuições nas intensidades de fluorescência nos experimentos realizados. Assim, os resultados obtidos mostraram que os compostos avaliados não se apresentaram viáveis para detecção de ADH. Outras aplicações como o estudo do efeito citotóxico destes compostos frente a linhagens tumorais, como também estudos direcionados quanto a suas aplicações como marcadores celulares estão sendo investigadas junto ao grupo de Pesquisas da Profa. Cátia Ornelas, no Instituto de Química da UNICAMP.
4. CONCLUSÕES
Este trabalho apresentou a síntese de 12 compostos derivados de imidazopiridinas e imidazopirimidinas, com promissoras propriedades fluorescentes. Além das caracterizações estruturais (massas, IV, e RMN) suas caracterizações fotofísicas (bandas de excitação e emissão e rendimentos quânticos de fluorescência) foram também atribuídas, tanto em nível teórico e, quando possível, em nível experimental.
Apesar dos baixos rendimentos sintéticos encontrados, foi possível obter os compostos 5a e 5b, via aquecimento assistido por micro-ondas. Ainda, como previsto através de cálculos teóricos, os cicloadutos 5a e 5b formados apresentaram maiores comprimentos de onda de excitação quando comparados aos seus precursores. Tal fenômeno pode ser atribuído ao aumento da conjugação do sistema, o que provoca uma diminuição da diferença de energia entre o HOMO e o LUMO (também prevista através de cálculos teóricos) e, consequentemente, torna possível a obtenção de derivados com comprimentos de onda maiores (efeito batocrômico).
Além disso, constatou-se que a inserção de uma cadeia de 3 carbonos com OH terminal aos fenóis para e meta substituídos das moléculas sintetizadas, via esterificação de Williamson, resultaram em compostos com intensidades de fluorescência consideravelmente maiores quando comparados aos seus precursores sem cadeia. Tal observação sugeriu uma aplicação como sonda fluorescente para detecção de ADH em sistemas biológicos. No entanto, até o presente momento, não foi possível comprovar esta hipótese com os sistemas biológicos (enzimas comerciais) empregados neste trabalho.
