Síntese e avaliação do potencial biológico de novos derivados N-fenacilados do aza-biciclo pirrolidino [3,2-d] isoxazolina

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS.. SÍNTESE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DE NOVOS DERIVADOS N-FENACILADOS DO AZA-BICICLO PIRROLIDINO [3,2-d] ISOXAZOLINA. NÁDIA LIMA DIAS CABRAL. RECIFE – PE Julho, 2005.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS.. SÍNTESE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DE NOVOS DERIVADOS N-FENACILADOS DO AZA-BICICLO PIRROLIDINO [3,2-d] ISOXAZOLINA. NÁDIA LIMA DIAS CABRAL (DISSERTAÇÃO DE MESTRADO). Dissertação de Mestrado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Síntese e Planejamento de Fármacos.. ORIENTADOR: Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria. RECIFE – PE Julho, 2005 ii.

(3) Cabral, Nádia Lima Dias Síntese e avaliação do potencial biológico de novos derivados N-fenacilados do aza-biciclo pirrolidino [3,2-d] isoxazolina / Nádia Lima Dias Cabral. – Recife : O Autor, 2005. xiv, 78 folhas : il. fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2005. Inclui bibliografia e anexos. 1. Fármacos – Síntese e planejamento. 2. Substâncias sintetizadas – Elucidação estrutural e avaliação biológica – Reações de cicloadição 1,3dipolar. 3. Novos derivados – N-fenacilados do azabiciclo pirrolidino [3,2-d] isoxazolina –Screening microbiológico –Teste de toxicidade aguda (efeitos gerais). I. Título. 615.31 615.31. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). UFPE BC2005-396.

(4) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS.. REITOR: Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins. VICE-REITOR: Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva. DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE: Prof. José Thadeu Pinheiro. VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE: Prof. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros. PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO: Prof. Celso Pinto de Melo. CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS: Profa. Jane Sheila Higino. COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS: Profa. Miracy Muniz de Albuquerque.. iii.

(5) iv.

(6) Aos meus pais José Ademar e Maria Lenauda, como também aos meus irmãos Edna, Hélder e Leane, constantes incentivadores e promotores da minha formação acadêmica e, porque não, “co-autores” deste trabalho, minha eterna gratidão!.... v.

(7) AGRADECIMENTOS A Deus primeiramente, pois sem o Seu consentimento, esta nem nenhuma outra conquista da minha vida, ter-se-ia concretizado. Aos meus pais José Ademar Dias Cabral e Maria Lenauda de Sousa Lima Cabral, que sempre priorizaram a educação dos filhos, renunciando muito de suas próprias vidas, em prol do nosso crescimento espiritual e intelectual, através dos seus ensinamentos e lições de vida, recheados com muito amor e paciência. Aos meus irmãos Edna, Hélder e Leane pelo incentivo constante, compartilhando não só dos momentos felizes, mas, dos mais difíceis também. Ao Prof. Rodolfo, por quem tenho grande admiração, pela maneira como desempenha com seriedade, compromisso e dedicação as suas atividades de professor e orientador nesta universidade. Sempre prestativo com todos, sem fazer distinções e possuidor de admirável respeito por seus alunos, faz jus às homenagens que recebe. Ao Prof. Alexandre Góes, que solidariamente nos cedeu o laboratório, para a realização dos trabalhos de bancada do nosso grupo de pesquisas, na fase em que mais precisamos deste apoio. À Profa. Ivone, pela realização dos testes toxicológicos e pela atenção que dispensou não só ao meu trabalho como também a minha pessoa particularmente, apoiando-me através de palavras de encorajamento nos momentos cruciais da finalização deste trabalho. Sinceramente, só tenho a agradecer! À Profa. Magali, pela realização dos testes microbiológicos e a Fátima e Tarcyana por terem ajudado na realização dos ensaios. Ao Prof. Carlos Roque e a Kézia Peixoto por terem viabilizado a realização dos espectros de infravermelho e massas. Aos técnicos da Central Analítica do DQF (Depto. de Química Fundamental) da UFPE pela realização das análises espectrométricas de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e de carbono dos compostos sintetizados. À Profa. Nena pela colaboração na editação dos espectros. À funcionária Fátima (Depto. de Antibióticos) por ter realizado as liofilizações dos compostos finais. Ao Prof. Alexandre Schuler (Depto. de Engenharia Química) por ter viabilizado a realização das reações de Hidrogenólise numa primeira instância e à Profa. Ivani (Depto. de Química Fundamental) num segundo momento em que precisamos. vi.

(8) Ao Prof. Bogdan Doboszewski, pela grande contribuição a nível de formação acadêmica por meio da Iniciação Científica. Aos Professores Sebastião, Gildo, Jane e demais que de forma direta ou indireta ajudaram no decorrer desta trajetória. À secretária do Programa de Pós-graduação do Depto. de Ciências Farmacêutica Iguacy, por ter ajudado nos trâmites burocráticos e no mais que fosse necessário. À Elis Pena que além de ter participado ativamente da realização das reações de síntese dos compostos descritos neste trabalho, deixando uma grande contribuição, foi minha companheira do dia-a-dia, sempre muito bem-humorada e prestativa. Ao amigo Rosiel que apesar da sua permanência no laboratório ter coincidido apenas no início do meu trabalho, sempre se manteve em contato com o grupo e disposto a contribuir para a conclusão do mesmo, sendo também um grande incentivador. A Valderes e Marcelo pela companhia e colaboração dadas sempre que precisei dentro das tarefas no laboratório e relacionadas ao projeto. Aos companheiros do Lassint Rômulo, Thiago, Léo, Pricila e Ricardo pela agradável companhia e amizade que me proporcionaram enquanto estive com vocês. Aos amigos e colegas Janinha, Chico, Flávio Ricardo, Lívia, Rebeca, Ana Carolina e Fernando Malagueño. Aos meus amigos Demétrius Perreli e Marcus Vinícius que mesmo um pouco distantes, sempre torceram por mim. A todos os colegas, amigos e parentes que de alguma maneira deixaram sua parcela de colaboração, seja num gesto ou palavra de conforto, nos momentos de alegria e de descontração, nos momentos de paciência, enfim por todos os momentos que me trouxeram o equilíbrio ao longo desta caminhada e que agora convergem para esta vitória.. vii.

(9) “Quando alguém julgar ter alcançado o saber, é porque ainda não sabe onde está o verdadeiro conhecimento” (1 Coríntios 8,2).. viii.

(10) SUMÁRIO. Página LISTA DE SIMBOLOGIAS E ABREVIAÇÕES................................................. x. LISTA DE FIGURAS, ESQUEMAS E TABELAS............................................... xi. RESUMO.................................................................................................................. xiii. ABSTRACT.............................................................................................................. xiv. 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA .......................................... 01. 1.1. ASPECTOS GERAIS.......................................................................................... 01. 1.2. 2-ISOXAZOLINAS (ASPECTOS QUÍMICOS ESTRUTURAIS E IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA)......................................... 01. 1.3. MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE 2-ISOXAZOLINAS..................................... 03. 1.4. DERIVADOS FENACILADOS (ASPECTOS QUÍMICOS ESTRUTURAIS E IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA)......................................... 07. 1.5. DERIVADOS HIDRAZIDAS (ASPECTOS QUÍMICOS ESTRUTURAIS E IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA)......................................... 11. 2. METODOLOGIA E OBJETIVOS..................................................................... 14. 2.1. METODOLOGIA............................................................................................... 14. 2.2. OBJETIVOS........................................................................................................ 17. ARTIGO.................................................................................................................... 18. CONCLUSÕES........................................................................................................ 27. PERSPECTIVAS...................................................................................................... 29. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 31. ANEXOS................................................................................................................... 37. ANEXO 01 (Resultados e Discussões)...................................................................... 37. ANEXO 02 (Procedimentos Experimentais)............................................................. 54. ANEXO 03 (Espectros).............................................................................................. 69. ix.

(11) LISTA DE SIMBOLOGIAS E ABREVIAÇÕES AcOEt. - Acetato de Etila. AN. - Ágar Nutritivo (meio de cultura). CAN III. - Nitrato de amônio de Cério(III) tetrahidratado. CAN IV. - Nitrato de amônio de Cério. CCD. - Cromatografia em Camada Delgada. DL50. - Dose Letal para 50% dos animais. DMSO. - Dimetilsulfóxido. DMSO-d6 - Dimetilsulfóxido deuterado Et3N. - Trietilamina. EtOH. - Etanol. GL. - Meio de Cultura GL (Glicose/Levedura). HRMS. - Espectrometria de Massas de alta Resolução. IV-FT. - Espectrometria no Infravermelho com Transformada de Fourier. MeOH. - Metanol. MH. - Muller Hinton (meio de cultura). P.F.. - Ponto de Fusão. RMN1H. - Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio. SNC. - Sistema Nervoso Central. SNP. - Sistema Nervoso Periférico. T.a.. - Temperatura ambiente. THF. - Tetrahidrofurano. VIP. - Via de Administração Intraperitoneal. x.

(12) LISTA DE FIGURAS, ESQUEMAS E TABELAS Página Figura 01 :. Classificação dos heterociclos de cinco membros quanto ao grau de oxidação........................................................................... Figura 02 :. Obtenção de 2-isoxazolinas 3,4-dissubstituídas........................... Figura 03 :. Obtenção de 2-isoxazolinas através de reações de cicloadição 1,3-dipolar envolvendo óxidos de nitrila e alquenos.................... Figura 04 :. Figura 05 : Figura 06 :. Obtenção de 2-isoxazolinas através de reações de cicloadição 1,3-dipolar envolvendo o clorooximidoacetato de etila e dipolarófilos................................................................................ Obtenção de 2-isoxazolinas por cicloadição 1,3-dipolar intermolecular.............................................................................. Cicloadição 1,3-dipolar envolvendo alquenos e (CAN IV) ou (CAN III)...................................................................................... 01 03 04. 04. 05 05. Figura 07 :. Obtenção de ∆2-isoxazolinas....................................................... Figura 08 :. Obtenção de 2-isoxazolinas através de cetonas α,β-insaturadas e NH2OH em piridina aquosa....................................................... 06. Obtenção de 2-isoxazolinas através de cetonas α,β-insaturadas e NH2OH em piridina aquosa....................................................... 06. Obtenção de 2-isoxazolinas através do aquecimento de oxima α,β-insaturada............................................................................... 07. Derivados fenacilados (atividade contra carcinoma renal em ratos e células T modificadas em humanos)................................. 08. Perspectiva de proteção da carbonila cetônica de derivados Nfenacilados.................................................................................... 29. Perspectiva de obtenção de aminoácidos não naturais por clivagem redutiva do anel isoxazolínico...................................... 30. Figura 09 : Figura 10 : Figura 11 : Figura 12 : Figura 13 : Figura 14 :. Reatividade de enecarbamatos e enamidas.................................. Figura 15 :. Preparação do trímero da 1-pirrolina........................................... Figura 16 :. Síntese do enecarbamato N-(benziloxicarbonil)-2-pirrolina........ 06. 39 40 41. xi.

(13) Figura 17 : Figura 18 : Figura 19 : Figura 20 : Figura 21 :. Síntese do clorooximidoacetato de etila, precursor do N-óxido de nitrila-CEFNO......................................................................... 42. Reação de cicloadição 1,3-dipolar entre o enecarbamato N(benziloxicarbonil)-2-pirrolina e N-óxido de nitrila-CEFNO...... 42. Mecanismo não concertado dipolar para a reação de cicloadição 1,3-dipolar................................................................. 43. Mecanismo concertado altamente assincronizado para a reação de cicloadição 1,3-dipolar............................................................ 44. Reação de hidrgenólise do grupamento benziloxicarbonila (CBz) do cicloaduto derivado do enecarbamato N(benziloxicarbonil)-2-pirrolina..................................................... 45. Figura 22 :. Reação de N-fenacilação do cicloaduto desprotegido.................. Figura 23 :. Síntese da hidrazona/ácido isoxazolínica..................................... Esquema 01 :. Rota sintética para obtenção de derivados N-(fenacil)pirrolidino[3,2-d]isoxazolinas...................................................... 15. Tentativa de obtenção de derivados N-(fenacil)-pirrolidino[3,2d]isoxazolinas através de enaminas endocíclicas......................... 38. Esquema 02 :. 46 47. Esquema 03 :. Obtenção do enecarbamato N-(benziloxicarbonil)-2-pirrolina.... Tabela I :. Atividade Antimicrobiana para substâncias sintetizadas testadas......................................................................................... 49. Efeitos observados da hidrazona/ácido em camundongos VIP.... 51. Tabela II :. 40. xii.

(14) RESUMO Diante de trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisas, em que foram obtidos derivados N-(benzoil)-pirrolidino[3,2-d]isoxazolinas 40, com excelentes atividades biológicas, por meio de reações de cicloadição 1,3-dipolar de enecarbamatos e enamidas endocíclicas de 5 membros, vislumbramos a obtenção dos derivados N-(fenacil)-pirrolidino[3,2-d]isoxazolinas 41, utilizando-se como produto de partida a isoxazolina bicíclica pirrolidínica. Inicialmente, tentou-se a síntese de uma enamina endocíclica N-fenacilada, que atuaria como dipolarófilo na reação de cicloadição, porém o único produto isolado e em baixo rendimento, foi o pirrol N-fenacilado juntamente com produtos de degradação, fato este, atribuído à alta reatividade da enamina formada, quando comparada ao enecarbamato, daí utilizarmos o enecarbamato (N-CBz) nas reações deste trabalho. O enecarbamato utilizado foi o N-(benziloxicarbonil)-2pirrolina, pois com ele, pudemos obter o seu cicloaduto correspondente 43 (contendo o grupamento protetor benziloxicarbonila). Este cicloaduto, após hidrogenólise do grupamento CBz, com Pd(OH)2 a 5% sob carvão ativado e hidrogênio no meio reacional, nos forneceu quantitativamente, o cicloaduto desprotegido o qual foi submetido à reação de N-fenacilação com haletos de fenacila, sendo produzidas novas isoxazolinas bicíclicas N-fenaciladas 46, 47 e 48 com a peculiaridade de possuírem no nitrogênio (N6) a função amina terciária, conferindo à molécula, propriedades químicas diferentes, quando comparada com os derivados isoxazolínicos (com função amida) já obtidos no grupo. Estes derivados 46, 47 e 48, foram devidamente caracterizados por métodos espectrométricos, sendo que, 47 e 48 foram submetidos a um screening antimicrobiano qualitativo e mostraram atividade contra Sarcina lutea, S. aureus, M. luteus, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis e contra M. luteus, S. lutea e Mycobacterium tuberculosis, respectivamente. Posteriormente, os ésteres foram submetidos à reação com hidrazina 25% em meio etanólico, mas dos três derivados obtidos, apenas um, a hidrazona/ácido 49, foi devidamente isolada e identificada. Com a hidrazona/ácido 49, realizou-se uma avaliação da toxicidade aguda, através de ensaios preliminares em camundongos, revelando-se, esta ser uma substância muito ativa no SNP e principalmente a nível de SNC, onde efeitos depressores e excitatórios foram observados, predominando os excitatórios conforme o aumento da dose administrada. A hidrazona/ácido 49 obtida, poderá ser usada para futura obtenção de aminoácido não-natural, após clivagem redutiva do núcleo isoxazolínico e este, por sua vez, pode ser precursor de seu respectivo alquil-imínio, servindo como importante intermediário na síntese de uma série de derivados pirrolidínicos potencialmente bioativos. xiii.

(15) ABSTRACT Recently, our group of research had been gotten N-(benzoyl)-pyrrolidine[3,2-d]-2isoxazolines derivatives 40, by 1,3-dipolar cycloaddition of five membered endociclic enecarbamates and enamides, with excellent biological activities. Due to this fact, we intended the obtention of the derivatives N-(fenacyl)-pyrrolidine[3,2-d]-2-isoxazolines 41, using the aza-bicycle isoxazoline as starting material. Initially, we was tried the synthesis of endociclic N-fenacyl-enamine, that should act as dipolarofile in the cycloaddition reaction, however, the only isolated product and in low yield, was N-fenacyl-pyrrol, with products of degradation, fact this, attributed to the high reactivity of the formed enamine, when compared with the respective enecarbamate. So then, we used the enecarbamate N-(benzyloxycarbonyl)2-pyrroline in the reactions of this work. The respective isoxazoline cycloadduct 43 (with protecting group Cbz) was obtained. This cycloaddut, after hydrogenolysis of the CBz group, supplied quantitatively the deprotected cycloaddut, which was submitted to the reaction of Nfenacylation with the respective fenacyl halides, being produced new N-(fenacyl)-aza-bicycleisoxazolines 46, 47 and 48, with the peculiarity of they will possess in nitrogen (N6) a tertiary amine function, conferring to the molecule, different chemical properties, when compared with the isoxazoline derivatives (with amide function), already gotten in the group. These derivatives 46, 47 and 48, duly had been characterized by espectromtric methods, where, 47 and 48 had been submitted to one qualitative antimicrobials screening and had shown activity against lutea Sarcina, Staphylococcus aureus, M. luteus, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis and against M. luteus, S. lutea and Mycobacterium tuberculosis, respectively. Later, esters 46, 47 and 48, had been submitted to the reaction with hydrazine 25% in ethanolic media, but only one, the hydrazone/acid derivative 49, was duly isolated and identified. With hydrazone/acid 49, an evaluation of the acute toxicity was become through preliminary assays in mice, showing a very high activity of this coumpoud in the PNS and, mainly, at level of CNS, where effect depressors and stimulants had been observed, predominating the stimulants ones in agreement the increase of the managed dose. Hydrazone/acid 49, could be used for future non-natural amino acid attainment, after reductive split of the isoxazoline nucleus and this, in turn, can be precursory of its respective alkyl-iminio, serving as important intermediary in the synthesis of a series of potentially bioactive pirrolidine derivatives.. xiv.

(16) INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA.

(17) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA 1.1 – ASPECTOS GERAIS De muitos compostos orgânicos existentes na natureza, a maior parte deles contêm, no mínimo, um componente heterocíclico. Os compostos heterocíclicos, correspondem à classe de compostos que mais apresenta propriedades biológicas a serem exploradas: propriedades farmacêuticas, agroquímicas, veterinárias, dentre outras(1), sendo de fundamental importância para os seres vivos, participando como componentes chaves em vários processos biológicos. Substâncias heterocíclicas contendo átomos de oxigênio e nitrogênio em suas estruturas cíclicas, constituem uma das classes que tem despertado grande interesse na síntese orgânica e na química medicinal(2), pela relevância que apresentam na indústria químicofarmacêutica.. 1.2- 2-ISOXAZOLINAS (ASPECTOS QUÍMICOS ESTRUTURAIS E IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA).. Heterociclos de 5 membros, contendo átomos de oxigênio e nitrogênio ligados entre si, têm despertado grande interesse, devido ao grande potencial biológico que estas substâncias apresentam. Estes heterociclos são classificados de acordo com o grau de oxidação do anel heterocíclico. Isoxazóis 1, totalmente oxidados e aromáticos, Isoxazolinas 2, parcialmente oxidadas e Isoxazolidinas 3, totalmente reduzidas (Fig.01)(3).. N O. 1. N. N. N. O. O. O. 2-Isoxazolina. 3-Isoxazolina. 4-Isoxazolina. 2a. 2b. 2c. N O. 3. Figura 01. ________________________________________________________________________. 1.

(18) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. Dos heterociclos descritos acima, particularmente as 2-isoxazolinas 2a interessam em termos de estratégias sintéticas, atividades biológicas e aplicações terapêuticas reportadas a estas estruturas. Tais substâncias serão, portanto, descritas representativamente a seguir. A 2-isoxazolina 4, foi relatada como mais uma substância de possível utilidade na prevenção da transmissão sexual da SIDA, por exibir, simultaneamente, atividades espermicida e anti-HIV(4). Br. O. N. C H. Br. O 4. Recentes. estudos. mostram. 2-isoxazolinas. tricíclicas. 5,. como. potenciais. antidepressivos, pelas ações de inibição de sítios transportadores de 5-HT e antagonismo de receptores α2-adrenérgicos(5). L L. N N. O. N. O. O. O. O. 5. Também foram relatadas, 2-isoxazolinas 3,5-dissubstituídas 6 e 7 apresentando atividades antifúngicas significativamente maiores que a Nistatina (droga já usada na terapêutica) contra cepas de Aspergillus flavus e Fusarium moniliform(6).. O N. O. COOC2H5. N. CH2OH. Cl. Cl N. NH. N. NH. Bu. Bu. 6. 7. ________________________________________________________________________. 2.

(19) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. Derivados de 2-isoxazolinas, análogos da linezolida (agente antibacteriano comercialmente conhecido como Zyvox) foram sintetizados e seus perfis de atividade e eficácia antibacteriana, exibiram níveis bastante interessantes, tanto in vitro como in vivo, contra alguns grupos de bactérias gram-positivas resistentes a certas drogas já usadas ou testadas, destacando-se a substância 8, sendo, portanto, um importante grupo de substâncias para a terapêutica no tratamento de infecções causadas por estes tipos de microrganismos(7). F. O N. N. HO N. F. O. H N. H. O CH3. 8. 1.2 – MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE 2-ISOXAZOLINAS.. Pesquisas recentes na literatura mostram alguns métodos interessantes para síntese de 2-isoxazolinas como ciclização nitrosativa de 3-cloro-1-nitropropano usando nitrato de sódio e n-propilnitrito em DMSO(8a)(8b); reações de 3-isoxazolin-5-ona com olefinas(8c); reações fotoquímicas de ciclopropanos 1,2-dissubstituídos com NOBF4(8d), entre outros. Sínteses de 2-isoxazolinas 3,4-dissubstituídas foram realizadas por tratamento de arenecarboxilatos alicíclicos com NOBF4 em acetonitrila a – 23°C(8) (Fig. 02).. O X. O. C H. O C H. NOBF4. X. Y. C. CH3CN, -23oC. O. N O. Y Y = H; CH2Br; XC6H4C(. O)OCH2. X = H; 2- Br; 4-Cl; 4-CH3O; 4-NC; 2-Ph; 4-O2N; 4-CH3 Figura 02. ________________________________________________________________________. 3.

(20) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. Porém, os dois principais métodos de obtenção de 2-isoxazolinas incluem reações de cicloadição 1,3-dipolar envolvendo óxidos de nitrila e alquenos e reações entre cetonas α,βinsaturadas e hidroxilamina. N-óxidos de nitrila, reagem com uma grande variedade de olefinas via cicloadição 1,3-dipolar, levando à formação de 2-isoxazolinas (Fig. 03).. R. R. C. C. N. N. O. O. +. N O. dipolarófilo. cicloaduto (2-isoxazolina). 1,3-dipolo Figura 03. 2-isoxazolinas foram preparadas em solução de tolueno, sob refluxo, durante 36h, com dipolarófilos apropriados e clorooximidoacetato de etila, como precursor do 1,3-dipolo. Os experimentos realizados sob atmosfera inerte e com adição lenta do precursor, forneceram após neutralização, 2-isoxazolinas(9) com rendimentos de 42 a 89% (Fig. 04).. EtOCOC(Cl) X. NOH. EtOOC. Tolueno. X. N. NaCO3 25%. X = CH2; (CH2)2; O. O. Figura 04. Derivados de cloretos de hidroximoila 10, obtidos através de reações de nitroolefinas 9 com silil-enol-éter, em presença de TiCl4, quando submetidos a reações com um dipolarófilo (maleato de dietila) na presença de TEA, levaram à formação de 2-isoxazolinas 11 correspondentes por cicloadição 1,3-dipolar intermolecular (10) (Fig. 05).. ________________________________________________________________________. 4.

(21) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. OSiMe3. Ph +. Ph. TiCl4 (1 equiv). HCl aq.(5%). O°C, 0,5h. NO2 9. Cl. O. Ph. Ph. O. Ph. N. OH. N. CH2Cl2, rt. 4h. Ph. O. Et3N (3 equiv) Maleato de dietila (4 equiv). EtO2C. CO2Et. 11. 10. (84%, rendimento total) Figura 05. Outro tipo de cicloadição 1,3-dipolar, descrita na literatura, envolve a reação de alquenos (como dipolarófilos) com nitrato de amônio cérico (CAN IV) – (NH4)2Ce(NO3)6 ou com nitrato de amônio de Cério (III) tetrahidratado (CAN III) – (NH4)2Ce(NO3)5.4H2O em acetona ou acetofenona, sob refluxo, resultando em derivados de 2-isoxazolinas 12 (Fig. 06). Vale ressaltar, que o uso do CAN III nestas reações, apresentou rendimentos mais satisfatórios, variando de 72 a 84% com uso de acetona e de 64 a 84% usando-se acetofenona(11). O R1. CAN(IV) ou CAN(III). R2. Acetona ou Acetofenona R1 = C6H13; CH2C6H11; CH2Ph; CH2CN R2(a) = CH3 (se acetona) R2(b) = Ph (se acetofenona). N O. R1. 12. Figura 06. Foram obtidas recentemente, novas 2-isoxazolinas por meio da adição de uma solução de aldoxima (previamente sintetizada e solubilizada em CH2Cl2/THF) + NaOCl + TEA, adicionada a uma outra solução contendo o alqueno(6) (Fig. 07).. ________________________________________________________________________. 5.

(22) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. H N. C. N. R. OH NaOCl/Et3N. Bu. THF. N. Cl R R O. H N. N. Bu. O. H N. +. N. Bu N. N. Cl. Cl. 14. 13. R = CN; C6H5; COOC6H5; COOCH3; COOC2H5; CH2COOCH3; CH2OH Figura 07. A primeira isoxazolina 15 isolada, foi obtida através da reação de cetonas α,βinsaturadas e hidroxilamina em piridina aquosa (Fig 08)(2).. O PhCCH. NH2OH.HCl CHPh. Ph. H2O/piridina. Ph N. O 15. Figura 08. Reações de hidroxilamina com o derivado tricloro da mesma cetona α,β-insaturada citada anteriormente, sob condições básicas, forneceu 16 (Fig. 09)(2). CCl3 O PhCCH. CHCCl3. NH2OH,base. Ph N. O 16. Figura 09. ________________________________________________________________________. 6.

(23) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. Quando a chalcona oxima 17 foi aquecida a 190oC, a 2-isoxazolina 18 foi obtida (Fig.10)(2). PhCH. 190oC. CHCPh NOH. Ph. Ph N. 17. O 18. Figura 10. 1.3 – DERIVADOS FENACILADOS (ASPECTOS QUÍMICOS ESTRUTURAIS E IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA).. Uma das substâncias fenaciladas mais simples reportada na literatura é o brometo de p-bromo-fenacila 19, que foi descrito como tendo a capacidade de alterar estrutural e conformacionalmente a fosfolipase A2 (PLA2), enzima existente em alguns organismos (sobretudo nos humanos) nos meios intra e extracelulares, responsável por catalisar reações de hidrólise de fosfolipídeos em presença de íons cálcio(12). Foi-se constatado (através de testes com PLA2 pancreática bovina) que o grupo p-bromo-fenacila modifica quimicamente o resíduo de histidina (48) da enzima, podendo provocar sua inibição, assim como forma interações hidrofóbicas com outros resíduos, especialmente com as cadeias laterais da fenilalanina (5) e cisteína (45), provocando mudanças conformacionais significativas em algumas partes da molécula enzimática(13).. O. O Br. + CH2 19. Br. R. Br CH2. R. R = Resíduo de aminoácido da PLA2. Acetofenonas α-substituídas 20 e 21, foram sintetizadas e tiveram atividade fungicida confirmada contra algumas espécies de dermatófitos, usando-se como comparativo padrão, a anfotericina B e o cetoconazol, drogas usadas na terapêutica de dermatomicoses (14).. ________________________________________________________________________. 7.

(24) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. O. O. O. Cl. O. CH3. O. Cl. O. CH3 CH3. O 21. 20. Mono e di-bases de Mannich sintetizadas, derivadas da acetofenona (Fig. 11), apresentaram atividade contra carcinoma renal em ratos e células T modificadas de humanos(15).. Monobases:. C. CH. O. R1. CH2. R2 . X. Dibases:. R1. R2. X. A. H. N(CH3)2. HCl. B. H. N. C. H. N. D. H. O. N(CH3)3. R1. R2. X. E. CH2N(CH3)2. N(CH3)2. 2HCl. HCl. F. H2CN. N. 2HCl. HCl. G. H2CN. I. H. CH2N(CH3)3. O. N. O. N(CH3)3. 2HCl. 2I. Figura 11. Estudos realizados com N-fenacil-imidazóis 22 obtidos sinteticamente, afirmaram que estas substâncias inibem seletivamente a enzima óxido nítrico sintase neuronal pela interação com alguns sítios enzimáticos (L-arginina, tetrahidrobiopterina ou heme). Esta inibição, evita que produtos de catálise como óxido nítrico e L-citrulina, acumulem-se no sistema nervoso central, servindo como estratégia terapêutica para várias doenças neurodegenerativas como Mal de Alzheimer e Mal de Parkinson e também outras neurotoxicidades decorrentes da elevação dos níveis desta enzima no SNC(16).. ________________________________________________________________________. 8.

(25) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. R = H; CH3. R N N. NO2 O 22. 2,4-tiazolidinonas. N-fenaciladas. 23. foram. sintetizadas. e. testadas. microbiologicamente através de determinação da concentração mínima inibitória (CMI) e todas apresentaram atividade moderada (comparando com o antibiótico ampicilina) contra Staphylococcus aureus. Notavelmente, apenas os derivados contendo os substituintes p-cloro e p-nitro mostraram atividade também contra Candida albicans e sendo esta ação nivelada à do fluconazol (droga usada no tratamento de afecções por este fungo)(17).. O O O. S. N CH2. C. R. O R = p-Cl; p-NO2; p-OCH3. O 23. Após Lespagnol et al. terem estudado as 2-benzoxazolonas e os efeitos hipnóticos a elas conferidas, muito se tem trabalhado em termos de obtenção sintética e avaliação das atividades biológicas de 2-benzoxazolinonas. Estas substâncias 24, contendo um grupo Nfenacila em suas estruturas, apresentam atividade antimicrobiana frente a três tipos de bactérias, duas gram positivas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) e uma gram negativa (Staphylococcus aureus) e três leveduras de fungos (Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis)(18).. ________________________________________________________________________. 9.

(26) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. R3. R1 = - H; -Cl R2 = - 2 F; 3F; 2,6-difluoro R3 = - H; - Cl; - Br; - CH3. R2. H2 C. R1. C. O. N O. O. C O 24. O derivado N-fenacilado 25, apresentou afinidade e seletividade por receptores antagonistas 5-HT2A. Para esta mesma substância, foram realizados também testes de biodisponibilidade(19).. O S. R. O. O N. 25. Relatos da literatura, também mostraram que derivados N-fenacilados, podem funcionar como agentes inibidores de reações não enzimáticas de Maillard entre carboidratos e proteínas de células de tecidos, sendo útil em situação de diabetes, uma vez que, durante a hiperglicemia, estas reações são aceleradas, prejudicando a funcionalidade de proteínas celulares como o colágeno (pela diminuição da permeabilidade e elasticidade da matriz extracelular); além de também afetar o “crosslink” de proteínas teciduais(20). Recentemente, foram isolados e identificados acetofenonas C-glicosídicas 26 e 27 da Upuna borneensis, planta típica da Malásia, caracterizando um importante achado fitoquímico(21).. ________________________________________________________________________ 10.

(27) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. O. O. OH. OH O. HO HO. HO. OH. O. HO HO. O. OH. O. OH. O. HO. OH. O OH. 26. 27 OH. 1.4 – DERIVADOS HIDRAZIDAS (ASPECTOS QUÍMICOS ESTRUTURAIS E IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA).. Substâncias contendo hidrazida-hidrazonas foram relatadas como possuidoras de atividades antibacteriana, anticonvulsivante e antituberculostática(22). Compostos 28(23a), 29(23b) e 30(23c) são exemplos de agentes antituberculostático e antibacterianos, respectivamente falando. O. O O. R. N N. NO2. F. N. N. H. H. N H. H 28. 29. O O. O. NO2. N N 30. H. N H. H3CO. Derivados do diflunisal 31 e 32, (2’,4’-difluoro-4-hidroxidifenil-3-ácido carboxílico) designado como agente antibacteriano e antituberculostático, foram obtidos e suas atividades. ________________________________________________________________________ 11.

(28) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. confirmadas contra Mycobacterium tuberculosis, fungos e leveduras e várias espécies de bactérias dentre elas Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermis(23). H H. NH2 H. N. C. O. H. N N. C. Ar O. C. OH. F. OH. F. F. F 32. 31. Uma série de hidrazonas 33 e 34 derivadas da hidrazida 1,2-benzotiazol, foram sintetizadas por Vicini et al e a avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica revelou uma potente ação antimicrobiana, expressa pelos valores da Concentração Mínima Inibitória (CMI), comprovando a importância do grupo hidrazona para atividade(24). NO2. O O N. N. HC. NH. Cl. N. HC. S N 33. S. 34. Güniz et al relatam em vários trabalhos atividade antituberculose para várias hidrazonas. A hidrazona 35 apresenta percentual de inibição da Mycobacterium tuberculosis semelhante ao antibiótico rifampicina(25). O O H3C H3C. N N. O. O. H. N H. N. 35. ________________________________________________________________________ 12.

(29) Nádia Lima Dias Cabral. Introdução e Revisão da Literatura. Barreiro et al relataram a síntese de novas arilhidrazonas e acil-arilhidrazonas(26), sendo observados excelentes resultados para atividade analgésica. A analgesia proporcionada pela arilhidrazona 36 foi muito próximo da obtida com a dipirona. Já a analgesia observada com a acil-arilhidrazona 37 foi superior ao efeito da dipirona. OCH3 N. HN. H3C. O. O. H3C H N. N N. N. N. N. N. O. H. N. Ph. Ph. 36. 37. Dimmock et al sintetizaram várias N-acetilhidrazonas 38, oxamohidrazonas e semicarbazonas como possíveis candidatas a agentes anticonvulsivantes. Os resultados obtidos. revelaram (27). anticonvulsivante. que. N-acetilhidrazonas. são. mais. promissoras. para. atividade. . O. H H3C. N. N. C. N. N. N. CH3. O. O. Cl 38. S 39. A hidrazona 39 obtida por Çakir et al apresentou também atividade anticonvulsivante significativa, sendo evidenciado a importância da porção hidrazona para a atividade(28).. ________________________________________________________________________ 13.

(30) METODOLOGIA E OBJETIVOS.

(31) Nádia Lima Dias Cabral. Metodologia e Objetivos. 2. METODOLOGIA E OBJETIVOS 2.1. METODOLOGIA Diante dos precedentes, derivados N-(Benzoil)-pirrolidino[3,2-d]isoxazolina 40, obtidos recentemente por nosso grupo, que apresentaram excelentes atividades biológicas, pretendemos obter derivados N-(fenacil)-pirrolidino[3,2-d]isoxazolina 41.. O O. NH2. C. 4. 3. NHNH2. C c. b. N. d 5. N. N1. O. 2 e. O. a. O. N R. O. R 40. 41. Percebe-se que nos derivados N-fenacilados 41 existe uma função amina terciária no nitrogênio N6, ao invés de uma função amida (benzamida). Tem-se, portanto, agora um importante sítio de ligação de hidrogênio (N6), não apresentado pelos derivados 40, importante para interações intermoleculares biológicas. A introdução da funcionalidade hidrazida em C3, além de poder induzir certas atividades biológicas importantes, como antimicrobiana, poderá ser utilizada posteriormente na obtenção das respectivas aril-hidrazonas, interessantes grupamentos farmacofóricos responsáveis por possíveis atividades analgésica e/ou anticonvulsivantes. Desta maneira, utilizaremos como produto de partida para síntese de nossas novas substâncias, a isoxazolina bicíclica pirrolidínica 43, oriunda do enecarbamato 42, aplicando metodologia sintética de reações de cicloadição 1,3-dipolar de enecarbamatos de 5 membros com N-óxidos de nitrila, desenvolvida em nosso grupo de pesquisa. Este cicloaduto 43, mostra-se muito versátil, pois, após hidrogenólise do grupo Cbz, obtem-se uma função amina. ________________________________________________________________________ 14.

(32) Nádia Lima Dias Cabral. Metodologia e Objetivos. secundária 44, que será N-alquilada com haletos de fenacila. As isoxazolinas bicíclicas 45, apresentando agora uma função amina terciária em N6, serão convertidas nas respectivas hidrazidas 41 (Esquema 01). N Trimerização. N. N. N. H Pirrolidina Destrimerização. N. COOEt. COOEt. H. H N. Cicloadição. O. 1,3 -dipolar. N. N. O. O. N. Hidrogenólise. O N. H O. O. 44. 43. 42. H. H. COOEt. CONHNH2. H. N-fenacilação. H N. N R. N. R. O H. N. Hidrazina. O. O. 41. 45. O H. R = p-Cl; p-F; p-NO2 Esquema 01. ________________________________________________________________________ 15.

(33) Nádia Lima Dias Cabral. Metodologia e Objetivos. As novas substâncias que iremos obter, terão peculiaridades estruturais em suas moléculas, relacionadas principalmente a dois grupos funcionais, o radical N-fenacila e o radical hidrazida. Com relação ao radical N-fenacila, a ligação direta do grupamento fenacila ao nitrogênio (6) do biciclo, conferirá à molécula 41 uma maior disponibilidade eletrônica existente nesta funcionalidade sendo, portanto, um grande diferencial comparativo com os derivados isoxazolínicos com função amida (benzoilamida) 40, já obtidos em nosso grupo de pesquisa. Esta disponibilidade eletrônica da função amina, poderá ser um diferencial com relação à atividade biológica, pois, ter-se-á agora um sítio para ligações de hidrogênio, importante nas interações com receptores biológicos. O. O. NHNH2. NH2. H. H. N. N O. 6. N. O. 6. N. H O. H. O. R R R = p-Cl; p-F; p-NO2. R = p-NO2; m-NO2; p-F; p-OMe; p-t-But. Amina. Amida. 41. 40. Além do mencionado acima, conforme abordado na introdução deste trabalho, substâncias contendo substituintes fenacilas ou derivados fenacilados, apresentam variadas atividades biológicas, principalmente ações sobre o sistema nervoso central. Derivados do nosso heterociclo 2-isoxazolina[3,2-d]-pirrolidina 40, apresentaram intensa atividade biológica associada ao SNC em testes de efeitos gerais. Diante dos fatos e proposição, justifica-se então, a obtenção de derivados Nfenacilados de 2-isoxazolinas[3,2-d]-pirrolidinas.. ________________________________________________________________________ 16.

(34) Nádia Lima Dias Cabral. Metodologia e Objetivos. 2.2. OBJETIVOS. 2.2.1. OBJETIVOS GERAIS. 1) Síntese de novos derivados 41 do novo heterobiciclo pirrolidino[3,2-d]isoxazolina, pela introdução de novas funcionalidades, os grupamentos N-fenacila e a função hidrazida. NH2. HN. O. C H. N N. R. O H. O 41. 2) Avaliação das atividades biológicas dos produtos finais.. 2.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. Elucidação estrutural das novas substâncias obtidas por métodos espectrométricos, como 1H RMN, 13C RMN, I.V-FT e Massas de Alta Resolução.. Avaliação da atividade antimicrobiana frente a bactérias gram positivas e gram negativas, fungos e leveduras.. Realização de estudos de Toxicidade Aguda para as novas substâncias.. ________________________________________________________________________ 17.

(35) ARTIGO.

(36) Nádia Lima Dias Cabral. Artigo submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. Síntese e avaliação preliminar do potencial biológico de novos derivados N-fenacilados do aza-biciclo pirrolidino[3,2-d]isoxazolina. Nádia Lima Dias Cabral1, Elis Carvalho Pena1, Valderes Moraes de Almeida1, Alexandre José da Silva Góes2, José Gildo de Lima1, Janete Magali de Araújo2, Ivone Antônia de Souza2 e Antônio Rodolfo de Faria1* 1. Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco, 2 Departamento de Antibióticos – Universidade Federal de Pernambuco. Substâncias que possuem o heterociclo 2-isoxazolina em suas estruturas apresentam pronunciadas e variadas atividades biológicas. Vários métodos de síntese de 2-isoxazolina são descritos na literatura, sendo o principal método e o mais utilizado, aquele que envolve reações de cicloadição 1,3-dipolar entre olefinas e N-óxidos de nitrila. Recentemente inciamos um estudo envolvendo enecarbamatos endocíclicos como dipolarófilos em reações com N-óxidos de nitrila. Os cicloadutos isoxazolínicos obtidos e seus derivados apresentaram interessantes atividades biológicas, tais como, antiinflamatória e antimicrobiana. No intuito de expandir a aplicação da metodologia desenvolvida, visamos neste trabalho a obtenção de novos derivados do biciclo pirrolidina[3,2-d]isoxazolina, Nfenacilados na posição N6, explorando-se assim, a versatilidade sintética deste novo heterociclo. Derivados ésteres (em C3) N-fenacilados (em N6), assim como uma hidrazona/ácido isoxazolínica foram obtidos e submetidos à avaliação biológica preliminar, como atividade antimicrobiana e toxicidade aguda (testes de efeitos gerais). Resultados muito promissores foram obtidos, tanto na parte sintética, assim como nos resultados preliminares de atividade biológica. Unitermos: enecarbamatos endocíclicos, 2-isoxazolina, N-fenacil derivados, hidrazona. * Correspondência Antônio Rodolfo de Faria, Av. Prof. Arthur de Sá, s/n, Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco, CEP 50470-521 – Recife-PE, Brasil e-mail: rodolfo@ufpe.br. INTRODUÇÃO Heterociclos de 5 membros, contendo átomos de oxigênio e nitrogênio ligados entre si (Katritzky et al., 1984), têm despertado grande interesse, devido às variadas atividades biológicas que estas substâncias apresentam. Dentre estes heterociclos de cinco membros, 2isoxazolinas despertam grande interesse em estratégias sintéticas devido ao fato de que inúmeras substâncias, que possuem tal heterociclo em sua estrutura, apresentam importantes atividades biológicas, tais como anti-HIV (Srivastava et al., 1999), antiinflamatória (Groutas et al., 1995), antituberculose e antitumoral (Martin et al., 1973), antidepressiva (Andrés et al., 2003), antifúngica (Basappa et al., 2003), antibacteriana (Barbachyn et al., 2003) etc... (figura 1). Vários métodos de obtenção de 2isoxazolinas e derivados são relatados na. literatura, tais como: condensação de cetonas α,β-insaturadas com hidroxilamina (Furukawa et al., 1974), ciclização desidrativa de nitroacetatos com Mn(OAc)3 (Snider et al., 2002), tratamento de ésteres alílicos com NOBF4 (Chang et al. 1999), tratamento de olefinas com nitrato cérico (IV) amoniacal (Itoh et al., 2002), a partir de olefinas e nitrocompostos (Kunetsky et al., 2003), condensação de α-nitro-ésteres com aldeídos (Chatterjee et al. 2002), síntese em fase sólida (Chandrasekhar et al., 2002), entre outros. H3N O. O H H3N. N O. núcleo 2-isoxazolina. N. C O. anti-HIV. N. Br. O. Br. H. O. N. antitumoral. antituberculose. N. Cl. CO2. O. CH2OH. Cl N. NH Bu. antifúngico. FIGURA 1 – Núcleo 2-isoxazolina e exemplos de substâncias com atividades biológicas.. ________________________________________________________________________ 18.

(37) Nádia Lima Dias Cabral. Artigo submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. Porém, o método mais extensivamente empregado, e que foi utilizado neste trabalho, consiste na reação de cicloadição 1,3-dipolar entre olefinas e N-óxidos de nitrila (Amici et al., 1996; Kozikowski et al., 1984). Como relatado anteriormente, muitas substâncias que contém o núcleo isoxazolínico são biologicamente ativas. Verifica-se na literatura, que muitas substâncias, que possuem as mais diversas funcionalidades e o grupamento fenacila, ou derivado do mesmo, como radical, também apresentam pronunciadas atividades biológicas, tais como: interferência na estrutura conformacional de fosfolipases (Wait et al., 1987), atividade fungicida (Rodríguez et al., 2000), anticarcinoma (Gul et al., 2000), inibidora enzimática de doenças neurodegenerativas (Sorrenti et al., 2001), antimicrobiana (Körsal et al., 2002), antagonista serotoninérgico (Fletcher et al., 2002), entre outras (figura 2). O. N. O. N. Br. NO2. R. Cl. O. O. CH3 CH3. O. inibidor enzimático inibidor de fosfolipase (R = resíduo de aminoácido) (doenças neurodegenerativas). fungicida Cl. O R. S. antimicrobiano. O. O N. O O. antagonista serotoninérgico. O F. O. FIGURA 2 – Exemplos de fenaciladas, biologicamente ativas. substâncias. Recentemente sintetizamos uma série de amidas derivadas dos novos heterociclos, e pirrolidino[3,2-d]isoxazolina 1a piperidino[3,2-d]isoxazolina 1b. Estas amidas apresentaram intensa atividade in vivo (Almeida et al.,2005), principalmente no sistema nervoso central, segundo testes de toxicidade aguda e também atividade antiinflamatória. Aliado ao fato de desenvolvermos novas metodologias sintéticas envolvendo enecarbamatos endocíclicos e no ensejo de analisarmos o potencial biológico de novos derivados do novo heterociclo, oriundos de enecarbamatos, vislumbramos neste trabalho a obtenção e avaliação biológica preliminar de novos derivados N-fenacilados 2 do aza-biciclo pirrolidino[3,2-d]isoxazolina (Cabral et al., 2004), para ampliarmos a aplicação sintética e biológica de nossa metodologia (figura 3).. COR2 CONH2 N N n(. ). O N. O. 1a (n = 1) 1b (n = 2). O. N X. X=O X = N-NH2. R1 R3. 2. FIGURA 3 – Derivados isoxazolínicos derivados de enecarbamatos endocíclicos. MATERIAL E MÉTODOS Parte química As reações de síntese do enecarbamato e também as reações de cicloadição são sensíveis à umidade e foram realizadas sob atmosfera de argônio, em aparato previamente seco em estufa por 4h (120°C). Clorofórmio e trietilamina foram tratados previamente com hidreto de cálcio e destilados. Tetrahidrofurano (THF) foi tratado com sódio/benzofenona e destilado imediatamente antes do uso. Acetato de etila e hexano, utilizados nas colunas cromatográficas, foram bidestilados. Quando não mencionado, reagentes e solventes foram utilizados sem prévio tratamento. Ponto de fusão foi obtido em aparelho POLAX WRS – 1, e não foi corrigido. Os espectros no infravermelho (I.V.) foram obtidos em aparelhos Bruker IFS 66 (transformada de Fourier), com as freqüências de absorção sendo expressas em cm-1, utilizando-se pastilhas ou janelas de KBr ou filme. Os espectros de 1H RMN e 13C RMN foram obtidos em aparelhos Variam Unity 300 MHz. Os deslocamentos químicos (δ) são expressos em ppm, tendo como padrão interno o tetrametilsilano para 1H RMN e tetracloreto de carbono para 13C RMN. Os sinais dos espectros de 1H RMN são designados da seguinte forma: deslocamento químico (ppm), multiplicidade (s= singleto, d= dubleto, dl= dubleto largo, t= tripleto, tl= tripleto largo, q= quarteto, dd= duplo dubleto, dt= duplo tripleto, ddl= duplo dubleto largo, m= multipleto, ml= multipleto largo, sl= sinal largo), constante de acoplamento (Hz) e números de hidrogênios. Os espectros de massas de alta resolução foram obtidos em aparelhos AUTOSPEC – MICROMASS-EBE, utilizando um potencial de ionização de 70eV.. ________________________________________________________________________ 19.

(38) Nádia Lima Dias Cabral. Artigo submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. Síntese do éster etílico do ácido 6(benziloxicarbonil)-4,5,6,6a-tetraidro-3aHpirrol[3,2-d]isoxazol-3-carboxílico 3 A uma solução do enecarbamato 1 (2,75g; 13,54 mmoles), e trietilamina (6,30 mL; 44,67 mmoles) em clorofórmio seco (45 mL), adicionou-se, à temperatura ambiente, uma solução de clorooximidoacetato de etila 2 (2,05g; 13,54 mmoles; 40 mL de CHCl3 seco) lentamente durante 1 hora. Em seguida adicionou-se um segundo e um terceiro equivalentes de clorooximidoacetato de etila nas mesmas condições acima. Após cerca de 3,5 horas de agitação, quando não mais detectou-se a presença do material de partida, fez-se uma extração com água (2x10 mL). A fase aquosa foi extraída em seguida com clorofórmio (3x 20 mL). Juntou-se as fases orgânicas e secou-se a mesma com Na2SO4. Após remoção do solvente, obteve-se um óleo amarelo, que foi submetido à cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano (35%), obtendo-se 3,55g do cicloaduto 3, correspondendo a um rendimento de 82,4 %. Rf = 0,47 (AcOEt/Hexano 1:1), 1H RMN (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.) 7,36 (m; 5H); 6,53 e 6,42 (d; J=7,5Hz; 1H; rotâmeros); 5,2 (m; 2H); 4,36 (m; 2H); 4,08 (m; 1H); 3,84 (m; 1H); 3,18 (dt; J= 11,1Hz; J= 11,1Hz; J=6,3; 1H); 2,23 (m; 2H); 1,37 (t; J=7,2Hz; 3H) Síntese do éster etílico do ácido 4,5,6,6atetraidro-3aH-pirrol[3,2-d]isoxazol-3carboxílico 4 A uma solução da isoxazolina 3 (3,55g; 11,15 mmoles) em metanol (75 mL) e Pd(OH)2 a 5% em suspensão (0,38g), sob agitação, borbulhouse hidrogênio durante 1 hora, quando não mais foi detectada a presença do material de partida. A suspensão foi filtrada em celite e após remoção do solvente, obteve-se quantitativamente 2,05g de um óleo incolor, correspondendo à isoxazolina bicíclica desprotegida 4. Rf = 0,12 (AcOEt/Hexano 35%). 1 H RMN (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.). 6,07 (d; J= 6,9Hz; 1H); 4,32 (m; 2H); 3,87 (m; 1H); 3,12 (m; 1H); 2,81 (ml; 2H); 2,07 (m; 2H); 1,35 (t; J=6Hz; 3H). APT13C RMN (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.). 160,5 (C); 152,3 (C); 100,8 (CH); 61,9 (CH2); 49,1 (CH2); 42,8 (CH); 29,9 (CH2); 14,0 (CH3) Síntese dos ésteres etílicos do ácido 6-(4-Rfenacil))-4,5,6,6a-tetrahidro-3aH-pirrol[3,2d]isoxazol-3-carboxílico 5a, 5b e 5c. A uma solução da isoxazolina bicíclica desprotegida 4 (1,50 g; 8,14 mmoles) em 75 mL de THF seco, adicionou-se uma solução do brometo de p-clorofenacila (2,0916 g; 8,958 mmoles em 35 mL de THF). Ao término da adição, a solução foi deixada sob refluxo por 5h, quando não mais detectou-se o material de partida. Após remoção do solvente, fez-se a extração com NaHCO3 5% (2 x 10 mL) e a fase aquosa foi extraída com clorofórmio (3x10 mL). Após mistura das fases orgânicas, secagen com Na2SO4 anidro e remoção do solvente, o produto bruto foi submetido à cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano 35 %), obtendo-se 1,36 g da N-(p-clorofenacil)isoxazolina 5a, correspondendo a um rendimento de 50 %. Os procedimentos para 5b e 5c são similares, utilizando os respectivos brometos ou cloretos de fenacila. Dados para 5a (p-Cl): óleo amarelo, Rf = 0,32 (AcOEt/Hexano 35%), 1H RMN (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.). 7,90 (d; J=8,7Hz; 2H); 7,44 (d; J=8,7Hz; 2H); 6,06 (d; J=7,2Hz; 1H); 4,53 (d; J=18,3Hz; 1H); 4,33 (m; 2H); 4,17 (d; J=18,3Hz; 1H); 3,96 (t; J=7,2Hz; 1H); 3,22 (t; J=7,5Hz; 1H); 2,56 (m; 1H); 2,31 (m; 1H); 2,08 (dd; J=12,9Hz; J=5,7Hz; 1H); 1,36 (t; J=7,2Hz; 3H); 13C RMN (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.) 194,4 (C=O); 160,3 (C=O); 153,0 (C=N); 139,9 (C); 133,7 (C); 129,3 (CH); 129,0 (CH); 102,9 (CH); 61,9 (CH2); 54,1 (CH2); 49,4 (CH2); 48,6 (CH); 29,2 (CH2); 14,1 (CH3). I.V. (filme, cm-1), principais sinais 2994, 2823, 1728, 1687, 1589, 1372, 1237, 1217, 1151, 996, 947, 707. HRMS Calculado: 336,08768; Encontrado: 336,08787. Dados para 5b (p-NO2): óleo amarelo, Rf = 0,25 (AcOEt/Hexano 35%), Rendimento: 46%; 1H RMN (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.) 8,30 (d;J=9,0Hz; 2H); 8,12 (d; J=9,0Hz; 2H); 6,00 (d; J=7,2Hz; 1H); 4,59 (d; J=18,6Hz; 1H); 4,33 (m; 2H); 4,24 (d; J=18,6Hz; 1H); 3,98 (t; J=7,95Hz; 1H); 3,21 (t; J=6,90Hz; 1H); 2,59 (m; 1H); 2,29 (m; 1H); 2,09 (dd; J=12,9Hz; J=5,70Hz; 1H); 1,35 (t; J=5,90Hz; 3H), 13C RMN (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.) 194,1 (C=O); 160,2 (C=O); 152,9 (C=N); 150,4 (C); 139,7 (C); 128,9 (CH); 123,9 (CH); 102,4 (CH); 62,0 (CH2); 54,6 (CH2); 49,5 (CH2); 48,6 (CH); 29,1 (CH2); 14,0 (CH3), I.V. (filme, cm-1) principais sinais 3112, 3081, 2984, 1718, 1691, 1601, 1525, 1346, 1265, 1130, 933, 857, HRMS Calculado: 347,1173; Encontrado: 347,1108. Dados para 5c (p-F): Óleo amarelado, Rf = 0,22 (AcOEt/Hexano 35%), Rendimento: 33%; 1H RMN (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.) 7,99 (dd; J = 5,4Hz; J = 8,7Hz; 2H); 7,14 (t; J = 8,4Hz;. ________________________________________________________________________ 20.

(39) Nádia Lima Dias Cabral. Artigo submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. 2H); 6,08 (d; J = 6,9Hz; 1H); 4,54 (d; J = 18,0Hz; 1H); 4,34 (m; 2H); 4,19 (d; J = 18,0Hz; 1H); 3,97 (t; J = 7,80Hz; 1H); 3,25 (t; J = 8,10Hz; 1H); 2,57 (m; 1H); 2,32 (m; 1H); 2,09 (dd; J = 5,70Hz; J = 12,90Hz; 1H); 1,36 (t; J = 7,20Hz; 3H). 13C RMN (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.) 193,8 (C=O); 167,6 (C=O); 164,2 (C=N); 156,7 (d; J = 546Hz) (CF); 131,7 (C); 130,5 (d; J = 9,3Hz) (CH); 115,8 (d; J = 21,7Hz) (CH); 102,8 (CH); 62,0 (CH2); 54,0 (CH2); 49,4 (CH2); 48,6 (CH); 29,2 (CH2); 14,0 (CH3) I.V. (filme, cm-1) principais sinais. 2978, 1719, 1695, 1593, 1503, 1367, 1262, 1217, 1151, 1123, 845. HRMS Calculado: 320,11723; Encontrado: 320,11739. Síntese do ácido 6-[2-(4-clorofenil)-2hidrazono-etil]-4,5,6,6a-tetraidro-3aHpirrolo[3,2-d]isoxazol-3-carboxílico 6 À uma solução do éster N-(p-clorofenacila) 5a (0,5927g; 1,76 mmol) em etanol (1,2 mL), adicionou-se, sob agitação, o hidrato de hidrazina a 25% (6,0 mL). Em seguida, deixouse a solução sob refluxo por 3,5h. A mistura reacional foi vertida sobre gelo, ocorrendo intensa precipitação. Centrifugou-se, obtendo-se um sólido amarelo, que foi lavado com acetato de etila. A água mãe foi resfriada e recentrifugada. O sólido obtido foi liofilizado, obtendo-se 0,3122g da hidrazona/ácido isoxazolínica 6 , correspondendo a um rendimento de 61,3%. Dados para 6: Pó amarelo-claro, Ponto de Fusão = 219°C - 221°C, Rf = 0,32 (AcOEt), 1H RMN (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.) 12,18 (sl; 2H); 8,91 (s; 1H); 7,82 (d; J = 7,8Hz; 2H); 7,53 (d; J = 7,8Hz; 2H); 4,92 (d; J = 5,7Hz; 1H); 4,25 (d; J = 19,5Hz; 1H); 4,10 (d; J = 19,5Hz; 1H); 4,15 (m; 1H); 3,63 (dd; J = 5,4Hz; J = 10,5Hz; 1H); 3,08 (t; J = 8,1Hz; 1H); 2,36 (m; 1H); 2,19 (m; 1H), ATP 13C RMN (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.) 157,4 (C=O); 154,0 (C=N); 153,0 (C=N); 135,1 (C); 133,4 (C); 128,6 (CH); 127,4 (CH); 70,9 (CH); 49,4 (CH2); 44,7 (CH2); 36,5 (CH); 28,5 (CH2), I.V. (pastilha KBr, cm-1) principais sinais 3500 – 2500 (OH); 3056; 2937; 1707; 1646; 1601; 1585; 1417; 1086; 735, HRMS Calculado: 337,11797; Encontrado: 337,11321.. Parte Biológica 1.Atividade Antimicrobiana Foi realizado teste microbiológico qualitativo, denominado de Difusão em Ágar, (Bauer et al., 1966), para as substâncias 6, 5b e 5c frente aos seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, M. luteus, Sarcina lutea, Mycobacterium smegmatis e Mycobacterim tuberculosis. Para preparação dos meios de cultura, foram utilizados os meios Mueller-Hinton e Ágar Nutritivo para avaliação da atividade antibacteriana e os meios Sabouraud e GL para atividade contra leveduras e fungos. Os inóculos microbianos foram obtidos a partir de uma cultura de 24 horas de cultivo. As suspensões foram preparadas utilizando-se água destilada esterilizada e turbidez para o grau 4, da escala de Mac Farland (Murray et al., 1995) equivalente a 107 - 108 UFC/mL. Destas suspensões, foram retiradas 100µL e devidamente transferidos para as placas de petri. Foram saturados com 60µL da solução de cada substância a ser testada, discos de papel de filtro com diâmetro de 6 mm correspondendo a 300µg de cada substância por disco e, em seguida, foram aplicados nas superfícies dos meios. Após incubação, foram efetuadas as leituras dos diâmetros dos halos de inibição em milímetros (mm). 2. Avaliação da Toxicidade Aguda (Testes de efeitos gerais) A metodologia para o protocolo experimental foi seguida conforme descrito por Karber e Behrens, 1964. Para o bioensaio da toxicidade, foram selecionados camundongos albinos Swiss (Mus musculus) com faixa etária de 60 dias e peso variando entre 25 e 35g, manipulados e mantidos conforme recomendações éticas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Foram administradas por via intraperitoneal, doses crescentes da substância 6 investigada (250 a 1250mg/kg de peso do animal), previamente solubilizada em tween 80 e solução salina 0,9%. Aos animais do grupo controle, foi administrado apenas a solução salina. A observação dos efeitos gerais foi efetuada com os animais em livre movimentação, dentro da gaiola, em superfície plana, por um período de 120 minutos. Após esse período, os animais foram ainda observados periodicamente por 72 horas.. ________________________________________________________________________ 21.

(40) Nádia Lima Dias Cabral. Artigo submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. RESULTADOS E DISCUSSÃO Parte Química O esquema 1 demonstra a rota sintética para obtenção das aza-isoxazolinas bicíclicas. O enecarbamato N-(benziloxicarbonil)-2-pirrolina 1 foi obtido a partir da pirrolidina (Kraus et al., 1981). A reação de cicloadição 1,3-dipolar entre o enecarbamato 1 e o carboetoxiformonitrila (CEFNO), obtido in situ a partir do éster etílico da glicina (Kozikowski et al., 1984), foi realizada conforme metodologia desenvolvida em nosso grupo. A aza-isoxazolina bicíclica 3 foi obtida de forma regioespecífica, sendo obtido o par d,l racêmico. Posterior reação de hidrogenólise, com Pd(OH)2 / H2, propiciou a. CO2ET. H. CO2ET. H. N. Cbz 3. H. N. H EtO2C. Cl N. 2. 1. CO2H N. O. N. H O. 4. O H N. H2NNH2. NH2. 25%. OH. N. H. N. O. N. H. CO2ET. H. N. O. N. desproteção da função amina (De Faria et al., 2002), o que levou à formação quantitativa da aza-isoxazolina bicíclica desprotegida 4. Após a desproteção, introduziu-se grupamentos fenacila na amina desprotegida (N6), utilizando-se os respectivos haletos de fenacila, substituídos em posição para. As aza-isoxazolinas bicíclicas Nfenaciladas 5 foram submetidas, em seguida, à reação com hidrato de hidrazina 25%. A reação foi executada sob refluxo, o que propiciou, para nossa surpresa, a hidrólise da função éster em C3, levando à formação do respectivo ácido e de uma função hidrazona na carbonila cetônica do grupamento fenacila 6.. 5a R = Cl 5b R = NO2 5c R = F. Cbz. R. 6. Cl. ESQUEMA 1 – Rota sintética de obtenção das aza-isoxazolinas bicíclicas N-fenaciladas. Na literatura verifica-se a formação da função hidrazida a partir de funções ésteres (Lima et al., 2000), quando se utiliza hidrato de hidrazina 80%, sob refluxo. Apesar da carbonila cetônica da função fenacila não estar protegida nesta reação, esperávamos até que não houvesse a formação da função hidrazona, devido ao grande excesso de água do meio, visto que a formação de hidrazona, na reação de hidrazinas com aldeídos ou cetonas se dá pela eliminação de água. Mesmo utilizando-se hidrato de hidrazina 25%, nas reações com as isoxazolinas. N-fenaciladas 5b e 5c (p-nitro e p-fluor, respectivamente) os produtos apresentaram grande instabilidade, apresentando degradação antes de seu isolamento. A única hidrazona/ácido isoxazolínica estável foi oriunda da isoxazolina N-p-clorofenacilada 5a. Tentou-se então posteriormente, a reação com hidrato de hidrazina 80%, porém, não se conseguiu isolar os produtos. Houve formação de material de aspecto polimérico e de degradação, impossibilitando a identificação dos mesmos.. ________________________________________________________________________ 22.

(41) Nádia Lima Dias Cabral. Artigo submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. As isoxazolinas bicíclicas descritas neste trabalho são inéditas e tiveram suas estruturas químicas elucidadas exaustivamente através de métodos de IV-FT, RMN 1H e 13C e Massas de alta–resolução. Parte Biológica 1. Atividade Antimicrobiana Foram considerados positivos os resultados cujos halos de inibição foram iguais ou superiores a 10 mm. Conforme a tabela 01, o éster 5b. .MICRORGANISMOS Staphylococcus aureus Bacillus subtilis M. luteus Sarcina lutea Mycobacterium smegmatis Mycobacterim tuberculosis. apresentou halos de inibição mais significativos para Sarcina lútea; Staphylococcus aureus; M. luteus; Bacillus subtilis (14 mm – no meio AN; 15 mm; 15 mm; 12 mm – no meio MH, respectivamente); Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium smegmatis (15 mm e 12 mm – no meio GL, respectivamente). O éster 5c para M. luteus; Sarcina lútea (10 mm – no meio AN; 10 mm – no meio MH, respectivamente) e Mycobacterium tuberculosis (25 mm – no meio GL). A hidrazona/ácido 6 apresentou atividade apenas contra M. luteus (14 mm – no meio MH).. MEIO AN MH AN MH AN MH AN MH GL GL. 6 14 14 -. Substância 5b 10 15 08 12 11 15 14 10 12 15. 5c 10 10 10 25. TABELA I – Halos de inibição em (mm) para as substâncias 5b, 5c e 6 testadas. 2. Avaliação da Toxicidade Aguda (Ensaios Preliminares) Os testes de toxicidade aguda têm por finalidade definir a amplitude da dosagem letal de uma droga administrada em dose única ou em algumas doses intercaladas por curtos intervalos de tempo. Estes testes fazem parte da triagem farmacológica inicial, durante a qual a ação da droga sobre importantes funções orgânicas (locomoção, comportamento, respiração, sinais. de vômito e convulsões) é observada (De Luca et al., 1996). As reações dos efeitos tóxicos foram verificadas pelo ensaio preliminar, conferido pela maior concentração da substância que não matou nenhum dos animais (D1). A outra fase experimental referiu-se à menor dose que foi capaz de matar todos os animais (D2). Considerando os resultados obtidos em nosso experimento, consideramos que D2 corresponderia a 1250 mg/Kg e D1 corresponderia a 500 mg/Kg. (Tabela II).. ________________________________________________________________________ 23.

(42) Nádia Lima Dias Cabral. Dose mg/Kg. 1250. 1000. 500. Artigo submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. ESTIMULANTES. DEPRESSORES. Reação de fuga, aumento da frequência respiratória e movimento de vibrissas (nos primeiros segundos). Piloereção; tremores finos; movimentos circulares; postura em garra; posição de ataque; agitação; agressividade; movimentos estereotipados; ereção de cauda. Tremores grosseiros (após 5 min. da administração). Superexcitação; reação de saltos; taquicardia e taquipnéia. Convulsão tônico-clônica em um animal e convulsão generalizada nos demais (após 5 min. da administração).. Paralisia espástica (após 9 min. da administração). 5 óbitos (após 6 min.) e um (após 1h). Todos os animais foram a óbito.. Sonolência e paralisia espasta (após 10 min., verificando-se Reação de fuga; aumento da frequência respiratória; novamente após 50 piloereção; tremores finos; movimento de vibrissas; min. da movimentos circulares; postura em garra; agitação; administração); movimentos estereotipados; ereção de cauda. Tremores Apnéia (após 40 grosseiros e espasmos (após 15 min. da min). Paralisia de administração). Superexcitação; animal salta da gaiola membros posteriores aproximadamente 4 vezes (após 20 min. da e anteriores (após administração). Convulsão clônica (após 30 min.); 20h da convulsão tônico-clônica (após 35 min.); convulsão administração); Um generalizada (após 45 min. em apenas um dos óbito (após 45 min.) animais). e quatro óbitos (dentro das 24h após a administração) totalizando 5 óbitos. Reação de fuga; aumento da frequência respiratória; piloereção; tremores finos; movimento de vibrissas; movimentos estereotipados e ereção de cauda (nos primeiros minutos). Animal tenta saltar da gaiola (após 40 min. da administração).. Reação de fuga; movimentos circulares; postura em garra; aumento da frequência respiratória; 250. movimentos estereotipados; ereção de cauda. Espasmo seguido de contorções (verificado em apenas um animal a partir do décimo minuto). Piloereção e movimento de vibrissas; tremores finos. Convulsão clônica (após 40 min. em apenas um dos animais).. OUTROS EFEITOS Excreção fecal e ausência de diurese (nos primeiros segundos). Alteração da marcha; abaixamento de membros posteriores.. Excreção fecal e abaixamento dos membros posteriores (nos primeiros segundos); diurese e contorções (nos primeiros minutos); palidez (após 15 min.).. Contorções (após 5 min. da administração). Sonolência (após 30 Todos os animais min. da apresentaram administração). sinais de recuperação 1h após a administração. Contorções iniciando-se após 10 min da administração e se Sonolência (após 55 repetindo por min. da muitas vezes. administração). Reação cutânea. Refluxo (em apenas um animal após 20 min). Palidez auricular.. TABELA II - Efeitos observados da substância 6 em camundongos após sua administração por VIP.. ________________________________________________________________________ 24.