Jaqueline Seugling
DESENVOLVIMENTO DE NANOEMULSÃO DE Baccharis dracunculifolia (ASTERACEAE) E SUA ATIVIDADE LARVICIDA SOBRE PRÉ PUPAS DE Cochliomyia hominivorax
(DIPTERA: CALLIPHORIDAE)
Florianópolis 2018
Dissertação submetida como requisito final para a obtenção do grau de Mestre em Agroecossistemas pelo Programa de Pós-graduação em Agroecossistemas da Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientadora: Prof.ª Dra. Patrizia Ana Bricarello Co-orientadora: Prof.ª Dra. Shirley Kuhnen
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
Seugling, Jaqueline
Desenvolvimento de nanoemulsão de Baccharis dracunculifolia (Asteraceae) e sua atividade larvicida sobre pré pupas de Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae) / Jaqueline Seugling ; orientador, Patrizia Ana
Bricarello, coorientador, Shirley Kuhnen, 2018. 73 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Agroecossistemas, Florianópolis, 2018.
Inclui referências.
1. Agroecossistemas. 2. Sanidade animal. 3. Fitoterapia. 4. Nanotecnologia. I. Bricarello, Patrizia Ana. II. Kuhnen, Shirley. III.
Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Agroecossistemas. IV. Título.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer em primeiro lugar, a Deus, por ter me sustentado até aqui! Jamais poderia ter chego aonde estou sem o seu amparo!
Agradeço também a minha família, em especial aos meus pais, que sempre me incentivaram na carreira acadêmica, por todo carinho e amor incondicional, eu amo vocês, e serei eternamente grata! Obrigada por ainda se dedicarem a mim!
Agradeço ao meu namorado Marcos, pela compreensão, cumplicidade, respeito, amor e apoio oferecidos, não somente nesses dois anos, mas desde o dia em que se tornou parte da minha vida.
Agradeço a minha coorientadora Shirley pela oportunidade e parceria, por estar sempre disposta a ajudar a solucionar os problemas com o decorrer do experimento, além de todo seu apoio com as reclamações da colônia. Obrigada pela sua compreensão e dedicação.
Agradeço a minha orientadora Patrizia, por estar sempre prontificada a me ajudar, fazendo de tudo para que pudéssemos permanecer no Laboratório de Parasitologia, por ter suportado todas as inúmeras reclamações e desavenças ocorridas durante o período de experimento. Obrigada por acreditar em mim, pela confiança depositada, pelos ensinamentos, e principalmente, por todo seu carinho. Para mim foi mais do que uma orientadora, uma grande amiga!
Agradeço aos meus amigos Andrey e Giuliano, por todo comprometimento com a manutenção da colônia, mesmo com os inúmeros problemas que surgiram ao longo do tempo, sem apoio e ajuda de vocês, tudo teria sido mais difícil. Pela compreensão para realização dos testes, ocorrido na maioria das vezes nos finais de semana. Por todo companheirismo e amizade, com certeza sem vocês, tudo teria sido mais trabalhoso e sem graça, é muito gratificante realizar uma pesquisa que se gosta, e ter uma equipe que anseia pelo mesmo é extraordinário. Muito Obrigada!
A minha amiga Samira, por estar sempre presente comigo no dia a dia, escutando minhas mazelas e alegrias, sempre muito compreensiva e disposta a ajudar, obrigada por todo seu zelo com a nossa amizade!
Agradeço a Letícia Mazzarino, por estar sempre solicita e poder me auxiliar no desenvolvimento das nanoemulsões, compartilhando suas experiências na área de nanotecnologia.
Agradeço a Bia, por sua ajuda durante o experimento e principalmente com o espectrofotômetro.
A Juliana Zanatta, por me disponibilizar gentilmente seu computador e programa.
A Monique que foi requisita no final do experimento, porém não menos importante, sempre bem-humorada e simpática, obrigada por compartilhar comigo seu conhecimento e por toda a sua ajuda.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Iniciação Cientifica (CNPq) pela concessão de bolsa e pelos recursos para realização deste projeto.
Ao Dr. Luís Rangel e a APC do Brasil por me disponibilizar amostras de hemácias spray dried que serviram para o desenvolvimento deste projeto e manutenção da colônia.
Ao Dr. Thiago Mastrangelo, por poder compartilhar conosco sua experiência, mostrando - se sempre solicito a sanar minhas inúmeras dúvidas ao longo do tempo.
RESUMO
A mosca Cochliomya hominivorax é a principal espécie causadora de miíase primária nos animais de sangue quente, inclusive humanos, sendo popularmente conhecida como mosca da bicheira. O uso contínuo dos produtos convencionais para o controle desse ectoparasita nos sistemas de produção animal, além de deixar resíduos em alimentos de origem animal, contribui para a degradação dos agroecossistemas. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma nanoemulsão a partir do óleo essencial de Baccharis dracunculifolia e avaliar in vitro o seu efeito sobre as larvas pré pupas de C. hominivorax. A técnica utilizada no desenvolvimento que resultou em uma nanoemulsão com maior teor de óleo essencial encapsulado (15%, m/v) foi a homogeneização de alta pressão (500 bars durante um minuto, equivalente a três ciclos de homogeneização). O diâmetro de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, pH e morfologia foram determinados após o preparo da formulação e durante 120 dias de armazenamento a temperatura ambiente. Os testes larvicidas foram realizados em recipientes de vidro (9 cm altura x 4 cm de diâmetro), contendo papel filtro impregnado com os produtos teste (1 mL), utilizando–se 15 larvas/repetição, totalizando 150 larvas por tratamento. Foram testadas 5 concentrações diferentes da nanoemulsão (5%, 7,5%, 10%, 13,5% e 15% m/v). O óleo essencial, nas mesmas concentrações da nanoemulsão foi testado para efeitos de comparação, além de grupos controle (nanoemulsão sem adição do óleo essencial, água destilada, papel filtro sem veículo e Neguvon®). A nanoemulsão foi testada logo após o seu preparo e também após 120 dias de armazenamento. Com a técnica utilizada foi possível obter 99% de eficiência de encapsulação do óleo essencial. A formulação tinha tamanho médio do diâmetro de partícula de 178 nm ± 6,75 nm, índice de polidispersão de 0,226 ± 0,03, potencial zeta de -35,40 mV ± 0,69 mV, pH 3,49 ± 0,02 e formato esférico. As mesmas características foram encontradas na formulação armazenada por 120 dias, exceto para o índice de polidispersão e pH (P<0,05). Apesar dessas pequenas diferenças, a formulação não mostrou sinais de instabilidade. A mortalidade das larvas pela nanoemulsão recém preparada foi 28%, 48%, 70%, 84% e 97%, enquanto que daquela armazenada há 120 dias foi 17%, 36%, 51%, 81% e 92% para as concentrações 5%, 7,5%, 10%, 13,5% e 15%, respectivamente. O efeito larvicida foi similar entre as nanoemulsões, exceto para as concentrações de 5% e 10% (m/v) (P<0,05). A DL₅₀ para a nanoemulsão foi 7,33% e para o óleo essencial foi 12%, mostrando que o encapsulamento do óleo
essencial melhorou a biodisponilidade dos compostos ativos. Com isso, foi possível desenvolver uma nanoemulsão do óleo de B. dracunculifolia estável por até 120 dias, a qual mostrou-se como uma alternativa promissora para o controle de larvas de C. hominivorax em condições de laboratório.
Palavras chave: produtos naturais, sanidade animal, dípteros, alecrim do campo, atividade inseticida, fitoterapia.
ABSTRACT
The Cochliomya hominivorax fly is the main species that causes primary myiasis in warm-blooded animals, including humans, and is popularly known as pinworm fly. The continuous use of conventional products to control this ectoparasite in animal production systems, besides leaving residues in food of animal origin, contributes to the degradation of agroecosystems. Thus, the present work aimed to develop a nanoemulsion from the essential oil of Baccharis dracunculifolia and to evaluate in vitro its effect on the pre-pupae larvae of C. hominivorax. The technique used in the development that resulted in a nanoemulsion with higher content of encapsulated essential oil (15%, m / v) was the homogenization of high pressure (500 bars during one minute, equivalent to three cycles of homogenization). The particle diameter, polydispersity index, zeta potential, pH and morphology were determined after preparation of the formulation and for 120 days storage at room temperature. The larvicid tests were carried out in glass containers (9 cm height x 4 cm in diameter), containing filter paper impregnated with the test products (1 mL), using 15 larvae / repetition, totalizing 150 larvae per treatment. Five different concentrations of the nanoemulsion (5%, 7.5%, 10%, 13.5% and 15% m/v) were tested. The essential oil at the same concentrations of the nanoemulsion was tested for comparison as well as control groups (nanoemulsion without addition of essential oil, distilled water, filter paper without vehicle and Neguvon®). The nanoemulsion was tested shortly after its preparation and also after 120 days of storage. With the technique used it was possible to obtain 99% of encapsulation efficiency of the essential oil. The formulation had mean particle size of 178 nm ± 6.75 nm, polydispersity index of 0.226 ± 0.03, zeta potential of -35.40 mV ± 0.69 mV, pH 3.49 ± 0.02 and spherical shape. The same characteristics were found in the formulation stored for 120 days, except for the polydispersity index and pH (P<0.05). Despite these small differences, the formulation showed no signs of instability. The mortality of the larvae by the newly prepared nanoemulsion was 28%, 48%, 70%, 84% and 97%, whereas that stored 120 days ago was 17%, 36%, 51%, 81% and 92% for the concentrations 5 %, 7.5%, 10%, 13.5% and 15%, respectively. The larvicidal effect was similar between nanoemulsions, except for the concentrations of 5% and 10% (m/v) (P <0.05). The DL₅₀ for the nanoemulsion was 7.33% and for the essential oil was 12%, showing that the encapsulation of the essential oil improved the bioavailability of the active compounds. Thus, it was possible to develop
a stable nanoemulsion of B. dracunculifolia oil for up to 120 days, which proved to be a promising alternative for the control of C. hominivorax larvae under laboratory conditions.
Keywords: natural products, animal health, diptera, field rosemary, insecticidal activity, phytotherapy.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mosca C. hominivorax, fêmea à esquerda e macho a direita...19 Figura 2. A - Aplicação da nanoemulsão de B. dracunculifolia sobre pré pupas de C. hominivorax. B - Finalização do teste larvicida...38 Figura 3. Nanoemulsão de B. dracunculifolia...45 Figura 4. Distribuição de tamanho da nanoemulsão contendo óleo da B.
dracundulifolia obtido em um ângulo de espalhamento de 90º...47
Figura 5. A e B. Caracterização das nanoemulsões através das imagens obtidas pelo TEM...48 Figura 6. A, B, C. Anormalidades morfológicas encontradas em pupas e insetos adultos de C. hominivorax, após a realização do teste larvicida com a nanoemulsão de B. dracunculifolia...50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição das nanoemulsões do óleo essencial de B.
dracunculifolia...36
Tabela 2. Composição química do óleo essencial da B.
dracunculifolia...40
Tabela 3. Diâmetro das partículas, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (mV) e pH das formulações desenvolvidas por emulsificação espontânea e homogeneização de alta pressão...43 Tabela 4. Diâmetro das partículas, índice de polidispersão, potencial zeta e pH das nanoemulsões durante os 120 dias de armazenamento em temperatura ambiente...45
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Análise da mortalidade das pré pupas de C. hominivorax após a aplicação da nanoemulsão da B. dracunculifolia nas concentrações 5%, 7,5%, 10%, 13,5% e 15% (m/v), grupos controles, sem nada, nano branca, água e triclorfon...49
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AChE - Acetilcolinesterase
B. dracunculifolia – Baccharis dracunculifolia
B.O.D - Câmara incubadora B.O.D
C. hominivorax – Cochliomyia hominivorax
OEs – Óleos Essenciais PDI – Índice de polidispersão
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO...15 2. OBJETIVOS...18 2.1. Objetivo geral...18 2.2. Objetivos específicos...18 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...19 3.1. Cochliomyia hominivorax...19
3.2. Utilização de extratos naturais com ação inseticida...24
3.3. Baccharis dracunculifolia...28
3.4. Nanoemulsões...31
4. MATERIAL E MÉTODOS...34
4.1. Estabelecimento da colônia de C. hominivorax...34
4.2. Óleo essencial da B. dracunculifolia...34
4.3. Desenvolvimento da nanoemulsão do óleo essencial da B. dracunculifolia...35
4.4. Caracterização das nanoemulsões...36
4.5. Atividade larvicida da nanoemulsão de B. dracunculifolia....37
4.6. Análise estatística...38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...40
5.1. Composição química do óleo da B. dracunculifolia...40
5.2. Desenvolvimento da nanoemulsão...42
5.3. Estudo da estabilidade da nanoemulsão do óleo de B. dracunculifolia preparada em homogeneizador de alta pressão...44
5.3.1. Análise macroscópica...44
5.3.2. Diâmetro de partícula, potencial zeta, índice de polidispersão e pH...45
5.4. Teste larvicida em pré pupas de C. hominivorax...49
6. CONCLUSÃO...56
1. INTRODUÇÃO
A mosca Cochliomyia hominivorax, conhecida popularmente como “mosca varejeira” e “mosca da bicheira”, é uma das principais espécies causadoras de miíases cutâneas em regiões tropicais e subtropicais do mundo (BRITO et al., 2008). Ao contrário da maioria das outras espécies de moscas, estas não colocam seus ovos em tecidos em decomposição, ao invés disso, depositam seus ovos em tecidos vivos que foram traumatizados de maneira natural ou acidental, como em feridas decorrentes do parasitismo por berne (larvas de Dermatobia hominis) e carrapatos, e por intervenções realizadas através de práticas de manejos, tais como aplicação de vacinas, descornas, castrações, entre outros (HALL; WALL, 1995; BEZZIANA, 2013).
As perdas econômicas causadas pelas miíases, juntamente com as ocasionadas por ecto e endoparasitas, são fatores limitantes para a pecuária Brasileira (CARVALHO et al., 2009). Os gastos gerados pela C.
hominivorax na pecuária brasileira são de R$ 336, 62 milhões/ano (GRISI
et al., 2014). As principais perdas estão relacionadas a mortalidade em bezerros recém-nascidos, redução na qualidade do couro e na produção de leite e carne (CARVALHO et al., 2009). Além das perdas econômicas, as miíases prejudicam também o bem-estar animal, pois, por menor que seja a infestação, atrapalham os hábitos normais do animal, incluindo sua alimentação e descanso. Desta forma, a miíase é considerada uma praga, principalmente em criações de bovinos, ovinos, caprinos e suínos (VARGAS-TERÁN; HOFMANN; TWEDDLE, 2005).
O tratamento preconizado atualmente aqui no Brasil para o controle de miíases consiste na utilização de inseticidas sintéticos (BORJA, 2003). Estes produtos são comumente conhecidos por “mata-bicheira” ou “larvicidas”, tendo em sua composição principalmente organosfosforados e piretróides (ALVES-BRANCO; PINHEIRO; SAPPER, 2001). Porém, o crescimento da resistência juntamente com preocupações ambientais e de saúde, associadas ao uso contínuo de alguns dos inseticidas neurotóxicos existentes, sugerem que novas alternativas de controle precisam ser estudadas (WALLER et al., 2001; BORJA, 2003; WALL, 2007).
A utilização de plantas e seus derivados são métodos terapêuticos originalmente utilizados para o tratamento de doenças, incluindo parasitas, tanto para o homem como para os animais (WALLER et al., 2001). Os óleos essenciais (OEs) têm sido amplamente utilizados desde a Idade Média devido aos seus inúmeros efeitos, tais como bactericida, viricida, fungicida, antiparasitário e inseticida. Nos dias de hoje,
continuam sendo amplamente utilizados nas indústrias farmacêutica, sanitária, cosmética, agrícola e alimentar (BAKKALI et al., 2008). Nos últimos anos, a utilização dos óleos essenciais como inseticidas de baixo risco aumentou consideravelmente devido ao seu uso ter se tornado popular entre produtores orgânicos e consumidores preocupados com o meio ambiente (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012). Desta forma, hoje em dia, os OEs vem sendo requisitados para o desenvolvimento de produtos fitossanitários (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012; PAVELA; BENELLI, 2016).
Dentre as plantas produtoras de OEs, a Baccharis dracunculifolia vem se destacando por suas diversas atividades farmacológicas, tais como antifúngica (PEREIRA et al., 2011), anticariogênica (LEITÃO et al., 2004; PEDRAZZI et al., 2015), antimicrobiana (FERRONATTO et al., 2007; PEREIRA et al., 2016), carrapaticida (DE ASSIS LAGE et al., 2015), antioxidante (FERRONATTO et al., 2006), inseticida e repelente (REICHERT JR et al., 2013). A B. dracunculifolia é um arbusto comumente encontrado nas regiões Sul e Sudeste do Brasil (ALENCAR et al., 2005). É tradicionalmente utilizada pela população para o tratamento de problemas hepáticos e processos inflamatórios, mas também é utilizada pelas abelhas (Apis mellifera) como principal fonte botânica para a produção da própolis verde, a qual é amplamente conhecida, por suas propriedades antimicrobiana e anti-inflamatória (SFORCIN et al., 2012).
De maneira geral, apesar do potencial dos OEs, incluindo o de B.
dracunculifolia no tratamento e no controle de diferentes enfermidades,
estes são extremamente voláteis e suas características físico – químicas dificultam a sua manipulação. Por isso, para otimizar a sua utilização devem ser escolhidas formulações que minimizem a sua evaporação e que protejam o óleo de alta temperatura, oxidação e luz, já que estes fatores podem ocasionar a degradação dos princípios ativos e, portanto, afetar as atividades biológicas de interesse (BILIA et al., 2014).
A nanobiotecnologia é uma tecnologia altamente promissora no desenvolvimento de formulações com extratos naturais, já que melhora a sua estabilidade e eficácia (GHORMADE; DESHPANDE; PAKNIKAR, 2011). Nesta área, existe um interesse crescente nas nanoemulsões, emulsões em que o tamanho das gotículas está em escala nanométrica, devido às suas novas propriedades físico-químicas e maior biodisponibilidade dos ingredientes ativos encapsulados (MASON et al., 2006; MCCLEMENTS, 2011). Apresentam também algumas vantagens, alta estabilidade cinética que pode durar meses, podendo suportar até
alterações climáticas, e podem ser diluídas sem perder sua estrutura inicial (ANTON; BENOIT; SAULNIER, 2008).
Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma nanoemulsão do óleo essencial de B. dracunculifolia e avaliar o seu efeito in vitro sobre a mortalidade de pré pupas de C. hominivorax, visando a utilização de alternativas para tratamento e controle de miíases.
2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral
Desenvolvimento de uma nanoemulsão do óleo essencial de B.
dracunculifolia e avaliação in vitro do seu efeito sobre a sobrevivência de
larvas pré-pupas de C. hominivorax. 2.2. Objetivos específicos
Caracterização química do óleo essencial de B. dracunculifolia; Desenvolvimento de uma nanoemulsão do óleo essencial de B. dracunculifolia;
Caracterização da nanoemulsão quanto ao diâmetro de partícula, índice de polidispersão, pontecial zeta, pH e eficiência de encapsulação;
Avaliação da estabilidade da nanoemulsão armazenada em temperatura ambiente quanto ao diâmetro de partícula, índice de polidispersão, pontecial zeta e pH por 120 dias;
Avaliação da eficácia do óleo essencial e da nanoemulsão de B.
dracunculifolia sobre pré-pupas de C. hominivorax em condições de
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Cochliomyia hominivorax
A espécie C. hominivorax pertence à família Calliphoridae, conhecida popularmente no Brasil como “mosca da bicheira”, é considerada uma das principais moscas causadoras de miíases na região Neotropical (HALL; WALL, 1995).
O termo Míiase foi definido por Zumpt (1895) como a “infestação de seres humanos e vertebrados vivos por larvas de dípteros que, pelo menos por algum período de tempo, se alimentam dos tecidos vivos ou mortos do hospedeiro, de suas substâncias corporais líquidas ou do alimento por ele ingerido”. Desta forma, as larvas de moscas que desenvolvem uma parte do seu ciclo ou completam ele dentro ou sobre o corpo de um hospedeiro vertebrado, podem ser classificadas como causadores de miíases (NEVES et al., 2011). As principais moscas causadoras de miíases pertencem às famílias Oestridae, Sarcophagidae e Calliphoridae (HALL; WALL, 1995).
A C. hominivorax é considerada uma mosca robusta (Figura 1), pois possui cerca de 8 mm de comprimento. Apresenta cor verde, com reflexos azul-metálico em todo o tórax e abdômen; o mesonoto possui três faixas negras longitudinais (NEVES et al., 2011), a cabeça possui cor de amarelo brilhante com os olhos amarelo-avermelhados, o aparelho bucal é do tipo lambedor e com palpos curtos e filiformes (BRITO et al., 2008).
As moscas adultas são excelentes voadoras, percorrendo uma distância de até 18 km em 24 horas. Estas preferem climas quentes e
Figura 1. Mosca C. hominivorax, fêmea à esquerda e macho a direita.
úmidos. Sua densidade aumenta nos meses chuvosos e no verão, não sendo vistas em climas com temperatura inferior a 6ºC (NEVES et al., 2011).
Os adultos da C. hominivorax atingem a maturidade sexual entre 36-48 horas após o nascimento. Os machos cruzam inúmeras vezes durante a sua vida. Entretanto, as fêmeas só irão copular uma única vez. Assim que a fertilização é dada por completa, a fêmea inicia a postura, entre 4 a 5 dias após a sua emergência, chegando a fazer deposição de até 300 ovos durante sua vida (LEITE, 2004). Os ovos eclodem em menos de 24 horas. As larvas de primeiro estágio das larvas (L1) ficam agregadas com as peças bucais voltadas para o interior da ferida mantendo os espiráculos respiratórios voltados para o exterior (AMARANTE; RAGOZO; SILVA, 2014). Com seus dentículos e gancho da mandíbula, elas raspam os tecidos moles e se alimentam das secreções resultantes, atingindo outros estágios rapidamente. Em um período de 24 horas, as cavidades se expandem tanto lateralmente como profundamente, podendo atingir até mesmo os músculos (ANIMAL HEALTH AUSTRALIA, 2007). As larvas permanecem alimentando-se do hospedeiro por um período de aproximadamente sete dias, e durante esse período, irão sofrer mais duas mudas, para larva de segundo e terceiro estágio (L2 e L3). Após atingirem o último estagio (L3), esta abandona a ferida em direção ao solo, onde irá se enterrar e se transformar de larva para pupa (AMARANTE; RAGOZO; SILVA, 2014). Em condições ideais, um ciclo de vida pode ser completado em menos de 3 semanas (VARGAS-TERÁN; HOFMANN; TWEDDLE, 2005).
Durante a fase de alimentação das larvas, um exsudado seroso e sangrento é evidente devido a necrose progressiva da pele, músculos e outros tecidos. Podem ocorrer hemorragias graves nas lesões, e o tecido ao seu redor é edematoso e quente ao toque. As lesões passam a emitir um odor característico e intenso (ANIMAL HEALTH AUSTRALIA, 2007). Isso se torna em um atrativo para outras fêmeas grávidas ovipositarem, deixando o animal mais susceptível a infecções secundárias. Se não houver nenhuma forma de tratamento, é comum que o animal venha a óbito (HALL, 1991; VARGAS-TERÁN; HOFMANN; TWEDDLE, 2005; BECERRA; CORTÉS; VILLAMIL, 2007).
A distribuição geográfica histórica desta espécie estendia-se desde o sul dos Estados Unidos, por toda América Central, incluindo o Caribe, Argentina, Uruguai, com exceção do Chile aonde ela ocorria apenas no norte do país (HALL; WALL, 1995). Baumhover (1996) estimou que as perdas ocasionadas pela C. hominivorax na região sudeste do Estados Unidos foram de US$ 20 milhões/ano e na região sudoeste de US$ 50 a
100 milhões/ano. Devido a essas perdas econômicas, iniciou-se em 1957, na Flórida, um programa de erradicação dessa espécie através da técnica do inseto estéril (SIT).
A técnica do inseto estéril é definida pela International Plant Protection Convention (FAO, 2005) como um “método de controle de pragas usando liberações inundativas de insetos estéreis em ampla área, visando reduzir a reprodução de uma determinada espécie“. Através do tratamento específico (radiação ionizante), o inseto transfere o esperma com as mutações letais dominantes para as fêmeas selvagens, impossibilitando assim a geração seguinte. O princípio desta técnica consiste em que os dípteros copulam apenas uma vez e a liberação exacerbada destes indivíduos irradiados competindo com a população selvagem, irá reduzir gradativamente, culminando a sua erradicação (WATKINSON-POWELL; ALPHEY, 2017; YARZON, 2005). Com o apoio de pesquisadores, governo federal e produtores, este programa acabou se estendendo até o sudeste e sudoeste dos Estados Unidos. Posteriormente, o mesmo Programa se estendeu para países da América Central que demonstraram interesse devido ao seu sucesso. Desse modo, esta mosca foi erradicada dos Estados Unidos no ano de 1992, do México em 2001 e da América Central em 2004 (WYSS, 2000). A atual distribuição geográfica da C. hominivorax, compreende a região do Caribe (Cuba, República Dominicana, Haiti, Jamaica, Trinidad e Tobago) e toda a América do Sul, com exceção do Chile (CARVALHO, 2010). Desde o ano de 2001, são liberadas moscas estéreis na região estreito de Darien (Panamá), formando uma barreira permanente para impedir que as áreas livres sejam recolonizadas com moscas oriundas da América do Sul (WYSS,2000). Estima-se que caso essa mosca fosse reintroduzida, as perdas geradas na produção norte americana poderiam chegar a US$ 900 milhões (MCGRAW, 2001).
Em 2006, foi apresentado ao Ministério da Agricultura do Brasil, um projeto regional para a erradicação da C. hominivorax na fronteira entre Uruguai e Brasil, pela Comisión México-Americana para la Erradicación del Gusano Barrenador del Ganado (COMEXA), em que ficou estabelecido uma área piloto de 4.662 km² onde faziam parte os municípios de Quaraí, Barra do Quaraí e Santana do Livramento. Os prejuízos ocasionados na região chegavam a US$ 150 mil/ano. O projeto foi executado no ano de 2009, sendo a COMEXA a agência executora e o Banco Interamericano de Desenvolvimento (BID), o financiador. Cerca de US$ 1 milhão foi liberado para o começo das atividades. As moscas estéreis foram importadas da biofábrica de Tuxtla Gutierrez e liberadas pela Força Aérea uruguaia. Eram liberadas 21,6 milhões de moscas por
semana, totalizando 1.545 moscas estéreis por km², contando ainda com armadilhas para insetos adultos na área. No final das 17 semanas de experimento, observou-se que 21,5% das massas de ovos coletados dos animais sentinelas eram estéreis (PONTES et al.,2009).
No entanto, mesmo com todo o sucesso da erradicação desta espécie através do SIT em outros países, o uso desta técnica aqui na América do Sul apresenta algumas limitações, principalmente pela vasta extensão territorial, com a presença de florestas, onde abrigam animais selvagens, que acabam tornando-se reservatórios naturais para reinfestações em períodos de supressão (CARVALHO, 2010). Desse modo, esse ainda é um grave problema na produção animal brasileira, com perdas estimadas de R$ 336,62 milhões/ano somente na pecuária (GRISI et al., 2014).
Para o controle da doença no Brasil, prevalece ainda o tratamento habitual com a utilização de produtos químicos inseticidas sobre as larvas e/ou feridas, uma vez que os adultos e outras formas imaturas de C.
hominivorax não tem sido alvo de combate eficaz (LEITE, 2004). Esses
produtos são popularmente conhecidos como “mata-bicheira”, tendo na sua composição principalmente organofosforados e piretróides sintéticos (ALVES-BRANCO; PINHEIRO; SAPPER, 2001).
O Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Saúde Animal (SINDAN), em 2009, tinha registrado 59 produtos junto ao Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) para o tratamento de miíases ocasionadas pela C. hominivorax. Destes 59 produtos, 42 apresentaram princípios ativos contendo organofosforados sozinhos ou em combinação com outros princípios ativos (CARVALHO, 2010). Existem ainda os endectocidas, compostos principalmente por lactonas macrocíclicas, tais como a ivermectina, doramectina, abamectina, entre outros. Estes são muito utilizados na prevenção de miíases como: lesões umbilicais de recém – nascidos, castrações em geral, bem como em outras práticas cirúrgicas realizadas a campo (ALVES-BRANCO; PINHEIRO; SAPPER, 2001). Apesar de já terem sidos considerados eficazes para o controle da bicheira (ANZIANI; LOREFICCE, 1993; MOYA-BORJA et al., 1993), atualmente não tem se verificado a mesma eficácia, uma vez que não impedem novas oviposições (VERÍSSIMO, 2003).
Segundo o SINDAN no ano de 2016, 31% das vendas foram destinadas aos produtos antiparasitários. Há mais de seis anos consecutivos os produtos mais vendidos são aqueles para tratar ecto e endoparasitas (SINDAN, 2016).
A resistência da C. hominivorax aos organosfosforados tem sido relatada por diversos autores (VERÍSSIMO, 2003; CARVALHO;
TORRES; AZEREDO-ESPIN, 2006; CORONADO; KOWALSKI, 2009; DA SILVA; DE CARVALHO; DE AZEREDO-ESPIN, 2011), assim como aos piretróides (DA SILVA; DE AZEREDO-ESPIN, 2009), e as lactonas macrocíclicas (ANZIANI et al., 2000; LOPES et al., 2013). Até o final do século XIX, o controle de pragas e parasitas dependia de uma gestão nem tanto eficiente, porém de baixo custo, como rotação de pastagens, o uso de plantas naturais, inseticidas derivados de enxofre, óleos e metais pesados tóxicos. O primeiro pó comercial vendido contendo arsênico e enxofre foi comercializado em 1843, por William Cooper. Desde então, seguindo este princípio surgiram as neurotoxinas sintéticas em 1940, com custo relativamente baixo e de fácil aplicação. A eficácia dos inseticidas os impulsionou rapidamente a ser a principal técnica utilizada contra os ectoparasitas. Todavia, nos últimos anos, preocupações com a saúde humana, contaminação ambiental associada ao uso dos mais velhos compostos neurotóxicos, como os organoclorados, organofosforados e piretróides, tem sido retirados gradualmente e com restrições em algumas áreas do mundo (EISLER et al., 2003).
O uso de produtos sintéticos para o tratamento de pragas em veterinária, está se tornando cada mais vez problemático. Algumas questões como a resistência das pragas, produtos com resíduos, a persistência residual ambiental e os riscos inaceitáveis para os organismos, estão entre os que conduzem as pesquisas para o advento de novas alternativas (WALL, 2007; GEORGE et al., 2014). Diante destas circunstâncias, houve uma preocupação global em relação aos impactos ocasionados ao meio ambiente e a saúde humana, restringindo a utilização de inseticidas sintéticos. Estamos em um momento adequado para a reavaliação de produtos botânicos, que passou por progresso na ciência, já que nos últimos 20 anos trabalhos relacionados a bioatividade de extratos de plantas no controle de artrópodes expandiu-se consideravelmente (VELASQUES et al., 2017).
Inseticidas botânicos, ou seja, produtos de manejo de pragas com base em material vegetal, tem sido apontados como uma potencial alternativa em substituição a produtos sintéticos convencionais, uma vez que os produtos naturais teriam menor impacto sobre o ambiente e a saúde humana, além de não terem efeitos comprováveis sobre os organismos e ecossistemas (ISMAN, 2006; GEORGE et al., 2014).
3.2. Utilização de extratos naturais com ação inseticida Os inseticidas naturais têm sido utilizados ao longo dos anos no combate de pragas (ISMAN, 2006). A utilização de extratos de plantas com efeito inseticida, por exemplo, foi disseminada durante todo o Império Romano. Há relatos de que durante o reinado do rei Persa, Xerxes, em 400 aC, um pó obtido a partir das flores secas da planta de piretro foi utilizado para combater piolhos em crianças (ADDOR, 1995).
Porém, após a Segunda Guerra Mundial, com a introdução dos inseticidas químicos sintéticos, a utilização de inseticidas botânicos diminuiu abruptamente (VIEGAS, 2003; KUMAR et al., 2011a). Posteriormente, surgiram os efeitos adversos da utilização dos compostos sintéticos, como problemas de contaminação ambiental, resíduos nos alimentos e resistência de pragas. Desta forma, mais recentemente os inseticidas botânicos tem sido novamente considerados como uma alternativa atraente para o controle de parasitas (WALLER et al., 2001; ISMAN, 2006).
A demanda por inseticidas naturais se intensificou nas últimas décadas, já que sua utilização consiste em compostos ativos biológicos, e estão sendo considerados como uma alternativa para o manejo sustentável de insetos (RATTAN, 2010). A maioria dos inseticidas obtidos a partir de plantas são biodegradáveis, sendo esse mais um atrativo para o seu uso. São conhecidas mais de 1500 espécies de plantas que possuem ação inseticida e muitas outras ainda não descobertas. Quando comparados com os inseticidas sintéticos, os compostos vegetais são menos agressivos e sua natureza relativamente “segura” resultou em uma nova visão, dando abertura e oportunidade sobre a utilização de plantas na formulação de inseticidas (RATTAN, 2010; KUMAR et al., 2011a).
As plantas, como organismos sedentários, têm que se adaptar ao ambiente durante seu ciclo de vida. Para compensar a sua imobilidade, elas desenvolveram vários mecanismos para sua interação com o meio ambiente, que incluem a liberação de vários compostos químicos voláteis. Esses compostos vem sendo chamados de metabólitos secundários, uma vez que embora não sejam essenciais para a sobrevivência do indivíduos, garantem vantagens para sua sobrevivência e para a perpetuação de sua espécie, em seu ecossistema (SIMÕES et al., 2007).
Dentre os metabólitos secundários, os óleos essenciais possuem função importante, atuando como moléculas de defesa direta e indireta das plantas contra herbívoros, agentes patogênicos, nos processos de reprodução das plantas através da atração de polinizadores e disseminadores de sementes e na termotolerância vegetal (BAKKALI et
al., 2008; REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012 PAVELA, 2015).
A síntese e a acumulação dos OEs pode ser realizada por diferentes órgãos das plantas, tais como brotos, flores, folhas, caules, galhos, sementes, frutas, raízes, casca. São armazenados em células secretoras, células epidérmicas ou tricomas glandulares (BAKKALI et al., 2008). Dependendo da espécie, os OEs podem ser armazenados por exemplo nas flores (laranja bergamota, Citrus bergamia), nas folhas (capim limão,
Citronela spp.; eucalipto, Eucalyptus spp.), na madeira (sândalo, Santalum spp.), nas raízes (capim vetiver, Chrysopogon Zizanioides), nos
rizomas (gengibre, Zingiber officinal; cúrcuma, Curcuma longa), nos frutos (anis, Pimpinella anisum) e até nas sementes (noz-moscada,
Myristica fragrans) (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON,
2012).
Segundo a 7º edição da Farmacopéia Européia, os OES são definidos como “produto odorante composto geralmente por uma composição complexa, obtido a partir de uma matéria prima da planta definida, seja conduzido pelo arraste a vapor, destilação a seco ou por um método mecânico sem aquecimento”. O OE é geralmente separado da fase aquosa por um método físico que não leva a mudanças significativas na sua composição química. O seu rendimento de extração varia de acordo com as espécies e órgãos, podendo ser muito baixo (cerca de 1%), o que os torna substâncias com alto valor agregado. Entre as espécies de plantas, apenas 10% contém OE e são chamadas de plantas aromáticas. No entanto, existem mais de 17.000 espécies de plantas distribuídas em todo o mundo (SVOBODA; GREENAWAY, 2003). As principais famílias de plantas utilizadas para a extração dos óleos essenciais são Myrtaceae, Lauraceae, Lamiaceae e Asteraceae (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012).
Os OEs representam geralmente uma pequena fração da composição vegetal (menos de 5% da matéria seca do vegetal) e são constituídos principalmente por compostos terpênicos. Os compostos majoritários são os sesquiterpenos e monoterpenos, este último representando mais de 80% da composição dos OEs. Os outros são derivados oxigenados de terpenos, podendo ser álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos, fenóis, éteres e ésteres (BAKKALI et al., 2008). Essa mistura complexa de compostos com diferentes propriedades encontrada nos OEs, permite a ocorrência de diversos mecanismos de defesa da planta, o que tem sido denominado de efeito sinérgico (BAKKALI et al., 2008; RATTAN, 2010; ZOUBIRI; BAALIOUAMER, 2014). Apesar da razão dos metabólitos secundários ser evolutiva, protegendo as plantas de
herbívoros e patógenos na natureza, os seres humanos também encontraram muitas utilidades para eles. Os OEs são responsáveis pelo sabor específico e aroma das plantas aromáticas (DUDAREVA et al., 2006; NAGEGOWDA, 2010), estas características juntamente com suas diversas atividades biológicas (BAKKALI et al., 2008), atraíram o interesse da indústria, incluindo o processamento de alimentos, a perfumaria, e os medicamentos (AHARONI; JONGSMA; BOUWMEESTER, 2005). Mas também pode ser utilizado contra muito agentes patogênicos (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012; RAUT; KARUPPAYIL, 2014) e artrópodes (NERIO; OLIVERO-VERBEL; STASHENKO, 2010). Desta forma, muitos OEs estão sendo considerados para o desenvolvimento de produtos fitossanitários (PAVELA; BENELLI, 2016).
Dentre os efeitos dos OEs estão sua ação repelente, inseticida e a redução no crescimento sobre uma variedade de insetos. Os compostos exercem efeitos neurotóxicos envolvendo vários mecanismos, nomeadamente através de GABA, sinapses de octopamina e a inibição de acetilcolinesterase (AChE) (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012). Nas últimas décadas, pesquisas sobre as interações entre plantas e insetos revelou o potencial uso de metabólitos secundários de plantas para esta finalidade, devido as propriedades inseticidas e repelentes dos óleos essenciais (NERIO; OLIVERO-VERBEL; STASHENKO, 2010; REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012).
Alguns estudos relatam a eficácia de diferentes OEs sobre a mortalidade da mosca C. hominivorax e outras espécies causadoras de miíases. O efeito do óleo de neem (Azadirachta indica), por exemplo, foi testado com quatro espécies de moscas: Lucilia cuprina, Chrysomya
megacephala, C. hominivorax e Musca domestica que estão entre as
pragas mais importantes da pecuária, causando miíases, além de serem portadoras de microrganismos patogênicos. O óleo a 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% e 0,6% foi pulverizado sobre as pupas de cada espécie. No laboratório, o efeito inseticida para as concentrações 0,5% e 0,6% foi similar para as quatros espécies, matando mais de 90% das pupas. Na aplicação no campo, o óleo a 0,5% foi capaz de controlar mais de 80% das moscas, resultado plenamente aceitável para as condições de campo (DELEITO; BORJA, 2008).
Os extratos de Eucalyptus staigeriana, Mentha piperita e Piper
tuberculatum foram testados in vitro sobre as larvas do terceiro estágio de C. hominivorax. Dentre os extratos testados, a M. piperita mostrou maior
Os efeitos de alguns OEs também foram testados no gênero
Lucilia. Apesar desta espécie não ter tanta importância no Brasil pode
provocar miíase secundária (WALL, 2012). Em outros países, este gênero merece atenção especial já que é uma das principais moscas causadoras de miíase (HOLDSWORTH et al., 2006). O óleo de Melaleuca
alternifolia foi testado sobre a sobrevivência de diferentes estágios de
larvas de Lucilia cuprina. Segundo os autores, a adição deste óleo no tratamento de feridas poderia auxiliar na proteção contra miíase, uma vez que este teve ação inseticida contra ovos e larvas de L. cuprina, estimulando as larvas a deixarem a ferida (CALLANDER; JAMES, 2012).
Diferentes OEs, como o extraído do feno grego (Trigonella
foenum-graecum), aipo (Apium gravesolens), rabanete (Raphanus sativus) e mostarda (Brassica compestris) foram testados através de
ensaios de ingestão em larvas do terceiro estágios de Lucilia sericata. Estes óleos podem ter ação inseticidas para o controle de moscas (KHATER; KHATER, 2009).
O óleo essencial de Commiphora molmol (mirra) e o extrato alcoólico de Balanites aegyptiaca foram aplicados nos três estágios larvais de L. sericata. Os resultados demonstraram que ambos os extratos possuíam toxicidade contra as larvas dos três instares de L. sericata e diferentes mudanças biológicas foram registradas após o tratamento das larvas com estes extratos vegetais, como anormalidades nas larvas, nas pupas e na emergência dos insetos adultos (HODA et al., 2016).
Os OEs de cânfora e lavanda foram testados in vitro em larvas de terceiro estágio de L. sericata. Os resultados de toxicidade revelaram que as larvas foram suscetíveis aos óleos. O óleo de lavanda foi mais eficaz na mortalidade do que o óleo de cânfora, com a concentração de 32%, as porcentagens de mortalidade foram de 100% e 93%, respectivamente (SHALABY et al., 2016).
Em um outro tipo de estudo, produtores relataram quais as plantas locais eram comumente utilizadas no tratamento de miíases (FAROOQ et al., 2008; GONZÁLEZ; GARCÍA-BARRIUSO; AMICH, 2010; MUKANDIWA; NAIDOO; ELOFF, 2012). A partir desse relato, os autores (MUKANDIWA; NAIDOO; ELOFF, 2012), investigaram a eficácia de sete plantas tradicionalmente utilizadas no tratamento de miíases em comunidades da África do Sul e Zimbabué. A ação antibacteriana encontrada foi associada a sua eficácia, uma vez que pode reduzir os componentes voláteis produzidos pelas bactérias, como por exemplo, a amônia e o enxofre, que são altamente atrativos para fêmeas causadoras de miíase ovipositarem.
Em geral, o uso de OEs no controle de pragas tem sido associado a inúmeras vantagens como múltiplos mecanismos de ação devido a complexidade de princípios ativos, diminuindo a probabilidade no desenvolvimento da resistência, os processos de produção são relativamente simples e baratos, e devido à baixa toxicidade dos resíduos apresenta baixo risco para a saúde durante a sua aplicação (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012; PAVELA; BENELLI, 2016).
Os OEs possuem várias características que os tornam altamente promissores como inseticidas. Possuem diversos compostos fitoquímicos (biossintéticamente diferentes), porém, redundantes (contendo muitos compostos análogos de uma mesma classe). Essas misturas complexas reduzem a evolução da resistência aos inseticidas naturais em comparação a um único composto (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012). Outro fator relevante é o risco oferecido durante a aplicação nos organismos não alvo, como é o caso dos humanos em que fazem a aplicação destes produtos, e os inseticidas naturais apresentam baixo risco (GOULSON, 2013). Em termos de toxicologia a maioria dos OEs tem baixa toxicidade, >2g/kg para aplicação oral e dérmica em organismos vertebrados não alvo (PAVELA; BENELLI, 2016). Além disso, os resíduos proporcionados pelos OEs são mínimos, devido ao seu modo de aplicação (fumigação) e sua fácil degradação em contato com o ambiente (TUREK; STINTZING, 2013).
No entanto, a aplicação dos OEs no dia a dia do produtor se torna impraticável e muito onerosa. Desta forma, torna-se necessário o desenvolvimento de formulações adequadas que possam melhorar as propriedades físico-químicas do óleos e garantam as suas atividades biológicas, assim como a sua praticidade de aplicação. Essas formulações devem ser estáveis ao longo do tempo, seguras pra quem for aplicar e econômicas o quanto possível, a fim de propiciar a sua utilização pelos produtores (KUMAR et al., 2011b).
3.3. Baccharis dracunculifolia
A espécie B. dracunculifolia DC (De Canole) é nativa do Brasil, sendo encontrada principalmente nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Santa Catarina e Paraná (VERDI; BRIGHENTE; PIZZOLATTI, 2005). No Brasil, na região sudoeste, existem aproximadamente 120 espécies de
Baccharis (BUDEL et al., 2005). B. dracunculifolia é popularmente
conhecida como “alecrim do campo” ou “vassourinha” e se adapta muito bem em habitats pobres em nutrientes e pastagens abandonadas (PARK et al., 2004). Tem como características ser um arbusto lenhoso, com
galhos bastante ramificados, podendo chegar até 4 metros de altura, é perene, dióica, reproduzindo-se por sementes. Possuem tricomas tectores e glandulares em suas folhas, que além de atuarem como barreira ao ataque de insetos predadores, favorecem a interação da planta com as abelhas, para coleta do seu material resinoso (TEIXEIRA et al., 2005).
O óleo essencial da B. dracunculifolia é produzido em pequena escala aqui no Brasil para o uso em perfumaria, pelo seu aroma exótico que varia conforme a sua origem geográfica e processo de extração. A sua importância comercial baseia-se nos teores dos seguintes compostos, E-nerolidol e espatulenol, normalmente encontrados como componentes principais nos óleos obtidos por hidrodestilação (FABIANE et al., 2008). Além disso, o uso da planta na medicina popular vem crescendo, sendo consumida principalmente na forma de chás para o tratamento de dores de estômago, problemas hepáticos, diabetes, anemias, inflamações, doença na próstata, e até como desintoxicante do organismo (VERDI; BRIGHENTE; PIZZOLATTI, 2005; LEITE, 2009). Entretanto, podem ser utilizadas como plantas ornamentais e no combate a erosão do solo. Devido a sua rápida propagação são também conhecidas como pragas de difícil combate em pastagens, chegando a causar intoxicação no gado (CORREA, 1984).
Além do que já foi mencionado, B. dracunculifolia vem sendo amplamente estudada devido a sua relação peculiar com as abelhas Apis
mellifera (BASTOS et al., 2011). De acordo com BANKOVA et al.
(1999) após uma criteriosa observação em seu apiário localizado na Unesp, (Campus de Botucatu), foi constatado que a B. dracunculifolia é a principal fonte utilizada para a preparação da propólis, seguida da
Araucaria angustifolia e do Eucalyptus citriodora. Por produzir óleos
essenciais com aroma forte e exótico, B. dracunculifolia torna-se bastante atrativa para as abelhas uma vez que estas possuem alta capacidade olfatória, que acabam visitando-as primeiramente para depois se deslocarem para outras plantas (SPRING, 2000; GONÇALVES; FILHO; MENEZES, 2005). De acordo com diversos autores, a B.
dracuncunlifolia é a principal fonte botânica da própolis denominada de
própolis verde produzida principalmente nos estados de Minas Gerais e São Paulo (BANKOVA et al., 1999; PARK; ALENCAR; AGUIAR., 2002; ALENCAR et al., 2005). Da mesma forma, ZEGGIO (2016) verificou que a própolis verde oriunda do planalto de Santa Catarina também era produzida a partir de material botânico de B. dracunculifolia. A própolis verde vem se destacando na literatura pelas suas inúmeras propriedades biológicas, tais como antimicrobiana (SALATINO et al., 2005; LU; CHEN; CHOU, 2005), antioxidante (FERRONATO et al.,
2006; GREGORIS et al., 2011), anti-inflamatória (REIS et al., 2000; SFORCIN, 2007) e antifúngica (MURAD et al., 2002).
No estado de Santa Catarina, B. dracunculifolia teve a sua ocorrência catalogada nos municípios de Brusque, Caçador, Campo Erê, Campos Novos, Dionísio Cerqueira, Erval Velho, Florianópolis, Itajaí, Joaçaba, Lacerdópolis, Lages, Lauro Muller, Palhoça, Rio do Sul, Santa Cecília, Santo Amaro da Imperatriz, São Joaquim, Seara e Sombrio (BARROSO; BUENO, 2002).
O óleo essencial do alecrim do campo muda a sua composição de acordo com a localização geográfica. Em amostras coletadas em Cochabamba, na Bolívia, possui teores significativos de trans-nerolidol e espatulenol, seguidos do germacreno-D e o biciclogermacreno, δ-cadineno e germacrona (LOAYZA et al., 1995). Os compostos trans-nerolidol e espatulenol também foram os componentes principais encontrados em óleos essenciais obtidos no município de Campestre da Serra – RS (CASSEL et al., 2000). Em plantas coletadas no Sudeste do Paraná, foram encontrados os compostos β-pineno, trans-nerolidol, limoneno e espatulenol como majoritários (FABIANE et al., 2008). Em plantas oriundas do Sudeste do Brasil, foram encontrados α-pineno, β-pineno, limoneno, terpineol, trans-cariofileno, aromadendreno, α-humuleno, δ-cadineno, espatulenol, nerolidol, globulol, mirceno, linalol, γ-muuroleno, cis-β-guaieno, δ-cadineno, epi-α-cadinol (MARÓSTICA JUNIOR et al., 2008).
Na literatura, estão relatadas para esta planta atividades tais como antimutagênica (RODRIGUES et al., 2009; MUNARI et al., 2010; RESENDE et al., 2012), imunomodulatória (MISSIMA et al., 2007), antimicrobiana (DA SILVA FILHO et al., 2004; FERRONATTO et al., 2007; ABREU; ONOFRE, 2010; PEREIRA et al., 2016), antioxidante (FERRONATTO et al., 2006; GUIMARÃES et al., 2012), anti-inflamatório (DOS SANTOS et al., 2010; CESTARI; BASTOS; DI STASI, 2011; FIGUEIREDO-RINHEL et al., 2013), antifúngica (PEREIRA et al., 2011), anticariogênica (LEITÃO et al., 2004; PEDRAZZI et al., 2015) e anti-úlcera (LEMOS et al., 2007).
Em uso veterinário, o extrato hidroalcoólico do Alecrim do campo foi testado no combate à mastite bovina, que mostrou atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus (DIAZ et al., 2010).
O óleo essencial obtido das partes aéreas e seu principal componente nerolidol, possuem alta atividade nas larvas de
Rhipicephalus microplus e fêmeas ingurgitadas, tornando–se um
óleo pode ser usado como matéria prima para produzir acaricidas (DE ASSIS LAGE et al., 2015).
Alguns testes inseticidas também já foram realizados. A atividade do óleo essencial de B. dracunculifolia sobre larvas de terceiro estágio de
Lucilia cuprina em condições de laboratório foi investigada, tendo sido
encontrada a mortalidade de 66,2% das larvas na concentração de 40% (CHAABAN et al., 2015). Este óleo também mostrou-se eficaz como inseticida e repelente do gorgulho do milho (Sitophilus zeamais). No teste de repelência todas as doses (10, 20, 30, 50 e 100 µL) do óleo em 20 g de grãos de milho se mostraram repelentes sobre os insetos. Já no teste inseticida, apenas a dose de 100 µL em 20 g de grãos de milho após 48 horas de exposição teve efeito significativo (REICHERT JR et al., 2013)
Testes antiparasitários também foram realizados, com ensaios tripanocidas e leishmanicidas. Nos ensaios tripanocidas in vitro utilizou-se o extrato da B. dracunculifolia e verificou-utilizou-se 100% da liutilizou-se das formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (DA SILVA FILHO et al., 2004). Já os ensaios leishmanicidas demonstraram que tanto o extrato hidroalcoólico da planta como o da própolis verde foram ativos, demonstrando valores de IC50 similares, de cerca de 45 μg/ml. Foram realizados ensaios de citotoxicidade utilizando-se células Vero e não foram encontrados efeitos citotóxicos, mesmo nas máximas concentrações testadas (DA SILVA FILHO et al., 2009).
De maneira geral, os OEs têm demonstrado o seu potencial, dentre eles, a sua atividade repelente contra várias espécies, não apenas insetos, mas contra diferentes tipos de artrópodes. Desta forma, estes produtos naturais tem um potencial considerável como repelentes naturais (NERIO; OLIVERO-VERBEL; STASHENKO, 2010). Porém em comparação com pesticidas sintéticos, inseticidas botânicos são relativamente instáveis e se degradam mais rápidos quando expostos a luz, temperatura e ar (TUREK; STINTZING, 2013). Alguns estudos foram realizados com intuito de desenvolver formulações capazes de melhorar a eficácia dessas substâncias e a nanotecnologia tem se mostrando eficaz neste sentido (OLIVEIRA et al., 2014).
3.4. Nanoemulsões
Uma emulsão é caracterizada pela mistura de dois líquidos imiscíveis, preferencialmente por óleo e água, com uma fase dispersa dentro da outra. Para uma emulsão de óleo em água, o óleo é disperso dentro de uma fase aquosa contínua, já para emulsão de água em óleo as fases são reversas. A diferença entre a emulsão e a nanoemulsão é o
tamanho do diâmetro das gotículas (MCCLEMENTS, 2011). O tamanho do diâmetro médio das gotículas pode variar de 100 a 600 nm (BOUCHEMAL et al., 2004).
Uma nanoemulsão de óleo em água é definida como um dispositivo termodinamicamente instável de dispersão coloidal consistindo em dois líquidos imiscíveis, com um dos líquidos sendo disperso em pequenas gotas no outro líquido (MCCLEMENTS, 2012). Desta forma, para melhorar a sua estabilidade são adicionados agentes emulsionantes, que diminuem a tensão superficial entre as fases contínua e dispersa, minimizando a coalescência das gotículas. O agente emulsionante é composto por moléculas tensoativas, que se dispõem nas superfícies das gotículas durante a dispersão das fases distintas, formando uma camada superficial que minimiza a agregação das gotas por coalescência devido à repulsão eletrostática (MCCLEMENTS, 2011; PIORKOWSKI; MCCLEMENTS, 2013).
Em particular, as nanopartículas exibem transparência óptica para os tamanhos médios de gotículas <40 nm, independentemente da fração de óleo, enquanto que, na faixa entre 40 e 100 nm, as nanoemulsões parecem nebulosas, com uma dependência acentuada do teor de óleo e para os tamanhos> 100 nm, aparecem brancos devido à dispersão múltipla significativa (MASON et al., 2006; MCCLEMENTS, 2011).
Para formar nanoemulsões é necessária uma contribuição de energia, geralmente de dispositivos mecânicos ou do potencial químico dos componentes. Três métodos podem ser aplicados para a preparação de nanoemulsões: com o uso de homogeneizadores de alta pressão (auxiliados pela escolha apropriada de surfactantes e tensoativos), uso de método de emulsão de baixa energia em constante temperatura ou aplicação da temperatura de inversão de fase (TADROS et al., 2004). A emulsificação espontânea e homogeneização de alta pressão são as técnicas mais comumente utilizadas ao se associar extratos de plantas para o desenvolvimento de nanoemulsões (ZORZI et al., 2015).
Os métodos de alta energia dependem de dispositivos mecânicos para criar grandes forças com poder disruptivos que possam reduzir o tamanho das partículas. Essas forças disruptivas são alcançadas através de ultra-sons, microfluidizadores e homogeneizadores de alta pressão. A sua versatilidade está no fato de que quase todo tipo de óleo pode ser submetido a nanoemulsificação. No entanto, estes aparelhos são onerosos e requerem altos custos de manutenção (SINGH et al., 2017). Estes dispositivos são mais eficazes na redução do tamanho das gotículas de uma pré – emulsão já existente, do que na criação de uma nanoemulsão desenvolvida a partir das fases de óleo e de água. A pré – emulsão
geralmente é produzida utilizando-se um agitador magnético e em seguida colocada na entrada do homogeneizador. Este possui uma bomba que puxa a pré – emulsão para dentro de uma câmara, em que será obrigado a passar por uma válvula estreita na outra extremidade da câmara durante o seu percurso. À medida que a pré – emulsão passa pela válvula, sofre uma combinação de forças disruptivas (turbulência de corte e cavitação) que ocasionam na redução do tamanho das gotas (WALSTRA, 2003; TADROS et al., 2004). O tamanho final das partículas alcançado por um homogeneizador é de suma importância, já que determina a estabilidade, aparência, textura e biodisponibilidade da formulação final (MCCLEMENTS; DECKER; WEISS, 2007; ACOSTA, 2009).
Alguns fatores devem ser levados em consideração ao se escolher o sistema e a técnica de preparação, como polaridade do composto ativo, solubilidade, a presença de solvente orgânico e a volatilidade. Por exemplo, os óleos essenciais são ricos em compostos lipofílicos e moléculas extramente voláteis. Desta forma, os sistemas a base de lipídeos preparados a baixas temperaturas e sem evaporação do solvente após a adição dos óleos, como é o caso do lipossoma ou a nanoemulsão, são mais prováveis de sucesso (ZORZI et al., 2015). Nanoemulsões são sistemas que podem incorporar maiores quantidades de extratos em comparação aos outros sistemas de nanotecnologia, neste caso a quantidade de óleo essencial associada pode chegar a 20% (ZORZI et al., 2015).
Os óleos essenciais possuem natureza hidrofóbica e são instáveis em condições normais de armazenamento, podendo facilmente perder a sua atividade biológica (LU et al., 2016). No entanto, a estabilização destes fatores podem ser resolvidos através de uma formulação adequada, como o uso de alguns métodos de encapsulamento (TUREK; STINTZING, 2013).
Dentre as vantagens das formulações obtidas a partir de nanotecnologia, estão melhorar a eficácia devido a maior área de superfície, aumentar a atividade sistêmica devido ao menor tamanho de partícula e mobilidade, e diminuir a toxicidade devido à eliminação de solventes orgânicos quando comparados as formulações dos pesticidas usados convencionalmente (SASSON et al., 2007).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Estabelecimento da colônia de C. hominivorax
Os insetos adultos foram capturados na Fazenda Experimental da Ressacada – UFSC. Após a captura, os insetos foram levados para o Laboratório de Parasitologia Animal, localizado no Departamento de Zootecnia e Desenvolvimento Rural, CCA/UFSC. Para o estabelecimento da colônia e manutenção das mesmas foi utilizada a metodologia descrita por MASTRANGELO (2011). O início dos testes só ocorreu após a obtenção da segunda geração (F2).
Os insetos adultos permaneceram em gaiolas de 35 x 35 cm² em ambiente com temperatura (33 ± 4 ºC) e umidade controladas (65 ± 10%). A sua alimentação consistiu de pedaços de rapadura e a água foi fornecida através de um pano umedecido. Foi colocado dentro da gaiola uma placa de petri contendo carne fresca com sangue afim de estimular a oviposição. Esse procedimento foi realizado até obter–se êxito.
Depois de obtida, a massa de ovos foi retirada cuidadosamente e transferida para recipientes contendo uma dieta adequada para o seu desenvolvimento que consistia de carne moída adicionada de água (2 litros), hemácias em pó (120 g), ovo em pó (80 g), leite em pó (80 g) e formol (2 mL). Os ovos foram mantidos sobre a dieta por 48 horas em B.O.D., a 37ºC e 60% de umidade, atingindo assim o primeiro estágio larval (L1). Após esse período, as L1 foram transferidas para recipientes maiores, contendo novamente a dieta larval por mais 3 dias, quando atingiam o seu último estágio larval (L3).
Ao término do último estágio larval, as larvas foram separadas e colocadas em recipientes de vidro contendo vermiculita estéril coberto por tule, em condições controladas de temperatura e umidade (26ºC e 60%), permanecendo até a emergência do inseto adulto.
4.2. Óleo essencial de B. dracunculifolia
O óleo utilizado nos ensaios foi adquirido em um estabelecimento comercial (Harmonia Natural, Canelinha – SC, Brasil). De acordo com a especificação do produto, as plantas foram cultivadas em sistemas agroflorestais e orgânico. A composição química do óleo foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à massa (CG-MS), realizada no Laboratório de Produtos Naturais, do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Recursos Genéticos Vegetais do Instituto Agronômico de Campinas (IAC) - São Paulo. Utilizou-se 200 µL do óleo
de B. dracunculifolia que foi solubilizado em 400 µL de hexano. O volume de injeção da amostra foi de 1μL de solução e a identificação das substâncias foi conduzida em cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas (CG-EM, Shimadzu, QP-5000), operando a 70 eV, em coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 um), hélio como gás de arraste (1,7 mL/min), injetor a 240ºC, detector a 230ºC e o seguinte programa de temperatura: 60ºC - 95ºC, 3ºC/min; 95ºC - 130ºC, 8ºC/min; 130ºC - 190ºC, 3ºC/min; 190ºC - 240ºC, 10ºC/min, split:1/50; fluxo:1mL/min (GARCIA, 2013).
A identificação dos constituintes químicos foi realizada por meio da análise comparativa dos espectros de massas das substâncias com o banco de dados 43 do sistema CG-EM (Nist 62.lib), literatura (MCLAFFERTY, F.W.; STAUFFER, 1989) e índice de retenção (ADAMS, 1995).
4.3. Desenvolvimento da nanoemulsão do óleo essencial de B. dracunculifolia
Inicialmente, utilizou-se a técnica de emulsificação espontânea descrita por BOUCHEMAL et al. (2004) para preparar as nanoemulsões do óleo de B. dracunculifolia. Esta técnica foi realizada no Laboratório Integrado de Bioquímica e Morfofisiologia Animal (LABIMA), localizado no Departamento de Zootecnia e Desenvolvimento Rural do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina. Para o desenvolvimento das nanoemulsões foi utilizado uma solução orgânica homogênea composta pelo óleo, solvente orgânico e surfactante lipofílico (Lecitina - LIPOID S 75-3N, Alemanha) e uma solução aquosa formada por água e surfactante hidrofílico (Poloxamer - Pluronic F 68 - BASF Chemical Company, Alemanha). O poloxamer foi dissolvido em água sob agitação magnética moderada (fração A). Em outro recipiente, o solvente orgânico (etanol P.A) foi misturado a lecitina e mantidos sob agitação, com aquecimento à 60ºC até a sua completa solubilização (fração B). Após a sua solubilização, foi acrescentado o óleo de B. dracunculifolia. A solução orgânica (fração A) foi gotejada sobre a solução aquosa (fração B) sob agitação magnética moderada. Neste tipo de procedimento, as nanoemulsões são formadas instantaneamente e a emulsão torna-se leitosa. Após o termino do gotejamento, a nanoemulsão permaneceu durante 15 minutos em agitação magnética moderada. Em seguida, o solvente orgânico da solução foi removido através da agitação magnética constante até a redução do seu volume para 10 mL, o que ocorreu após 5 horas de evaporação.
Com esta metodologia foram testadas diferentes proporções dos tensoativos (Tabela 1).
Formulação Técnica % de óleo de B. dracunculifolia Lecitina de Soja (%) Poloxamer (%) Tween 80 (%) NB1 Emulsif. 5% 25% 25% - NB2 Emulsif. 5% 50% 75% - NB3 Emulsif. 7,5% 50% 75% - NB4 Emulsif. 10% 25% 75% - NB5 Homog. 15% - - 2%
A segunda técnica empregada para a preparação das nanoemulsões do óleo de B. dracunculifolia foi a de homogeneização de alta pressão. Os ensaios foram realizados no Laboratório NanoBioMat, do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina em um homogeneizador de alta pressão (Homolab FBF Itália, Sala Baganza (Parma) - Italy). O óleo de B. dracunculifolia (15 g) e o surfactante Tween 80 (2 g) foram pesados e colocados sob agitação magnética. A água deionizada (83 mL) foi acrescentada e após 15 minutos de agitação, esta pré – emulsão foi transferida para o homogeneizador de alta pressão, com uma pressão de 500 bars por minuto, correspondendo a três ciclos de homogeneização. Foram desenvolvidas três repetições.
4.4. Caracterização das nanoemulsões
A caracterização das formulações foi realizada após 0, 7, 14, 21, 30, 60, 90 e 120 dias de armazenamento em temperatura ambiente. Nesses intervalos de tempo, foram determinados o diâmetro de partícula, o índice de polidispersão e o potencial zeta, por espectroscopia de correlação de fótons, que possibilita a determinação do raio hidrodinâmico das partículas em suspensão, e Laser Doppler usando um Zetasizer Nano Series (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) à 25°C. Além disso, o pH da emulsão foi determinado em pHmetro (PHTEK pH100, São Paulo, Brasil).
A caracterização morfológica das nanopartículas em suspensão foi feita utilizando-se a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) Jeol JEM-1011 (Jeol Ltd.,Tóquio, Japão). As nanoemulsões foram Tabela 1. Composição das nanoemulsões do óleo essencial de B. dracunculifolia.
previamente diluídas em água destilada e 10µL de cada amostra foram depositadas em grades de cobre revestida com carbono por 15 minutos. Em seguida, 10µL de acetato de uranila foi acrescentado e incubado por 25 minutos.
A eficiência de encapsulação do óleo essencial nas nanoemulsões foi determinada utilizando-se a técnica de ultrafiltração/centrifugação. As nanoemulsões foram colocadas em dispositivos de centrífuga (Amicon Centrifugal Filter Devices) com membrana Ultracel-100 membrana (100 kDa, Millipore Corp., Billerica, MA) e centrifugados (2,350 g por 30 minutos) para separar o óleo livre do encapsulado. Através da quantificação do conteúdo de óleo presente na formulação, determinada pela dissolução das nanoemulsões em metanol, e do óleo livre no ultrafiltrado, calculou-se a diferença entre os dois, obtendo-se a quantidade de óleo incorporado às nanoemulsões. Os conteúdos de óleo na nanoemulsão após adição de metanol e no ultrafiltrado foram determinados por espectrofotometria a 253 nm, utilizando-se uma curva de calibração externa (y= 87,904x + 0,0142, R² = 0,999). A eficiência de encapsulação foi expressa em porcentagem.
4.5. Atividade larvicida da nanoemulsão de B. dracunculifolia Para avaliação do efeito larvicida da nanoemulsão de B.
dracunculifolia, 15 larvas (L3) de C. hominivorax foram selecionados ao
acaso e colocadas em recipientes de vidros (9 cm altura x 4 cm de diâmetro), contendo papel filtro impregnado com os produtos a serem testados (1 mL) e vermiculita. A seleção dos recipientes de vidro com os produtos a serem testados foi feita aleatoriamente. Foram testadas 5 concentrações diferentes da nanoemulsão do óleo de B. dracunculifolia: 5%, 7,5%, 10%, 13,5% e 15%, as quais foram preparadas a partir da diluição da nanoemulsão de 15% (m/v). Para cada concentração, foram realizadas 10 repetições contendo 15 larvas por concentração, totalizando 150 larvas/concentração (Figura 2 - A). Foram incluídos no teste, os seguintes grupos controle negativo: (a) nanoemulsão sem o óleo essencial de B. dracunculifolia. Em substituição ao óleo essencial, utilizou-se o óleo inerte denominado triglicerídeo de cadeia média (TCM) (controle negativo da nanoemulsão), (b) água destilada e (c) papel filtro sem adição de nenhum produto (controle negativo do ensaio). Além disso, um grupo controle positivo foi incluído, utilizando-se o produto comercial com o princípio ativo Triclorfone (Neguvon®), produzido pelo laboratório Bayer no Estado de São Paulo, Brasil. Para efeitos de comparação da eficácia do produto (nanoemulsão), o ensaio foi realizado conforme a
