Ingestão de alimento após a ativação de receptores 5-HT1A do núcleo arqueado do hipotálamo e da área hipotalâmica lateral de ratas em duas fases do ciclo estral

SÉRGIO MURILO STEFFENS

INGESTÃO DE ALIMENTO APÓS A ATIVAÇÃO DE

RECEPTORES 5-HT1A DO NÚCLEO ARQUEADO DO

HIPOTÁLAMO E DA ÁREA HIPOTALÂMICA LATERAL DE

RATAS EM DUAS FASES DO CICLO ESTRAL

Florianópolis - SC

2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS

SÉRGIO MURILO STEFFENS

INGESTÃO DE ALIMENTO APÓS A ATIVAÇÃO DE

RECEPTORES 5-HT

DO NÚCLEO ARQUEADO DO

HIPOTÁLAMO E DA ÁREA HIPOTALÂMICA LATERAL DE

RATAS EM DUAS FASES DO CICLO ESTRAL

Tese apresentada à Universidade

Federal de Santa Catarina para

obtenção do título de Doutor em

Neurociências.

Florianópolis - SC

2009

Catalogação na fonte pela Biblioteca Universitária da Universidade Federal de Santa Catarina

S817 Steffens, Sérgio Murilo

Ingestão de alimento após a ativação de receptores 5-HT1A do núcleo arqueado do hipotálamo e da área hipotalâmica lateral de ratas em duas fases do ciclo estral [tese] / Sergio Murilo Steffens ; orientadora, Marta Aparecida Paschoalini. - Florianópolis, SC : 101 f.: tabs., grafs.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências.

Inclui bibliografia

1. Ingestão de Alimentos. 2. Hipotálamo. 3. Receptores de serotonina. I. Paschoalini, Marta Aparecida. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. III. Título.

Serviço Público Federal

Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Ciências Biológicas

Programa de Pós-graduação em Neurociências Orientadora: Profª. Dra. Marta Aparecida Paschoalini

Doutorando: Sérgio Murilo Steffens

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: NEUROPSICOBIOLOGIA

CONTROLE NEURAL DO METABOLISMO E DO COMPORTAMENTO INGESTIVOS

Título da Tese:

Ingestão de alimento após a ativação de receptores 5-HT1A do núcleo

arqueado do hipotálamo e da área hipotalâmica lateral de ratas em

duas fases do ciclo estral

Laboratório da Profª. Dra. Marta Aparecida Paschoalini, Prof. Dr. José Marino Neto e Prof. Dr. Moacir Serralvo

Departamento de Ciências Fisiológicas - CCB – UFSC Florianópolis – SC

BANCA EXAMINADORA

MEMBROS TITULARES

1. Profa. Dra. Marta Aparecida Paschoalini

Departamento de Ciências Fisiológicas – CCB – UFSC

3. Profa. Dra. Adelina Martha dos Reis

Instituto de Ciências Biológicas - ICB – UFMG

2. Prof. Dr. Cândido Celso Coimbra

Instituto de Ciências Biológicas - ICB – UFMG

4. Profa. Dra. Thereza Christina Monteiro Lima

Departamento de Ciências Fisiológicas – CCB – UFSC

5. Prof. Dr. José Marino-Neto

Departamento de Ciências Fisiológicas – CCB – UFSC

MEMBRO SUPLENTE

1. Prof. Dr. Vander Baptista

Departamento de Ciências Fisiológicas – CCB – UFSC

AGRADECIMENTOS

À Profª Dra Marta Aparecida Paschoalini, por ter me aceito no programa de Doutorado em Neurociências e acreditado no meu potencial para desenvolver este projeto de pesquisa.

Para meus queridos pais, Elísio Steffens e Olga Meurer Steffens, pela sua dedicação, apoio, carinho e amor indispensáveis na minha formação e em toda minha vida.

Para meus familiares, pelo constante apoio e carinho.

Para meus colegas de laboratório (Luana, Aparecida, Isabel, Amanda, Luciana, Rúbia, Samira), pelo carinho e apoio nos momentos certos. Sem todos vocês, não chegaria aqui.

Aos Prof°. Dr. José Marino-Neto e Moacir Serralvo, por abrirem as portas de seus laboratórios e me darem a oportunidade de ter realizado este trabalho. Obrigado pela confiança, paciência e orientação dispensada.

Aos alunos de iniciação científica (em especial, a Danielle Beckman) por ter aparecido no momento certo, me auxiliando no desenvolvimento deste trabalho.

Aos funcionários do Departamento de Ciências Fisiológicas, Ana Cláudia, Péricles, Dona Vilma e Seu Carlão, pelo apoio e momentos vividos.

À Capes e ao CNPq pelo apoio financeiro.

A todos os animais utilizados neste estudo, pois sem eles nada disso poderia ter sido realizado.

E, acima de tudo à Deus, que sempre está iluminando meu caminho e me dando forças para lutar e seguir trabalhando e batalhando.

Resumo

Steffens SM. Ingestão de alimento após a ativação de receptores 5-HT1A do núcleo arqueado do hipotálamo e da área hipotalâmica lateral de ratas em duas fases do ciclo estral [tese]. Florianópolis: Pós-graduação em Neurociências, Universidade Federal de Santa Catarina; 2009.

O presente estudo examinou os efeitos da injeção local de metergolina (MET, antagonista de receptores 5-HT1 e 5-HT2; 0, 2 e 20nmol), 8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)-tetralina (8-OH-DPAT, agonista de receptores 5-HT1A e 5-HT7; 0, 6 e 6nmol) e de 8-OH-DPAT (6nmol) em ratas pré-tratadas com maleato de ciclo hexano carboxamida n-[2-[4-(2-metoxifenil)-1-piperazinil]etil]-n-(2-piridinil) (WAY 100635, antagonista seletivo de receptor 5-HT1A, 37nmol) no núcleo arqueado (ARC) e na área hipotalâmica lateral (AHL), nos comportamentos ingestivos e não ingestivos de ratas. Estes efeitos foram examinados durante as fases de estro ou diestro e as ratas foram adaptadas com dieta enriquecida com sacarose 10% durante 1h, por 3 dias consecutivos, na caixa de experimento. Os resultados mostraram que a injeção de 8-OH-DPAT na AHL reduziu a ingestão de alimento em todas as doses e em ambas as fases do ciclo estral, enquanto que no ARC esse tratamento desencadeou uma resposta hipofágica, somente na maior dose de 8-OH-DPAT e apenas na fase de estro. A administração de MET (em todas as doses) no ARC não afetou a ingestão alimentar durante ambas as fases do ciclo estral examinadas. Ocorreu uma redução na ingestão de alimento após a injeção de ambas as doses de MET na AHL de ratas durante as fases de estro e diestro. Na fase de estro, a injeção da maior dose de 8-OH-DPAT no ARC e na AHL diminuiu a duração da ingestão de alimento. A latência para iniciar o consumo de alimento, a ingestão de água e de outros comportamentos não ingestivos não foi afetada pela administração de 8-OH-DPAT ou MET no ARC ou na AHL em ambas as fases do ciclo estral. O pré-tratamento com WAY 100635 na AHL bloqueou o efeito hipofágico desencadeado pela injeção de 8-OH-DPAT (6nmol) durante as fases de estro e diestro. O pré-tratamento com WAY 100635 no ARC bloqueou a resposta hipofágica, bem como a redução na duração do consumo de alimento desencadeado pela injeção de 8-OH-DPAT na fase de estro. A latência para iniciar a ingestão de alimento, ingestão de água, bem como a duração dos outros comportamentos não ingestivos, não foi afetada pelos diferentes tratamentos efetuados, pela região hipotalâmica examinada (ARC ou AHL) ou pelas diferentes fases do ciclo estral estudadas (estro e diestro). Estes resultados indicam que receptores 5-HT1A participam no controle serotoninérgico de mecanismos relacionados à regulação da ingestão de alimentos localizados no ARC e na AHL. Estes circuitos serotoninérgicos relacionados com ingestão de alimento em ambas as áreas são, possivelmente, afetados por hormônios esteróides ovarianos, que poderiam aumentar a sensibilidade dos neurônios do ARC aos efeitos hipofágicos desencadeados pela injeção de 8-OH-DPAT, ou aumentar a eficácia de sinais de saciedade que desencadeiam o término do consumo de alimento. Além disso, este estudo indica que circuitos serotoninérgicos localizados no ARC e na AHL não exercem uma atividade inibitória tônica sobre circuitos neuronais relacionados com a ingestão de alimento. Descritores: Ingestão de alimento; hipotálamo; receptores 5-HT; ciclo estral.

Abstract

Steffens SM. Food intake after the activation of 5-HT1A receptors of the arcuate nucleus and the lateral hypothalamic area of rats in different estrous cycle stages [thesis]. Florianopolis: Neuroscience Pos-grade, Federal University of Santa Catarina; 2009.

This study examined the effects of local injections of metergoline (MET, 5-HT1 and 5-HT2 receptor antagonist, 0, 2 and 20nmol), 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)-tetralin (8-OH -DPAT, 5-HT1A and 5-HT7 receptor agonist, 0, 0.6 and 6nmol) and 8-OH-DPAT (6nmol) in rats pre-treated with N-[2-[4-(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl]ethyl]-N-(2-pyridinyl) cyclohexane carboxamide maleate (WAY 100635, full 5-HT1A receptor agonist, 37nmol) into the arcuate nucleus (ARC) and the lateral hypothalamic area (LHA) on ingestive and non-ingestive behaviors of female rats. These effects were examined during the diurnal periods of estrus or diestrus in rats adapted to eat a wet mash diet (enriched with 10% sucrose) during 1h by 3 consecutive days at the recording chamber. The results showed that 8-OH-DPAT injected into the LHA reduced food intake at all doses and both cycle stages, while in the ARC these treatment evoked hypophagic response only at the highest 8-OH-DPAT dose and only at the estrus phase. MET administered into the ARC (at all doses) failed to affect food intake during both estrous stages. In contrast, food intake decreased after injection of both doses of MET into the LHA of rats during estrus and diestrus phases. In estrus stage, injections of the higher dose of 8-OH-DPAT into the ARC and into the LHA decreased the duration of feeding. Latency to start feeding, drinking and non-ingestive behaviors were not affected by 8-OH-DPAT or MET treatments in the ARC or LHA in both cycle phases. The LHA pretreatment with WAY 100635 suppressed the hypophagic effects evoked by 8-OH-DPAT (6nmol) injection during estrus as well as diestrus. The ARC pretreatment with WAY 100635 blocked the hypophagia evoked by 8-OH-DPAT in estrus rats. The previous treatment with WAY 100635 in the ARC also suppressed the feeding duration decrease evoked by 8-OH-DPAT in estrus. Latency to start feeding, drinking as well as the duration of other non-ingestive behaviors were not affected by different treatments performed, hypothalamic regions examined (ARC or LHA) or the different estrous cycle stage studied (estrus and diestrus).These results indicated that 5-HT1A receptors participate in the serotonergic control of feeding-related mechanisms located at the ARC and the LH. These feeding-related serotonergic circuits in both areas are possibly affected by ovarian hormones that could increase sensitivity of ARC neurons to the hypophagic effects of 8-OH-DPAT or increase the efficacy of satiety signals that terminate feeding. In addition, the present data indicated that serotonergic inputs do not exert a tonic inhibitory activity on the ARC and LH feeding-related circuits.

Lista de abreviaturas

AgRP - Proteína relacionada ao agouti AHL - Área hipotalâmica lateral ARC - Núcleo arqueado do hipotálamo

BDNF - Fator neurotrófico derivado do encéfalo CART - Transcrito regulado pela cocaína e anfetamina CB-1 - Receptor endocanabinóide do tipo 1

CCK - Colecistocinina

CRH - Hormônio liberador de corticotropina DMN - Núcleo dorsomedial do hipotálamo GABA - Ácido gama-aminobutírico

GLP-1 - Peptídeo semelhante ao glucagon-1 MAO - Enzima monoamino oxidase

MAPK - Proteína cinase ativada por mitógeno MCH - Hormônio concentrador de melanina MET - Metergolina

NDR - Núcleo dorsal da rafe NPY - Neuropeptídeo Y NTS - Núcleo trato solitário OXM - Oxintomodulina POMC - Pró-opiomelanocortina PP - Polipeptídeo pancreático

PVN - Núcleo paraventricular do hipotálamo PYY - Peptídeo YY

SERT - Transportador de serotonina de membrana TRH - Hormônio liberados de tiroidotropina VMN - Núcleo ventromedial do hipotálamo

WAY 100635 _{- Maleato de ciclo hexano carboxamida n-[2-[4-(2-metoxifenil)-1-}

piperazinil]etil]-n-(2-piridinil)

α-MSH - Hormônio estimulante de α-melanócito 5-HT - 5-hidroxitriptofano; serotonina

Lista de figuras

Figura 1. Principais núcleos hipotalâmicos, neuropeptídeos e vias envolvidas na regulação

da ingestão do alimento... ₁₆

Figura 2. Microfotografia de um corte coronal (coloração pelo método de Nissl) do hipotálamo, ilustrando o trajeto de uma cânula guia e injetora no ARC e na AHL... 49

Figura 3. Desenho esquemático de um corte coronal do hipotálamo de rato, ilustrando

o sítio aproximado das injeções de veículo; OH-DPAT; metergolina e 8-OH-DPAT em ratas pré-tratadas com WAY 100635 na fase de estro ou diestro... 50

Figura 4. Ingestão de alimento 1h após o tratamento com metergolina (MET; 0, 2 e 20nmol) injetado no ARC e na AHL de ratas em fase de estro ou diestro... 48

Figura 5. Ingestão de alimento 1h após o tratamento com 8-OH-DPAT (0, 0,6 e 6 nmol) injetado no ARC e na AHL de ratas em fase de estro ou diestro... 51

Figura 6. Efeito da injeção de 8-OH-DPAT (6nmol) sobre a ingestão de alimento em ratas pré-tratadas com WAY 100635 (37nmol) em diferentes fases do ciclo estral... 52

Lista de quadros

Quadro 1. Efeitos de peptídeos e hormônios na ingestão de alimentos... 14

Quadro 2. Efeitos da ativação de receptores 5-HT1B ou 5-HT2C no o consumo de alimento em roedores... 25

Quadro 3. Efeitos da ativação de receptores 5-HT1A no consumo de alimento em roedores... 26

Quadro 4. Efeitos do estrogênio na ingestão de alimento e na expressão de peptídeos orexígenos e anorexígenos em núcleos hipotalâmicos de roedores... 31

Lista de tabelas

Tabela 1. Latência e duração de comportamentos ingestivos e não ingestivos durante 1h após o tratamento com diferentes doses de metergolina (0, 2 ou 20nmol) injetado no ARC ou na AHL de ratas em fase de estro ou diestro... 54

Tabela 2. Latência e duração de comportamentos ingestivos e não ingestivos durante 1h após o tratamento com diferentes doses de 8-OH-DPAT (0, 0.6 ou 6nmol) injetado no ARC ou na AHL de ratas em fase de estro ou diestro... 55

Tabela 3. Latência e duração de comportamentos ingestivos e não ingestivos durante 1h após o tratamento com 8-OH-DPAT no ARC de ratas pré-tratadas com WAY 100635 durante as fases de estro ou diestro... 56

Tabela 4. Latência e duração de comportamentos ingestivos e não ingestivos durante 1h após o tratamento com 8-OH-DPAT na AHL de ratas pré-tratadas com WAY 100635 durante as fases de estro ou diestro... 57

SUMÁRIO Resumo Abstract Lista de abreviaturas Lista de figuras Lista de quadros Lista de tabelas 1. INTRODUÇÃO... 13

1.1. Regulação central da ingestão de alimento... 14

1.2. Serotonina e ingestão de alimento... 23

1.3. Influência do ciclo ovariano na ingestão alimentar... 28

2. OBJETIVOS... 34 2.1. Objetivos gerais... 34 2.2. Objetivos específicos... 34 3. MATERIAIS E MÉTODOS... 35 3.1. Animais... 35 3.2. Cirurgia estereotáxica... 35 3.3. Drogas administradas... 37 3.4. Administração de drogas... 37

3.5. Determinação do ciclo estral... 38

3.6. Procedimentos experimentais... 39

3.6.1. Protocolo experimental I... 39

3.6.2. Protocolo experimental II... 40

3.7. Registro comportamental... 41

3.8. Análise histológica... 42

3.9. Análise estatística... 43

4. RESULTADOS... 44

4.1. Efeitos da injeção intra-hipotalâmica de metergolina... 44

4.2. Efeitos da injeção intra-hipotalâmica de 8-OH-DPAT... 45

4.3. Efeitos da injeção intra-hipotalâmica de 8-OH-DPAT em ratas pré-tratadas com WAY 100635... 47 5. DISCUSSÃO... 58 6. CONCLUSÕES... 78 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 79 8. ANEXOS... 95 8.1. Artigo publicado………..……..…….. 95 8.2. Artigo submetido………....…….… 96

1. INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, o mecanismo neuroendocrinológico envolvido na regulação da ingestão de alimento e do balanço energético é um dos eventos fisiológicos mais largamente estudado. Isto, devido, principalmente, a maior incidência de transtornos causados por distúrbios alimentares como: obesidade, anorexia nervosa e bulemia (Erlanson-Albertsson, 2005; Ogden et al., 2006; Simpson et al., 2009).

Os mecanismos que controlam a ingestão de alimento envolvem uma complexa interação de sinais periféricos e do sistema nervoso central (SNC), que são influenciados não somente pela avaliação do alimento e do balanço energético, mas também, por fatores genéticos, psicológicos e ambientais (Schwartz et al., 2000).

Os peptídeos e hormônios secretados pelo trato gastrintestinal (TGI) ocupam um papel primário na complexa interação neuroendócrina que são a base da regulação da ingestão de alimento. Esses peptídeos e hormônios gastrintestinais podem atuar perifericamente e, também, diretamente em receptores localizados nos neurônios do hipotálamo e do tronco encefálico, que são regiões do SNC que fazem parte do controle central do apetite. A eminência mediana e a área postrema são caracterizadas por uma fragilidade na barreira hemato-encefálica, sendo assim, estruturas do SNC próximas, tais como o núcleo arqueado do hipotálamo (ARC) e o núcleo do trato solitário (NTS), respectivamente, estão suscetíveis às influências de fatores circulantes (Chaptini e Peikin, 2008). Entre os mais extensivamente estudados encontra-se a insulina, a leptina, a colecistocinina (CCK), o polipeptídeo pancreático (PP), o peptídeo YY (PYY), o peptídeo semelhante ao glucagon-1 (GLP-1), a oxintomodulina (OXM) e a grelina. Exceto a grelina, todos os demais hormônios atuam no aumento da saciedade e na

redução da ingestão de alimentos. Além destes, outros peptídeos e hormônios modulam a regulação da ingestão de alimento, conforme descrito no Quadro 1.

Quadro 1. Efeitos de peptídeos e hormônios sobre a ingestão de alimentos (Adaptado de

Schwartz et al., 2000; Morton et al., 2006; Meister, 2007).

Anorexígeno Orexígeno

Colecistocinina (CCK) Cortisol Hormônio estimulante de α-melanócito

(α-MSH)

Endorfinas

Hormônio liberador de corticotropina (CRH)

Galanina

Insulina e leptina Grelina

Oxintomodulina (OXM) Hormônio concentrador de melanina (MCH) Peptídeo semelhante ao glucagon-1

(GLP-1)

Neuropeptídeo Y (NPY)

Peptídeo YY (PYY) Orexinas A e B

Transcrito regulado pela cocaína e anfetamina (CART)

Proteína relacionada ao agouti (AgRP)

1.1. Regulação central da ingestão de alimento

As principais regiões encefálicas envolvidas na regulação da ingestão de alimento são o hipotálamo e o tronco encefálico (Murphy e Bloom, 2006). O hipotálamo foi um dos primeiros locais do SNC a ser envolvido na regulação da ingestão de alimento. Esta região do SNC também está intimamente associada com a regulação de funções orgânicas básicas, tais como a sede, a reprodução, a temperatura e o balanço hormonal.

O hipotálamo é constituído, histologicamente, por mais de 40 distintas áreas e núcleos, que podem ser divididas em diferentes núcleos e áreas. As áreas e núcleos hipotalâmicos envolvidos na regulação da ingestão de alimento e do balanço energético

incluem o ARC, o núcleo paraventricular (PVN), o núcleo ventromedial (VMN) e o núcleo dorsomedial (DMN) e as áreas hipotalâmica lateral (AHL) e perifornical (APF) (Schwartz et al., 2000; Morton et al., 2006; Murphy e Bloom, 2006; Meister, 2007;

Simpson et al., 2009). Na porção anterior do hipotálamo anterior está localizado o PVN e na porção médio-basal do hipotálamo estão localizados os núcleos ARC, o VMN, o DMN e as áreas AHL e APF.

Inicialmente, vários experimentos com a utilização de lesões e estimulações de núcleos hipotalâmicos, sugeriram o papel de centro da saciedade ao VMN e de centro da fome à AHL (Stellar, 1954). Posteriormente, outros trabalhos mostraram que lesões de vários núcleos hipotalâmicos médio-basais resultavam em roedores obesos, diminuição da atividade física e distúrbios neuroendócrinos. A destruição do ARC após administração sistêmica de glutamato monossódico em ratos produzia hiperfagia e obesidade (Olney, 1969), enquanto lesões do VMN resultavam também no aumento da ingestão de alimento e do peso corporal (Debons et al., 1977). Da mesma forma, lesões situadas em núcleo anterior do hipotálamo (PVN) igualmente conduziam a hiperfagia e ganho de peso corporal em roedores (Olney, 1969).

Ao longo das últimas duas décadas, importantes avanços foram feitos para esclarecer as vias neuronais, os mediadores químicos e os mecanismos de transdução de sinais intracelulares ou extracelulares que contribuem para o processo de regulação da ingestão de alimento e do balanço energético no hipotálamo (Stanley et al., 2005; Morton et al., 2006; Simpson et al., 2009). Embora muitas outras áreas cerebrais envolvidas na regulação da ingestão de alimento sejam pesquisadas, sabe-se que, no hipotálamo, o ARC desempenha um papel integrador na regulação homeostática da ingestão de alimento, recebendo sinais da periferia (via tronco encefálico e barreira hemato-encefálica) (Broadwell e Brightman 1976; Niswender e Schwartz, 2003; Small

e Bloom, 2004). Alguns hormônios gastrintestinais, pancreáticos e do tecido adiposo são transportados pela barreira hemato-encefálica para os neurônios do ARC, tais como: insulina (Banks, 2004), leptina (Banks et al., 1996), grelina, CCK, OXM e PYY (Kastin et al., 2002; Nonaka et al., 2003). Esses peptídeos e hormônios modulam a atividade dos neurônios do ARC, que projetam eferências para outros núcleos hipotalâmicos, como o PVN, a AHL e o VMN, onde ocorreria a liberação de mais peptídeos orexígenos ou anorexígenos para modular a ingestão de alimento e o balanço energético (Figura 1) (Schwartz et al., 2000; Stanley et al., 2005; Berthoud, 2007; Valassi et al., 2008; Chaptini e Peikin, 2008; Simpson et al., 2009).

Figura 1. Principais núcleos hipotalâmicos, neuropeptídeos e vias envolvidos na regulação da

ingestão do alimento. Os peptídeos e hormônios circulantes (grelina, leptina, insulina, PYY, OXM, GLP-1, CCK) agem diretamente no ARC provocando alterações nos circuitos peptidérgicos que modulam o controle da ingestão de alimento. No ARC existem neurônios que co-expressam NPY/AgRP (orexígeno) e outros que co-expressam POMC/CART (anorexígenos) e os circuitos neuronais dessas regiões hipotalâmicas utilizam receptores e neuropeptídeos específicos, como por exemplo, o hormônio liberador da corticotropina (CRH), o hormônio liberador da tireotropina (TRH), o fator neutrófico derivado do encéfalo (BDNF), a orexina, o hormônio concentrador de melanina (MCH), o NPY, a AgRP, a POMC, o CART e os endocanabinóides e o receptor endocanabinóide do tipo 1 (CB-1) (adaptado de Simpson et al., 2009).

Além disso, o ARC contém ao menos dois grupos neuronais que apresentam ações opostas relacionadas à ingestão de alimento. Um grupo de neurônios expressa peptídeos relacionados com a inibição da ingestão de alimento, co-expressando o transcrito regulado pela cocaína e anfetamina (CART) e o hormônio estimulante do α-melanócito (α-MSH, derivado da pró-opiomelanocortina – POMC) (Elias et al., 1998a; 1998b; Kristensen et al., 1998). Estes neurônios projetam uma ampla rede de eferências dentro do SNC e do próprio hipotálamo (AHL, APF, PVN e DMN) (Elias et al., 1998b; Elmquist et al., 1998; Kalra et al., 1999).

Outro grupo neuronal expressa peptídeos associados ao aumento do consumo de alimento, como o neuropeptídeo Y (NPY) e a proteína relacionada ao agouti (AgRP) (Chen et al., 1999; Cone et al., 2001; Cowley et al., 2001). Estes neurônios projetam eferências, principalmente, ao PVN ipsilateral e também localmente, dentro do ARC (Bai et al., 1985). Os neurônios do ARC que expressam NPY, quando ativados, liberam localmente GABA, para inibir os neurônios que expressam POMC. Este grupo neuronal parece ser o principal alvo das ações de diversos hormônios que regulam a ingestão de alimento, incluindo a insulina, leptina, grelina e CCK (Jobst et al., 2004). Sendo assim, o ARC parece ser o local de convergência de muitos dos sinais centrais e periféricos que regulam o balanço energético do organismo (Figura 1) (Schwartz et al., 2000; Erlanson-Albertsson, 2005; Stanley et al., 2005; Valassi et al., 2008; Chaptini e Peikin, 2008, Simpson et al., 2009).

Outras regiões hipotalâmicas envolvidas na regulação da ingestão de alimento são as AHL e APF. Na verdade, a APF é uma das áreas mais sensíveis para ação do NPY induzir a alimentação, mais do que o PVN (Stanley et al., 1993). As AHL e APF contêm neurônios que expressam hormônio concentrador de melanina (MCH) (Marsh et al., 2002). Nestas áreas, a expressão de MCH é regulada pelo estado nutricional do

animal, uma vez que o jejum em ratos desencadeia um aumento na expressão de ácido ribonucléico mensageiro (RNAm) para MCH. A injeção repetida via intracerebroventricular (i.c.v.) de MCH na AHL provoca uma resposta hiperfágica (Qu et al., 1996) e determina um aumento do tecido adiposo em ratos (Marsh et al., 2002). Inversamente, a administração de antagonista de receptor MCH-1 na AHL de ratos desencadeia uma inibição da ingestão de alimento e a administração crônica leva a uma redução sustentada no peso corporal dos animais estudados (Borowsky et al., 2002). O excesso de expressão de pré-pró-MCH resulta em camundongos que apresentam hiperfagia e obesidade (Marsh et al., 2002), enquanto camundongos que não expressam MCH exibem maior gasto energético, redução plasmática de leptina e redução na expressão de POMC no ARC e, consequentemente, apresentam hipofagia e são extremamente magros (Shimada et al., 1998; Marsh et al., 2002). Os camundongos que apresentam depleção de MCH e leptina têm reduzido ganho de peso e tecido adiposo comparados com camundongos ob/ob (deficientes de leptina) (Segal-Lieberman et al., 2003). Esse fato é sugestivo de que o MCH pode ser um mediador do mecanismo de ação da leptina e da POMC na regulação da ingestão de alimento e do balanço energético nesta região hipotalâmica.

As AHL/APF também exibem neurônios que expressam pré-pró-orexina e o peptídeo liberador de orexinas A e B (ou hipocretinas 1 e 2). Estudos imunorreativos na AHL/APF mostram que populações neuronais que expressam orexina são diferentes daquelas que expressam MCH (De Lecea et al., 1998; Sakurai et al., 1998). Os neurônios que expressam orexinas projetam uma ampla rede de eferências no SNC, incluindo o ARC, PVN, NTS e o núcleo motor dorsal do vago (De Lecea et al., 1998; Peyron et al., 1998). A orexina A tem uma alta afinidade para os receptores orexina-1, que são altamente expressos no VMN. As orexinas A e B apresentam semelhantes

afinidades para os receptores orexina-2, e, estes, são expressos principalmente no PVN (Sakurai et al., 1998). A síntese de RNAm da pré-pró-orexina é estimulada pelo jejum e a administração i.c.v. de orexina em camundongos desencadeia uma resposta hiperfágica (Sakurai et al., 1998; Hagan et al., 1999; Haynes et al., 1999). Em modelos experimentais que utilizam a privação alimentar em roedores, a orexina parece mediar a resposta hiperfágica e o comportamento de procura de alimentos. É possível que a orexina também possa agir como um regulador periférico do balanço energético, uma vez que neurônios que expressam orexinas foram encontrados no TGI. Esses mesmos neurônios expressam receptores para orexina e leptina e, esses receptores, parecem ser ativados por estado de inanição (Kirchgessner e Lin, 1999).

Estudos imunohistoquímicos mostraram a presença de NPY, AgRP, e α-MSH em terminações neuronais na AHL que estão em contato com neurônios que expressam MCH e orexina (Broberger et al., 1998; Elias et al., 1998b; Horvath et al., 1999). Os neurônios da AHL que expressam orexina apresentam receptores para NPY (Campbell et al., 2003) e para leptina (Horvath et al., 1999) e, portanto, são capazes de integrar suas ações. Além disso, um grande número de neurônios sensíveis à glicose está presente na AHL (Bernardis e Bellinger, 1996), e os neurônios que expressam orexina podem desempenhar, também, um papel neste processo regulatório. Já foi descrito que a hipoglicemia aumenta a expressão de RNAm para a orexina e de c-fos (proto-ocncogene de ativação imediata; pertencente da família Fos) na AHL (Cai et al., 1999; Moriguchi et al., 1999). Os mecanismos, pelos quais, os neurônios que expressam MCH e orexina influenciam a ingestão de alimento e o balanço energético, continuam a ser estudados.

O PVN atua na integração de sinais neuropeptidérgicos, oriundos de diversas regiões encefálicas, incluindo o ARC e tronco encefálico (Sawchenko e Swanson, 1983). Em mamíferos, o PVN interage com três sistemas efetores: o endócrino, o

autonômico e o comportamental (Berthoud, 2007). É um centro integrador, no qual convergem muitas vias neurais que influenciam a ingestão de alimento e o balanço energético. É ricamente suprido por projeções neuronais que expressam NPY/AGRP e POMC/CART, vindas do ARC e projeções de neurônios que expressam orexina, vindas da AHL (Elmquist et al., 1998). Muitas aferências chegam ao PVN oriundas do tronco encefálico, córtex cerebral e áreas límbicas (ter Horst e Luiten, 1986). É rico em terminais contendo numerosos neurotransmissores e neuropeptídeos, incluindo NPY, α-MSH, serotonina, galanina, noradrenalina e peptídeos opióides. O hormônio liberador de corticotropina (CRH) é expresso por neurônios no PVN que se projetam à eminência mediana (ARC) (Sarkar e Lechan, 2003) e podem inibir os neurônios que expressam NPY oriundos do ARC. A administração de agonistas da melanocortina no PVN de ratos, potencialmente, inibe a ingestão alimentar (Giraudo et al., 1998; Kim et al., 2000). Inversamente, a injeção de um antagonista de melanocortina no PVN de ratos estimula a ingestão alimentar (Giraudo et al., 1998). Registros eletrofisiológicas de neurônios do PVN têm demonstrado que neurônios expressando POMC do ARC inibem a sinalização inibitória GABAérgica dentro do PVN e, assim, reduzem a ingestão alimentar. Ao contrário, neurônios que expressam NPY/AgRP do ARC inibem esta sinalização GABAérgica (Cowley et al., 1999) e estimulam a ingestão alimentar. Recentes estudos sugerem que os neuropeptídeos que regulam a ingestão de alimento podem ter uma via de sinalização comum no PVN envolvendo uma proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK). Farmacologicamente, o aumento da atividade da MAPK no PVN desencadeia um aumento no consumo de alimento em ratos (Anderson et al., 2004). Muitos peptídeos e hormônios anorexígenos, tais como leptina, insulina, e os agonistas da melanocortina reduzem a atividade da MAPK, que regulam a expressão

gênica no ARC e no PVN, enquanto substâncias orexígenas, como AgRP e grelina, aumentam a atividade da MAPK (Anderson et al., 2004; Minokoshi et al., 2004).

Muitos neuropeptídeos que modulam o apetite também influenciam a função endócrina, por exemplo, a função tireoidiana e, consequentemente, o balanço energético. O PVN desempenha um importante papel na integração destas funções. As projeções dos neurônios que expressam NPY/AgRP e de melanocortina, a partir do ARC para o PVN, terminam em neurônios que expressam hormônio liberador de tireotropina (TRH) (Legradi e Lechan, 1999; Fekete et al., 2000). É descrito que o NPY e a AgRP inibem a expressão de pró-TRH (Fekete et al., 2002), enquanto o α-MSH estimula a expressão de pró-TRH e inibe a supressão de TRH induzido pelo jejum (Fekete et al., 2000). O PVN também contém neurônios que expressam CRH e as projeções de neurônios que contêm NPY do ARC influenciam a expressão e a liberação de CRH do PVN, desta forma modulando também o balanço energético (Sarkar e Lechan, 2003).

O VMN em mamíferos é um grande núcleo hipotalâmico e foi considerado, por muito tempo, desempenhar um importante papel na regulação da ingestão de alimento e do balanço energético, desde a constatação de que lesões bilaterais no VMN induziam resposta hiperfágica e aumento do tecido adiposo em ratos (Debons et al., 1977). Esse núcleo apresenta conexões diretas com o PVN, a AHL e o DMN (Guan et al., 1998). O VMN recebe projeções de neurônios do ARC que expressam NPY/AgRP e α-MSH e, por sua vez, projetam eferências para outros núcleos hipotalâmicos (AHL e DMN) e para regiões do tronco encefálico (NTS). Adicionalmente, recebe aferências provenientes do tronco encefálico (núcleo parabraquial e NTS) e da amígdala ( Huang et al., 2003). A expressão de neuropeptídeos no VMN é modulada pelo estado nutricional. Os animais submetidos à privação alimentar apresentam elevada produção

de peptídeos orexígenos (Guan et al., 1998) e aumento na expressão de receptores MC-4 no VMN de ratos modificados geneticamente para obesidade (Huang et al., 2003). O fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) é altamente expresso no VMN. A expressão de BDNF no VMN é regulada pela privação de alimento e após a administração de agonistas de melanocortina em camundongos (Xu et al., 2003). Camundongos com expressão reduzida de receptor para BDNF ou redução de expressão de BDNF, apresentam um aumento na ingestão alimentar e no peso corporal (Rios et al., 2001; Xu et al., 2003). Portanto, os neurônios que expressam BDNF no VMN podem atuar como uma via adicional na regulação da ingestão de alimento e do balanço energético através da modulação do sistema de melanocortinas.

Existem evidências que o DMN apresenta um papel na modulação da ingestão de alimento. A destruição do DMN em ratos resulta em hiperfagia e obesidade, embora menos acentuadamente quando comparada à destruição do VMN (Bernardis e Bellinger, 1987). A injeção de aminoácidos ou de peptídeos orexígenos, tais como, NPY, galanina e ácido gama-aminobutírico (GABA) no DMN de ratos desencadeia um aumento na ingestão alimentar (Kelly et al., 1979; Stanley et al., 1985; Kyrkouli et al., 1990). O DMN apresenta extensas conexões com outros núcleos hipotalâmicos. Ele recebe aferências de neurônios do ARC que expressam NPY/AgRP (Kalra et al., 1999) e contêm neurônios que expressam NPY. Estudos imunorreativos no DMN de ratos mostram que existe uma estreita proximidade de fibras que expressam α-MSH com aquelas que expressam NPY (Kalra et al., 1999). A administração de agonistas da melanocortina no DMN de ratos determina uma redução na expressão de NPY e desencadeia uma resposta hiperfágica nos animais estudados (Chen et al., 2004).

Atualmente, já está bem estabelecido que os diferentes núcleos hipotalâmicos sejam regulados por diferentes circuitos neuronais que utilizam neuropeptídeos

específicos, neurotransmissores não peptidérgicos ou hormônios e, que, conjuntamente participam na regulação central da ingestão de alimento. Sendo assim, no hipotálamo, ao menos 25 substâncias têm sido identificadas como participantes na regulação do comportamento ingestivo. Entre eles, algumas aminas: serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT), noradrenalina, dopamina, histamina e alguns aminoácidos: ácido glutâmico (glutamato), GABA (Kalra et al., 1999).

1.2. Serotonina e ingestão de alimento

A 5-HT tem sido implicada em muitas funções mediadas pelo SNC que incluem atividade motora, resposta ao stress, sono e comportamento alimentar (Dourish, 1985; Blundell 1986; Simansky, 1996; Rueter et al., 1997; Bickerdike et al., 1999). Na maioria das espécies de vertebrados, a ativação central de sistemas serotoninérgicos parece suprimir a alimentação (Dourish, 1985; Blundell 1986; Simansky, 1996).

A 5-HT tem um papel inibitório na modulação da ingestão de alimento (Blundell, 1986; Leibowitz e Alexander, 1988; Simansky, 1996; Halford et al., 1998). Em mamíferos tem sido demonstrado que a redução da neurotransmissão serotoninérgica estimula a ingestão de alimentos, enquanto que o aumento na liberação de 5-HT central induz hipofagia (Blundell, 1986; Simansky, 1996). O efeito hipofágico da 5-HT e de seus agonistas parece ser mediado por diversos subtipos de receptores pós-sinápticos localizados em circuitos hipotalâmicos (Bovetto e Richard, 1995).

Durante anos, o agente mais utilizado em estudos de supressão serotoninérgica da alimentação foi a fenfluramina, que, juntamente com os estimulantes anfentamínicos, constituíram os principais componentes anorexígenos comercializados mundialmente (retirados do mercado há dez anos devido à indução de doença cardíaca valvar).

A fenfluramina desencadeia um aumento generalizado na neurotransmissão serotoninérgica, devido à estimulação da liberação sináptica de 5-HT e do bloqueio da recaptação de 5-HT nos terminais pré-sinápticos (Rowland e Carlton, 1986). Em ratos alimentados ad libitum, a fenfluramina provoca uma redução na quantidade de alimento ingerido e aumenta o intervalo entre o consumo alimentar (Blundell e Leshem, 1975; Grinker et al., 1980; Rowland e Carlton, 1986). Efeitos similares desencadeados pela administração de fenfluramina no comportamento alimentar foram também demonstrados em uma grande variedade de espécies de mamíferos, incluindo seres humanos (Rogers e Blundell, 1979; Foltin e Moran, 1989; McGuirk et al., 1991). Inversamente, os tratamentos que reduzem a neurotransmissão serotoninérgica, tais como as injeções i.c.v. de di-hidroxitriptamina e lesões de grupos neuronais de 5-HT localizados no NDR de roedores, desencadeiam uma hiperfagia crônica e ganho de peso (Geyer et al., 1976; Saller e Stricker, 1976).

Embora seja bem conhecido que as drogas serotoninérgicas com alta afinidade para um ou mais subtipos de receptores da família 5-HT1 e 5-HT2 possam afetar o comportamento ingestivo, o papel específico dos diversos subtipos (HT1A, HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E, 5-HT1F, 5-HT2A, 5-HT2B e 5-HT2C) no controle deste comportamento, assim como nos mecanismos comportamentais e neuroanatômicos que são a base dos efeitos hipofágicos destes compostos, ainda não são inteiramente compreendidos (Bovetto e Richard, 1995; De Vry e Schreiber, 2000).

Na literatura são descritos inúmeros relatos de estudos com drogas serotoninérgicas mostrando que a ativação de receptores 5-HT1B ou 5-HT2C reduz a ingestão alimentar (Quadro 2) (Kennet e Curzon, 1988; Samamin et al., 1989; Dourish,

1995; Halford e Blundell, 1996; Lee e Simansky, 1997; De Vry e Schreiber, 2000; Hewitt et al., 2000; Heisler et al., 2006).

Quadro 2. Efeitos da ativação de receptores 5-HT1B ou 5-HT2C sobre o consumo de alimento em roedores.

Ativação receptor Alimento Animais/via/estado nutricional Autores

5-HT1B Redução Ratos/ip/jejum Kennet e Curzon, 1988

Camundongo/ip/saciados Halford e Blundell, 1996

Ratos/ip/jejum Lee e Simansky, 1997

5-HT2C Redução Ratos/ip/saciados Samamin et al., 1989

5-HT1B e 5-HT2C Redução Ratos/ip/icv/saciados De Vry e Schreiber, 2000

Camundongo/ip/saciados Hewitt et al., 2002

Por outro lado, a ativação de receptores 5-HT1A pode causar hiperfagia (Dourish et al., 1985; 1988; Gilbert e Dourish, 1987; Ebenezer, 1992; Currie e Coscina, 1993; Coscina et al., 1994; Parker e Coscina, 2001; Ebenezer e Surujbally, 2007) ou redução na ingestão de alimento (Quadro 3) (Ebenezer, 1992; Ebenezer et al., 1999; Arkle e Ebenezer, 2000; Coscina et al., 2000; Ebenezer et al., 2001; Ebenezer e Tite, 2003; Ebenezer et al., 2007; López-Alonso et al., 2007). Estes efeitos ingestivos parecem ser mediados primariamente por ativação de receptores 5-HT1A, 5-HT1B e 5-HT2C presentes no NMR, no complexo amigdalóide ou no hipotálamo (Hutson et al., 1986; Fletcher e Davies, 1990; Leibowitz et al., 1990; Currie e Coscina, 1993; Coscina et al., 2000; De Vry e Schreiber, 2000; Parker e Coscina, 2001; Parker et al., 2001; Collin et al., 2002; Heisler et al., 2002; 2006).

O efeito hiperfágico das injeções sistêmicas ou i.c.v. de metergolina, em ratos com livre acesso ao alimento, tem sido interpretado como sugestivo da presença de uma ação serotoninérgica tônica inibitória sobre circuitos de regulação central da ingestão de

alimento (Fletcher, 1988; Stallone e Nicolaidis, 1989; Leibowitz et al., 1993; Coscina et al., 1994; Currie e Coscina, 1996).

Quadro 3. Efeitos da ativação de receptores 5-HT1A sobre o consumo de alimento em roedores.

Ativação receptor Alimento Animais/via/estado nutricional Autores

5-HT1A Aumento

Ratos/ip/saciados Dourish et al., 1985

Ratos/sc/saciados Gilbert e Dourish, 1987

Ratos/sc/saciados Dourish et al., 1988

Ratos/NDR/NMR/saciados Currie e Coscina, 1993

Ratos/pBLA/saciados Coscina et al., 2000

Ratos/pBLA/saciados Parker e Coscina, 2001

Camundongo/sc/saciados Ebenezer e Surujbally, 2007

5-HT1A Redução

Porcos/iv/jejum Ebenezer et al., 1999

Ratos/sc/jejum Arkle e Ebenezer, 2000

Porcos/iv/jejum Ebenezer et al., 2001

Ratos/ip/jejum Ebenezer e Tite, 2003

Ratos/sc/jejum Ebenezer et al., 2007

Ratos/PVN/jejum López-Alonso et al., 2007

A região posterior da amígdala basolateral (pBLA) é um local aonde terminações serotoninérgicas podem exercer uma influência inibitória tônica, uma vez que lesões em áreas posteriores e dorsais da amígdala atenuam a ingestão de alimento desencadeada pela injeção de 8-OH-DPAT (agonista de receptor 5-HT1A e 5-HT7) e lesões restritas à pBLA bloqueiam completamente a resposta hiperfágica induzida pela injeção de 8-OH-DPAT nesta região (Coscina et al., 1994; Parker e Coscina, 2001). Adicionalmente, a injeção de MET na região pBLA desencadeia uma resposta hiperfágica (Parker et al., 2001).

O PVN do hipotálamo também parece estar envolvido nos efeitos hipofágicos induzidos pela 5-HT. A infusão direta de 5-HT, de vários agonistas de receptores serotoninérgicos ou de inibidores da recaptação de 5-HT no PVN, suprime a ingestão alimentar desencadeada por diferentes modelos experimentais (Leibowitz et al., 1990; Fletcher e Coscina, 1993; Grignaschi et al., 1995; Currie e Coscina, 1996; Mancilla-Diaz et al., 2005; Lopez-Alonso et al., 2007). Enquanto a injeção de MET no PVN inibe a resposta hipofágica desencadeada pela injeção de 5-HT no PVN (Currie e Coscina, 1996). No entanto, somente injeções de MET no PVN não afetam o consumo de ração granulada em ratos com livre acesso ao alimento (Leibowitz et al., 1993; Coscina et al., 2000), sugerindo que os impulsos neurais serotoninérgicos sobre o PVN parecem exercer apenas efeitos fásicos (mas não tônicos) sobre o comportamento alimentar.

Uma atividade serotoninérgica no controle da ingestão de alimento também tem sido observada em outros núcleos hipotalâmicos, envolvidos na regulação do balanço energético tais como o ARC e AHL, que expressam neuropeptídeos orexígenos e anorexígenos (Schwartz et al., 1999; Voigt et al., 2000; Hikiji et al., 2004; Heisler et al., 2002; 2006). Existe uma intensa projeção de fibras serotoninérgicas dos NMR e NDR ao ARC e ao PVN, e há uma grande expressão de receptores 5-HT2A no PVN e 5-HT2C no ARC (Gundlah et al., 1999; Heisler et al., 2006). A ativação de receptores 5-HT2C estimula neurônios do ARC que expressam POMC, o qual é peptídeo precursor do α-MSH (anorexígeno), enquanto que a ativação de receptores 5-HT1B do ARC inibe a atividade neuronal de neurônios que expressam AgRP (orexígeno) e reduz os sinais inibitórios pós-sinápticos sobre os neurônios que expressam a POMC. Esse controle do sistema de melanocortinas pode representar um importante mecanismo, pelo qual a 5-HT reduz a ingestão de alimento (Heisler et al., 2002; 2006). A abrangência de

influências serotoninérgicas sobre outras regiões hipotalâmicas, diferente do PVN, se estão relacionadas à atividade fásica ou tônica ainda é desconhecida e precisa ser determinada.

A influência de circuitos serotoninérgicos sobre neurônios hipotalâmicos relacionados à ingestão de alimento, também pode ser mediada por receptores 5-HT1A. Existe uma grande densidade destes receptores em neurônios localizados no núcleo supra-óptico, PVN, VMH, assim como no ARC e AHL (Collin et al., 2002). Neste mesmo estudo, Collin e seus colaboradores também mostraram que existe intensa imunorreatividade para receptores 5-HT1A em neurônios que expressam neuropeptídeos orexígenos (NPY e AgRP) e neuropeptídeos anorexígenos (POMC e CART) no ARC. Na AHL, a imunorreatividade para receptor 5-HT1A foi observada em neurônios que expressam neuropeptídeos orexígenos, tais como o MCH e orexina. Sugerindo, assim, uma importante ação de atividade serotoninérgica, mediada por receptores 5-HT1A, nestes neurônios peptidérgicos localizados no ARC e na AHL. Como a imunorreatividade para 5-HT1A nunca foi identificada em fibras neuronais ou terminações neuronais (Collin et al., 2002), parece que o controle da liberação de neuropeptídeos por 5-HT possa ser mediado por receptores pós-sinápticos 5-HT1A. Não foi encontrado na literatura, estudos funcionais sobre a possível participação destes receptores nos mecanismos de controle da ingestão de alimentos no ARC e na AHL.

1.4. Influência do ciclo ovariano na ingestão alimentar

Existem poucas diferenças sexuais no comportamento alimentar entre ratos, camundongos e seres humanos. A quantidade de alimento ingerido e o número de refeições são semelhantes entre animais machos e fêmeas. Porém, existe uma evidente diferença sexual no comportamento alimentar em ratos, camundongos e seres humanos: as fêmeas, ciclicamente, ingerem menor quantidade de alimento durante a fase

peri-ovulatória do ciclo ovariano (estro em ratos e camundongos) que nas outras fases do ciclo ovariano (Geary 2001a; b).

Os ratos e camundongos fêmeas têm ciclos ovarianos de 4-5 dias e a ingestão alimentar é de até 25% menor durante a noite em que ocorre a ovulação e estro, em comparação com outras noites do ciclo estral (cerca de 80-90% do consumo alimentar ocorre no período noturno em ratos e camundongos). Este efeito é mediado pelas alterações cíclicas na secreção de estradiol (Asarian e Geary, 2006). A concentração plasmática de estradiol é mais elevada imediatamente antes do pico do hormônio luteinizante e é muito baixa durante o estro. No entanto, em virtude da ativação de receptores estrogênicos estimularem fatores de transcrição (a maioria dos efeitos fisiológicos do estradiol tem uma latência de 12h ou mais), é perfeitamente plausível que a diminuição na ingestão alimentar na fase de estro em ratos e camundongos é causada pelo precedente aumento na secreção de estradiol (Asarian e Geary, 2002; 2006).

A realização de gonadectomia revela outras diferenças sexuais na regulação da ingestão de alimento em ratos e camundongos. Os animais fêmeas submetidos a ooforectomia apresentam maior ingestão de alimento e os machos, submetidos a orquiectomia, ingerem menor quantidade de alimento (Chai et al. 1999; Wallen et al. 2001). Importante ressaltar que, as duas alterações desencadeadas pela gonadectomia na ingestão alimentar são expressas de maneiras diferentes, nos machos ocorre redução na freqüência da ingestão de alimento e nas fêmeas ocorre um aumento na quantidade total de alimento ingerido (Chai et al. 1999; Asarian e Geary, 2002). Essas alterações na ingestão de alimento são totalmente revertidas pela administração de testosterona nos machos (Chai et al. 1999; Wallen et al. 2001) e de estradiol nas fêmeas (Wade 1972; Geary 2001a; b). Sendo assim, esses achados sugerem que influências do eixo

hipotalâmico-hipofisário-gonadal na regulação da ingestão de alimento envolvem dois componentes funcionais, uma inibição tônica revelada pelo aumento do consumo alimentar após a ooforectomia e uma inibição fásica ou cíclica revelada pela ausência de redução na ingestão alimentar na fase peri-ovulatória.

O estradiol tem sido demonstrado em vários estudos como inibidor do consumo

de alimento em várias espécies de animais (Geary et al., 1994; Geary e Asarian, 1999; Geary, 2001a; 2001b; Asarian e Geary, 2006; Roepke, 2009). O mecanismo pelo qual o estrógeno exerce o efeito hipofágico, ainda não está totalmente elucidado. Relatos da literatura demonstram que os neurônios serotoninérgicos apresentam alterações decorrentes da ação de esteróides ovarianos (Bethea et al., 1998). Tradicionalmente estes efeitos dos esteróides são atribuídos à ativação de receptores nucleares (McEwen, 2001). Em primatas não-humanos, os estrógenos, especificamente o estradiol, modulam várias funções homeostáticas através de fatores de transcrição via subtipos de receptores estrogênicos (RE): REα e REβ (Couse e Korach, 1999), estimulando a expressam da enzima triptofano hidroxilase nos neurônios serotoninérgicos localizados no diencéfalo, diminuindo a expressão do transportador de 5-HT na rafe mediana (Bethea et al., 1998) e diminuindo a expressão de receptores 5-HT2C nos núcleos hipotalâmicos (Gundlah et al., 1999). No quadro 4 estão relacionados os efeitos do estrogênio na expressão dos principais neuropeptídeos presentes no hipotálamo e na ingestão de alimento.

Em ratas, a regulação do comportamento alimentar por circuitos serotoninérgicos, também parece ser influenciada por alterações fisiológicas na concentração dos esteróides ovarianos que ocorrem durante o ciclo estral. Estes animais em fase de diestro apresentam efeitos hiperfágicos mais significativos após a injeção sistêmica de 8-OH-DPAT que em fase de estro (Uphouse et al., 1991).

Quadro 4. Efeitos do estrogênio sobre a ingestão de alimento e sobre a expressão de peptídeos

orexígenos e anorexígenos em núcleos hipotalâmicos de roedores (adaptado de Roepke, 2009).

Núcleo Peptídeo Regulação pelo estrogênio Efeito na ingestão alimento

ARC POMC/α-MSH + - CART ND - NP Y - + AgRP - + VMN BDNF NR - NPY - + DMN NPY - + CART ND - AHL MCH - + Orexina ? + CART ND - PVN CRF +/- - TRH ND - NPY - - CART ND - BDNF ND -

Abreviaturas: NR: não regulação; ND: não determinado; (+) efeito ou regulação positiva; (-) efeito ou regulação negativa e (?) efeitos mistos.

Além disso, a injeção de MET na região posterior da amígdala basolateral afeta diferentemente o consumo de alimento em diferentes fases do ciclo estral, sendo os efeitos hiperfágicos dessas injeções mais evidentes em ratas fêmeas na fase de diestro que em estro (Parker et al., 2002). Neste mesmo sentido, foi demonstrado que os efeitos anoréticos da fenfluramina são mais intensos em ratas no estro que em diestro, e que a

resposta hipofágica induzida pela fenfluramina é intensificada pelo tratamento com estrogênios em ratas ooforectomizadas (Eckel et al., 2005, Rivera e Eckel, 2005).

Adicionalmente, o tratamento com estrogênio reduz a resposta hiperfágica induzida pela 8-OH-DPAT em ratas ooforectomizadas (Salamanca e Uphouse, 1992). É notável que drogas serotoninérgicas (inibidores seletivos da recaptação de serotonina) e o estradiol são eficazes em aliviar sintomas climatéricos em mulheres (Stearns e Hayes, 2002) e que o estradiol e a 5-HT, através de RE e receptores serotoninérgicos do subtipo 5-HT2C, respectivamente, atuem sinergicamente na regulação do metabolismo energético em adolescentes do sexo feminino (Fuemmeler et al., 2008). Consequentemente, compreender as ações dos hormônios esteróides e da 5-HT sobre os neurônios hipotalâmicos poderá fornecer novos dados sobre as diferenças funcionais na regulação da ingestão alimentar e do balanço energético exercido pelo hipotálamo nos animais machos e fêmeas.

O projeto utilizado como base para esta tese de doutorado, representa a continuidade de uma linha de pesquisa em andamento em nosso laboratório que investiga o controle neural do metabolismo e estuda a participação de circuitos glutamatérgicos (Da Silva et al., 2003; Da Silva et al., 2006; Lopes et al., 2007; da Cunha et al., 2008) catecolaminérgicos (Sabi et al., 2002; Maidel et al., 2007; dos Santos et al., 2009) e serotoninérgicos (Steffens et al., 1997; Da Silva et al., 2004; Häckl et al., 2005; Da Silva et al., 2007; Steffens et al., 2008) no controle da ingestão de alimento em aves e mamíferos. Sobre a participação do sistema serotoninérgico na regulação da ingestão de alimento, em 1997, investigamos o efeito da administração central de serotonina (5-HT) em pombos (Columbia lívia), no qual encontramos que a injeção i.c.v. de 5-HT e de 8-OH-DPAT (agonista de receptores 5-HT1A e 5-HT7) desencadeava uma resposta dipsogênica e hipofágica (Steffens et al., 1997). Da Silva et

al., em 2004 mostraram que a injeção i.c.v. de 8-OH-DPAT em pombos desencadeava um efeito lipolítico e dipsogênico e a administração i.c.v. de GR 46611 (agonista de receptores 5-HT1B/1D) provocava uma resposta hipofágica, lipólise e hiperglicemia nas aves estudadas. Em seguida, foi examinado em pombos o comportamento alimentar após a administração de metergolina (antagonista de receptores 5-HT1 e 5-HT2) e de GR 46611 no PVN, na área póstero-medial do hipotálamo e no núcleo pré-óptico (Da Silva et al., 2007). Os resultados desse estudo mostraram que a injeção de metergolina e de GR 46611 desencadeava uma resposta hiperfágica, demonstrando, assim, que existe uma influência inibitória tônica serotoninérgica sobre a ingestão de alimento nestas áreas hipotalâmicas e sugerindo que esses circuitos serotoninérgicos, possivelmente sejam mediatos por receptores 5-HT1B/1D. Posteriormente, sabendo-se da existência de receptores 5-HT1 e 5-HT2 no ARC e na AHL de ratos, decidiu-se iniciar o projeto de pesquisa intitulado: modulação serotoninérgica do comportamento ingestivo em ratos fêmeas em diferentes fases do ciclo estral, com o objetivo de localizar no hipotálamo a presença de uma influência inibitória tônica serotoninérgica sobre a ingestão de alimento, através da injeção de metergolina e de 8-OH-DPAT, administrada em ratos fêmeas nas diferentes fases do ciclo estral, uma vez que hormônios esteróides ovarianos também modificam as respostas dos neurônios serotoninérgicos.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos gerais

Este trabalho teve com objetivo geral examinar a presença de uma influência inibitória tônica da serotonina sobre neurônios do núcleo arqueado do hipotálamo (ARC) ou da área hipotalâmica lateral (AHL) e os efeitos da ativação dos receptores 5-HT1A do ARC ou da AHL sobre a ingestão de alimento, assim como a possível influência dos hormônios ovarianos sobre esses receptores serotoninérgicos.

2.2. Objetivos específicos

2.2.1. Avaliar os efeitos da injeção de metergolina no ARC e na AHL sobre a

ingestão de alimento em fase de estro e dietro de ratas.

2.2.2. Avaliar os efeitos da injeção de 8-OH-DPAT no ARC e na AHL sobre a

ingestão de alimento em fase de estro e diestro de ratas.

2.2.3. Avaliar os efeitos da injeção de 8-OH-DPAT no ARC e na AHL sobre a

ingestão de alimento em fase de estro e diestro de ratas pré-tratadas com WAY 100635.

2.2.4. Determinar se existe diferença no consumo de alimentos nas diferentes

fases do ciclo estral e entre os diferentes tratamentos efetuados.

2.2.5. Avaliar possíveis alterações na ingestão de água (quantidade ingerida,

duração e latência para iniciar a resposta de consumo), bem como as durações e latências para iniciar os comportamentos não ingestivos (exploração vertical, auto-limpeza, locomoção e imobilidade).

3. MATERIAS E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Santa Catarina (CEUA-UFSC), protocolo de pesquisa número 372/CEUA e 23080.007968/2003-71. Todos os procedimentos experimentais aqui realizados estavam em acordo com os princípios éticos de experimentação animal, postulados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.

3.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar adultos (Rattus norvegicus), fêmeas, com peso corporal variando entre 200 a 230 gramas, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina. Os animais foram adaptados durante sete dias em uma sala com temperatura controlada entre 22 a 25°C e um ciclo claro-escuro de 12h (luz das 7h00 às 19h00). As ratas foram mantidas em caixas polipropileno (49 x 34 x 16cm), forradas com maravalha, dispondo de água e ração granulada (CR-1, Nuvilab - Nuvital Nutrientes, Brasil). Composição de macronutrientes em 100 gramas de ração: Carboidratos (56g), Proteína (22g), Gordura (4,5g) e fibras (4,92g) ad libitum. Durante esse período os animais foram manipulados somente durante a limpeza das caixas (a cada dois dias).

3.2. Cirurgia estereotáxica

Previamente ao ato cirúrgico, cada rata foi anestesiada com solução de cloridrato de cetamina (100mg/kg) e cloridrato de xilazina (20mg/kg), ambas do laboratório König S.A., administradas por via intraperitoneal (i.p.). Em seguida, o animal foi colocado no aparelho estereotáxico (David Kopf Instruments, Califórnia, EUA). Após a assepsia com álcool iodado, uma incisão longitudinal de aproximadamente 1cm foi realizada no escalpo com bisturi, seguida por ressecção com

tesoura; de forma a expor a calota craniana. A calota craniana foi exposta pela ressecção do periósteo e seca com algodão cirúrgico, com o objetivo de melhorar a adesão do acrílico. Em seguida, foi marcada a posição para a perfuração e implantação da cânula-guia, de acordo com as coordenadas descritas por Paxinos e Watson (2007). Para o núcleo arqueado (ARC): plano frontal (posterior bregma) -3,6mm, plano sagital (lateral à sutura sagital) 0,2mm e plano horizontal (abaixo da calota craniana) -7,8mm. Para a área hipotalâmica lateral (AHL): plano frontal (posterior bregma) -3,6mm, plano sagital (lateral à sutura sagital) 1,5mm e plano horizontal (abaixo da calota craniana) -7,2mm.

As cânulas-guias (0,6mm de diâmetro externo e 18mm de comprimento) foram confeccionadas a partir de agulhas injetoras hipodérmicas de 23G (Becton Dickinson indústria cirúrgica – Brasil), sendo que a ponta desta cânula foi posicionada a 2mm acima do ARC ou da AHL. Na posição previamente determinada, foi realizado um orifício na calota craniana com aproximadamente 1mm de diâmetro, por intermédio de uma broca esférica de uso odontológico. A cânula-guia foi introduzida e ancorada à calota craniana, juntamente com um parafuso inoxidável de joalheiro contra-lateral e fixada com acrílico polimerizável líquido (monômero de metil metacrilato – Laboratório Dencril – Brasil) e pó acrílico (co-polímero metil metacrilato – Laboratório Artigos Odontológicos Clássicos Ltda. – Brasil); formando uma estrutura sólida capaz de resistir aos eventuais choques mecânicos com a caixa e a grade de proteção. Em cada cânula-guia foi ajustado um mandril de aço inoxidável para evitar sua obstrução. Imediatamente após o procedimento cirúrgico, cada animal retornou ao biotério onde foi mantido individualmente em caixas de polipropileno. Após um período de recuperação, que variou de cinco a sete dias, iniciaram-se os procedimentos experimentais.

3.3. Drogas administradas

Neste estudo as doses utilizadas foram baseadas em estudos prévios sobre efeitos da injeção central de 8-OH-DPAT (Dourish et al., 1985; Gilbert e Dourish, 1987; Dourish et al., 1988; Coscina et al., 2000; Häckl et al., 2005), de MET (Fletcher, 1988; Stallone e Nicolaidis, 1989; Coscina et al., 1994; Currie e Coscina, 1996; Da Silva et al., 2007) e de WAY 100635 (Mancilla-Diaz, 2005) efetivas em influenciar seletivamente o comportamento ingestivo e não ingestivo em ratos ou pombos. De acordo com o protocolo experimental, as seguintes drogas foram utilizadas:

3.3.1. Veículo (Veic): solução de ácido ascórbico 5% (estéril, livre de pirógenos,

pH 7,4) utilizada nos experimentos de controle e sendo também usada como diluente das demais drogas deste estudo.

3.3.2. Metergolina (MET): antagonista de receptores 5-HT1 e de 5-HT2 (Tocris Cookson Inc., Ellisville MO, EUA) nas doses de 2 e 20 nmol.

3.3.3. 8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)-tetralina (8-OH-DPAT): agonista de

receptores 5-HT1A e 5-HT7 (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA) nas doses de 0,6 e 6 nmol.

3.3.4. Maleato de ciclo hexano carboxamida

n-[2-[4-(2-metoxifenil)-1-piperazinil]etil]-n-(2-piridinil) (WAY 100635): antagonista seletivo de receptor 5-HT1A (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA) na dose de 37 nmol.

3.4. Administração das drogas

A administração de veículo ou das drogas foi realizada através de agulha injetora, confeccionada a partir de uma agulha gengival, 30G (Injecta produtos odontológicos – Brasil) medindo 20mm de comprimento, conectada por um tubo de

polietileno (PE 10) a uma microsseringa Hamilton de 1µL. Seu tamanho excedeu o da cânula-guia em 2mm. Com o objetivo de minimizar variações de pressão no parênquima, as soluções foram administradas no período de 1min, seguidos por mais 1min (de espera) para permitir uma melhor difusão da solução pelo parênquima neural. O PE 10 foi preenchido com água destilada e o deslocamento de uma bolha de ar no tubo foi utilizado para verificar se a droga foi realmente injetada. O volume injetado foi sempre constante de 0,2µL. A injeção das drogas foi realizada em animais despertos, a partir do décimo dia após a implantação da cânula-guia no ARC ou AHL.

3.5. Determinação da fase do ciclo estral

As amostras de epitélio vaginal foram obtidas diariamente entre 10h00 e 11h00 a partir do sétimo dia após o ato cirúrgico para implantação da cânula. Estas amostras foram coletadas com uma pipeta de plástico contendo 10µL de solução salina (NaCl 0,9%) inserida no intróito vaginal da rata. O fluído vaginal contido no interior desta pipeta foi colocado em lâminas de vidro. Para cada animal foi usada uma lâmina diferente. Esta lâmina foi observada sob luz de um microscópio óptico, com lentes objetivas de 10 e 40x. A fase do ciclo estral foi determinada, utilizando-se os critérios padrões adotados por Long e Evans (1922) e Freeman (2006). A fase de metaestro foi caracterizada por leucócitos interpostos com pequenos nichos de células vaginais cornificadas e anucleadas ou leucócitos interpostos com células epiteliais nucleadas. O diestro foi caracterizado por leucócitos interpostos com células epiteliais nucleadas. O proestro foi caracterizado por células epiteliais grandes, nucleadas, ausência de leucócitos e, ocasionalmente, presença de pequenos nichos de células vaginais cornificadas. O estro foi caracterizado por células epiteliais grandes e anucleadas e células vaginais escamosas cornificadas. As amostras de epitélio vaginal foram examinadas por dois observadores independentes para se caracterizar a fase do ciclo

estral. A fase de diestro é precedida por baixos níveis plasmáticos de estradiol e o estro é precedido por uma alta secreção de estradiol (Freeman, 2006), assim foram escolhidas essas duas fases do ciclo estral para conduzir este projeto de pesquisa. Uma outra razão para a escolha dessas fases é que as ratas comem menos durante o estro que em diestro (Eckel e Geary, 1999; Eckel et al., 2000, 2004, 2005; Geary, 2001; Asarian e Geary, 2006). Neste estudo todas as ratas utilizadas no experimento exibiam regularmente ciclo estral de 4-5 dias.

3.6. Procedimentos experimentais

3.6.1. Procedimento experimental I

Sete dias após a implantação da cânula-guia, os animais foram colocados dentro da caixa de registro comportamental, que continha em seu interior um recipiente de vidro (Placa de Petri, de 5cm de diâmetro) contendo 20g de ração enriquecida com sacarose 10% (Fletcher, 1988) e uma garrafa de vidro contendo 100mL de água. Essa garrafa possuía um bico de aço inoxidável que projetava para o interior da caixa de registro. Após o período de habituação nesse ambiente durante 1h/dia, por três dias consecutivos, suficiente para os animais atingirem a ingestão máxima e estável da dieta enriquecida com sacarose 10%, as ratas, portanto cânulas-guias na AHL durante o estro receberam uma injeção de veículo (n=7); 8-OH-DPAT 0,6 nmol (n=7) ou 6 nmol (n=7); MET 2 nmol (n=7) ou 20 nmol (n=6) e durante o diestro receberam uma injeção de veículo (n=14); 8-OH-DPAT 0,6 nmol (n=8) ou 6 nmol (n=8); MET 2 nmol (n=7) ou 20 nmol (n=9). Os animais que portavam cânulas-guias no ARC foram igualmente divididos. Todos os experimentos foram realizados entre 13h00 e 15h00.

3.6.2. Procedimento experimental II

Sete dias após a implantação da cânula-guia, os animais foram colocados dentro da caixa de registro comportamental, que continha em seu interior um recipiente de vidro (Placa de Petri, de 5cm de diâmetro) contendo 20g de ração enriquecida com sacarose 10% (Fletcher, 1988) e uma garrafa de vidro contendo 100mL de água. Essa garrafa possuía um bico de aço inoxidável que projetava para o interior da caixa de registro. Após o período de habituação nesse ambiente durante 1h/dia, por três dias consecutivos, suficiente para os animais atingirem a ingestão máxima e estável da dieta enriquecida com sacarose 10%, as ratas, portanto cânulas-guias na AHL, foram separadas em estro e diestro e receberam uma injeção de veículo (ácido ascórbico 5%) e, após 7min de espera, receberam outra injeção de veículo (n=8; grupo controle) ou 8-OH-DPAT 6 nmol (n=8); outro grupo, separado em estro e diestro recebeu uma injeção de WAY 100635 37 nmol e, após 7min, recebeu outra injeção de veículo (n=8) ou de 8-OH-DPAT 6 nmol (n=8). Os animais, portando cânulas-guias no ARC, foram igualmente divididos. Cada animal recebeu somente um tratamento (uma dose de droga ou veículo) e foi examinado numa única fase do ciclo estral. Imediatamente, após a injeção, o animal era colocado na caixa de registro, e por um período de 1h, foi realizado o registro dos comportamentos ingestivos e não ingestivos. Todos os experimentos foram realizados entre 13h00 e 15h00.

3.7. Registro comportamental

A caixa experimental foi confeccionada em vidro transparente de 4mm de espessura, possuindo as medidas de comprimento e de largura similares aos da caixa de hospedagem (49 X 34cm). Porém, tendo a medida de altura maior (40cm) para evitar fugas. O assoalho da caixa e as três paredes laterais foram recobertas com plástico