FRANCILE DIAS BARBOSA
DESENVOLVIMENTO DE UM SISTEMA DE RADIAÇÃO PULSADA COM LEDS UV- C PARA REDUÇÃO DE PATÓGENOS PÓS-COLHEITA E MANUTENÇÃO DA
QUALIDADE DE PRODUTOS AGRÍCOLAS.
CAMPINAS 2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Agrícola
FRANCILE DIAS BARBOSA
DESENVOLVIMENTO DE UM SISTEMA DE RADIAÇÃO PULSADA COM LEDS UV- C PARA REDUÇÃO DE PATÓGENOS PÓS-COLHEITA E MANUTENÇÃO DA
QUALIDADE DE PRODUTOS AGRÍCOLAS.
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia Agrícola da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutor, na Área de Engenharia Agrícola.
Orientador: Prof. Dr. SYLVIO LUÍS HONÓRIO Co-Orientador: Prof. Dr, DAVID MENDES SOARES
CAMPINAS 2015
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 1 2. HIPÓTESE ... 3 3. OBJETIVOS ... 4 3.1. Objetivo Geral ... 4 3.2. Objetivos Específicos ... 4 4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 5 4.1. Irradiação de Alimentos ... 5
4.2. Radiação ultravioleta empregada em alimentos ... 6
4.2.1. Fundamentos e mecanismos de ação da radiação UV-C ... 6
4.2.2. Fontes artificiais de UV-C ... 7
4.2.3. Sistemas de irradiação UV-C ... 10
4.2.3.1. Sistema de emissão contínua ... 11
4.2.3.2. Luz pulsada (LP) ... 11
5. CAPITULO I: Construção do sistema de radiação pulsada ... 14
5.1. Objetivo ... 14
5.2. Material e Métodos ... 14
5.2.1. Construção do equipamento de radiação pulsada com leds UV-C ... 14
5.2.1.1. Câmara de iluminação ... 14
5.2.1.2. Circuito Elétrico ... 15
5.2.1.3. 2° Etapa- Sistema de controle das leds UV-C pulsadas. ... 17
5.2.2. Ensaios de Validação do Equipamento ... 18
5.2.2.1. 1° Ensaio ... 19
5.2.2.2. 2° Ensaio ... 19
5.3. Resultados e Discussão ... 20
5.3.2. Ensaios de validação do equipamento ... 20
5.3.2.1. 1° Ensaio ... 20
5.3.2.2. 2° Ensaio ... 20
5.4. Conclusões preliminares ... 21
6. CAPÍTULO II - Avaliar a eficiência do equipamento de radiação pulsada e as potencialidades dos Leds de UV-C no controle do desenvolvimento microbiano in vitro. ... 23
6.1. Objetivo ... 23
6.2. Material e Métodos ... 23
6.2.1. 1° experimento ... 23
6.2.1.1. Aplicação da Radiação Pulsada UV-C ... 23
6.2.1.2. Inoculação dos patógenos ... 23
6.2.1.3. Avaliação dos tratamentos ... 24
6.2.1.4. 2° experimento ... 25
6.3. Delineamento Experimental ... 25
6.4. Resultados e Discussão ... 25
6.5. CONCLUSÃO ... 33
7. CAPÍTULO III : Avaliar o efeito da RP UV-C nos critérios de qualidades de produtos agrícolas. ... 34 7.1. Objetivo ... 34 7.2. Material e Métodos ... 34 7.2.1. Figo ... 34 7.2.2. Semente de soja ... 37 7.2.3. Batata semente ... 37 7.3. Resultados e Discussão ... 39 7.3.1. Figo ... 39 7.3.2. Soja ... 42 7.3.2.1. Teste sanidade... 42 7.3.2.2. Teste germinação ... 43 7.4.1. Batata semente ... 43 7.4.1.1. Perda de massa ... 43
7.4.1.2. Sólidos solúveis. ... 44 7.4.1.3. Brotação ... 44 7.4.1.4. Microrganismos ... 45 7.5. CONCLUSÕES ... 46 8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 47 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 48 10. APÊNDICE ... 56
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA Análise de Variância
AT Acidez titulável
BDA Batata dextrose ágar
LED Diodos emissores de luz
FAO Food and Agriculture Organization
ID Índice de doença
LP Luz Pulsada
OMS Organização Mundial de Saúde
RP Radiação Pulsada
RDC Resolução
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação Esquemática do sistema elétrico. ... 16
Figura 2. Configuração do Protoboard do Sistema de RP UV-C. ... 16
Figura 3. Diagrama de blocos geral do projeto ... 18
Figura 4. Variação média da densidade de hifas após 15 dias. ... 24
Figura 5. Valores médios da densidade das hifas (%) para Rhizopus stolonifer, após exposição as diferentes densidades de energias de RP UV-C. ... 28
Figura 6. Valores médios da densidade de hifas (%) para Fusarium solani, após exposição as diferentes densidades de energias de RP UV-C. ... 29
Figura 7. Valores médios da densidade micelial (%) para Phomopsis sp, após exposição as diferentes densidades de energias de RP UV-C. ... 29
Figura 8. Valores médios de amadurecimento e enrugamento ao final de sete dias de armazenamento de figos não tratados (controle) e submetidos as densidades de energia de 0,9877 J.m-2 e armazenados à 20°C e 70% UR ... 39
Figura 9. Índices de Doença (ID) para figos inoculados não tratados (controle) e expostos a densidade de energia 0,9877 J.m-2 (7 horas) e incubados a 20ºC por 7 dias. ... 42
Figura 10. Média da incidência do Fusarium solani inoculados não tratados (controle) e expostos a densidade de energia de 0,9877 J.m-2 (7 horas) ... 45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Especificações dos leds UVTOP255TO39FW ... 15 Tabela 2. Variáveis de entrada do sistema de RP- UV-C. ... 19 Tabela 3. Taxa de fluência de acordo com a variação da distância entre os leds e a amostra do produto. ... 20 Tabela 4. Taxa de fluência de acordo com a variação da frequência (Hz) e largura de pulso (µs) dos leds UV-C, mantendo fixo a distância da amostra aos leds. ... 21 Tabela 5. Valores médios do crescimento micelial (cm) para Rhizopus stolonifer, após a exposição a diferentes níveis de RP UV-C. ... 26 Tabela 6. Valores médios do crescimento micelial (cm) para Fusarium solani, após exposição as diferentes densidades de energia de RP UV-C... 26 Tabela 7. Valores médios do crescimento micelial (cm) 1° ensaio para Phomopsis sp, após a exposição a diferentes níveis de REP UV-C. ... 27 Tabela 8. Valores médios do crescimento micelial (cm) 2° ensaio para Phomopsis sp, após a exposição a diferentes níveis de radiação UV-C. ... 27 Tabela 9. Valores médios da produção de esporos de Rhizopus stolonifer, após exposição as diferentes densidades de RP UV-C. ... 30 Tabela 10. Valores médios da produção de esporos de Fusarium solani. após exposição as diferentes densidades de energia de RP UV-C. ... 30 Tabela 11. Valores médios da produção de conídios do 1º ensaio de Phomopsis sp., após exposição as diferentes densidades de energia de RP UV-C... 31 Tabela 12. Valores médios para produção de conídios do 2° ensaio para Phomopsis sp., após a exposição a diferentes níveis de Radiação UV-C. ... 31 Tabela 13. Perda de Massa em figos ‘Roxo de Valinhos’ submetido a radiação pulsada UV-C e armazenado a 20°C por sete dias. ... 40 Tabela 14. Teor de sólidos solúveis (°Brix) em figo ‘Roxo de Valinhos’ submetido a radiação pulsada UV-C e armazenado a 20°C por sete dias (Valor inicial: 14,22ºBrix). ... 40 Tabela 15. Acidez titulável (% ácido cítrico) em figos ‘Roxo de Valinhos’ submetidos a radiação pulsada UV-C e armazenado a 20°C por sete dias (Valor inicial: 0,18 % de ácido cítrico). ... 41
Tabela 16. Valores médios de pH em figos ‘Roxo de Valinhos’ submetidos a radiação pulsada UV-C e armazenado a 20°C por sete dias (Valor inicial: 4,87). ... 41 Tabela 17. Média do teste de sanidade das sementes de soja irradiadas com radiação pulsada UV-C. ... 42 Tabela 18. Média do teste de germinação das sementes de soja irradiadas com radiação pulsada UV-C. ... 43 Tabela 19. Perda de Massa em Batata semente, submetida a radiação pulsada UV-C e armazenado a 20°C por quinze dias (Valor inicial: 60 g)... 44 Tabela 20. Teor de sólidos solúveis (°Brix) de Batata semente submetidas a radiação pulsada UV-C e armazenado a 20°C por quinze dias (Valor inicial: 4,35ºBrix). ... 44 Tabela 21. Números de brotos por tubérculo, submetidos a RP- UV-C após quinze dias. ... 44 Tabela 22. Análise de variância para crescimento micelial de Rhizopus stolonifer, após a exposição a diferentes doses de Radiação Pulsada UV-C. ... 56 Tabela 23. Análise de variância para produção de conídeos de Rhizopus stolonifer, após a exposição a diferentes doses de Radiação Pulsada UV-C. ... 56 Tabela 24. Análise de variância para crescimento micelial de Fusarium solani, após a exposição a diferentes doses de Radiação Pulsada UV-C. ... 56 Tabela 25. Análise de variância para produção de conídeos de Fusarium solani, após a exposição a diferentes doses de Radiação Pulsada UV-C. ... 56 Tabela 26. Análise de variância para crescimento micelial de Phomopsis sp., após a exposição a diferentes doses de Radiação Pulsada UV-C. ... 57 Tabela 27. Análise de variância para produção de conídeos de Phomopsis sp., após a exposição a diferentes doses de Radiação Pulsada UV-C. ... 57 Tabela 28. Análise de variância do parâmetro de aparência “ amadurecimento” de figos submetidos à radiação pulsada UV-C. ... 57 Tabela 29. Análise de variância do parâmetro de aparência “ Enrugamento” de figos submetidos à radiação pulsada UV-C. ... 57 Tabela 30. Análise de variância para perda de massa de figos submetidos à radiação pulsada UV-C. ... 58 Tabela 31. Análise de variância para perda de massa para figos submetidos à radiação pulsada UV-C . ... 58 Tabela 32. Análise de variância para teor de sólidos solúveis para figos submetidos à radiação pulsada UV-C. ... 58 Tabela 33. Análise de variância para acidez titulável para figos submetidos à radiação pulsada UV-C. ... 58
Tabela 34. Análise de variância para pH de figos submetidos à radiação pulsada UV-C ... 58 Tabela 35. Análise de variância para sanidade de sementes de soja submetidas à radiação pulsada UV-C. ... 59 Tabela 36. Análise de variância para germinação de sementes de soja submetidas à radiação pulsada UV-C . ... 59 Tabela 37. . Análise de variância para perda de massa para batata semente submetidas à radiação pulsada UV-C . ... 59 Tabela 38. Análise de variância para teor de sólidos solúveis para batata semente submetidas à radiação pulsada UV-C. ... 59 Tabela 39. Análise de variância para brotação de batatas sementes submetidas à radiação pulsada UV-C de 0,00 J.m- 2 ... Erro! Indicador não definido.
RESUMO
De acordo com a Food and Agriculture Organization (FAO) e a Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) estimam que o Brasil será, na próxima década, o maior produtor agrícola e o maior consumidor de agrotóxicos do mundo (FAO e OECD , 2014). No entanto, os consumidores estão cada vez mais interessados com a redução do uso de agrotóxicos, exigindo frutas com qualidade e produzidas com a substituição de insumos poluentes e não renováveis. A necessidade da adequação e desenvolvimento de tecnologias alternativas para o controle de doenças em pós-colheita, vem estimulando os métodos de natureza física (vapor, raios gama, radiação ultravioleta (UV), ozônio, luz pulsante, etc.), que em maior ou menor extensão, também preservam a qualidade dos alimentos.
A exposição de vegetais à luz ultravioleta C (UV-C) vem sendo utilizada como uma técnica segura e eficiente no tratamento e conservação de produtos vegetais. Esse tipo de radiação compreende a faixa de comprimentos de onda de 200-280 nm, e sua utilização constitui-se em um tratamento que não produz compostos orgânicos clorados ou tóxicos, resultantes da utilização de sanitizante comuns a base de cloro; é uma técnica de baixo custo se comparada à radiação gama, alta pressão ou atmosferas modificadas; é ambientalmente segura; apresenta boa eficiência na descontaminação, pois reduz a multiplicação de bactérias psicrotróficas, coliformes, bolores e leveduras; não produz odores e sabores desagradáveis ao produto; e aumenta a capacidade antioxidante dos vegetais (LÓPEZ-RUBIRA et al., 2005; MANZOCCO; DRI; QUARTA, 2009; LEMOINE; CHAVES; MARTÍNEZ, 2010; MANZOCCO; DA PIEVE; MAIFRENI, 2011b; SCHENK et al., 2011; ZHAN et al., 2012). Dentre as técnicas de irradiação, está a luz pulsada que é um método que vem sendo estudado como alternativa aos processos convencionais (OMS-OLIU et al., 2008; RAJKOVIC et al., 2010; WAMBURA & VERGHESE, 2011), pois é uma versão modificada dos sistemas de tratamentos por luz UV-C em onda contínua. A luz pulsada é uma técnica não termal que utiliza pulsos de alta intensidade, curta duração (1 μseg–0,1 seg) com um espectro de ondas de luz capaz de assegurar a descontaminação microbiológica (200–1100 nm). Sua utilização foi aprovada pelo FDA (1996) para a descontaminação das superfícies de alimentos. O efeito antimicrobiano letal causado pela LP pode ser explicado pelo mesmo mecanismo do UV-C contínuo, onde a inativação é fotoquímica. Em bactérias, a luz UV-C induz a formação de dimeros de pirimidinas (GIESE; DARBY, 2000) que inibem a formação de um novo DNA no processo de replicação das células, inativando o micro-organismo afetado (BOLTON;
LINDEN, 2003).Neste contexto o objetivo deste trabalho foi construir e adequar através de novas abordagens fisicas e parametros de interesse para desinfecção em produtos agrícolas um equipamento para aplicação de radiação pulsada de UV-C gerada por Leds para fins de controle microbiano, bem como com potencial para utilização agroindustrial sendo alternativa aos processos de sanitizações convencionais. As principais etapas fora as seguintes: (1)Desenvolvimento e construção do sistema de radiação pulsada; (2) Avaliação a eficiência do equipamento de radiação pulsada e as potencialidades dos leds de UV-C no controle do desenvolvimento microbiano in vitro dos fungos Rhizopus stolonifer, Fusarium solani e Phomopsis sp expostos a radiação pulsada uv-C de 0,00 J.m-2 ( 0,00 h); 0,1411 J.m-2( 1 hora); 0,4233 J.m-2 ( 3 horas); 0,7055 J.m-2 (5 horas); 0,9877 J.m-2 (7 horas), (3) Avaliar o efeito da RP UV-C na qualidade pós-colheita de produtos agrícolas ( figo, semente de soja e batata semente), avaliada pela manutenção da qualidade e diminuição da carga microbiana. Os resultados dos ensaios demonstraram que o algoritmo desenvolvido para controlar o sistema de RP UV-C mostrou-se eficiente e estável, no entanto as leds UV-C utilizadas apresentam baixa potência, limitando assim a quantidade de energia emitida pelo equipamento. Sobretudo quando aplicada a RP UV-C nas colônias do Fusarium solani, Rhizopus stolonifer e Phomopsis sp. os mesmos apresentaram sensibilidade quanto a radiação pulsada UV-C, e a redução na viabilidade dos conídios foi maior do que a observada para o crescimento micelial, sendo que as energias de radiação superiores a 0,7055 J.m-2 apresentaram melhores resultados. Nos teste in vitro os Figos e as sementes de soja apresentam sensibilidade à exposição de radiação UV-C, evidenciando perdas qualitativas e fisiológicas nos mesmos. Apesar da dose 0,9877 J.m -2 se mostrar eficiente in vitro contra os patógenos estudados, a mesma não se mostrou eficiente na análise in vivo, pois não suprimiu a infecção nos frutos e sementes inoculadas antes da irradiação.
PALAVRAS- CHAVES: Métodos físicos, Irradiação de alimentos, qualidade, doenças pós-colheita.
ABSTRACT
According to the Food and Agriculture Organization (FAO) and the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) estimates that Brazil will be in the next decade, the largest agricultural producer and the largest consumer of pesticides in the world (FAO and OECD, 2014 ). However, consumers are increasingly concerned with the reduction of pesticide use, requiring fruit with quality and produced with the replacement of polluting and non-renewable inputs. The need for adaptation and development of alternative technologies for the control of diseases in post-harvest, has been encouraging the methods of physical nature (steam, gamma rays, ultraviolet (UV), ozone, pulsating light, etc.), which in most or lesser extent, also preserve the quality of food. Exposure of plants to ultraviolet C (UV-C) has been used as a safe and effective technique in the treatment and conservation of plant products. This type of radiation includes the range of 200-280 nm wavelengths, and constitutes its use in a treatment that does not produce toxic or chlorinated organic compounds, resulting from the use of common chlorine based sanitizer; It is a low cost technique compared to gamma radiation, high blood pressure or modified atmospheres; It is environmentally safe; It has good efficiency in decontamination because it reduces the proliferation of psychotropic bacteria, coliforms, molds and yeasts; does not produce odors and flavors to the product; and increases the antioxidant capacity of vegetables (LOPEZ-RUBIRA et al., 2005; MANZOCCO; DRI; FOURTH, 2009; LEMOINE; KEYS; MARTÍNEZ, 2010; MANZOCCO; DA PIEVE; MAIFRENI, 2011b;. SCHENK et al, 2011; ZHAN et al., 2012). Among the irradiation techniques is the pulsed light which is a method that has been studied as an alternative to conventional processes (WHO-Oliu et al, 2008;. Rajkovic et al, 2010;. WAMBURA & Verghese, 2011) as it is a modified version of the treatment systems by UV-C light in continuous wave. The pulsed light is a non-thermal technique that uses high intensity pulses, short (1 μseg-0.1 sec) with a spectrum of light waves capable of ensuring the microbiological decontamination (200-1100 nm). Its use was approved by the FDA (1996) for decontamination of surfaces of food. The lethal caused by LP antimicrobial effect can be explained by the same mechanism of the continuous UV-C, which is photochemical inactivation. In bacteria, the UV-C light induces the formation of dimers pyrimidines (GIESE; Darby, 2000) which inhibit the formation of new DNA into the cell replication process, inactivating the affected micro-organism (Bolton; Linden, 2003). In this context the aim of this study was to construct and adapt through new approaches and
physical parameters of interest for disinfection in agricultural equipment for pulsed radiation application of UV-C generated by leds for microbial control purposes as well as with potential for use agro industrial being sanitization alternative to conventional processes. The main out the following steps: (1) the development and construction of the pulsed radiation system; (2) review the effectiveness of pulsed radiation equipment and the potential of led UV-C in controlling microbial growth in vitro of the fungus Rhizopus stolonifer, Fusarium solani and Phomopsis sp exposed to UV-C radiation pulsed 0.00 J. m-2 (0.00 h); 0.1411 J. m-2 (1 hour); 0.4233 J. m-2 (3 hours); 0.7055 J. m-2 (5 hours); 0.9877 J. m-2 (7 hours), (3) evaluate the effect of RP UV-C in postharvest quality agricultural products (figs, soy and seed potato seed), as assessed by maintaining the quality and decrease the load Microbial. The test results showed that the algorithm developed to control the PR UV-C was efficient and stable, however the UV-C leds used have low power, thus limiting the amount of energy emitted by the equipment. Especially when applied to RP UV-C in the colonies of Fusarium solani, Rhizopus stolonifer and Phomopsis sp. They showed the same sensitivity as pulsed UV-C radiation and the reduction in the viability of the conidia was greater than that observed for mycelial growth, wherein the radiation energies exceeding 0.7055 J. m-2 showed the best
results. In the in vitro test the figs and soybeans have sensitivity to radiation exposure UV-C, showing qualitative and physiological losses in them. Despite 0.9877 J. m-2 dose prove effective in vitro against the tested pathogens, it was not efficient in vivo analysis because not suppressed the infection in fruit and inoculated seeds before irradiation.
1
1. INTRODUÇÃO
De acordo com a Food and Agriculture Organization (FAO) e a Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) estimam que o Brasil será, na próxima década, o maior produtor agrícola e o maior consumidor de agrotóxicos do mundo (FAO e OECD, 2014). No entanto, os consumidores estão cada vez mais interessados com a redução do uso de agrotóxicos, exigindo frutas com qualidade e produzidas com a substituição de insumos poluentes e não renováveis.
A necessidade da adequação e desenvolvimento de tecnologias alternativas para o controle de doenças em pós-colheita, vem estimulando os métodos de natureza física (vapor, raios gama, radiação ultravioleta (UV), ozônio, luz pulsante, etc.), que em maior ou menor extensão, também preservam a qualidade dos alimentos.
Sabe-se que não existe uma única maneira de se prevenir uma contaminação, o interesse pela irradiação como tecnologia de tratamento é a possibilidade do controle sanitário de alimentos contaminados por microrganismos patogênicos como Salmonela, Campylobacter, Escherichia coli 0157. H7, Listeria monocytogenes etc., além do que tem forte justificativa econômica devido às perdas decorrentes da infestação por insetos, contaminação e deterioração por microrganismos e, manifestações fisiológicas como germinação prematura de tubérculos ou do amadurecimento de frutas.) (ICGFI, 1999; RELA, 2000).
Dentre as tecnologias de irradiação de alimentos está a luz pulsada (LP) que tem sido utilizada como alternativa aos sistemas de aplicação contínua de radiação UV-C, uma vez que possui alto grau de penetração nas frutas e a reparação do DNA não ocorre quando utilizado o tratamento pulsado (ELMNASSER et al., 2007).
A luz pulsada é aplicada com lâmpadas de xenônio que podem produzir pulsos intensos em curto tempo possuindo amplo espectro de "luz branca" (ultravioleta até a região do infravermelho próximo). A zona UV-C do espectro (200 a 280 nm) é a mais importante para inativação microbiana e mudança da atividade enzimática. A inativação depende da intensidade e mecanismos que incluem a modificação química e a clivagem do DNA, a desnaturação de proteínas e outros materiais celulares (BARBOSA-CANOVAS et al., 2004).
Apesar dessa técnica ser inovadora e de grande utilidade, podendo trazer grandes benefícios para países como o Brasil é, entretanto, dificultada pelo alto custo de seus componentes e sistemas. Desse modo, o presente trabalho, objetivou-se o desenvolvimento e
2 criação de um sistema de radiação pulsada com leds UV-C e parâmetros de interesse para desinfecção em produtos agrícolas e de baixo custo, podendo atender as necessidades dos produtores rurais de pequeno e médio porte.
3
2. HIPÓTESE
O sistema de luz pulsada com leds UV-C, construído e adequado através de parâmetros de interesse para aplicação em produtos agrícolas, é um equipamento com potencial para utilização em fins agroindustriais e alternativa aos processos de sanitizações convencionais.
4
3.
OBJETIVOS3.1.
Objetivo GeralConstruir um equipamento para aplicação de RP gerada por leds UV-C para fins de controle microbiano nos processos de desinfecção de produtos agrícolas.
3.2.
Objetivos Específicos
Construir um equipamento para aplicação de RP gerada por leds UV-C caracterizando os parâmetros: frequência de pulsos, duração e energia de interesse para aplicação em produtos agrícolas.
Avaliar a eficiência do equipamento de RP e as potencialidades dos Leds UV-C no controle do desenvolvimento microbiano in vitro.5
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4.1. Irradiação de Alimentos
Os alimentos são fontes de nutrientes essenciais para o ser humano. Muitos destes alimentos passam por uma série de etapas de manipulação, possibilitando sua contaminação por espécies de microrganismos patogênicos e/ou deteriorantes, comprometendo a sua qualidade. Uma forma eficaz de controle da qualidade microbiológica é a irradiação dos alimentos. Dentro do cenário de modernização da produção de alimentos a irradiação pode proporcionar um alimento seguro e ampliar sua vida de prateleira que é a grande tendência e busca dos consumidores atuais.
Devido ao aumento do comércio internacional de alimentos e das crescentes exigências regulatórias dos mercados consumidores, cada vez mais países importadores e exportadores têm demonstrado interesse na irradiação de alimentos e desenvolvido pesquisas na aplicação prática desta tecnologia.( TEZOTTO, 2014).
Do ponto de vista da saúde pública, a irradiação é aplicada aos alimentos visando garantir sua qualidade higiênico-sanitária, da mesma forma que outros métodos de conservação de alimentos, a partir da redução ou da eliminação de microrganismos e de parasitas ( FERREIRA, 1999).
É interessante observar que no processo de irradiação não há aquecimento do produto tratado, o que o torna viável e vantajoso, principalmente para materiais termossensíveis. Além disso a confiabilidade do processo, o fácil monitoramento ( uma vez que a única variável a ser controlada é o tempo), e a diminuição da contaminação microbiológica a níveis aceitáveis pela legislação brasileira (FARKAS, 2006).
Cada tipo de alimento requer uma dose específica de radiação, sendo que a dose máxima absorvida tem que ser inferior a dose que comprometa as propriedades funcionais dos alimentos, preservando seus atributos sensoriais e a dose mínima absorvida seja suficiente para alcançar o efeito microbiológico (LACROIX, 2005).
De acordo com Diehl (2002), em 1983 o Codex Alimentarius padronizou a técnica de irradiação de alimentos e criou um código internacional para a prática da tecnologia pelas empresas prestadoras de serviço.
No Brasil, existe regulamentação sobre a irradiação de alimentos desde 1973 e portarias complementares foram editadas em 1985 e, 1989 (OLIVEIRA, 2000). Em 26/01/2001, a Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, (ANVISA),
6 aprovou a Resolução (RDC) n° 21 que não restringe quais alimentos podem ser irradiados e nem a dose máxima absorvida para se obter o fim desejado, desde que não haja prejuízo nas suas qualidades funcionais e sensoriais (EMBRARAD, 2003 ver se é legislação). A RDC n° 21 estabelece ainda que, quando um produto irradiado é usado como ingrediente em outro alimento, este fato deve ser mencionado na embalagem final.
De acordo com o GCIIA (1990), esta tecnologia, não implica em danos ambientais ou à saúde humana e provoca poucas alterações químicas nos alimentos, sendo que pequenas alterações no valor nutricional dependerão de vários fatores tais como: tipo de alimento e suas características, atividade de água, DNA, embalagem, temperatura e tempo de armazenamento.
4.2. Radiação ultravioleta empregada em alimentos
4.2.1. Fundamentos e mecanismos de ação da radiação UV-C
O efeito germicida da radiação ultravioleta foi detectado pela primeira vez em 1878, mas as primeiras unidades de processamento foram construídas em 1955 na Suíça e na Áustria (AGUIAR et al., 2002). No Brasil sua utilização data do final da década de 70 sendo os primeiros equipamentos comerciais de UV produzidos para as indústrias farmacêuticas e tratamentos de águas, surgindo depois o interesse para a utilização desses equipamentos nas indústrias de alimentos e bebidas (BINTSIS, 2000).
A efetividade da radiação UV para redução da carga microbiana, em alimentos, já foi registrada por vários autores (Oms-Oliu et al. ,2010; GÓMEZ et al., 2012; Charles et al., 2013). De acordo com seus efeitos biológicos, a radiação UV é subdividida em três faixas; UV-A (315 nm a 400 nm); UV-B (280 nm a 315 nm); UV-C (100 nm a 280 nm).
A radiação UV-C tem como alvo principal o material genético (DNA/RNA) de bactérias, fungos e vírus. Age penetrando na célula, onde provoca um rearranjo da informação genética, interferindo na capacidade de reprodução da célula por dano fotoquímico, podendo haver a formação de dímeros de timina que irão bloquear a ação da DNA polimerase, impedindo que a célula possa se replicar, ocasionando a morte celular (ZAHA, 2003). Este tratamento também pode induzir inúmeras mudanças, não somente visando prevenir podridões (VICENTE et. al., 2005; COSTA et. al., 2006 e POMBO et. al. 2011), mas também retardar a senescência de diferentes espécies de frutas e vegetais
7 Os efeitos biológicos da radiação UV-C derivam da excitação e não da ionização de moléculas (KAREL e LUND, 2003). As consequências das alterações causadas são variáveis, sendo a sensibilidade à radiação inversamente proporcional ao tamanho e complexidade do microrganismo (URBAIN, 1986). De acordo com Grecz et al (1983), Farkas (1989) e Murano (1995), a radio sensibilidade dos microrganismos é afetada por fatores intrínsecos do microrganismo e fatores extracelulares, a saber: tipo de microrganismo, natureza e extensão do dano direto na estrutura do DNA, fase de multiplicação, conteúdo de água do meio, composição do meio, pH, composição atmosférica e temperatura. De um modo geral, os microrganismos nas fases lag e estacionária são mais resistentes à radiação do que na fase logarítmica, pois nesta fase a divisão celular é mais intensa e a grande quantidade de DNA em fita simples resulta em aumento na sensibilidade.
Segundo Urbain (1986), o comprimento do DNA do microrganismo é um dos fatores que tem grande influência quanto à eficiência do tratamento por irradiação em alimentos. Insetos e demais parasitas apresentam um DNA maior que os microrganismos e portanto são rapidamente eliminados através da técnica de irradiação em baixas doses. Da mesma forma, é necessária uma alta dose de irradiação para eliminação de bactérias pois possuem um DNA de menor tamanho.
Contudo, segundo Matak (2004), em alguns casos, as células injuriadas podem ser regeneradas por enzimas microbianas reparadoras, fenômeno conhecido como fotoreativação (“dark repair” ou “light repair”), onde enzimas ativadas pela radiação UV rompem as ligações covalentes dos dímeros de pirimidina. Para evitar isso, Matak (2004) sugere que a exposição de radiação deve ser no mínimo de 40 mJ/cm2 .
.
4.2.2. Fontes artificiais de UV-C
O aproveitamento do espectro ultravioleta é limitado pelos tipos de fontes disponíveis comercialmente: lâmpadas de deutério, xenônio, vapor de mercúrio e diodos (Leds).
Lâmpadas de mercúrio
Lâmpadas UV de ondas curtas, lâmpadas de mercúrio projetadas para produzir energia na região germicida (254 nm), são eletricamente idênticas às lâmpadas fluorescentes, exceto pela ausência de cobertura de fósforo. As lâmpadas podem ser construídas de vidro ou
8 quartzo, as quais permitem a transmissão de UV-C. O espectro de emissão depende da pressão dos gases no interior do bulbo havendo, por este motivo, a distinção entre lâmpadas de baixa, média e alta pressão.
A fonte mais comum para produção de luz na região germicida é a lâmpada de vapor de mercúrio de baixa pressão, essencialmente monocromática. São cobertas por material que permite a transmissão de radiação UV-C adequada para produzir energia na região germicida (85% do total de emissão das lâmpadas). As lâmpadas de quartzo oferecem maior transmitância, no entanto, seu elevado custo faz com que sejam substituídas pelas de vidro (com níveis aceitáveis de transmitância). A radiação atravessa o tubo de quartzo ou vidro e atinge os microrganismos que estão localizados no ar ou no líquido em volta da lâmpada (LÓPEZMALO e PALOU, 2005). Sua eficiência de conversão da potência em radiação UV é melhor do que as lâmpadas de média e alta pressão e está diretamente relacionada à pressão de mercúrio (saturado), que depende da menor temperatura detectada na lâmpada (PHILIPS, 2004), apesar de apresentarem potência nominal aproximadamente uma ordem de grandeza maior, convertem em luz UV somente cerca de 30% da potência elétrica consumida. Sua vida útil dependente da geometria do eletrodo, da corrente aplicada, do preenchimento de gás nobre, da frequência de liga/desliga, da temperatura ambiente e dos circuitos elétricos.
Essas lâmpadas têm maior utilidade na descontaminação de superfícies e podem ser instaladas no teto e no chão para descontaminação do ar, em dutos de ar, próximos à superfície. Para ser imersa em líquido, a lâmpada UV deve ser encamisada por material de quartzo ou outro material transparente ao UV-C.
Lâmpadas de xenônio
São lâmpadas acionadas por eletricidade, do tipo descarga, de alta pressão, pertencente a um grupo de fontes de luz denominadas de HID (High Intensity Discharge), emitem luz policromática (200 nm a 1000 nm), não colimada (não se propaga como um feixe) e não coerente.
Estas lâmpadas ganharam destaque por serem utilizadas em aparelhos de luz intensa pulsada (LP) (BOHREROVA et al., 2008), existindo vários estudos em diversas aplicações que incluem: a medicina, estética e desinfecção de alimentos (DUNN et al., 1995; CALDEIRON, 2000; FINE & GERVAIS, 2005).
9 O princípio básico de funcionamento de um sistema de LP dá-se pelo acúmulo de energia elétrica num banco de capacitores. Através da interface do equipamento são programadas as características do disparo: fluência, tempo de exposição e números de pulsos do disparo; estes parâmetros são transmitidos para um circuito controlador o qual realiza a compilação dos dados de entrada.
Quando acionado o disparo, a energia armazenada nos capacitores é então liberada em fração de segundos com as características previamente programadas. Esta energia é transmitida diretamente para lâmpada de xenônio, a qual transforma a energia elétrica acumulada em energia luminosa. A luz emitida pela lâmpada pode ser direcionada para um filtro de corte (cut-off), sendo este responsável por deixar passar apenas o espectro de luz desejado, em função da aplicação desejada.
Wang et al. (2005), estudando a eficiência de radiação luminosa contra E. Coli, em função do comprimento de onda (230 nm a 360 nm), observaram eficiência máxima de inativação em torno de 270 nm, e nenhuma inativação mensurável acima de 300 nm. Esses autores concluíram que a faixa de comprimento de onda de 220 a 290 nm tem o melhor desempenho antimicrobiano, independente da fonte luminosa.
Leds
As novas gerações de Leds estão impactando áreas tão diversas quanto a medicina, a odontologia, a fisioterapia, a arquitetura e até mesmo a agricultura (BAGNATO, 2007).
O diodo emissor de luz (Light emitting diode - Led) é um dispositivo semicondutor que emite luz através de um processo denominado de eletroluminescência, isto é, com a passagem de corrente elétrica através do dispositivo é gerada uma radiação cujo comprimento de onda está associado ao material do meio ativo. Aproximadamente 80% da potência nele aplicada são transformadas em radiação óptica dependendo do comprimento de onda.
Diferentemente das lâmpadas incandescentes existentes, as fontes leds podem produzir luz que mudam de cor, intensidade e distribuição, atendendo necessidades no tempo e no espaço. A cor da luz depende da composição e da condição do material semicondutor usado, podendo variar do ultravioleta ao infravermelho (CARVALHO, 2007).
Os arranjos de leds são meios para fornecer o comprimento de onda desejado sem aquecer o tecido e emitem uma grande quantidade de energia próxima ao comprimento de onda específico. Teoricamente, a foto ativação pode ser obtida por meio de qualquer fonte de
10 luz visível, mas as diferenças na sua efetividade vão depender do comprimento de onda gerado, da potência total, do tamanho do campo de iluminação, da facilidade e custo do uso. Em comparação com as lâmpadas de mercúrio, os leds instantaneamente alcançam 100% de intensidade, e o seu tempo de vida não é dependente do número de ciclos on-off, possuem produção de potência confiável, operando silenciosamente e sem necessidade de refrigeração (INTENSE UV, 2014).
Até o início da década de 80, desconheciam-se os mecanismos da radiação eletromagnética em nível molecular e celular (KARU, 1987). Trabalhos científicos realizados ao longo da década de 80 (KARU et al., 1982, 1983) estabeleceram as bases para a compreensão dos mecanismos moleculares associados aos efeitos da luz sobre as células.
A tecnologia de fabricação dos leds-UV-C (germicidas) é recente, os quais foram pesquisados, desenvolvidos, fabricados e lançados comercialmente em 2003 pela empresa Sandia National Laboratories. Em 2005 a empresa Hydro-Photon, Blue Hill, EUA, anunciou seu produto portátil para esterilização de água em campo utilizando leds UV-C, fabricados pela empresa SET, com potência de saída óptica de 7,3 mW suficiente para reduzir em 99% (2 log) a presença da bactéria Escherichia coli num fluxo de água de 300 ml/min e em 99,99% (4 log) para 150 ml/min (HANSON, 2001) e em 2006 a Sensor Electronic Technology, Inc.(SETI) exibiu um dispositivo emissor de UV-C em montagem de múltiplos leds (lamp) na região de 260-262 nm com potência óptica da ordem de 5 mW suficiente para inativar o DNA de microrganismos numa área de 1 cm2 em poucos segundos.
Pesquisas utilizando leds para desinfecção de microrganismos já vem sendo realizadas (HAMAMOTO et al., 2007, LI et al., 2010, WENGRAITIS et al., 2012), no entanto a tecnologia de inserção dos leds UV-C é pouco explorada no Brasil. Visto que as fontes semicondutoras estão em crescente evolução na eficiência e eficácia energética e o potencial dos leds na região do ultravioleta bactericida abre janelas de oportunidades para fins de desinfecção e esterilização do ar, da água, de superfícies e alimentos.
4.2.3. Sistemas de irradiação UV-C
O dano subletal causado por radiação à célula microbiana pode aumentar sua sensibilidade a fatores ambientais estressantes e outros agentes de injúria (CAMPBELL-PLATT e GRADISON, 1990; FARKAS, 1990). Por isso o feito sinérgico da irradiação com
11 outros processos vem sendo estudado ao longo dos anos. Com a combinação de métodos, doses de radiação menores podem ser aplicadas, não só minimizando os problemas relacionados com as alterações nas características sensoriais, como também reduzindo o custo do processo de radiação.
4.2.3.1. Sistema de emissão contínua
A inativação de microrganismos por um sistema de luz ultravioleta, em onda contínua, é atingida com lâmpadas de baixa pressão que produzem radiação a 254 nm – luz monocromática, conhecida como luz germicida (BINTSIS et al., 2000). O potencial dos leds na região do ultravioleta bactericida abre janelas de oportunidades para fins de desinfecção e esterilização do ar, da água, de superfícies e alimentos.
Uma das maiores desvantagens da aplicação da radiação UV-C contínua é seu baixo poder de penetração. Os microrganismos a serem inativados devem ser expostos diretamente à radiação, ou seja, não devem estar protegidos por sólidos (partículas de pó). Por outro lado, essa baixa penetração de UV-C em sólidos também o torna adequado para a descontaminação de superfícies como materiais de embalagens, frascos, garrafas, tampas e invólucros (LÓPEZ-MALO e PALOU, 2005).
4.2.3.2. Luz pulsada (LP)
A luz pulsada é um processo inovador, permitindo, através de tecnologias suaves de conservação aplicadas aos produtos alimentares, destruir parcialmente ou totalmente os microrganismos dos alimentos ou produtos sensíveis, sem ter que recorrer a tratamentos térmicos ou a conservadores químicos (GÓMEZ-LÓPEZ et al., 2007). É um método que vem sendo estudado como alternativa aos processos convencionais (OMS-OLIU et al., 2008; RAJKOVIC et al., 2010; WAMBURA & VERGHESE, 2011), pois é uma versão modificada dos sistemas de tratamentos por luz UV-C em onda contínua. Este método foi proposto como uma tecnologia não-térmica para a conservação de alimentos ou descontaminação de embalagem pela PurePulse Technology Inc., em San Diego, Califórnia (DUNN et al., 1995).
A potência da radiação é magnificada por meio de estocagem de eletricidade num capacitor e liberação num tempo muito curto (milésimos ou milionésimos de segundo) (GÓMEZ-LÓPEZ et al., 2007). Enquanto as fontes de luz (baseadas nos sistemas convencionais) têm potência da ordem de 100 w a 1.000 w, o sistema de luz pulsada pode
12 gerar muitos MWs de potência para uma única fonte luminosa, além de gerar maior produção relativa de luz na faixa de menores comprimentos de onda, de maior poder bactericida (MCGREGOR et al., 1998).
O equipamento usado na sanitização dos produtos agrícolas é composto de uma ou mais lâmpada de xenônio (170 a 1000 nm) em uma câmara de radiação, sendo aproximadamente 1-20 flashes por s, com intervalo de duração de 1 ms a 0,1 s e densidade de energia na faixa de 0,01 a 50 J / cm 2 (OMS-OLIU et al., 2008). De acordo com Miller et al. (1999) os pulsos curtos tornam a luz pulsada um método mais eficaz e eficiente em relação à UV-C contínua. De fato, é frequente que o mecanismo da luz pulsada seja explicado com base em estudos em que se utilizou radiação em onda contínua, no entanto embora haja semelhanças entre os mecanismos de inativação, existem algumas diferenças. A curta duração dos pulsos, associada as altas doses de radiação UV-C, são vantajosas em relação aos tratamentos em onda contínua, quando uma inativação rápida é requerida. Além disso, a LP possui alto grau de penetração nos frutos e a reparação do DNA não ocorre (ELMNASSER et al., 2007). Possui também, vantagens ambientais, já que não envolve compostos químicos com possíveis impactos ambientais negativos, pois as lâmpadas de xenônio não contêm mercúrio (GÓMEZ-LÓPEZ et al., 2007).
Para que um tratamento por luz pulsada seja efetivo em inativar microrganismos, é preciso que esses microrganismos entrem em contato com os fótons. Assim, qualquer material absorvedor de luz presente entre a fonte de luz e os microrganismos pode prejudicar o efeito do tratamento, neste caso, frutas e hortaliças são mais receptivas ao tratamento do que os alimentos ricos em proteínas e lipídios.
Diversos autores verificaram o potencial da luz pulsada (MCGREGOR et al. 1997, ROWAN et al. 1999; ANDERSON et al. 2000; ROBERTS & HOPE, 2003). Farrell et al. (2010) observaram diferenças significativas na inativação dos microrganismos quando considerado o nível da energia (faixa 3.2-20 J), a quantidade de pulsos (0-60 pulsos) e a distância entre a fonte de luz e o tratamento de superfície (intervalo de 8-20 cm) utilizado. Estes pesquisadores também observaram diferença na sensibilidade a LP, a qual dependia do tipo, idade e concentração das culturas tratadas. Outros fatores a serem considerados incluem se o microrganismo alvo está em estado dormente ou os esporos estão crescendo ativamente.
Mcdonald et al. (2000) tratando esporos de Bacillus subtilis in vitro com LP concluíram que a inativação foi significativamente maior do que a irradiação UV-C contínua.
13 Resultados idênticos in vitro foram obtidos com 4 mJ cm2 de LP e 8 mJ cm2 de irradiação contínua.
Charles et al. (2013) estudaram o efeito da LP em mangas minimamente processadas. Os autores constataram que a utilização de doses próximas a 8 J cm-2 permitiram a manutenção da cor, textura e perda de água dos produtos.
Além da inativação de microrganismos a LP oferece prolongamento da vida útil dos alimentos. Oms-Oliu et al. (2010) estudaram os efeitos da luz pulsada em cogumelos minimamente processados e observaram que as doses de 4,8 e 12 J cm-2 prolongaram 2-3 dias a vida útil.
Por apresentar essas características diversas pesquisas foram realizadas nos últimos anos. No entanto, o mecanismo de ação da luz pulsada sobre os microrganismos ainda não é completamente conhecido e a técnica ainda apresenta algumas limitações como o rápido aquecimento dos vegetais e formas de aplicação homogênea que ainda não existem.
14
5. CAPITULO I: Construção do sistema de radiação pulsada
5.1. Objetivo
Desenvolver e construir um equipamento para aplicação de radiação pulsada gerada por leds UV-C e caracterizar seus parâmetros: frequência de pulsação ( Hz), duração dos pulsos (µs) e energia de interesse para aplicação em produtos agrícolas.
5.2. Material e Métodos
Através da revisão bibliográfica, observou-se a metodologia de autores como (BOHREROVA et al., 2008; GÓMEZ et al., 2011) entre outros, para o desenvolvimento do equipamento, sendo o mesmo construído no Laboratório de Nanoestruturas e Interfaces-IFGW/UNICAMP.
Na implementação do equipamento denominado RP por leds UV-C (RP UV-C), achou-se mais conveniente dividir a abordagem de seu desenvolvimento em duas partes. A primeira referente a construção da câmara de irradiação e do projeto eletroeletrônico do equipamento, e, a segunda, referente ao desenvolvimento do controle do sistema. Assim, o presente capítulo será dividido em dois subitens, abrangendo essas duas etapas.
5.2.1. Construção do equipamento de radiação pulsada com leds UV-C
O equipamento RP UV-C possui uma câmara de irradiação e um circuito elétrico, sendo os mesmos detalhados a seguir.
5.2.1.1. Câmara de iluminação
Esta câmara foi desenvolvida com o intuito de evitar influências do ambiente, reduzir o local de irradiação e, ainda, fixar a amostra a ser irradiada.
Testes Preliminares
5.2.1.1.1. 1° Teste.
Inicialmente a mesma foi construída em madeira, nas dimensões de 30x16x10 cm, seu interior foi revestido com papel alumínio, visando maior aproveitamento da radiação a partir da reflexão. Oito Leds UV-C (255nm), sendo quatro soldados em uma placa de fenolite
15 espaçados de 4 em 4 cm e um sensor de Temperatura e Umidade Relativa (DHT11) foram posicionados na parte superior interna da caixa. Os outros quatros leds também foram soldados em outra placa de fenolite, espaçados de 4 em 4 cm e fixadas na parte inferior interna da caixa. A parte inferior da caixa era solta para permitir ajuste de altura. As amostras irradiadas foram colocadas em uma rede de metal no centro da caixa, a qual possuía um sistema de ajuste de altura para aproximar ou afastar as amostras dos leds. No entanto, foi verificado em testes que com o passar do tempo a energia irradiada era baixa, devido à baixa potência dos leds na faixa UV-C que são comercializados atualmente, não fornecendo assim bons resultados.
5.2.1.1.2. 2° Teste
Para aumentar a quantidade de energia irradiada pelos leds optou-se por fazer outro arranjo dos mesmos. Foi utilizado a mesma caixa de madeira e os ajustes de alturas na rede de metal e na parte inferior da caixa. Oito leds e um sensor de Temperatura e Umidade Relativa (DHT11) o foram soldados em uma placa de fenolite e fixados na parte superior interna da câmara de iluminação .
Os leds utilizados foram da marca SETI, modeloUVTOP255TO39FW, cujas especificações encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1. Especificações dos leds UVTOP255TO39FW
5.2.1.2. Circuito Elétrico
Dentre todos os componentes projetados e especificados durante a realização do projeto, o circuito elétrico, foi o de maior complexidade. Tal complexidade se deve aos leds UV-C utilizados, os quais apresentavam limite de corrente e baixa potência de funcionamento. Devido a tais características, e a necessidade de se construir um sistema com as maiores energias de radiação possíveis, este conjunto tornou-se o limitante da corrente, potência e tensão utilizada no sistema.
16 Para alimentação e controle dos leds o sistema elétrico foi montado de acordo com a representação esquemática da Figura 1 e está implementado num protoboard (Figura 2) e ligado a uma fonte de alimentação +12 V, +5V e -5V e 2A, uma vez que a alimentação através da porta USB (5V) não fornecia corrente suficiente para manter a estabilidade do sistema.
Figura 1. Representação Esquemática do sistema elétrico.
Figura 2. Configuração do Protoboard do Sistema de RP UV-C.
O circuito elétrico de acionamento do equipamento de RP UV-C (Figura 1) é composto basicamente pelos seguintes componentes:
17 Circuito integrado CMOS 4051 (1): Como o controlador Arduino Uno não possuía portas suficientes, pois o projeto necessitava de 8 entradas analógicas, para que os 8 leds fossem conectados, utilizou-se o multiplexador Cd 4051 de oito entradas analógicas e três entradas de controle binário como alternativa para criação de mais portas para o Arduino.
Leds UV-C (2) Resistores: 10K (3) Capacitor de cerâmica: 100k250 (4) Datasheet: LF 355N (5) Fonte de alimentação (+12 V, +5V e -5V e 2 A) (6) Transistor PNP: 2n2222a (7)
Sensor de temperatura e Umidade (DHT 11).
5.2.1.3. 2° Etapa- Sistema de controle das leds UV-C pulsadas.
Devido à necessidade de automação, controle rápido e de interação do usuário com o sistema, preferiu-se realizar o controle da RP- UV-C via microcontrolador, utilizando para isso o Arduino Uno. Dentre as principais característica da UNO está o uso do microcontrolador ATmega328, tensão de operação de 5V, 14 pinos de entrada/saída digital, 6 pinos de entrada/saída analógicos, 32 KB de memória flash, 2 KB de SRAM, 1 KBde EEPROM e velocidade de clock de 16 MHz (Figura 2).
A comunicação do microcontrolador com o sistema pulsado foi desenvolvido na ferramenta Arduino IDE em linguagem C, que pode ser adquirido no site do desenvolvedor
(www.arduino.cc). O programa de controle é responsável pelo acionamento dos Leds UV-C
em: largura (us), frequência de pulsos (Hertz), intensidade (0 a 5V) e leitura da temperatura (°C) e umidade relativa (%) durante todo o tempo de acionamento das Leds.
Para conseguir obter o controle de cada dispositivo físico de forma separada, foi criado um código fonte (Apêndice 6.3) a ser interpretado pelo microcontrolador.
O algoritmo consiste no seguinte:
A função void setup realiza as ações dentro dos colchetes uma única vez, geralmente utilizada nas configurações iniciais. A função pinMode ativa as portas digitais (11,10,9), como saída (OUTPUT). A função void loop realiza as ações dentro dos colchetes de forma
18 cíclica, em um laço eterno. A função analogWrite, indicada como código binário (001,010 etc.) liga as portas digitais uma a uma respectivamente e analogWrite (000), desliga a porta digital e o delay estabelece o tempo que os Leds permanecem acesos em milissegundos, enquanto for (int i=0; i<=freq; i++) estabelece a frequência dos Leds em Hertz (ou seja quantidade de pulsos por segundo).
Outro ponto a ser observado é que os leds funcionam sob a tensão recomendada de 2V, sob uma corrente de no máximo 30 mA. O máximo brilho será atingido quando a corrente for máxima int intensidade = 255 (5V). O código escrito foi gravado no microcontrolador que passa a realizar as ações de forma independente e contínua até que o tempo de trabalho dos leds seja alcançado if (millis () <= tempoTrabalho).
Figura 3. Diagrama de blocos geral do projeto
Uma característica importante do programa desenvolvido (Figura 3) é a interface do mesmo com o usuário, sendo possível informar as variáveis de entrada requeridas (frequência, largura dos pulsos e intensidade dos leds). Através do programa, o usuário também pode acompanhar em tempo real, a temperatura e a umidade relativa da câmara de irradiação. O programa ainda é dotado de um sistema que interrompe o processo, caso o tempo de irradiação estipulado pelo usuário seja ultrapassado.
Para a calibração da frequência de pulsação (Hz), largura dos pulsos (µs) e intensidade dos leds do sistema de RP UV-C foi utilizado um osciloscópio digital.
5.2.2. Ensaios de Validação do Equipamento
Considerando não ter encontrado referência em trabalhos semelhantes, para a aplicação do RP UV-C em patógenos, alguns testes preliminares foram efetuados com o objetivo de definir o método e o procedimento mais adequado para a irradiação.
Os testes foram realizados sem nenhuma interferência de qualquer fonte luminosa além dos leds, para isso as luzes do laboratório foram apagadas.
19 Foram realizados vários ensaios, dos quais variou-se os parâmetros do sistema para validação do algoritmo, controle das varáveis de entrada e para estabelecer os limites de operação do equipamento, como também observar o comportamento do processo em diferentes faixas de trabalho.
Desta forma, os parâmetros utilizados foram definidos ao longo dos ensaios, tendo em vista a evolução dos mesmos.
5.2.2.1. 1° Ensaio
O primeiro ensaio utilizou as seguintes variáveis de entrada: largura de pulso 100 µs, intensidade de 2v, frequência de pulsação de 10000 Hz, variando-se apenas a distância entre os leds e a amostra do produto em 1cm, 2cm, 3cm, respectivamente, para se determinar a melhor posição para que as amostras fossem irradiadas.
5.2.2.2. 2° Ensaio
Este ensaio foi realizado para determinar o máximo de energia emitida pelo sistema, no qual variou a largura do pulso e a frequência de pulsação, mantendo fixa a distância de 1 cm entre as amostras e os leds e a intensidade de 2v, como mostra a Tabela 2.
Tabela 2. Variáveis de entrada do sistema de RP- UV-C.
Largura do pulso (µs) Frequência (Hz)
10 10000 1000 100 25 10000 1000 100 50 10000 1000 1000 100 10000 1000 10
A irradiância emitida foi mensurada pelo radiômetro (Optometer Newport, modelo 1830-C, resolução 0,1 pW e precisão 2%).
20
5.3. Resultados e Discussão
5.3.1. Câmara de irradiação
Nos testes preliminares (item 5.2.1.1) as amostras do primeiro teste foram irradiadas com uma intensidade de radiação de 0,176 mw/cm2 na parte inferior e superior, porém como
os leds possuem baixa potência e necessitava-se de maior energia emitida realizou-se o segundo teste (item 5.2.1.2) com o intuito de aumentar a energia incidente nas amostras. Cada amostra do segundo teste recebeu 0,352 mw/ cm2.
5.3.2. Ensaios de validação do equipamento
5.3.2.1. 1° Ensaio
Os resultados apresentados na Tabela 3 demonstram que ocorre uma queda na taxa de fluência com o aumento da distância entre os leds e as amostras. O aumento no tempo de exposição à luz, não é suficiente para compensar essa diminuição na intensidade de luz. A intensidade de luz tem sido relatada como fator fundamental na determinação do desempenho dos aparelhos com luz UV-C, pois os valores de intensidade de luz causam alterações no DNA dos patógenos (TIBOLA et al., 2012).
Tabela 3. Taxa de fluência de acordo com a variação da distância entre os leds e a amostra do produto. Distância entre os leds e a amostra Taxa de fluência (mw/cm2) 1 cm 2 cm 3 cm 4 cm 5 cm 6 cm 7 cm 0,44 0,40 0,38 0,33 0,28 0,20 0,10 5.3.2.2. 2° Ensaio
Observando os valores das taxas de fluência apresentados na Tabela 4, constata-se a tendência de maiores valores de energia, em todas as larguras de pulso, quando utilizada a
21 frequência de pulsação de 10000 Hz, visto que o máximo de energia emitida durante todo o período de radiação, foram com as variáveis: largura de pulso 100 µs, intensidade de 2v, frequência de pulsação de 10000 Hz e distância da amostra os leds de 1 cm, sendo que cada led apresentou uma taxa de fluência de 0,44 mw/cm2.
Tabela 4. Taxa de fluência de acordo com a variação da frequência (Hz) e largura de pulso (µs) dos leds UV-C, mantendo fixo a distância da amostra aos leds.
Largura pulso (µs)
Frequência (Hz) Taxa de fluência (mw/cm2) 10 10000 1000 100 0,018 0,007 0,001 25 10000 1000 100 0,028 0,012 0,002 50 10000 1000 100 0,037 0,020 0,003 100 10000 1000 100 0,044 0,040 0,006 5.4. Conclusões preliminares
O melhor arranjo experimental que emite o máximo de energia é: câmara de iluminação com 8 leds na parte superior, largura de pulso 100 µs, frequência de pulsação de 10000 Hz, intensidade dos leds de 2v e distância dos leds ao anteparo de 1 cm.
22
O algoritmo desenvolvido para controlar o sistema de RP UV-C mostrou-se eficiente e estável.
Os leds UV-C utilizados apresentam baixa potência, limitando assim a quantidade de energia emitida pelo equipamento.
23 6. CAPÍTULO II - Avaliar a eficiência do equipamento de radiação pulsada e as potencialidades dos Leds UV-C no controle do desenvolvimento microbiano in vitro.
6.1. Objetivo
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da RP UV-C no crescimento in vitro dos fungos Fusarium solani, Rhizopus stolonifer e Phomopsis sp.
6.2. Material e Métodos
6.2.1. 1° experimento
Os microrganismos modelo selecionados para o estudo foram: Fusarium solani (IAC 102411), Rhizopus stolonifer e Phomopsis sp (MMBF 19/98), pela importância desses fitopatógenos como causadores de danos em produtos agrícolas após a colheita. Os isolados utilizados são provenientes do Instituto Biológico e do Instituto Agronômico de Campinas. Os ensaios foram desenvolvidos no Laboratório de Pós-Colheita, na Faculdade de Engenharia Agrícola/FEAGRI, da UNICAMP.
6.2.1.1. Inoculação dos patógenos
Nos testes in vitro, discos de micélio de 5mm de diâmetro dos fungos Fusarium solani, Rhizopus stolonifer e Phomopsis sp., com 3 dias de crescimento, foram inoculados, no centro de placas de petri, com meio mínimo (Apêndice 6.4) e oxietraciclina (50 µg.mL-1).
Inicialmente, o meio utilizado seria o BDA (Batata Dextrose Agar), por ser o meio mais utilizado nos experimentos in vitro, porém durante os testes preliminares, notou-se que os fungos se desenvolviam rapidamente, dificultando a avaliação do crescimento e o efeito da RP nos patógenos. Tendo em vista, esses resultados, optou-se por um meio com poucos nutrientes, no qual o desenvolvimento fúngico é mais lento.
6.2.1.2. Aplicação da Radiação Pulsada UV-C
Com as variáveis independentes do planejamento experimental definidas, foram realizados os ensaios definitivos a fim de comprovar a eficiência do método. As placas de
24 petri com os patógenos estudados foram expostas abertas a densidades de energia UV-C (J.m
-2) e tempos de exposição (horas): Controle (0 J.m-2). 0,1411 J.m-2 (1 hora); 0,4233 J.m-2 ( 3
horas); 0,7055 J.m-2 ( 5 horas).; 0,9877J.m-2 ( 7 horas), sendo três repetições por tratamento. Imediatamente após a irradiação, os tratamentos foram incubados em câmaras BOD, sem alternância de luz, a temperatura de 25°C por um período de 15 dias.
6.2.1.3. Avaliação dos tratamentos
A dinâmica do crescimento do raio da colônia micelial depende efetivamente do crescimento e ramificação das hifas. Estes dois processos são essencialmente distintos, portanto foram realizadas medidas de crescimento das colônias e densidade das hifas. As medições de crescimento das colônias começaram a ser realizadas 48 horas após a transferência dos microrganismos, e continuaram sendo realizadas no intervalo de 48 horas, até a paralisação do crescimento da colônia (15 dias) e comparado com o controle que não recebeu irradiação. As placas foram mantidas à 25°C, no escuro, medindo-se o crescimento micelial com o auxílio de uma régua milimetrada, medindo-se o diâmetro, em dois sentidos opostos, sendo posteriormente calculada uma média por placa.
Já a densidade das hifas foi avaliada de acordo com a evolução da densidade das mesmas em relação ao tempo (Figura 4).
Ralo (10% da placa) Meio denso (50% da placa) Denso (100% da placa) Figura 4. Variação média da densidade de hifas após 15 dias.
Ao final do tempo de incubação, foi avaliado a produção de esporos. Para isso as placas foram congeladas a -20°C por 48 horas (KORTEKAMP, 2006). Após o congelamento, removeu-se das amostras o micélio aéreo com uma espátula, adicionando-se em seguida água
25 destilada nas placas e tampas para coletar os esporos presentes nas mesmas. O micélio removido e a suspensão foram colocados em um béquer de vidro e agitados com bastão de vidro para separação dos esporos e micélio. Acrescentou-se à suspensão de esporos 10 µL do dispersante Twen 20 e adicionou-se água destilada até se obter uma suspensão com densidade de esporos contáveis. Procedeu-se à contagem dos esporos na suspensão utilizando-se um hemacitômetro e microscópio ótico, e os resultados expressos pela quantidade total de esporos na suspensão.
6.2.1.4. 2° experimento
Vista a ineficácia da RP no Phomopsis sp. no decorrer dos dias de avaliação obtida com todas as densidades de energias estudadas, optou-se por utilizar radiação contínua com led UV-C, nos mesmos tempos de exposição utilizados no primeiro experimento, sendo iguais à (1 hora, 3 horas, 5 horas e 7 horas).
Com o intuito de comparação entre a Radiação Pulsada e Radiação Contínua a metodologia de inoculação dos patógenos e a avaliação dos tratamentos foi mantida como descrito nos itens 6.2.1.1 e 6.2.1.3. As amostras foram irradiadas apenas com 1 led UV-C de maneira pontual.
6.3. Delineamento Experimental
Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial, sendo amostra não tratada (controle) e amostra tratada com 4 densidades de energia; 0,1411 J.m-2(1
hora); 0,4233 J.m-2 (3 horas); 0,7055 J.m-2 (5 horas); 0,9877 J.m-2 (7 horas), e três repetições
por tratamento.
Foi realizada análise de variância e comparação de médias entre os tratamentos utilizando-se teste de Tukey (p<0,01), com o auxílio do pacote estatístico.
6.4. Resultados e Discussão
A temperatura na câmara de irradiação independente da densidade de energia utilizada não variou, permanecendo constante em 25°C e UR de 50%. Estes valores demonstram que os Leds UV-C utilizados não aquecem o ambiente.
26 Apesar de todas as colônias dos patógenos estudados terem ocupado toda a extensão da placa, os três apresentaram serem sensíveis a radiação pulsada UV-C, sendo que o crescimento micelial, a densidade de hifas e a produção de conídios variaram dependendo do patógeno.
6.4.1. Crescimento micelial
Tabela 5. Valores médios do crescimento micelial (cm) para Rhizopus stolonifer, após a exposição a diferentes níveis de RP UV-C.
* Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si (Tukey, p < 0,01).
Tabela 6. Valores médios do crescimento micelial (cm) para Fusarium solani, após exposição as diferentes densidades de energia de RP UV-C.
Tempo de incubação (dia) Tratamento (J/m-2) 1° 3° 5° 7° 9° 11° 13° 15° 0 0,5 a 2,45 b 7,5 a 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,1411 0,5 a 2,96 ab 5,3 c 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,4233 0,5 a 3,61 a 6,2 b 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,7055 0,5 a 2,64 b 5,28 c 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,9877 0,5 a 2,51 b 5,03 c 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a
* Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si (Tukey, p < 0,01). Tempo de incubação (dia)
Tratamento (J/m2) 1 3 5 7 9 11 13 15 0 0,5 a 3,61 a 7,3 a 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,1411 0,5 a 3,51 a 7,03 ab 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,4233 0,5 a 3,6 a 6,1 bc 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,7055 0,5 a 2,96 ab 5,86 c 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,9877 0,5 a 2,03 b 5,06 c 7 b 9 a 9 a 9 a 9 a
27 Tabela 7. Valores médios do crescimento micelial (cm) 1° ensaio para Phomopsis sp, após a exposição a diferentes níveis de REP UV-C.
Tempo de incubação (dia) Tratamento (J.m-2) 1 3 5 7 9 11 13 15 0 0,5 a 2,1 c 5,13 b 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,1411 0,5 a 3,4 a 5,86 a 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,4233 0,5 a 3,26 a 5,5 ab 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,7055 0,5 a 2,57 bc 5,15 b 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,9877 0,5 a 2,62 b 5,26 b 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a * Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si (Tukey, p < 0,01).
Tabela 8. Valores médios do crescimento micelial (cm) 2° ensaio para Phomopsis sp, após a exposição a diferentes níveis de radiação UV-C.
Tempo de incubação (dia) Tratamento (J.m-2) 1 3 5 7 9 11 13 15 0 0,5 a 3,00a 5,21 a 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 0,834 0,5 a 3,20a 5,70a 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 2,5 0,5 a 4 bc 5,53a 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 4,16 0,5 a 3,5 b 5,65 a 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a 5,84 0,5 a 4,8 bc 5,23 a 9 a 9 a 9 a 9 a 9 a * Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si (Tukey, p < 0,01).
Considerando- o crescimento do fungo Rhizopus stolonifer entre o 3° e 5° dia de incubação (Tabela 5), observa-se que os fungos expostos a densidade de energia de 0, 9877J.m-2 apresentaram menor valor médio de diâmetro, sendo que no 7° dia o mesmo
tratamento diferiu estatisticamente dos demais.
Enquanto que o Fusarium solani no 3° dia não apresentou redução em comparação com o controle. No entanto a partir do 5° dia nota-se que nas densidades de energia 0,7055 J.m-2 e 0,9877 J.m-2 o crescimento micelial foi retardado quando comparado ao controle
28 Observa-se no primeiro ensaio do Phomopsis sp, que a inibição do crescimento micelial acompanhou a mesma tendência do tratamento controle. Porém, os valores médios da taxa de crescimento dos tratamento irradiados foram levemente superiores. (Tabela 7).No segundo ensaio notou-se que o crescimento micelial do Phomopsis sp. (Tabela 8) permaneceu constante, não ocorrendo redução quando comparados à testemunha. ). Estes resultados devem- se ao fato de o Phomopsis ser de uma linhagem resistente, apresentando-se como parasita.
6.4.2. Densidade de Hifas
Figura 5. Valores médios da densidade das hifas (%) para Rhizopus stolonifer, após exposição as diferentes densidades de energias de RP UV-C.
29
Figura 6. Valores médios da densidade de hifas (%) para Fusarium solani, após exposição as diferentes densidades de energias de RP UV-C.
Figura 7. Valores médios da densidade micelial (%) para Phomopsis sp, após exposição as diferentes densidades de energias de RP UV-C.
Nas figuras 5, 6 e 7 pode- se observar a densidade de hifas dos patógenos estudados. Nota-se entre o 5° e 9° dia que as amostras do Rhizopus stolonifer expostas as densidades de energias de 0,7055 J.m-2 e 0,9877 J.m-2 apresentaram menor densidade de hifas quando
comparadas ao controle e a partir do 11° dia foi possível observar um menor adensamento de hifas no tratamento com 0,9877 J.m-2 (Figura 5) evidenciando uma sensibilidade do patógeno
à radiação pulsada UV-C. De acordo com Gewandsznajder (2005) os são fungos primitivos, de organização mais simples, com apenas um núcleo e hifas septadas, ou seja, os
