MARCOS PAULO STEOLA
QUANTIFICAÇÃO DOS HORMÔNIOS ESTEROIDES EM PLASMA E FLUIDO FOLICULAR BOVINO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA
A ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQUENCIAL (LC-MS/MS).
CAMPINAS 2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
MARCOS PAULO STEOLA
QUANTIFICAÇÃO DOS HORMÔNIOS ESTEROIDES EM PLASMA E FLUIDO FOLICULAR BOVINO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA
A ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQUENCIAL (LC-MS/MS).
ORIENTADOR: PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR MARCOS PAULO STEOLA, E ORIENTADA PELO PROF.DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN.
_______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2014
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química
Simone Lucas Gonçalves de Oliveira - CRB 8/8144
Steola, Marcos Paulo,
St42q SteQuantificação dos hormônios esteroides em plasma e fluido folicular bovino
utilizando cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) / Marcos Paulo Steola. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
SteOrientador: Marcos Nogueira Eberlin.
SteDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Química.
Ste1. Espectrometria de massas sequencial. 2. Diluição isotópica. 3. Hormônios
esteroides. 4. Líquido folicular bovino. I. Eberlin, Marcos Nogueira. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Quantification steroids hormones in plasma and follicular fluid bovine
using liquid chromatography coupled sequencial mass spectrometry (LC-MS/MS)
Palavras-chave em inglês:
Sequencial mass spectrometry Isotope diluition
Steroids hormones Follicular fluid bovine
Área de concentração: Química Analítica
Titulação: Mestre em Química na área de Química Analítica Banca examinadora:
Marcos Nogueira Eberlin [Orientador] Carla Beatriz Grespan Bottoli
Ed Hoffmann Madureira
Data de defesa: 11-06-2014
Programa de Pós-Graduação: Química
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
Sejam quais forem os resultados com êxito ou não, o importante é que no final cada um possa dizer: “fiz o que pude”
Louis Pauster.
Dedico esse trabalho A Deus por estar comigo em todos os momentos, sendo meu refugio e minha fortaleza nos momentos mais difíceis Aos meus pais Maria Angela e Luiz Paulo pelo exemplo e pelo apoio. Ao meu avô José Carlos pelos ensinamentos. Ao meu irmão Luiz Renato pela amizade e companheirismo. À Bruna pelo amor, compreensão e por estar sempre ao meu lado.
Agradecimentos
Ao meu orientador professor Marcos Nogueira Eberlin, por ter me recebido em seu laboratório e pela ajuda e orientação no trabalho.
À Rosineide Costa Simas, pelo apoio fundamental, pelos conselhos e por acreditar em mim e no grupo de quantificação.
À Andreia de Melo Porcari, pela ajuda de extrema importância em todos os momentos que precisei.
À Patrícia Marafon Porciuncula, pelos conhecimentos veterinários, pela alegria contagiante, pela companhia no laboratório nos sábados e domingos extraindo amostra.
Ao Hélio Alves Martins Junior, pelos ensinamentos em quantificação e pela ajuda com o tratamento estatístico das amostras.
À Christina Ramires Ferreira, pelo apoio e pelas correções mesmo que a distância.
À Mirela Coelho pela ajuda com os relatórios, qualificação e com as apresentações.
Ao José Nélio Salles, por ter fornecido as amostras para a quantificação e pela ajuda com os conhecimentos em fisiologia animal.
Ao Professor Pietro Sampaio Baruselli e a Emiliana Santana Batista pela ajuda com a interpretação fisiológica dos dados.
Aos colegas de laboratório Eduardo Meurer, Giovana Anceski Bataglion, Fábio D’Alexandri, Phellipe H. Amaral, Clécio Klitizke, Marcos Albieri Pudenzi, Elias Tessaro.
À Quantum Analítica e Biotecnologia Ltda, em especial aos colegas Laurindo César Pampana, Geógio Freesz Valadares e Mauricio del Biggio.
À T&E Analítica Ltda., em especial ao Flávio Leite, por ter me permitido cursar as matérias do curso e aos colegas Bruna Nardy Valadares, José Arnaldo Dibbern Fávero e Izumi Kanashiro Minguini.
Aos professores Ed Hoffman Madureira e Carla Beatriz Grespan Bottoli, por terem me auxiliado na finalização deste trabalho com seus comentários.
CURRICULUM VITAE
DADOS PESSOAIS
Nome: Marcos Paulo Steola
Nascimento: 09/03/1981- Amparo/SP - Brasil
Endereço Eletrônico: steola.sabia@uol.com.br
FORMAÇÃO ACADÊMICA:
2002 – 2009 Bacharelado em Química
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Campinas, Brasil. 1996 – 1999 Técnico em Química
Escola Técnica Estadual “Conselheiro Antônio Prado”, ETECAP, Campinas, Brasil
EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL:
Cargo: Químico Pesquisador
Empresa: Quantum Analítica e Biotecnologia Ltda.
Período: 05/2011 – 06/2014
Cargo: Analista Químico
Empresa: T&E Analítica Centro Analítico e Cientifico Ltda
Período: 07/2008 – 10/2010
Cargo: Analista Químico
Empresa: LabTec Laboratório de Alta Tecnologia Ltda
Cargo: Analista Químico
Empresa: SGB Consultoria Química Ltda.
Período: 11/2002 – 06/2006
Cargo: Auxiliar de Escritório
Empresa: Baccarelli, Tonelotto & Cia Ltda.
xiii
QUANTIFICAÇÃO DOS HORMÔNIOS ESTEROIDES EM PLASMA E
FLUIDO FOLICULAR BOVINO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEQUENCIAL (LC-MS/MS)
RESUMO
A utilização da espectrometria de massas como ferramenta de quantificação de moléculas em matrizes biológicas complexas vem sendo difundida durante os últimos anos, devido ao sua versatilidade, facilidade no preparo das amostras, alta sensibilidade e rapidez na quantificação. A utilização da cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas uniu o poder de separação da cromatografia líquida com o poder de identificação da espectrometria de massas, proporcionando corridas analíticas mais rápidas e menores limites de detecção.
O presente trabalho teve como objetivo validar metodologia para a quantificação de 5 hormônios esteroides (estradiol, cortisol, testosterona, progesterona e androstenediona) em plasma e 2 hormônios esteroides ( estradiol e progesterona) em fluido folicular bovino, utilizando-se cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas, para uso na quantificação de amostras provenientes de duas raças diferentes, Bós taurus e Bós indicus, principais constituintes do rebanho brasileiro, submetidas a duas dietas diferentes.
Devido à dificuldade de encontrar matrizes biológicas isentas de hormônios esteroides optou-se pelo uso da técnica de diluição isotópica na validação da
xiv metodologia, técnica em que o sinal do hormônio a ser analisado é comparado com seu análogo deuterado, minimizando o efeito da matriz biológica.
A metodologia desenvolvida e validada poderá ser utilizada na quantificação de hormônios em matrizes biológicas provenientes de outras raças bovinas, bem como ser aplicada para a quantificação de hormônios esteroides em plasma e fluido folicular em humanos.
xv
QUANTIFICATION STEROIDS HORMONES IN PLASMA AND
FOLLICULAR FLUID BOVINE USING LIQUID CHROMATOGRAPHY
COUPLED SEQUENCIAL MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS)
ABSTRACT
The use of mass spectrometry and quantification of molecules in complex biological matrices tool has been widespread over the last years due to its versatility, ease of sample preparation, high sensitivity and fast quantification. The use of high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry attached the separation power of the liquid chromatography and identification mass spectrometry, giving analytical runs faster and lower detection limits.
This study aims to validate the methodology for quantification of 5 steroid hormones ( estradiol , cortisol , testosterone , progesterone and androstenedione ) in plasma and 2 steroid hormones ( estradiol and progesterone ) in bovine follicular fluid , using liquid chromatography with mass spectrometry detector , for use in the quantification of samples from two different breeds , Bos taurus and Bos indicus , the main constituent of the Brazilian herd , subjected to two different diets .
Due to the difficulty of finding in biological matrices free steroid hormones, we opted for the use of the isotope dilution technique to validate the methodology , a technique in which the signal of the hormone being examined is compared with its deuterated analogue, minimizing the effect of the biological matrix .
The methodology developed and validated may be used in the quantification of hormones in biological matrices from other cattle breeds, as well as be applied to quantify steroid hormones in plasma and follicular fluid in humans.
xvi
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ... xviii
LISTA DE TABELAS ... xix
LISTA DE FIGURAS ... xx
1 Capitulo 1: Introdução Geral ... 2
1.1 Introdução... 2
2 Capítulo 2: Objetivos ... 9
3 Capitulo 3: Procedimento Experimental ... 11
3.1 Procedimento Experimental... 11
3.1.1 Delineamento Experimental e Coleta das Amostras: ... 11
3.1.2 Desenvolvimento e Validação do método LC-MS/MS. ... 14
3.1.3 Extração das Amostras de Plasma e Líquido Folicular ... 18
3.1.4 Escolha da metodologia de quantificação ... 19
3.1.5 Soluções e Curvas de calibração para amostras de plasma. ... 19
3.1.6 Soluções e curvas analíticas para amostras de líquido folicular ... 20
3.1.7 Validação ... 20
4 Capítulo 4: Resultados e Discussões ... 24
4.1 Validação analítica para quantificação de hormônios esteróides em plasma bovino ... 24
4.2 Validação do método para quantificação de progesterona e estradiol de amostras de fluido folicular ... 27
4.3 Resultados das Análises das Amostras de Plasma. ... 29
4.3.1 Critérios para aceitação e cálculo dos resultados ... 29
4.3.2 Quantificacão de progesterona em Plasma ... 30
xvii
4.3.4 Testosterona em plasma ... 33
4.3.5 Cortisol em plasma ... 34
4.3.6 Androstenediona em plasma ... 35
4.4 Resultados das Análises das Amostras de Fluido Folicular ... 36
4.4.1 Progesterona em fluido folicular ... 36
4.4.2 Estradiol em líquido folicular ... 37
5 Capitulo 5: Conclusões ... 40
xviii
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ACN – Acetonitrila
APCI – Ionização Química a Pressão Atmosférica
APPI – Fotoionização a Pressão Atmosférica
CQ – Amostra de Controle de Qualidade
ESI – Ionização de Eletronspray
ID – Diluição Isotópica
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
FF – Fluido Folicular
LD – Limite de Detecção
LLE – Extração Líquido Líquido
LIQ – Limite Inferior de Quantificação
MeOH – Metanol
MS – Espectrometria de Massas
MRM – Monitoramento de Reações Multiplas
MTBE - Éter Metil terc-butílico
m/z – Razão Massa Carga
OPU– Aspiração Folicular
PFP – Penta Flúoro Funil
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 :Transições de quantificação e confirmação otimizadas para os
hormônios estudados e seus padrões internos...16
Tabela 2 : Gradiente de Eluição...17
Tabela 3 : Valores de LD e LOQ em plasma...24
Tabela 4 : Curvas de calibração para os diferentes hormônios em plasma...25
Tabela 5: Precisão intra-ensaio e inter-ensaio para os hormônios em plasma...26
Tabela 6 : Curvas de calibração para os hormônios estradiol e progesterona em líquido folicular...27
Tabela 7 : Precisão intra-ensaio e inter-ensaio para os hormônios em líquido folicular...28
xx
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Exemplos de raças de bovinos da e origem zebuína (Bos indicus; à
esquerda) e de origem taurina (Bos taurus; à direita)...2
Figura 2. Estrutura molecular e massa molar dos hormônios esteroides
quantificados...7
Figura 3. Diagrama esquemático das diferentes fases do estudo e OPU
destinadas a produção in vitro de embriões...12
Figura 4. Sincronização da onda de crescimento folicular para realização da
aspiração dos óocitos (D5) e do fluido folicular (D11). No D0 – a administração de 2 mg. de benzoato de estradiol e um implante auricular de norgestomet. No D5 – aspiração folicular para PIV. No D11 – aspiração do folículo dominate (FD) para coleta do fluido folicular e retirado do implante...13
Figura 5. Diagrama esquemático das aspirações do foliculo dominante durante o
período experimental...14
Figura 6 Cromatograma do Padrão 17 Estradiol na concentração de 2000 pg mL
-1
ionizado em APPI, APCI e ESI...15
Figura 7: Relação 1:1 entre esteroide marcado e não marcado nas amostras
referência...20
Figura 8: Comparativo entre as médias das concentrações de progesterona em
plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia)...30
Figura 9: Comparativo entre as médias das concentrações de estradiol (pg mL-1) em plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia)...32
Figura 10: Comparativo entre as médias das concentrações de testosterona (pg
mL-1) em plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia)...33
xxi
Figura 11: Comparativo entre as médias das concentrações de cortisol (pg mL-1) em plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia)...34
Figura 12: Comparativo entre as médias das concentrações de androstenediona
(pg mL-1) em plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia)...35
Figura 13: Comparativo entre as médias das concentrações de progesterona (pg
mL-1) em fluido folicular para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia)...37
Figura 14: Comparativo entre as médias das concentrações de estradiol (pg mL-1) em líquido folicular para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia)...38
1
2
1
Capitulo 1: Introdução Geral
1.1 Introdução
A crescente demanda mundial por alimentos exige manejo intensivo e nutrição que estimulem o desenvolvimento precoce, engorda e reprodução de rebanhos. O rebanho bovino brasileiro é o maior rebanho comercial do mundo, com aproximadamente 200 milhões de cabeças de gado, superando o indiano e o chinês (1). Em sua maioria (80%), ele é composto de animais da raça zebuína (Bos
indicus) e animais da raça taurina (Bos taurus), que representam 20% do rebanho
(2)
(Figura 1). Os animais Bos indicus são reconhecidamente mais tolerantes ao
clima tropical, especialmente quanto ao calor (3) apresentando também maior resistência a endo e ectoparasitas quando comparados com os bovinos Bos
taurus. Entretanto as características de produtividade dos animais zebuínos, como
ganho de peso pré e pós desmama, fertilidade e habilidade materna são consideradas inferiores em relação aos animais taurinos, além disso, os mesmos apresentam qualidade de carne e carcaça inferiores aos animais Bos taurus, especialmente quanto à maciez da carne (4).
Figura 1: Exemplos de raças de bovinos da e origem zebuína (Bos indicus;
à esquerda) e de origem taurina (Bos taurus; à direita).
São observadas diferenças entre animais de origem zebuína e taurina em relação à eficiência reprodutiva. Devido à importância dos hormônios esteroides
3 no ciclo ovariano, acredita-se que estes possam variar significativamente entre zebuínos e taurinos. A avaliação de hormônios esteroides em fluidos biológicos como plasma e líquido folicular e de fundamental importância para responder a essa questão biológica e desenvolver protocolos hormonais mais eficientes para o manejo eficiente da reprodução em bovinos(5).
Os hormônios esteroides compreendem um grupo de moléculas de baixo peso molecular, lipofílicas e que são derivadas do colesterol. Esses hormônios atuam como poderosas moléculas sinalizadoras que regulam uma série de funções no organismo (6). Um exemplo de processo regulado por tais moléculas é a produção de leite em mamíferos, característica bastante diferenciada entre taurinos e zebuínos. Outro fluido biológico diretamente relacionado às características reprodutivas de fêmeas é o fluido folicular (FF). O FF representa o micro-ambiente oocitário e portanto é um elemento vital e dinâmico do folículo ovariano. A composição do FF está relacionada à viabilidade de desenvolvimento dos oócitos para formarem embriões (19). Os principais componentes do líquido folicular são hormônios esteroides, metabólitos, polissacarídeos, proteínas, espécies reativas de oxigênio, bem como antioxidantes e enzimas que auxiliam principalmente o crescimento e na maturação do oócito e das células foliculare que o circulam. O FF também protege o oócito de danos físicos e estresse oxidativo(7-9) , além de servir como meio de comunicação entre o oócito e as células foliculares. O intercâmbio metabólico entre o oócitos e as células foliculares é necessário para a aquisição do potencial do desenvolvimento oocitário, bem como permitir que o ciclo meiótico oocitário seja completo para permitir a fertilização do mesmo pelo espermatozoide logo após a ovulação (20). Acredita-se que diferenças relacionadas à maturidade sexual das raças possam estar expressas e correlacionadas com a concentração de esteroides sexuais no líquido folicular desses animais (33-35). Além disso, o tipo de alimentação a que os animais são submetidos também pode afetar diretamente a produção e a concentração desses hormônios no plasma de no FF (22).
Na área comercial e científica de medicina humana e veterinária existe demanda crescente de quantificação de hormônios esteroides em fluidos
4 biológicos (25,26). Esse tipo de ensaio exige a utilização de técnicas analíticas de alta sensibilidade e alta seletividade, devido ao fato de que os hormônios esteroides encontram-se presentes em baixas concentrações (ng mL-1 ou pg mL-1) e existe limitação de volume de amostras biológicas complexas em diversos casos. (10-12)
Técnicas analíticas baseadas em imunoensaio são comumente empregadas para a quantificação de esteroides em amostras biológicas devido à facilidade e simplicidade de seu uso(23). Entretanto, a limitação mais grave das técnicas baseadas em detecção de hormônios esteroides por meios de anticorpos é que as mesmas apresentam alta inespecificidade de ligação aos esteroides, fenômeno denominado reação-cruzada (13,14). A inespecificidade dos anticorpos comerciais deve-se principalmente à estrutura molecular similar (ciclopentano-peridrofenantreno) dos hormônios esteroides e aos efeitos de matriz ocasionados pela extração ineficiente em amostras biológicas (7,8). No caso de estudos veterinários, esse cenário se agrava ainda mais, uma vez que praticamente não existem kits de imunoensaios desenvolvidos e validados para determinação de esteroides em bovinos. É comum ocorrer adaptações de kits humanos, sendo essa prática é extremamente questionável e inapropriada do ponto de vista analítico, dada à grande discrepância dessas matrizes e à falta de adequada validação analítica das adaptações.
Por essas razões, há crescente interesse e demanda para desenvolvimento de ensaios baseados em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) para quantificação de hormônios esteroides em amostras biológicas de origem animal, uma vez que esta técnica possui altíssima sensibilidade e permite a quantificação específica (ou seja, sem possibilidade de ocorrência de reações cruzadas) de hormônios esteroides (9). LC-MS/MS tem a potencialidade de analisar de modo simultâneo um grande número de analitos em uma mesma corrida cromatográfica (24). A ionização de hormônios esteroides utilizando-se APPI é especialmente vantajosa comparando-se com outras fontes de ionização comerciais (ESI e APCI), já que APPI é uma fonte de ionização
5 suave, ionizando de forma bastante seletiva os hormônios esteroides, resultando em cromatogramas mais limpos (25).
A técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) foi amplamente utilizada para a caracterização estrutural dos esteroides, possuindo melhores resoluções na separação dos picos cromatográficos, em comparação com (LC-MS/MS), porém nessa técnica há necessidade de derivatização química para garantir a volatilidade das moléculas, aumentando assim o tempo de preparo das amostras e das corridas cromatográficas. Devido à necessidade de protocolos simples de preparação de matriz e de rápida análise, a utilização de LC-MS/MS com ionização por APPI é uma estratégia atraente para laboratórios de análises clínicas (26,27).
Em métodos cromatográficos utilizados para quantificação, normalmente os compostos são xenobióticos, sendo assim, os mesmos não ocorrem normalmente na matriz biológica de interesse. Esse fato torna a validação de métodos analíticos mais simples, pois o preparo das amostras de referências como amostras de calibração e controles de qualidade podem ser facilmente obtido pela adição de concentrações conhecidas dos padrões de referencia diretamente na matriz biológica.
A determinação quantitativa de substâncias endógenas (de ocorrência natural) em matrizes biológicas é, entretanto, mais complicada tanto do ponto de vista analítico como de validação. As principais figuras de mérito de uma validação analítica: seletividade, precisão, exatidão e estabilidade. Essas figuras de mérito são determinados pela adição de concentrações conhecidas de padrões de referência na matriz biológica. Entretanto, essa abordagem não pode ser aplicada impossível encontrar uma matriz biológica isenta do analito endógeno, como ocorre na determinação de hormônios esteroides em plasma e FF.
Existem alternativas para a validação de hormônios esteroides em plasma e FF. Primeiramente essas amostras biológicas podem ser quantificadas usando-se uma curva de calibração com padrões preparados em soluções aquosas ou de solventes orgânicos, porém essas soluções não serão capazes de demonstrar a
6 eficiência da extração a partir de uma matriz biológica ou os efeitos da matriz que ocorrem durante a analise. Uma segunda opção seria o pré-tratamento da matriz branco, para remover o máximo possível de analíto endógeno. Essa última alternativa apresenta como desvantagem descaracterização da matriz e tempo longo de preparo de amostra, podendo não ser bem sucedida para moléculas presentes em baixos níveis de concentração como é o caso dos hormônios esteroides. A terceira alternativa seria a determinar a concentração utilizando o intercepto da curva de calibração, esse processo requer grande volume de amostra. O uso de uma matriz simulada (surrogate) pode ser também considerado. Porém devido à complexidade das matrizes biológicas é muito difícil, se não impossível, reproduzir a complexidade do plasma e do FF (28-30). A alternativa mais vantajosa, e que foi empregada neste trabalho, é a quantificação utilizando a técnica de diluição isotópica aliada à cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (ID-LC-MS/MS).
A estratégica de ID-LC-MS/MS combina a alta seletividade e sensibilidade da espectrometria de massas à versatilidade da cromatografia líquida, permitindo quantificação simultânea e confiável de um grande número de esteroides em ampla faixa de concentração (10). Uma vez que o equilíbrio entre o isótopo análogo e o analito tenha sido alcançado, a recuperação total do analito não é mais necessária porque a determinação da concentração encontrada baseia-se na medida da razão entre o sinal do analito e do isótopo análogo (conhecida), a transformação do analito é compensada pelo uso do isótopo análogo como padrão interno (11).
O presente trabalho é fruto de uma parceria interdisciplinar do Instituto de Química da Unicamp com a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ/USP) visando desenvolver e validar uma metodologia para a quantificação de cinco hormônios esteroides em plasma e dois hormônios esteroides em FF bovino zebuíno e taurino. Os níveis dos hormônios em plasma e FF foram a animais submetidos a diferentes níveis energéticos (dietas), correlacionando esses resultados com as diferenças observadas na reprodução e produção de leite desses animais. Entre os esteroides foram
7 selecionados a progesterona, 17 -estradiol, testosterona, cortisol e androstenediona, cujas estruturas estão apresentadas na Figura 2. A escolha desses hormônios deveu-se à sua importância fisiológica na produção de leite e controle do ciclo estral nesses animais (31-33).
Figura 2. Estrutura molecular e massa molar dos hormônios esteroides
8
9
2
Capítulo 2: Objetivos
• Desenvolver e validar um método de LC-MS/MS para análise de progesterona, 17 -estradiol, testosterona, cortisol e androstenediona em amostras de plasma bovino;
• Desenvolver e validar um método de LC-MS/MS para análise de progesterona, 17 -estradiol em amostras de fluido folicular bovino;
• Comparar níveis desses hormônios encontrados nas diferentes matrizes para decidir se há correlação da concentração do hormônio entre elas;
• Estudar se a concentração desses hormônios é afetada pelo nível energético ao qual os animais são submetidos.
• Estudar se a concentração desses hormônios é afetada pela origem (taurina ou zebuína) dos animais em estudo.
10
11
3
Capitulo
3:
Procedimento
Experimental
3.1 Procedimento Experimental
3.1.1 Delineamento Experimental e Coleta das Amostras:
As amostras de plasma e fluido folicular bovino foram disponibilizadas em sistema de colaboração interdisciplinar pela Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, Campus de Pirassununga – SP. O estudo foi divido em três fases Figura 3: Na fase pré-experimental os animais foram submetidos a uma dieta de adaptação a base de uréia e cana de açúcar, fornecida à vontade. Na fase de adaptação, todos os animais receberam a dieta de mantença durante 21 dias, com o objetivo de adaptar os animais a nova dieta. Na fase de tratamento, as vacas receberam as dietas experimentais durante 98 dias e foram distribuídas de forma equilibrada de acordo com o peso corporal, população folicular e idade em arranjo fatorial 2x2 (nível de energia da dieta e raça). Os níveis de energia utilizados no experimento foram 100% da energia de mantença (M) e 170% da energia de mantença (1,7M) e as raças utilizadas foram Gir (Bos indicus) e Holandesa (HPB, Bos taurus). Dessa forma, ficaram categorizados quatro grupos experimentais: 1) Grupo mantença indicus - vacas da raça Gir, as quais receberam 100% da dieta de mantença, 2) Grupo alta energia indicus - vacas da raça Gir. As quais receberam 170% da dieta de mantença, 3) Grupo mantença taurus - vacas da raça Holandesa, as quais receberam 100% da dieta de mantença e 4) Grupo alta energia taurus - vacas da raça Holandesa, as quais receberam 170% da dieta de mantença1.
1
Energia de Mantença é a quantidade de energia ingerida que resultará em nenhuma perda ou ganho de energia a partir dos tecidos do corpo do animal (10)
12
Figura 3. Diagrama esquemático das diferentes fases do estudo e OPU
destinadas a produção in vitro de embriões.
As aspirações foliculares foram precedidas de sincronização da emergência da onda de crescimento folicular, na qual consistiu em administrar 2 mg de benzoato de estradiol (Sincrodiol , Ourofino Agronegócio) e um implante auricular de norgestomet (Crestar , Intervet Schering-PloughAnimal Health). Cinco dias após a administração dos tratamentos hormonais, realizou-se a OPU. Os animais permaneceram com o implante auricular por mais 6 dias para realizar a colheita do fluido folicular do folículo dominante (Figura 4).
13
Figura 4. Sincronização da onda de crescimento folicular para realização
da aspiração dos óocitos (D5) e do fluido folicular (D11). No D0 – a administração de 2 mg. de benzoato de estradiol e um implante auricular de norgestomet. No D5 – aspiração folicular para PIV. No D11 – aspiração do folículo dominate (FD) para coleta do fluido folicular e retirado do implante.
Durante o período experimental, foram realizadas colheitas de sangue semanais, concomitantes às aspirações foliculares e do folículo dominante para avaliação hormonal. A amostra de líquido folicular foi obtida por aspiração do folículo dominante, 11 dias após o início da sincronização (ou 6 dias após a OPU;
Figura 3). Durante o período experimental, foram realizadas 10 OPUs do Foliculo
14
Figura 5. Diagrama esquemático das aspirações do foliculo dominante durante o
período experimental
3.1.2 Desenvolvimento e Validação do método LC-MS/MS.
O presente projeto foi realizado em um equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC – High Performance Liquid Chormatography) modelo Agilent 1200 Series, acoplado a um espectrômetro de massas tipo triplo quadrupolo com ion trap linear modelo 5500 Q-Trap® da AB Sciex com fonte de fotoionização à pressão atmosférica (APPI – Atmospheric Pressure Photo
Ionization). Esta fonte de ionização foi escolhida por ter desempenho superior às
demais, APCI e ESI devido à baixa polaridade e baixo peso molecular característicos das moléculas de hormônios esteroides, conforme exemplo mostrado na Figura 6, onde a eficiência de ionização de 17 estradiol em mesma concentração, é comparada, utilizando três fontes clássicas de ionização (APPI, APCI e ESI). A maior eficiência na ionização de hormônios esteroides é necessária para atingir níveis de quantificação adequados sem necessidade de derivação dos analitos. Além disso, como a ionização ocorre em fase gasosa e é
15 dependente do potencial de ionização do analito, ocorre menor efeito de matriz e supressão iônica(11-14).
Figura 6 Cromatograma do Padrão 17 Estradiol na concentração de 2000
pg mL-1ionizado em APPI, APCI e ESI.
As transições de MRM (Monitoramento de Reações Múltiplas) foram selecionadas com base em especificidade, intensidade e relação sinal ruído, sendo otimizadas conforme mostra a Tabela 1, por infusão direta dos padrões em metanol no espectrômetro de massas, de acordo com as especificações do equipamento.
É importante salientar que entre os esteroides, o estradiol e seu padrão interno foram analisados em modo negativo, enquanto que os outros hormônios foram analisados em modo positivo, na mesma corrida cromatográfica. Isso foi possível utilizando rápida troca de modos de ionização no equipamento durante a corrida cromatográfica. Utilizou-se como dopante para a fonte de APPI o tolueno,
16 o qual foi infundido por uma bomba HPLC Shimadzu LC-20AD, com vazão de 0,15 mL min-1. Utilizou-se também uma válvula de 5 portas para evitar que a fonte de ionização fosse contaminada com impurezas resultantes do processo de extração das amostras. Essa válvula tem a função de descartar a vazão de fase móvel cromatográfica da coluna antes que a mesma seja ionizada e atinja o analisador de massas, evitando contaminação da fonte de ionização por substâncias presentes na matriz
Tabela 1. Transições de quantificação e confirmação otimizadas para os
hormônios estudados e seus padrões internos
Hormônio 1o Transição de m/z (quantificação) 2o Transição de m/z (confirmação) Estradiol 271,1>173,1 271,1>143,1 D2-Estradiol* 273,1>185,1 - Cortisol 363,2>121,2 363,2>327,3 D4-cortisol* 367,2>121,2 - Progesterona 315,0>109,1 315,0>97,3 D9-Progesterona* 324,2>113,1 - Testosterona 289,1>97,0 289,1>109,1 13C3-Testosterona* 292,0>100,0 - Androstenediona 287,1>97,1 287,1>109,1 13 C5-Androstenediona* 292,2>100 -
* Hormônios marcados com isótopos estáveis, utilizados como padrão interno dos mesmos hormônios não marcados.
A coluna cromatográfica escolhida para a separação foi Luna® PFP Penta Flúor Fenil (150 mm x 4,6 mm x 5 µm). A temperatura do forno foi mantida em
17 40oC. O gradiente de vazão de fase móvel utilizado é mostrado na Tabela 2. O volume de injeção foi 40 µL. Acetona foi utilizada como solvente de lavagem da agulha. A temperatura do injetor foi mantida a 4oC.
Tabela 2: Gradiente de Eluição
Tempo (min) Vazão de Fase Móvel (µL min-1) % (v/v) H2O (0,1% ác. Fórmico) % (v/v) MeOH (0,1% ác. Fórmico) 0,00 800 1,0 99,0 2,00 800 0,0 100,0 4,00 800 0,0 100,0 4,10 1600 0,0 100,0 8,00 1600 0,0 100,0 8,10 800 1,0 99,0 9,0 800 1,0 99,0
A análise cromatográfica foi realizada em tempo total de 5 minutos, na qual os 5 hormônios e correspondentes padrões internos deuterados foram eluídos. A utilização dos padrões internos teve também a função de corrigir pequenas perdas de volume durante o processo de extração dos hormônios.
Devido a alguns interferentes que possuíam tempo de retenção superior ao dos analitos, foi necessário, entretanto tempo total de análise total de 10 minutos. Durante esse período, a vazão cromatográfica foi descartada na válvula de 5 portas do espectrômetro de massas, visando evitar contaminação da fonte de ionização, como esclarecido anteriormente.
A quantificação foi realizada com base na área do pico cromatográfico das transições de m/z mais intensa de cada um dos fragmentos. Uma segunda transição de m/z para a confirmação da identificação do hormônio foi incluída no método para garantir sua especificidade analítica, ou seja, excluir completamente a possibilidade de reações cruzadas.
18 3.1.3 Extração das Amostras de Plasma e Líquido Folicular
Para a extração dos hormônios em ambas as matrizes biológicas utilizou-se extração líquido-líquido (LLE).
3.1.3.1 Amostras de Plasma
Para amostras de plasma, partiu-se do volume de 350 µL de amostra, adicionando-se primeiramente a solução contendo padrão interno (8,75 µL de uma solução contendo 320 pg mL-1 de todos os padrões marcados). Após agitação, aguardaram-se 5 min para que o equilíbrio isotópico pudesse ser atingindo. Em seguida, agitou-se durante 30 segundos em vortex, e adicionaram-se 500 µL de MTBE (éter metil-tercbutílico). Realizou-se a agitação em vortex por 1 min, centrifugando-se então durante 5 min a 12100 g. Uma alíquota de 400 µL da fase orgânica superior foi recolhida. O processo de extração foi repetido então para a fase aquosa, adicionando-se novamente 500 µL de MTBE, agitando-se por 1 minuto em vortex e finalmente centrifugando-se durante 5 min a 12.100 g. Uma nova alíquota de 400 µL da fase orgânica superior foi retirada e combinada ao volume de 400 µL retirado anteriormente. O solvente orgânico foi evaporado utilizando fluxo de nitrogênio até a secura. As amostras foram re-suspendidas em 175 µL de MeOH.
3.1.3.2 Amostras de Líquido Folicular
Para o FF partiu-se de 100 µL de amostra, adicionando-se primeiramente a solução contendo padrão interno (13 µL de uma solução contendo 75 ng mL-1 dos padrões marcados progesterona e estradiol). Após a agitação, aguardaram-se 5 min. para que o equilíbrio isotópico pudesse ser atingido. Em seguida, agitou-se durante 30 segundos em vortex, e adicionaram-se 500 µL de MTBE (éter metil-tercbutílico). Agitou-se em vortex por 1 min., centrifugando-se então durante 5 min. a 12100 g. Uma alíquota de 400 µL da fase orgânica superior foi recolhida. O processo de extração foi repetido então para a fase aquosa adicionando-se novamente 500 µL de MTBE, agitando-se por 1 minuto em vortex centrifugando-se durante 5 min. a 12100 g. Uma nova alíquota de 400 µL da fase orgânica superior
19 foi retirada e recombinada com os 400 µL retirados anteriormente. O solvente orgânico foi evaporado sobre fluxo de nitrogênio até a secura. As amostras foram re-suspendidas em 650 µL. de metanol.
3.1.4 Escolha da metodologia de quantificação
Para a quantificação das amostras foi proposta a metodologia de diluição isotópica (ID – isotopic dilution). Por MS com diluição isotópica (ID-MS), uma vez que o equilibrio isotópico é atingido, a recuperação total do analito não é mais necessária, pois será determinada pela da relação de área entre o pico do analito e do isótopo análogo (padrão interno). Essa metodologia é mais rápida e proporciona melhor precisão em comparação com a metodologia de adição de padrão(15-17). Por esses motivos, essa estratégica foi escolhida para a quantificação das amostras deste projeto.
Por se tratar de análise de substâncias endógenas em matriz biológica complexa, não foi possível encontrar uma amostra branca, ou seja, sem a presença, ainda que mínima, de nenhum dos analitos estudados. Assim, as curvas de calibração foram efetuadas utilizando-se MeOH como solvente. Os controles de qualidade (CQs) foram efetuados em matriz, seguindo a metodologia de diluição isotópica.
3.1.5 Soluções e Curvas de calibração para amostras de plasma.
Soluções-estoque dos hormônios estudados e de seus padrões internos foram preparadas separadamente em MeOH na concentração de 250 µg mL-1. Soluções de trabalho foram preparadas a partir da solução estoque, também em MeOH, na concentração de 500 ng mL-1. Todas as soluções foram mantidas a -20oC.
As soluções de calibração para os hormônios em plasma foram preparadas em MeOH nas concentrações de: 10,8; 12,4; 86,8; 92,6; 111,1; 138,9; 173,6; 231,2; 347,2; 694,4; 1296,3; 1388,9; 2500,0 e 2777,8 pg mL-1.
20 3.1.6 Soluções e curvas analíticas para amostras de líquido folicular
Para as amostras de FF, devido às concentrações dos diferentes hormônios apresentarem grande diferença em unidades de concentração, foram quantificados os hormônios progesterona e 17 -estradiol, que apresentam maior concentração e maior importância na reprodução bovina. As soluções de calibração foram preparadas a partir das solução de trabalho de 500 ng mL-1 na concentração de 0,5; 0,75; 1,0; 2,0 ;2,5 ;3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 ng mL-1 para 17 -estradiol, e de 0,5; 0,75; 1,0; 2,0 ;2,5 ;3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0; 8,0; 10,0; 12,0; 14,0; 16,0; 18,0; 20,0 ng mL-1 para progesterona
3.1.7 Validação
Como já discutido, não foi possível obter um plasma “branco”, ou seja, sem a presença de nenhum dos hormônios estudados. Desta forma, foi preparado um
pool de amostras de plasma, o qual foi denominado “amostra referência”. Em
alíquotas dessa amostra, foram adicionadas quantidades conhecidas dos padrões internos (marcados), procurando-se estabelecer uma relação 1:1 entre o analito e seu padrão interno. A Figura 7 mostra a relação utilizada na diluição isotópica.
Amostra com Esteroide Esteroide Marcado Mistura (1:1)
Figura 7: Relação 1:1 entre esteroide marcado e não marcado nas
21 A partir do estabelecimento da razão 1:1 entre analito marcado e não marcado, foram construídos os CQ a serem utilizados para avaliação da precisão, recuperação e eficiência de extração. Como CQ baixo, foi utilizada a amostra referência dopada com padrão marcado na proporção 1:1. Para o CQ médio, aumentou-se em 50% a concentração dos analitos endógenos (pela da adição de padrão) e adicionou-se 1,5 vezes (em relação ao CQ baixo) a concentração dos padrões marcados, mantendo-se a proporção 1:1 entre marcados e não marcados. Para o CQ alto, dobrou-se a concentração dos analitos endógenos (em relação ao CQ baixo) e dobrou-se a concentração dos padrões marcados em relação ao CQ baixo, mantendo mais uma vez a proporção 1:1. Essas adições foram efetuadas para manter a relação de área entre o analito e o padrão marcado próximas a 1.
A repetitividade (precisão intra-ensaio) foi determinada por meio da análise das amostras CQ, nas concentrações baixa, média e alta (N=3). A precisão intermediária (precisão inter-ensaio) foi avaliada pela da análise de amostras CQ em dois dias diferentes (N=6). A eficiência de extração (recuperação) foi determinada para os pontos de CQ baixo, médio e alto, comparando esses resultados com uma amostra não dopada, extraída e re-suspendida em solução de analito e padrão interno nas diferentes concentrações. Também foi avaliada a exatidão calculando-se o valor encontrado frente à concentração de hormônio adicionada.
Para expressar os resultados de exatidão na validação foram expressos na forma de média ± I, onde I é a incerteza da média, definida por I = tn-1* / .
O coeficiente de variação relativo (CV%) foi calculado através da fórmula: s/( )*100, onde s é a estimativa do desvio padrão e é a média das determinações. Os cálculos de exatidão e recuperação foram efetuados considerando a concentração teórica de padrão marcado adicionado na matriz:
Exatidão = *100
22 As amostras de plasma (N=194) foram analisadas da mesma forma como realizado para a amostra referência e os resultados foram determinados utilizando-se equação da curva de calibração. Amostras-controle (amostras referência dopadas) foram analisadas entre as amostras, visando garantir a qualidade dos resultados.
As amostras de FF (N=194) foram analisadas utilizando-se o mesmo principio das análises em plasma, quantificando-se os hormônios 17 estradiol e progesterona. Os resultados foram determinados pela da equação da curva de calibração, amostras controle (amostras referência dopadas) foram analisadas entre as amostras, de forma a garantir a validade dos resultados. As amostras de FF estavam diluídas em soro fisiológico para facilitar o manuseio no momento da coleta.
23
24
4
Capítulo 4: Resultados e Discussões
4.1 Validação analítica para quantificação de hormônios
esteróides em plasma bovino
Os critérios de aceitação para os parâmetros de validação foram estabelecidos de acordo com o guia para validação de métodos analíticos e bio analíticos da ANVISA, RE899. Foram avaliados parâmetros como: linearidade, precisão, exatidão limite de quantificação, limite de detecção, estabilidade de auto-injetor e efeito residual das injeções (carry over).
Para a validação das amostras, o limite de detecção para o plasma foi determinado pela razão sinal ruído do equipamento, sendo determinado em 3,0 pg mL-1 , estabeleceu-se também como limite de quantificação o primeiro ponto da curva de calibração, sendo 10,8 pg mL-1 para estradiol, progesterona e testosterona e de 12,4 pg mL-1 para cortisol e androstenediona. Foi necessário o uso de limites de quantificação em nível de picogramas por mililitros, pois esta é a faixa de concentração dessas moléculas em plasma. Os valores para o limite de quantificação e para o limite de detecção estão descritos na Tabela 3.
Tabela 3: Valores de limite de detecção e quantificação em plasma
Hormônio Plasma LOD LOQ pg mL-1 pg mL-1 Progesterona 3,0 10,8 17- - Estradiol 3,0 10,8 Cortisol 3,0 12,4 Testosterona 3,0 10,8 Androstenediona 3,0 12,4
25 As curvas de calibração foram construídas utilizando ponderação 1/x. Para critério de aceitação das curvas foi considerado um valor de coeficiente de correlação linear (r) 0,98. Os pontos com desvio menor do que 20% para o limite inferior de quantificação e 15% para os demais pontos. A seguir (Tabela 4), estão descritos os valores da equação da curva, o valor de R e a faixa validada para cada hormônio em plasma.
Tabela 4. Curvas de calibração para os diferentes hormônios em plasma
Analito Equação (c/ ponderação 1/x) R Intervalo Linear (pg mL-1) Estradiol y=0,00107x+0,05022 0,9941 10,8 – 2777,8 Cortisol y=0,00156x+0,00563 0,9988 12,4 – 2777,8 Progesterona y=3,65273x10-4 x +0,02277 0,9937 10,8 – 2777,8 Testosterona y=0,00151x +0,00137 0,9997 10,8 – 2777,8 Androstenediona y=0,00116x - 0,00461 0,9994 12,4 – 2777,8
Foram avaliadas a precisão e a exatidão dos hormônios em plasma em dois dias diferentes, e em três níveis de concentração. Em cada dia foram realizadas 3 determinações, avaliados os parâmetros de exatidão e precisão referentes à RE 899 da ANVISA, pela qual o coeficiente de variação (CV) deve apresentar valor máximo de 15 % e a exatidão entre 85 % a 115 %.Os valores de concentração teórica foram determinados por meio da concentração de hormônio marcado adicionado à matriz.
A Tabela 5 apresenta valores de precisão e exatidão para os hormônios: estradiol, cortisol, progesterona, testosterona e androstenediona em plasma.
26
Tabela 5. Precisão intra-ensaio e inter-ensaio para os hormônios em
plasma. Conc.Teórica Estradiol (pg mL-1) Intra-ensaio (n = 3) Inter-ensaio (n = 6) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) 158,5 147 ± 3,53 6,3 98,2 161 ± 19,2 11,9 101,2 237,8 235 ± 6,08 2,6 99,1 242 ± 8,76 3,6 101,7 317,0 297 ± 6,34 2,1 93,8 325 ± 22,7 7,0 98,7 Conc.Teórica Cortisol (pg mL-1) Intra-ensaio (n = 3) Inter-ensaio (n = 6) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) 802,9 802 ± 14,10 1,7 99,1 824 ± 32,8 3,9 102,7 1204,3 1288 ± 70,65 5,8 102,1 1223 ± 7,8 0,6 101,6 1605,7 1607 ± 31,99 2,0 100,1 1621 ± 26,1 1,6 99,8 Conc.Teórica Progesterona (pg mL-1) Intra-ensaio (n = 3) Inter-ensaio (n = 6) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) 284,8 258 ± 4,48 1,7 90,9 289 ± 28,1 9,7 101,5 427,3 419 ± 13,63 3,3 98,2 409 ± 13,4 3,2 95,9 569,7 559 ± 25,34 4,1 108,2 511 ± 16,7 3,3 95,9 Conc.Teórica Testosterona (pg mL-1) Intra-ensaio (n = 3) Inter-ensaio (n = 6) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) 115,5 119 ± 6,34 5,3 103,3 113 ± 28,1 5,5 98,3 173,2 201 ± 11,97 5,9 116,3 169 ± 44,4 9,9 97,7 231,0 215 ± 11,20 5,2 93,2 161 ± 14,5 9,0 92,1 Conc.Teórica Androstenediona (pg mL-1) Intra-ensaio (n = 3) Inter-ensaio (n = 6) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) Média + s (pg mL-1) CV (%) Exatidão (%) 67,6 67 ± 1,19 1,8 99,9 69 ± 3,81 5,5 102,7 101,4 95 ± 6,28 6,6 93,9 94 ± 0,93 1,0 93,3 135,2 131 ± 3,66 2,8 96,9 137 ± 15,6 11,3 104,9
27 Para a escolha do solvente de lavagem da agulha do auto injetor, foram realizados vários testes para minimizar o efeito residual, ou seja, a contaminação com amostras contendo altas concentrações de hormônios em amostras com baixas concentrações de hormônios. Foram testados os solventes acetonitrila, MeOH e água contendo 1% de ácido fórmico. Os melhores resultados forma obtidos utilizando-se acetona.
4.2 Validação do método para quantificação de progesterona e
estradiol de amostras de fluido folicular
Para FF foram efetuadas a validação dos hormônios progesterona e estradiol. Devido à diferença de concentração desses hormônios e sua maior importância para a ovulação, foram validados somente esses hormônios para as amostras de FF.
As curvas de calibração foram construídas utilizando ponderação 1/x. Para critério de aceitação das curvas foi considerado um valor de coeficiente de correlação linear (r) 0,98. Os pontos com desvio maior que 20% para o limite inferior de quantificação e 15% para os demais pontos foram excluídos da curva. A seguir (Tabela 6), estão descritos os valores da equação da curva, o valor de R e a faixa validada para cada hormônio.
Tabela 6. Curvas de calibração para os hormônios estradiol e progesterona
em líquido folicular Analito Equação (c/ ponderação 1/x) R Intervalo Linear (ng mL-1) Estradiol y=0,45506x+0,08744 0,9980 0,50 – 5,00 Progesterona y=0,25911x+0,17309 0,9983 0,50– 20,00
Foram avaliadas a precisão e a exatidão dos hormônios em plasma em dois dias diferentes, em três níveis diferentes de concentração. Em cada dia foram realizadas 3 determinações, foram avaliados os parâmetros de exatidão e precisão referentes à RE 899 da ANVISA, em que o coeficiente de variação (CV),
28 apresentaria valores máximos de 15 %, e a exatidão com valores entre 85 % a 115 %.Os valores de concentração teórica foram determinados pela da concentração de hormônio marcado adicionado à matriz.
A Tabela 7, apresenta valores de precisão e exatidão para os hormônios: estradiol, progesterona em líquido folicular.
Tabela 7. Precisão intra-ensaio e inter-ensaio para os hormônios liquido folicular
Conc.Teórica Estradiol (ng mL-1) Intra-ensaio (n = 3) Inter-ensaio (n = 6) Média + s (ng mL-1) CV (%) Exatidão (%) Média + s (ng mL-1) CV (%) Exatidão (%) 0,70 0,69 ± 0,02 2,2 98,6 0,70 ± 0,02 2,9 100,0 3,00 3,04 ± 0,12 3,8 101,3 2,96 ± 0,13 4,4 98,7 4,50 4,47 ± 0,08 1,8 99,3 4,46 ± 0,16 3,5 99,1 Conc.Teórica Cortisol (ng mL-1) Intra-ensaio (n = 3) Inter-ensaio (n = 6) Média + s (ng mL-1) CV (%) Exatidão (%) Média + s (ng mL-1) CV (%) Exatidão (%) 1,90 1,79 ± 0,26 14,7 94,3 1,70 ± 0,20 11,9 89,5 9,00 9,24 ± 0,50 5,4 102,7 9,73 ± 1,73 11,9 108,1 14,00 14,28 ± 1,09 7,6 102,0 13,22 ± 1,82 13,8 94,4
Os valores de exatidão e precisão foram obtidos dentro das especificações, tanto para plasma quanto para FF.
29
4.3 Resultados das Análises das Amostras de Plasma.
4.3.1 Critérios para aceitação e cálculo dos resultados
As amostras de plasma foram analisadas utilizando-se a mesma faixa de concentração de calibração obtida na validação. O procedimento de extração foi o mesmo validado para o plasma. No lote analítico foram analisadas amostras de curva de calibração, CQ’s e as amostras a serem quantificadas, provenientes das coletas de plasma efetuadas nos animais dos quatro grupos experimentais.
Para aceitação do lote analítico foram observados os critérios de aceitação da RE 899 da ANVISA: Coeficiente de correlação linear (r) de no mínimo 0,98, desvio menor ou igual a 20% em relação à concentração nominal para o limite inferior de quantificação (LIQ), desvio menor ou igual a 15 % em relação a concentração nominal para os outros pontos de calibração, mínimo de 75 % dos padrões de calibração aprovados conforme os critérios anteriores, mínimo de 6 padrões de calibração de concentrações diferentes aprovados, incluindo o limite inferior de quantificação (LIQ) e o limite superior de quantificação (LSQ).
Para as amostras de controle de qualidade foram seguidos os seguintes parâmetros: O número de controle de qualidade baixo (CQB), controle de qualidade médio (CQM) e controle de qualidade alto (CQA) a serem incorporadas em a cada lote analítico não deve ser inferior a 5% do número de amostras a serem analisadas e não deve ser inferior a 6 controles de qualidade, sendo uma duplicata de cada concentração. No mínimo 67% do total de amostras de controle de qualidade e no mínimo 50% das amostras de controle de qualidade de cada concentração devem apresentar desvio menor ou igual a 15% em relação aos seus respectivos valores nominais (37).
Todas as amostras foram calculadas utilizando as equações da curva de calibração, com a ponderação de 1/x, devido a amplitude da faixa linear para os hormônios. Os cálculos foram efetuados pela da relação entre a área do hormônio e área do hormônio marcado (padrão interno).
30 4.3.2 Quantificacão de progesterona em Plasma
Os resultados obtidos em plasma tanto para os animais Bos taurus (raça Gir) quanto para os animais Bos indicus (raça Holandesa - HPB) foram tratados para retirada de valores “outliers” e foram comparadas as médias entre os resultados das raças e dos tratamentos. As comparações raça x dieta foram realizadas utilizando-se software estatístico SAS® As medias das concentrações obtidas entre as raças e as dietas de alta e baixa energia são apresentadas na
Figura 8.
Figura 8: Comparativo entre as médias das concentrações de progesterona
(pg mL-1) em plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia).
31 Os animais Bos taurus apresentam diferenças de concentrações de progesterona em plasma entre as dietas, os animais submetidos à dieta de baixa energia apresenta maiores concentrações que os animais submetidos à dieta de alta energia. Os animais Bos indicus não apresentam diferenças de concentração de progesterona no plasma na comparação entre as dietas. Na comparação entre as dietas tanto as dietas de alta energia, quanto à de baixa energia os animais
Bos taurus e Bos indicus diferem entre si. Isso pode ser explicado pelo fato de que
os animais Bos indicus possuem metabolização de progesterona mais lenta do que os animais Bos taurus. Utilizando o mesmo princípio, os animais submetidos à dieta de alta energia possuem metabolização progesterona mais rápida que os animais submetidos à dieta de baixa energia (38).
4.3.3 Estradiol em plasma
As médias dos resultados das concentrações de estradiol para as raças Bos indicus e Bos taurus submetidas às diferentes dietas são apresentados na
32
Figura 9: Comparativo entre as médias das concentrações de estradiol (pg
mL-1) em plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia).
As concentrações de estradiol em plasma possuem a mesma ordem de grandeza para ambas as raças, os resultados obtidos estão de acordo com as concentrações descritas na literatura, entre 10 e 15 pg mL-1. Efetuamos a comparação estatística e não encontramos nenhum efeito raça dieta, de acordo como descrito em algumas literaturas, descrevem que não há diferença entre o nível de estradiol em plasma entre os animais Bos taurus e Bos indicus
(39).Entretanto, outras literaturas relatam a concentração de estradiol em plasma de
animais da raça Bos taurus apresenta maior valor que animais da raça Bos indicus
(40). ! ! ! "
33 4.3.4 Testosterona em plasma
As médias dos resultados das concentrações de testosterona para raças
Bos indicus e Bos taurus submetidas às diferentes dietas são apresentados na Figura 10.
Figura 10: Comparativo entre as médias das concentrações de
testosterona (pg mL-1) em plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia).
A quantidade de testosterona tanto para os animais Bos taurus quanto para os animais Bos Indicus apresenta a mesma ordem de grandeza, tanto para os animais submetidos à dieta de baixa como de alta energia. Na comparação entre as dietas os animais submetidos a dieta de baixa energia apresentaram maior concentração de testosterona no plasma que os animais submetidos a dieta de alta energia.
! ! !
34 4.3.5 Cortisol em plasma
As médias dos resultados das concentrações de cortisol em plasma para as raças Bos indicus e Bos taurus submetidas às diferentes dietas são apresentados na Figura 11.
Figura 11: Comparativo entre as médias das concentrações de cortisol (pg
mL-1) em plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia).
Os resultados de cortisol para plasma estão abaixo dos descritos na literatura (44-45) (1 – 20 ng mL-1), porém muitos estudos foram executados em situações de estresse animal, onde a concentração de cortisol no plasma tende a ser maior. Comparando-se as Bos taurus e Bos indicus submetidos as dietas, para os animais Bos indicus a diferença entre as dietas e as concentrações, para os
" ! #
35 animais Bos taurus não. Na dieta de alta energia Bos taurus e Bos indicus diferem entre si
4.3.6 Androstenediona em plasma
As médias dos resultados das concentrações de androstenediona para raças Bos indicus e Bos taurus submetidas às diferentes dietas são apresentados na Figura 12.
Figura 12: Comparativo entre as médias das concentrações de
androstenediona (pg mL-1) em plasma para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia).
Comparando-se os resultados de androstenediona em plasma para Bos
indicus e Bos taurus, os animais Bos taurus submetidos a dieta de alta energia
apresentam menor concentração de androstenediona em plasma que os animais submetidos a dieta de baixa energia. Na dieta de alta energia os animais Bos
! ! !
36
taurus apresentam menor concentração de androstenediona em plasma que os
animais da raça Bos indicus.
4.4 Resultados das Análises das Amostras de Fluido Folicular
Os resultados das amostras de FF foram submetidos ao mesmo tratamento que foi realizado para as amostras de plasma, com os mesmos critérios de aceitação utilizados para o plasma e descritos na RE 899 da ANVISA.Devido a maior importância dos hormônios progesterona e estradiol no FF e sua maior concentração, somente esses hormônios foram analisados nessa matriz biológica.
As amostras de FF estavam diluídas em soro fisiológico para facilitar a coleta por aspiração folicular guiada por ultrassonografia. Essa diluição foi levada em conta no cálculo da concentração dos hormônios nas amostras.
4.4.1 Progesterona em fluido folicular
As médias dos resultados das concentrações de progesterona para raças
Bos indicus e Bos taurus submetidas às diferentes dietas são apresentados na Figura 13.
37
Figura 13: Comparativo entre as médias das concentrações de
progesterona (pg mL-1) em fluido folicular para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia).
A concentração de progesterona em fluido folicular está na ordem de grandeza descrita na literatura (>100 ng mL-1), porém não se pode afirmar que a diferença nas raças ou na alimentação, já que concentração de progesterona depende do grau de maturação do folículo (41,42).
4.4.2 Estradiol em líquido folicular
As médias dos resultados das concentrações de progesterona para raças
Bos indicus e Bos taurus submetidas às diferentes dietas são apresentados na Figura 14.
38
Figura 14: Comparativo entre as médias das concentrações de estradiol
(pg mL-1) em líquido folicular para as raças (Gir e Holandesa) e diferentes dietas (alta e baixa energia).
A concentração de estradiol em líquido folicular está na ordem de grandeza descrita na literatura (de 26 a 1776 ng mL-1). Para os animais Bos indicus a concentração de estradiol nos animais submetidos aa dieta de alta energia é maior que a concentração de estradiol nos animais submetidos a dieta de baixa energia. Porém não se pode afirmar que a diferença nas raças ou na alimentação, já que concentração de estradiol depende do grau de maturação do folículo(30,43).
39
40
5
Capitulo 5: Conclusões
Foi desenvolvido um método para a quantificação dos hormônios esteroides estradiol, progesterona, cortisol, testosterona e androstenediona em plasma bovino utilizando-se extração líquido-líquido. Para a validação da metodologia em plasma foi utilizado o método de diluição isotópica, onde os principais requisitos da RE 899 ANVISA foram atendidos, exatidão entre 85 a 115%, coeficiente de variação (CV) menor que 15%.
Desenvolveu-se um método para a quantificação dos hormônios esteroides estradiol e progesterona em FF bovino utilizando-se extração líquido-líquido. Para a validação da metodologia em FF foi utilizado o método de diluição isotópica, atendendo os principais requisitos da RE 899 ANVISA, exatidão entre 85 a 115%, coeficiente de variação (CV) menor que 15%.
A metodologia analítica mostrou-se eficaz para a determinação rápida de moléculas de grande importância para o desenvolvimento da pecuária. Essa metodologia pode ser ampliada para outras matrizes, ou para outras áreas além da veterinária, podendo ser facilmente adaptada em estudos de reprodução assistida em humanos.
Estabeleceu-se a comparação entre os níveis de concentração de hormônios esteroides obtidos na diferentes raças submetidas a diferentes dietas e foram estabelecidas diferenças, as quais foram correlacionadas às características de metabolismo dessas raças. Os animais da raça Bos indicus tendem a apresentar maior concentração de hormônios circulantes em plasma em comparação aos animais Bos taurus, devido ao fato de que zebuínos apresentarem metabolismo mais lento que taurinos.
Os animais submetidos à dieta de alta energia apresentaram concentração de hormônios esteroides em plasma menor que os animais submetidos às dietas de baixa energia, provavelmente devido ao fato de que o metabolismo dos animais submetidos à dieta de baixa energia tenha se tornado mais lento por menor disponibilidade de energia.
41 Dessa maneira, o tratamento hormonal com suplementação exógena de esteroides deve ser otimizado para cada raça e cada situação nutricional em bovinos, de maneira a obter máxima performance reprodutiva. Esses valores podem ser determinados utilizando-se o método desenvolvido neste trabalho e os resultados têm potencial de promover significativo impacto econômico na pecuária Brasileira.
Em relação ao FF, os valores de concentrações de progesterona e estradiol mensurados foram correspondentes às concentrações descritas na literatura. Não foi possível afirmar que a diferença de concentração tenha sido afetada pela origem genética ou pelo nível de energia na dieta a qual os animais foram submetidos. Esse fato ocorreu porque, as concentrações desses hormônios dependem principalmente do grau de maturação do folículo.
