ESTRATÉGIA DE SÍNTESE DE FENÓIS E DERIVADOS POLIFUNCIONAIS COM PROPRIEDADES ANTITUMORAIS E BAIXA TOXICIDADE
Trabalho dedicado aos 70 Aniversários do Prof. Dr. Klaus Peseke
José Agustín Quincoces Suárez Mestrado Profissional em Farmácia, Universidade Bandeirante, São Paulo, SP, Brasil
RESUMO
Neste artigo se apresenta um resumo dos principais resultados obtidos em várias patentes, publicações e trabalhos apresentados em Congressos Internacionais nos últimos anos. Este trabalho descreve a estratégia de síntese usada para a obtenção de fenóis e derivados polifuncionais com destacadas propriedades antitumorais e baixa toxicidade. Estes compostos foram obtidos guiados pelos resultados de delineamento racional de fármacos mediante os programas computacionais TOPS-MODE, bem como, levando em consideração as características estruturais e os resultados biológicos de vários fenóis e derivados descritos na literatura. Nesta estratégia foram desenvolvidos métodos de síntese e purificação simples e não caros. Este fato é muito importante para a possível produção na Indústria Farmacêutica destes compostos antitumorais líderes.
Palavras chaves: Estratégia Sintética; Fenóis Polifuncionais; Antitumorais; Baixa Toxicidade
INTRODUÇÃO
Na busca de novos princípios ativos “líderes de compostos” com potencial atividade antitumoral o sintético orgânico esforça-se no desenvolvimento de novos procedimentos de obtenção destes compostos, que apresentem uma alta seletividade, isto significa, poder citotóxico destacado contra linhagens tumorais e a mais baixa toxicidade possível contra células sadias do organismo. Se a pesquisa está orientada para potenciais aplicações na Indústria Farmacêutica, é recomendável que estes produtos sejam obtidos a partir de matérias primas baratas e de fácil acesso e os procedimentos sintéticos e de purificação, utilizados na obtenção destas substâncias bioativas, sejam assimilados pela Indústria sem grandes dificuldades tecnológicas para garantir uma produção em maior escala.
Como desenvolver uma estratégia de síntese para atingir estes três grandes objetivos de forma simultânea?
O primeiro trabalho publicado que nos chamou a atenção foi o artigo publicado por Aga e colaboradores (1). Eles foram os primeiros a relatar em 1994 o isolamento dos ácidos 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico (Artepillin C), 3-prenil-4-hidroxicinâmico e 3-(2,2-Dimetil-2H-cromen-6-il)-acrilico. Estes compostos exibiram propriedades antimicrobianas, destacando-se entre eles pela sua bioatividade, o ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico com os seguintes valores de Concentração Inibitória Mínima em μg/mL:
Correspondência para:
Tabela 1. Atividade antimicrobiana de compostos isolados da própolis brasileira. Composto B. cereus E. aerogenes A. benhamiae ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico 15.6 31.3 15.6 ácido 3-prenil-4-hidroxicinâmico 2.3 62.5 >250 ácido 3-(2,2-Dimetil-2-H-cromen-6-il)-acrilico 125 125 62.5
Como pode observar-se na tabela 1, o composto com maior número de grupos C-prenilas ligadas ao anel aromático apresenta a melhor atividade antimocrobiana.
Em segundo lugar deve-se destacar que Banskota e colaboradores (2) isolaram constituintes da própolis brasileira e determinaram a sua atividade citotóxica. Foram estudados vários compostos contra linhagens de células tumorais humanas do tipo HT-1080 (fibrosarcoma) e L5-26 (carcinoma de colon), obtendo os seguintes resultados: Tabela 2. Citotoxicidade de alguns compostos isolados de própolis brasileira
Nome do composto HT-1080 Colon L5-26
Ácido 3-hidroxi-2,2-dimetil-8-prenilcromano-6-propenóico 71.53 77.07 Acido 2,2-dimetil-8-prenil-2H-1-benzopirano-6-il)-2-propenóico 46.86 50.22 Acido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico 45.47 59.32 Ácido 4-dihidro-cinamoiloxi-3-prenilcinâmico 25.94 77.90 Como pode observar-se o composto com maior número de grupos C-prenilas e grupo OH fenólico livre apresenta a melhor atividade antiproliferativa, neste caso trata-se também do ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico.
O coletivo encabeçado por Yagi (3) também isolou da própolis brasileira novos compostos prenilados derivados do ácido p-cinâmico (ácido 4-hidroxi-3-(E)-(4-hidroxi-3-metil-2-butenil)-5-prenilcinâmico, Capillartemisin A) e do ácido caféico (ácido 3,4-diidroxi-5-prenilcinâmico). Este último composto 4 apresenta uma atividade antioxidante superior à exibida pelo Artipillin C (compare os valores dos compostos 1 e 4 colocados na tabela 3). Neste mesmo artigo comparam-se as propriedades antioxidantes de vários compostos prenilados e não prenilados isolados da própolis brasileira com amostras de reconhecidos padrões antioxidantes.
A partir destes resultados poderíamos realizar as seguintes conclusões parciais:
Os compostos prenilados apresentaram uma maior atividade antioxidante em comparação com seus análogos não prenilados (compare 1, 3, 4 e 5 com 6, 7 e compare 11 com 12 e 13 ).
Quando o grupo OH de compostos prenilados está substituído sua atividade antioxidante decresce (compare 2 com 1, 3, 4 e 5).
Ao analisar os diferentes derivados do ácido cinâmico prenilados, podemos comprovar que os compostos que possuem um número maior de grupos OH ligados ao anel benzênico apresentam uma atividade antioxidante maior (compare 4 com 1, 2, 3 e 5). Na família dos derivados do ácido cinâmico não prenilados, os compostos que possuem um número maior de grupos OH ligados ao anel benzênico têm uma atividade antioxidante maior (compare 10 com 9, 8, e 7).
Os compostos prenilados que possuem uma dupla ligação conjugada exocíclica ligada ao grupo COOH têm uma atividade antioxidante superior em relação aos compostos que não possuem a mesma (compare 3 com 11).
Os compostos não prenilados que possuem uma dupla ligação conjugada exocíclica ligada ao grupo COOH têm uma atividade antioxidante superior em relação aos compostos que não possuem a mesma (compare 7 com 13).
Quando aumenta o número de grupos OMe ligados ao anel benzênico, os compostos têm uma maior atividade antioxidante (compare 9 com 8 e 7).
Na medida que aumenta o número de grupos C-prenilados ligados ao anel benzênico, incrementa-se a atividade antioxidante (compare 1 com 3).
Tabela 3. Inibição da per oxidação do ácido linoléico mediante o emprego de compostos prenilados antioxidantes da própolis brasileira, em comparação com compostos derivados do ácido 4-hidroxi-cinâmico e ácidos fenólicos análogos.
Composto Número IC50 (μM) 1 Ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico 0,44 2 Ácido 3-prenil-4-dihidrocinamoloxi-cinâmico 160 3 Ácido 4-hidroxi-3-prenilcinâmico 2,9 4 Ácido 3,4-dihidroxi-5-prenilcinâmico 0,17 5 Ácido 4-hidroxi-3-(E)-4-hidroxi-3-metil-2-butenil)-5-prenilcinâmico 0,60
Derivados do ácido cinâmico não prenilados
6 2,2-dimetil-6-carboxietenil-2H-1-benzopirano 56 7 Ácido 4-hidroxi-cinâmico (ácido p-cumárico) 17 8 Ácido 4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico (ácido ferúlico) 2,1 9 Ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinâmico (ácido sinapico) 0,80 10 Ácido 3,4-dihidroxi-cinâmico (ácido cafeico) 0,41 Derivados do ácido p-hidroxibenzoico prenilados e não
prenilados 11 Ácido 4-hidroxi-3-prenilbenzóico 24 12 Ácido p-hidroxibenzóico 50 13 Ácido p-hidroxifenilpropiônico 90 Padrões antioxidantes 14 Quercetina 0,68 15 Ácido clorogênico 0,28 16 Ácido elágico 0,23
No trabalho publicado por Banskota e colaboradores (2) podemos apreciar também que o coniferaldeído apresentou uma maior citoxicidade que a vanilina, o que constitui outro exemplo que revela que a existência de uma dupla ligação C=C exocíclica contribui a elevar o poder antiproliferativo das moléculas.
Um grupo numeroso de autores (4-13) conseguiu isolar produtos naturais prenilados bioativos a partir de vários tipos de plantas. Merecem destaque os trabalhos de Bohlmann e colaboradores. Também em plantas do gênero Baccharis foi encontrada a presença dos ácidos 3-Prenil- e 3,5-Diprenil-p-cumárico. Adicionalmente este grupo isolou e caracterizou várias Hidroxiacetofenonas preniladas em um número significativo de plantas, por exemplo, a partir de Helianthella uniflora, Gerbera, Gerbera piloselloides Cass., Eupatorium-gruppe, Lagascea Rigida, Chilean Senecio Species. Estas hidroxiacetofenonas preniladas também foram detectadas somente na Própolis brasileira (14) mediante o emprego da técnica Crom-Mass. Por esta razão suas propriedades biológicas não foram estudadas.
Desde longa data os povos principalmente asiáticos vinham usando alguns corantes isolados de varias espécies da Curcuma principalmente como aditivos alimentares e temperos. Devido a este fato foi de nosso interesse pesquisar os compostos que formam parte desta planta, pois os mesmos devem exibir uma baixíssima toxicidade. A partir da curcuma domestica foram isolados compostos com alta conjugação eletrônica, tais como, curcumina e várias pentadienonas, que exibiram propriedades antioxidantes e antiinflamatórias (15).
Como podemos observar muitos dos Produtos Naturais isolados da Própolis e Plantas exibiram relevantes propriedades farmacológicas, tais como: antitumorais, entre outras atividades biológicas de grande importância. Devido a estes destacados resultados biológicos e ao fato de que estes compostos naturais bioativos encontram-se numa faixa de concentração muito baixa e em alguns casos misturados com substâncias de difícil separação, houve um forte aumento no número de trabalhos sintéticos envolvendo reações de obtenção destes princípios ativos nos últimos anos para garantir os necessários estudos pré-clínicos e de caracterização estrutural. Deve-se ressaltar que nem todos estes trabalhos de síntese de produtos naturais bioativos estão orientados para possíveis aplicações na Indústria Farmacêutica, pois encontramos vias de síntese bastante complexas e de difícil produção numa escala superior.
A síntese realizada por Hori e colaboradores (16) do ácido 3,5-Diprenil-p-cumárico é um exemplo do anteriormente exposto. Eles sintetizaram este produto natural partindo do p-Halofenol diprenilado, isolado a partir de uma mistura de produtos prenilados de difícil separação e acrilato de metila segundo o método de síntese de Mizoroky-Heck. F. Bohlmann e colaboradores (17) desenvolveram uma variante sintética para introduzir grupos prenilas em produtos naturais. Por exemplo, estes autores partindo de p-Hidroxiacetofenona e 3-Cloro-3-metil-butino-1 em presença de KI/K2CO3/DMF,
conseguiram obter o correspondente 1-[4-(1,1-Dimetil-prop-2-iniloxi)-fenil]etanona intermediária, a qual mediante as condições de hidrogenação parcial transformou-se no produto intermediário [4-(1,Dimetil-aliloxi)-fenil]etanona. Finalmente se forma 1-[4-Hidroxi-3-(3-metil-but-2-enil)-fenil]etanona com um 79% de rendimento a partir do derivado alílico sob as condições de reação do rearranjo de Claisen. Como desvantagem deste procedimento pode-se colocar a difícil hidrogenação parcial catalítica, que em algumas ocasiões conduz a misturas de produtos de difícil separação.
A síntese da 1,5-Bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-penta-1,4-dien-3-ona foi realizada por vários autores (18,19), mas os procedimentos de obtenção empregados são de baixo rendimento e pureza e empregam tempos de reação prolongados, o que não é atrativo para a Indústria Farmacêutica.
Com o objetivo de sintetizar somente aqueles compostos naturais e seus derivados com alto potencial bioativo é usado hoje em dia o Delineamento Racional de Fármacos. Em particular o programa computacional TOPS-MODE (TOPological Substructural MOlecular DEsign) desenvolvido por Estrada e colaboradores (20-24) prediz quais das substâncias naturais e seus derivados possuem a maior probabilidade de exibir uma ação biológica específica.
Os primeiros trabalhos de obtenção de produtos naturais e seus derivados realizados na Universidade Bandeirante do Brasil, orientados pelos resultados do delineamento de fármacos “Drug Design”, levaram em consideração que a Própolis constitui um conjunto de produtos naturais coletados pelas abelhas das diversas plantas de seu habitat para preparar esta mistura protetora de suas colméias. Também todos sabem que as abelhas, junto a peixes e aves, constituem indicadores muito sensíveis de toxicidade. Isto significa que os produtos químicos que estão em contato direto com estes insetos não devem ser tóxicos e isto já foi comprovado pelos povos que usaram a Própolis nas
mais diversas regiões deste Planeta para curar suas doenças. Então uma boa escolha de produtos naturais a serem sintetizados está relacionada com produtos orgânicos existentes na Própolis e em algumas Plantas com aplicações na Indústria alimentícia, pois os compostos não apresentam toxicidade significativa e suas aplicações biológicas já foram relatadas durante um longo período de tempo e numa faixa de aplicação muito extensa.
MATERIAIS E MÉTODOS.
Os materiais e métodos empregados para desenvolver estas pesquisas já foram colocados nas patentes e publicações indicadas nesta publicação.
Observação:
Linhagens tumorais citadas neste artigo: Pulmão NCI460, Mama normal MCF-7, Mama que expressa fenótipo de resistência a múltiplas drogas NCIADR, Melanoma UACC-62, Leucemia K-5UACC-62, Cólon HT-29, Renal, 786-0, Ovário OVCAR-3, Próstata PC-3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO.
A seguir relatamos os principais resultados obtidos pelo nosso coletivo interdisciplinar de trabalho na área da síntese de substâncias naturais e derivados com propriedades antitumorais e que já foram reportadas em varias patentes, publicações e trabalhos apresentados em Congressos Internacionais.
A partir dos trabalhos de delineamento de fármacos projetamos a síntese de um composto C-prenilado, o 6-(3-metilbut-2-enil)-cromona-3-carbaldeído 4, que segundo predições TOPS-MODE (25) tinha uma probabilidade de atividade antitumoral igual a +59,2. No esquema 1 mostra-se a seqüência de reações empregadas, a reação de O-prenilacão partindo da o-hidroxiacetofenona para obter 2, o rearranjo de Claisen para formar o composto natural existente na Própolis brasileira 3 e finalmente a reação de Vilsmeier-Haack para sintetizar o composto potencialmente antitumoral 4.
OH O Br K 2CO3, DMF, 40 oC O O OH O + PhN(Et)2, 216 oC 1 2 3 O CHO O DMF, POCl3,45 oC 4
Esquema 1. Estratégia de Síntese empregada para a obtenção do composto 4. Linhagens de Células Humanas testadas IC50 (μg/mL)
Composto
NCI460 UACC62 MCF7 NCIADR 2 25.0 45.0 25.0 8.0 3 9.0 4.2 6.0 6.0
4 30.0 32.0 11.0 34.0
A atividade antitumoral da hidroxiacetofenona C-prenilada 3 tinha sido estimada com uma baixa probabilidade (somente 12,8%), mas resultou ser o produto mais ativo frente a outras 11 linhagens de células tumorais humanas com uma IC50 media de 8,41 μg/mL
e muito mais seletivo, pois apenas afetou a linhagem de fibroblastos WI38. Isto confirma a existência de excelentes produtos antitumorais na Própolis brasileira com baixa toxicidade e coincide com as nossas observações de que determinados grupos funcionais são essenciais para uma atividade biológica destacada. Neste caso este composto 3 apresenta um grupo OH fenólico livre e possui um grupo C-prenila ligado diretamente ao anel aromático. Ao mesmo tempo estes novos resultados enriquecem a base de dados TOPS MODE para realizar novos achados de compostos “compostos lideres” na Síntese Orgânica (Lead Compounds in Organic Synthesis).
Outro resultado que merece destaque foi a obtenção da 1,5-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-penta-1,4-dien-3-ona e derivados, partindo da vanilina e acetona sob irradiação ultrasônica (US) na presença de ácido clorídrico concentrado. A estratégia de síntese aparece no Esquema 2. CHO MeO HO O + HCl US O MeO HO OMe OH 5
Esquema 2. Estratégia de Síntese empregada para a obtenção do composto 5. Este produto foi testado inicialmente frente a quatro linhagens de células tumorais humanas exibindo os seguintes resultados:
Valores de IC50 expressos em μg / mL
Composto NCI460 UACC62 MCF7 NCIADR
5 0,5 0,03 0,04 0,27
Tabela 2. Atividade antitumoral exibida pelo composto 5:
Levando em consideração estes excelentes resultados foram sintetizados vários derivados deste composto e foi ampliado o número de linhagens tumorais nestes estudos in vitro. 5 O MeO MeO OMe OMe O MeO MeOCO OMe OCOMe C(CN)2 MeO HO OMe OH O MeO O OMe O a b c d
a = Anidrido acetico, NaAc; b = CH2(CN)2, NH4Ac, HAc; c = MeI, KOH ; d = Brometo de prenila, DMF, K2CO3
6
7 8
9
Composto Linhagens Celulares Humanos testados IC50 (μg/mL) UACC62 MC7 NCIADR 786-O NCI46 0 K562 PC03 OVCAR 03 HT29 5 0,03 0,04 0,27 0,65 0,5 0,6 0,41 0,72 0,75 6 1,77 0,45 1,28 0,27 0,7 0,58 0,39 0,57 0,61 7 1,25 1,96 1,11 2,67 2,58 2,84 1,59 43 1,26 8 0,75 0,71 0,84 1,19 0,66 0,65 0,82 0,82 0,86 9 14,16 8,43 3,34 3,64 15,8 2,22 27,99 14 1,87
Tabela 3. Atividade antitumoral exibida pelo composto 5 e derivados
Inicialmente este produto 5 foi obtido pela nossa equipe com 92% de rendimento (26), usando um método de purificação simples e barato que consiste em dissolver o produto bruto em solução de NaOH, filtrar e o filtrado ser acidificado com HCl concentrado. Esta operação se repete mais uma vez obtendo-se uma alta pureza sem usar colunas cromatográficas, cujo processo de purificação não é preferido na Indústria Farmacêutica, mas se apresentava a desvantagem que o processo de síntese e purificação durava sete dias. Este inconveniente foi resolvido satisfatoriamente (27) empregando um volume de ácido superior, o que facilita a agitação da mistura de reação e ajuda a diminuir consideravelmente o tempo de reação (somente um dia), o que poderia facilitar a possível produção deste principio ativo numa escala superior pela Indústria Farmacêutica.
Levando em consideração estes destacados resultados foi realizado o Teste de Toxicidade Aguda aos compostos 5 e 6, alcançando-se 8,54 e 3,68 g/Kg, respectivamente. Estes são valores de toxicidade baixos, o que confirma a nossa estratégia de síntese que os fenóis polifuncionais e derivados com alta conjugação eletrônica apresentam alta seletividade antiproliferativa.
Posteriormente foram realizados estudos antitumorais in vivo com o composto 5 (vide Figura 1 e 2, onde pode comprovar-se a atividade in vivo exibida por este composto). Análise da capacidade inibitória (volume tumoral) do composto 5 ou HB1 diluído em Miglyol 810 em tumores de melanoma implantados em camundongos C57BL/6J, tratados pela via intraperitoneal.(1,15 μg/kg diários).
Figura 1
Figura 2
Nossos resultados mostraram alta significância na redução dos parâmetros tumorais (volume e área), após o tratamento com o composto 5 (HB-1) diluído em Miglyol 810. Durante o tratamento observamos que os animais que receberam este composto diluído em Miglyol 810 não apresentaram, em nenhum momento, crescimento exponencial do tumor dorsal o que ocorreu com o grupo controle que recebeu somente o Miglyol 810. A porcentagem inibitória do tratamento do melanoma B16F10 foi superior a 98%, o que mostra claramente sua eficácia na redução e inibição da proliferação tumoral.
Devido ao fato de que o composto 5 apresenta uma baixa solubilidade em água foi necessário empregar dimetilsulfóxido e Miglyol 810 para realizar estes estudos antitumorais in vivo, mas tivemos dificuldades com o primeiro solvente por ser muito tóxico e com o segundo por não poder-se injetar em altas concentrações nos animais de experimentação, pois causa embolias.
Ante estas limitações surgiu a idéia de transformar o fenol 5 em seu correspondente sal monosódico 10 (DM-1) (28). O MeO OMe HO O Na 10
A formação desta ligação iônica aumentou de forma significativa a solubilidade deste princípio ativo em meio aquoso, facilitando a realização de novos estudos farmacológicos e toxicológicos.
Nossos resultados (Figura 3) mostraram que a formulação do composto 10 DM-1 aumentou significativamente a resposta citotóxica em células de melanoma B16F10, apresentando uma IC 50% = 1.9μg/mL. In vitro sua eficácia aumentou em torno de 7,0
vezes com relação ao composto 5.
Figura 3
Análise dos Efeitos Citotóxicos pelo método do MTT e Anti-Proliferativos do Composto 10 (DM-1) e Controle sobre Células de Melanoma Murino B16F10.
A análise da capacidade inibitória (volume tumoral) do composto 10 ou DM-1 diluído em água em tumores de melanoma implantados em camundongos C57BL/6J, tratados pela via intraperitoneal e endovenosa, mostra que este composto apresenta uma atividade antitumoral in vivo significativamente superior (29) ao composto 5.
Camundongos Balb-C foram pesados e acondicionados no biotério, subdivididos em grupos de 05 animais por gaiola e após duas semanas receberam o composto 10 ou DM-1 em diferentes concentrações pela via endovenosa. O composto foi administrado em volume de 0,2 mL utilizando seringa de insulina, em todas as concentrações, pelo plexo retro-orbital. Após sua administração não foi observada alteração comportamental, como diminuição da motilidade, prostração, dificuldade no ritmo respiratório ou choque endovolêmico.
Após 24 horas foi observada a mortalidade e a perda do peso corpóreo total dos animais tratados para a determinação da máxima dose tolerável (MTD); este grupo de animais foi observado por 60 dias.
Nossos resultados mostraram que a dose de 14 mg/Kg é a dose letal 50% (DL50) como
necropsia aos 30 dias não foram observadas alterações macroscópicas e histopatológicas dignas de nota nos órgãos internos.
Após a análise dos dados de atividade antitumoral e toxicidade in vivo anteriormente discutidos, pode-se realizar um breve comparativo da ação das penta-1,4-dien-3-onas e seus derivados com os fármacos atualmente aplicados na terapêutica como a doxorrubicina, o taxol e o etoposídeo.
O composto 10 (DM-1) apresenta valor de DL50 inferior quando comparado aos
exibidos pelo Taxol (1,75 vezes menor) e pela Doxorrubicina (35 vezes menor).
O DM-1 não apresentou, durante os testes pré-clínicos, qualquer efeito sugestivo de toxicidade respiratória e cardíaca aguda o que se constitui em grande vantagem para a exploração da série como potenciais fármacos antitumorais com menores efeitos colaterais.
Agradecimentos
Agradeço a todos os meus colaboradores científicos que aparecem nas patentes, publicações e trabalhos apresentados em Congressos Internacionais colocadas nas referências bibliográficas deste artigo, assim como a UNIBAN, DAAD (4 auxílios aprovados) e a FAPESP (17 auxílios aprovados) pelo apoio financeiro outorgado para a realização de estas pesquisas aplicadas.
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