UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
MILENA AGUIAR BRAGA
ESTUDO DE MECANISMOS PRÓ-INFLAMATÓRIOS E LEISHMANICIDAS DE ASTRONIUM FRAXINIFOLIUM SCHOTT IN VITRO
FORTALEZA 2018
MILENA AGUIAR BRAGA
ESTUDO DE MECANISMOS PRÓ-INFLAMATÓRIOS E LEISHMANICIDAS DE
ASTRONIUM FRAXINIFOLIUM SCHOTT IN VITRO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Doutora em Biotecnologia. Área de concentração: Desenvolvimento de agentes profiláticos, terapêuticos e testes diagnósticos.
Orientadora: Profa. Dra. Aparecida Tiemi Nagao-Dias.
Coorientadora: Profa. Dra. Flávia Almeida Santos.
FORTALEZA 2018
B794e Braga, Milena Aguiar.
Estudo de mecanismos pró-inflamatorios e leishmanicidas de Astronium fraxinifolium schott in vitro / Milena Aguiar Braga. – 2019.
114 f. : il. color.
Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (Rede Nordeste de Biotecnologia), Fortaleza, 2019.
Orientação: Profa. Dra. Aparecida Tiemi Nagao-Dias. Coorientação: Profa. Dra. Flávia Almeida Santos.
1. Astronium fraxinifolium. 2. Leishmania (Vianna) braziliensis . 3. Células RAW 264.7. 4. Atividade leishamnicida. 5. Atividade pró-inflamatória. I. Título.
MILENA AGUIAR BRAGA
ESTUDO DE MECANISMOS PRÓ-INFLAMATORIOS E LEISHMANICIDAS DE
ASTRONIUM FRAXINIFOLIUM SCHOTT IN VITRO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Doutora em Biotecnologia. Área de concentração: Desenvolvimento de agentes profiláticos, terapêuticos e testes diagnósticos.
Aprovada em: 08/03/2018
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________ Profa. Dra. Aparecida Tiemi Nagao-Dias (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________________ Profa. Dra. Flávia Almeida Santos (Coorientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________________ Profa. Dra. Selene Maia de Morais
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
______________________________________________ Prof. Dr. Gandhi Rádis Baptista
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________________ Profa. Dra. Maria Jania Teixeira
Universidade Federal do Ceará (UFC)
______________________________________________ Profa Dra. Alba Fabiola Costa Torres
A Deus.
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter sempre me iluminado durante essa trajetória e ter colocado em meu caminho pessoas iluminadas.
Aos meus pais, Carlos e Francisca, por serem o meu maior e melhor exemplo de vida.
À minha irmã, Liana, uma das maiores incentivadoras desse trabalho, por me inspirar a crescer, superar meus limites.
À minha orientadora, Profa. Dra. Aparecida Tiemi Nagao-Dias, por todo o empenho e decicação, não apenas comigo, mas com todos que solicitam sua ajuda, sendo um exemplo a ser seguido.
À Profa. Flávia Almeida Santos, Profa. Maria Jania Teixeira e Profa. Dr. Selene Maia de Morais por me acolherem tão afetuosamente em seus respectivos laboratórios para a execução desse trabalho, por todo o suporte técnico-científico, paciência, ensinamentos e sabedoria.
Aos membros da banca examinadora, Prof. Dr. Gandhi Rádis Baptista, Dra. Alba Fabiola Costa Torres, Profa. Maria Jania Teixeira e Profa. Dr. Selene Maia, por terem aceitado gentilmente participar da avaliação desse trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Imunologia, Laboratório de Produtos Naturais e Laboratório de Parasitologia, pela amizade, companheirismo e grandes momentos de aprendizado compartilhados.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico – FUNCAP e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES pelo auxilio financeiro.
RESUMO
Astronium fraxinifolium Schott (Anacardiaceae), conhecida como Gonçalo-alves, é uma planta
medicinal utilizada no tratamento de bronquite, tuberculose pulmonar, diarreia e hemorróidas. Apesar do amplo uso popular, estudos sobre suas atividades biológicas ainda são escassos, não havendo conhecimento sobre sua atuação no sistema imunológico. A inflamação é uma resposta protetora do organismo ao estresse causado por estímulos como infecção ou exposição a lipopolissacarídeos (LPS). Macrófagos desempenham um papel importante nesse processo. As células, tais como células RAW 264.7, são amplamente utilizadas em estudos pró ou antiinflamatórios bem como em estudos sobre ação leishmanicida. A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada considerada um problema de saúde pública. Uma das espécies causadoras da leishmaniose cutânea e mucocutânea é a Leishmania (Vianna) braziliensis. Em busca de aperfeiçoar a terapia existente, há necessidade de pesquisa de novos medicamentos alternativos com alta capacidade leishmanicida, com propriedade de estimular a resposta imune e com baixos efeitos colaterais. Dessa forma, no presente trabalho propõe se avaliar mecanismos pró-inflamatorios e leishmanicida de A. fraxinifolium. Inicialmente, realizou-se a caracterização fitoquímica do extrato etanólico da entrecasca de A. fraxinifolium (EEAF) por cromatografia líquida de alta eficiência. Seu potencial antioxidante foi mensurado pela capacidade de inibir a produção de radicais livres DPPH e ABTS. Para investigar sua atividade pró-inflamatória, foi realizado o teste de viabilidade celular. Avaliou-se a produção de óxido nítrico (NO), TNF-α e TGF-β em sobrenadantes de células RAW 264.7 estimuladas com LPS, com e sem tratamento com EEAF (31.25; 62.5 e 125 µg/mL). A expressão de RNA mensageiro para COX-2, iNOS e TGF-β também foi avaliada. Para a pesquisa da atividade leishmanicida do EEAF, o extrato (31.25; 62.5 e 125 µg/mL) foi incubado com formas promastigotas de L.(V.)
braziliensis e, posteriormente com macrófagos infectados com as formas amastigotas. A
produção de ânion superóxido foi dosado, bem como os níveis de TNF-α, 12p40, 4, IL-10 e TGF-β foram avaliados, assim como a expressão de mRNA para COX-2, iNOS. Foi avaliada também a presença aumentada de lisossomos. Entre os constituintes identificados no extrato o ácido cafeico, a quercetina seguida de orientina e ácido ρ-cumárico foram os principais compostos. O EEAF não demonstrou atividade antioxidante significativa. Em células estimuladas por LPS tratadas com EEAF, foi observada alta produção de NO e expressão de mRNA para COX-2, níveis elevados de TNF-α e reduzidos de TGF-β, comparados aos controles estimulados com LPS e não tratados. Quanto à avaliação da função leishmanicida, o EEAF
reduziu significativamente o número de promastigotas e de amastigotas, promovendo a diminuição da produção de ânion superóxido. Na concentração de 125 μg/mL, EEAF induziu aumento dos níveis de TNF-α, IL-12p40 e expressão de mRNA para COX-2. Observou-se ainda redução dos títulos de TGF-β, IL-4 e expressão de mRNA para iNOS nas células infectadas. Além disso, evidenciou-se aumento da marcação de lisossomos nas células infectadas e tratadas com EEAF 125 μg/mL. Desta forma, podemos concluir que Astronium fraxinifolium (Schott) Spreng é um potencial candidato a ser utilizado em protocolos experimentais de leishmanioses cutâneas, uma vez que demonstrou uma capacidade pró-inflamatória e atividade leishmanicida importantes.
Palavras-chave: Astronium fraxinifolium. Leishmania (Vianna) braziliensis. Células RAW 264.7. Atividade leishamnicida. Atividade pró-inflamatória. Lipopolissacáride.
ABSTRACT
Astronium fraxinifolium Schott (Anacardiaceae), known as Gonçalo-alves, is a medicinal plant
used in the treatment of bronchitis, pulmonary tuberculosis, diarrhea and hemorrhoids. Despite its wide popular use, studies on its biological activities are still few. There is no knowledge about its performance in the immune system. Inflammation is a protective response of the body to stress caused by stimuli such as infection or exposure to lipopolysaccharides (LPS). Macrophages play an important role in this response. Cells, such as RAW 264.7 cells, are widely used in pro or anti-inflammatory studies as well as in leishmanicidal activity studies. Leishmaniasis is a neglected tropical disease considered a public health problem. One of the species that causes cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis is Leishmania (Vianna)
braziliensis. In order to improve existing therapy, there is a need to research new alternative
drugs with high leishmanicidal capacity, with the property of stimulating the immune response and with low side effects. Thus, the present work proposed to evaluate the pro-inflammatory and leishmanicidal mechanisms of A. fraxinifolium. Initially, the phytochemical characterization of the ethanolic extract of A. fraxinifolium (EEAF) was performed by high performance liquid chromatography. Its antioxidant potential was measured by the ability to inhibit the production of free radicals DPPH and ABTS. To investigate its proinflammatory activity, the cell viability assay was performed. The production of nitric oxide (NO), TNF-α and TGF-β were evaluated in supernatants of LPS-stimulated RAW 264.7 cells with or without EEAF treatment (31.25, 62.5 and 125 μg/mL). The expression of messenger RNA for COX-2, iNOS and TGF-β were also evaluated. For the leishmanicidal activity of the EEAF, the extract (31.25, 62.5 and 125 μg/mL) was incubated with promastigote form of L. (V.) braziliensis and later with macrophages infected with the amastigote forms. The production of superoxide anion was measured, as well as the levels of TNF-α, IL-12p40, IL-4, IL-10 and TGF-β were evaluated as well as mRNA expression for COX-2, iNOS. The increased presence of lysosomes was also evaluated. Between constituents identified in the extract caffeic acid, quercetin followed by orientin and ρ-coumaric acid were the major compounds. The EEAF did not demonstrate significant antioxidant activity. High NO production and expression of mRNA for COX-2, elevated levels of TNF-α and reduced TGF-β were observed in LFA-stimulated LPS cells compared to LPS-stimulated and untreated controls. Regarding the evaluation of the leishmanicidal function, the EEAF significantly reduced the number of promastigotes and amastigotes, and promoted the increase of superoxide anion production. At the concentration
of 125 μg/mL, EEAF induced levels of TNF-α, IL-12p40 expression of mRNA for COX-2. Reduced titers of TGF-β, IL-4 and mRNA expression for iNOS were also observed in infected cells. In addition, there was a marked increase in lysosomal labeling in infected and treated cells with 125 μg/mL EEAF. In this way, we can conclude that Astronium fraxinifolium (Schott) Spreng is a potential candidate to be used in protocols of cutaneous leishmaniasis, since it demonstrated an important pro-inflammatory and leishmanicidal activities.
Keywords: Astronium fraxinifolium. Leishmania (Vianna) braziliensis. RAW 264.7 cells. Leishmanicidal activity. Proinflammatory activity. Lipopolysaccharides.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 − Tipos de células T. As células T CD4 + são estimuladas por células apresentadoras de antígeno em ambiente de citocinas que induzem diferenciação e proliferação de um determinado tipo celular ... 18 Figura 2 − Casos confirmados de leishmaniose tegumentar americana, Brasil – 1980 a
2014 ... 25 Figura 3 − Casos de leishmaniose cutânea, de acordo com sub-região das Américas, 2001
-2015... 26 Figura 4 − Ciclo da leishmaniose... 30 Figura 5 − Fotografia de A. fraxinifolium. A: Planta A. fraxinifolium; B: Folhas e flores
de A. fraxinifolium... 34 Figura 6 − Estruturas moleculares dos padrões pesquisados... 41
LISTA DE TABELA
Tabela 1 − Moléculas alvo com suas temperaturas de anelamento otimizadas e o número de ciclos de amplificação utilizados no PCR... 46
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABTS 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
cNOS Óxido nítrico sintase constitutiva COX-2, Ciclooxigenase 2
DMEM Meio Dulbecco MEM
DMSO Dimetilsulfóxido
DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
EEAF Extrato Etanólico da Entrecasca de Astronium fraxinifolium ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ERN Espécies Reativas de Nitrogênio ERO Espécies Reativas de Oxigênio H2O2 Peróxido de Hidrogênio
IFN-γ Interferon gama
IKK Enzima IκB quinase
IL Interleucina
iNOS Óxido Nítrico Sintetase Induzida IκB Inibidor de kappa B
LC Leishmaniose Cutânea
LMC Leishmaniose Mucocutânea
LOD Limite de Detecção
LOQ Limite de Quantificação
LPS Lipopolissacarídeo
LTA Leishmaniose Tegumentar Americana
LV Leishmaniose Visceral
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenilbrometo de tetrazolina N.N.N Neal, Novy, Nicolle
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase NBT Cloreto de Nitro-Blue Tetrazólio
NFκB Fator Nuclear Kappa B
NK Natural Killer
NO Óxido Nítrico
RNA Ácido Ribonucléico
SBF Soro Bovino Fetal
Teff Célula T Efetora
TGF-β Fator de Transformação do Crescimento Β
Th T Helper (T Auxiliar
TLR Toll-Like Receptor
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
tR Tempo de Retenção
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 17
1.1 Inflamação e resposta imune ... 17
1.2 Leishmaniose ... 23
1.2.1 Aspectos gerais da leishmaniose ... 23
1.2.2 Epidemiologia da leishmaniose ... 24
1.2.3 Protozoário do gênero leishmania ... 26
1.2.4 Fisiopatogenia da leishmaniose ... 27
1.2.5 Tratamento da leishmaniose ... 30
1.3 Plantas medicinais ... 31
1.3.1 Astronium fraxinifolium Schott ex.Spreng ... 33
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS ... 36 2.1 Justificativa ... 36 2.2 Objetivos ... 36 2.2.1 Objetivo geral ... 36 2.2.2 Objetivos específicos ... 36 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 38
3.1 Obtenção e preparação do EEAF ... 38
3.2 Análise fitoquímica do EEAF ... 38
3.2.1 Quantificação de fenóis totais ... 38
3.2.2 Quantificação de flavonoides ... 38
3.2.3 Quantificação de taninos ... 39
3.2.4 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ... 39
3.3 Avaliação da atividade antioxidante de EEAF ... 42
3.3.1 Avaliação da capacidade antioxidante através do 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) ... 42
3.3.2 Avaliação da capacidade antioxidante através do 2,2´-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS) ... 42
3.4 Atividade in vitro de EEAF em células RAW 264.7 ... 43
3.4.1 Preparação da amostra ... 43
3.4.2 Linhagem celular ... 43
3.5 Atividade de EEAF em células ativadas por LPS ... 44
3.5.1 Determinação da produção de Óxido Nítrico ... 44
3.5.2 Dosagem das citocinas TNF-α e TGF-β ... 45
3.5.3 Expressão de RNA mensageiro para COX-2, iNOS e TGF-β ... 45
3.5.4 Detecção de COX-2 por Western blot ... 46
3.6 Atividade de EEAF frente a Leishmania (Viannia) braziliensis ... 47
3.6.1 Parasito ... 47
3.6.2 Avaliação da atividade de EEAF contra formas promastigotas ... 47
3.6.3 Modelo de infecção de Leishmania (Viannia) braziliensis em células RAW 264.7 ... 48
3.6.4 Avaliação da atividade contra formas amastigotas ... 49
3.6.5 Ensaio de redução do cloreto de nitro-blue tetrazólio (NBT) ... 49
3.6.6 Dosagem de citocinas IL-12, TNF-α, TGF-β, IL-10, IL-4 ... 49
3.6.7 Expressão de RNA mensageiro para COX-2 e iNOS ... 50
3.6.8 Coloração de lisossomos ... 50
3.7 Análise Estatística ... 51
4 ARTIGO I - SUBMETIDO À FITOTERAPIA ... 52
4.1 Pro-inflammatory activity of Astronium fraxinifolium Schott on lypopolysaccharide- stimulated RAW 264.7 cells ... 52
5 ARTIGO II – EM ELABORAÇÃO ... 77
5.1 In Vitro Leishmanicidal Activity of Astronium fraxinifolium (Schott) against Leishmania (Viannia) braziliensis ... 77
5.1.1 Mechanisms of leishmanicidal activity of Astronium fraxinifolium (Schott) against Leishmania (Viannia) braziliensi ... 77
6 CONCLUSÃO ... 98
REFERÊNCIAS ... 99
1 INTRODUÇÃO
O processo inflamatório é um mecanismo complexo que envolve ativação e regulação de células em resposta a estímulos. Participam da resposta inflamatória células e moléculas (SHIN et al., 2017). Em patologias infecciosas crônicas, como as leishmanioses, ocorre um processo de modulação da resposta inflamatória de forma a favorecer a perpetuação da infecção (SHIRIAN et al., 2014).
A leishmaniose é uma antropozoonose causada por protozoários do gênero
Leishmania, considerada uma das mais importantes doenças tropicais negligenciadas
(CARVALHO et al., 2017). É um protozoário pertencente à família Trypanosomatidae, parasito intracelular obrigatório das células do sistema fagocítico mononuclear. A L. (V.)
braziliensis foi a primeira espécie de Leishmania descrita como agente etiológico da
Leismaniose Tegumentar America (LTA) (ORYAN; AKBARI, 2016). Estudos comprovam que as respostas imunes inatas e adaptativas estão implicadas diretamente na resistência ou na susceptibilidade à infecção (ZAMORA-CHIMAL et al., 2017).
Em busca de alternativas a terapia convencional, a pesquisa por novos medicamentos que estimulem simultaneamente a imunidade celular e possuam atividade leishmanicida são de grande importância para a população acometida.
Alguns estudos evidenciam ação direta e indireta de produtos de origem vegetal sobre o parasito. Dentre as diversas plantas com potencial leishminicida, a Astronium
fraxinifolium Schott ex. Spreng, conhecida como gonçalo-alves, teve destaque. Na literatura,
encontram-se várias pesquisas que relatam funções biológicas de espécies de Anacardiaceae como, atividade antibacteriana do óleo essencial de Astronium fraxinifolium contra Escherichia
coli, Bacillus cereus e Staphylococcus (MONTANARI et al., 2012).
1.1 Inflamação e resposta imune
O processo inflamatório é um mecanismo complexo que envolve ativação e regulação de células em resposta a estímulos. É considerado um mecanismo de defesa do organismo contra patógenos e toxinas, sendo benéfico quando regulado. No entanto, em casos em que o processo não é controlado, a inflamação resulta em danos celulares e teciduais, bem como pode levar à perpetuação da mesma (ARULSELVAN et al., 2016). Participam da resposta inflamatória células tais como neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, mastócitos, linfócitos Natural killer (NK), além de moléculas, tais como óxido nítrico (NO), prostaglandina
E2 (PGE2) e citocinas, entre elas, fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β), IL-12, IL-6 (SHIN et al., 2017).
Citocinas são proteínas com uma variedade de estruturas e funções, podendo ser produzidas por células imunes e não imunes. Desempenham um papel fundamental no organismo, seja induzindo atividades pró-inflamatórias ou anti-inflamatórias, além de contribuir expressivamente em processos de maturação e diferenciação de células (BEHZADI
et al., 2016; YUZHALIN; KUTIKHIN, 2012).
Os linfócitos T auxiliares ou helper expressam CD4 e são importantes fontes de produção de citocinas. Eles podem ser divididos em pelo menos 3 subtipos de células conhecidas como linfócitos T helper 1 (Th1), T helper 2 (Th2) e 17 (Th17) (CHEN, 2007) (Figura 1).
Figura 1 – Tipos de células T. As células T CD4 + são estimuladas por células apresentadoras de antígeno em ambiente de citocinas que induzem diferenciação e proliferação de um determinado tipo celular.
Fonte: Ruyssers et al. (2008) com modificações.
Além desses perfis, há o subtipo T regulatório (Treg), que apresenta propriedades imunossupressoras importantes para o controle de doenças auto-imunes (LEE et al., 2017). As células Treg inibem as respostas imunes por uma variedade de mecanismos, incluindo a secreção de citocinas antiinflamatórios tais como interleucina 10 (IL-10), fator de crescimento tumoral β (TGF- β) e IL-35 (VIGNALI et al., 2008). Além disso, as células Treg expressam
altos níveis de IL-2R, diminuindo os níveis de IL-2, um fator de crescimento para célula T efetora (Teff). As células Treg também destroem células Teff diretamente através da via FasL-Fas produzindo citotoxicidade mediada por perforinas e granzimas, interrompendo seu metabolismo celular (HASENKRUG et al., 2018) .
Linfócitos do perfil Th1 secretam citocinas pró-inflamatórias, tais como IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β, sendo responsáveis pela imunidade mediada por células. Exercem papeis fundamentais na resposta imune contra patógenos intravesiculares, entre eles,
Mycobacterium tuberculosis, M. leprae e leishmania (BLOOM; MODLIN, 2015), e contra
patógenos intracelulares, como vírus e Toxoplasma gondii (OLGUÍN et al., 2015).O perfil Th2 regula o perfil Th1 e contribui com a imunidade humoral, induzindo produção de anticorpos. As citocinas secretadas são principalmente IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 (CHEN, 2007). Participam em processos alérgicos, helmintíases e em circunstâncias em que há modulação de resposta imune celular, como no caso de hanseníase multibacilar (SAINI et al., 2017), leishmaniose difusa (ALBUQUERQUE et al., 2017), tuberculose disseminada (SHINKAI et
al., 2002).
Linfócitos Th17 são as principais fontes de IL-17 e também de IL-21 e IL-22 (BETTELLI et al., 2007). A IL-17 é uma citocina pró-inflamatória que atua sobre várias células, induzindo-as a produzirem outra variedade de citocinas (IL-6, IL-8, GM-CSF, GCSF), quimiocinas (CXCL1, CXCL10) e metaloproteinases. Entre as principais funções desse perfil, está a ativação e quimiotaxia de neutrófilos para sítios de inflamação (BETTELLI et al., 2007; BAETEN; KUCHROO, 2013).
A diferenciação de linfócitos em Th1 ou Th17 depende majoritariamente da exposição local à determinadas citocinas, tais como 12, que induz o perfil Th1 enquanto IL-6 e IL-21 induzem o perfil Th17 (NALBANT; ESKIER, 201IL-6). IL-23 é outra citocina importante para a diferenciação e manutenção dos linfócitos Th17 (PIDALA et al., 2017).
O perfil Th1 pode induzir aumento da produção de IL-23 em resposta a sinais exógenos ou endógenos (MA et al., 2015). IL-23 apresenta a subunidade p40, também presente na interleucina 12, mas a IL-12 possui a subunidade p19, que a distingue da IL-23 (MCGEACHY et al., 2009). Embora as células Th17 tenham sido descritas pela primeira vez como um subconjunto de células T helper que podem ter atuação em doenças auto imunes (BETTELLI et al., 2007), esse subtipo também desempenha um papel importante na depuração de tipos específicos de agentes patogênicos que requerem uma resposta inflamatória maciça (KORN et al., 2009; BANERJEE et al., 2016).
Os macrófagos estão presentes em todos os tecidos de vertebrados, de modo que diferentes estímulos afetam de maneira distinta seus fenótipos (HIRAYAMA et al., 2018). Desempenham funções fundamentais na manutenção da homeostase através da eliminação de metabólitos e na reparação tecidual, também atuam na defesa contra patógenos. Elas destacam-se pela ingestão e morte de microrganismos através do processo de fagocitodestacam-se, e eliminação dos mesmos, através de mecanismos dependentes e independentes de oxigênio, além de produzirem citocinas e quimiocinas (FUJIWARA; KOBAYASHI, 2005).
Dentre as linhagens imortalizadas de macrófagos disponíveis em laboratório, as células RAW 264.7, oriundas de células tumorais peritoneais de camundongos induzidas pelo vírus Abelson murine leukemia (RASCHKE et al., 1978), são frequentemente utilizadas em estudos que avaliam o papel dos macrófagos na resposta imune (HARTLEY et al., 2008). Além disso, outros fatores que contribuem para sua larga utilização incluem alta taxa de fagocitose e de multiplicação, facilidade de cultivo, além de serem células aderentes (SHIN et al., 2006). Em muitos laboratórios, células RAW 264.7 são escolhidas para estudos de sinalização celular, pois apresentam metabolismo que mimetiza aquele apresentado por macrófagos de culturas primárias, porém não sofrem declínio no seu crescimento, por serem imortalizadas (LIU et al., 2012).
O lipopolissacarídeo (LPS), componente da membrana celular externa de bactérias Gram-negativas, estimula a atividade de macrófagos, levando à produção e secreção de citocinas pró-inflamatórias e de seus mediadores. Dessa forma, a estimulação de macrófagos por LPS tem sido amplamente utilizada em modelos experimentais que avaliam mecanismos relacionados com inflamação (ZHOU et al., 2017).
O processo de produção de citocinas está associado com fatores de transcrição (HAO; BALTIMORE, 2009), tais como o fator nuclear kappa B (NFκB), que regula a expressão de genes envolvidos na transcrição de diferentes moléculas pró-inflamatórias e inflamatórias como citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão e diferentes enzimas (HE; KING, 2004). O NFκB participa no controle de respostas a estímulos como radicais livres, citocinas, radiação ultravioleta, antígenos virais e bacterianos. Em sua forma inativa, ele está localizado no citoplasma como heterodímero composto por dois polipeptídeos de 50 kDa (p50) e 65 kDa (p65) ligados a uma família de inibidores de F− (IB) (BEHZADI et al., 2016).
Em resposta à exposição a um determinado estímulo, por exemplo, LPS, IB sofre fosforilação em seu domínio N-terminal através da enzima IB quinase (IKK), havendo a translocação do heterodímero NF-B para o núcleo (CHEN et al., 1998; KIM et al., 2013).
Dessa forma, o NF-B livre liga-se à regiões promotoras de genes alvo, induzindo a codificação de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, IL-6 (LIANG et al., 2004). NF-B também pode induzir a produção de enzimas pro-inflamatórias, entre elas a ciclooxigenase 2 (COX-2) e a óxido nítrico sintase induzível (iNOS) (KARIN; GRETEN, 2005).
Os radicais livres, tais como espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERN) podem ser produzidos através do metabolismo celular ou induzidos por fontes exógenas. Durante o processo de fagocitose de patógenos ocorre a explosão respiratória celular através da ativação do complexo enzimático nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH), gerando numerosos precursores oxidantes como parte da resposta a estímulos nocivos, entre eles, peróxido de hidrogênio (H2O2), ânion superóxido
(O2-) e óxido nítrico (NO) (KAUFMANN; DORHOI, 2016). O NO é um radical livre altamente
reativo, lábil e de curta duração, e pode se combinar com ânion superóxido, levando à produção de peroxidonitrito, potente molécula antimicrobiana (AHMAD et al., 2017). O NO é produzido a partir da L-arginina, por ação da enzima óxido nitrico sintase (NOS), que compreende três isoformas, ou seja, oxido nítrico sintase neuronal (nNOS), oxido nítrico sintase constitutiva (cNOS) e óxido nítrico sintase induzível (iNOS). Estas enzimas estão presentes em numerosas células de mamíferos, no entanto, a produção da iNOS ocorre em condições inflamatórias, após estimulação celular ou microbiana (LEE et al., 2016). Uma vez produzida, iNOS sintetiza uma grande quantidade de NO (FORBES et al., 2013).
A citocina TNF-α é considerada um dos principais mediadores da inflamação na lesão tecidual. Ela induz produção de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos, induz a produção de fatores que levam à diferenciação da linhagem mielocítica na medula óssea, induz aumento de expressão de moléculas de adesão endotelial, é quimiotático para neutrófilos, induz a expressão de iNOS. Seus níveis elevados, no entanto, podem estar correlacionados com gravidade da resposta inflamatória (AHMAD et al., 2017).
A interleucina 4 (IL-4) é secretada por basófilos (VAN PANHUYS et al., 2011), mastócitos (PLAU et al., 1989), eosinófilos (SABIN et al., 1996), células natural killer T (NKT) e células T (AKBARI et al., 2003). É uma citocina que induz resposta relacionada ao perfil Th2, e participa da resposta imune humoral (PONOMAREV et al., 2007; PARSA et al., 2012), inibe a expressão de óxido nítrico sintase induzível (iNOS), e inibea produção de NO e IFN-γ (HURDAYAL; BROMBACHER, 2017). Quando se trata de doenças infecciosas como a leishmaniose, a citocina está relacionada com a progressão da doença (YANG et al., 2017).
A interleucina-12 (IL-12) é uma família de citocinas heterodiméricas (BEHZADI
diferentes subunidades dessa família resulta na produção de quatro citocinas, ou seja, IL-12 (p35/p40), IL-23 (p19/p40), IL-27 (p28/EBI3) e IL-35 (p35/EBI3) (GORIELY et al., 2008; CHUNG et al., 2013). Monócitos /macrófagos e células dendríticas (DCs) são as principais produtoras de IL-12, IL-23 e IL-27 (MA et al., 2016). A IL-12 é uma molécula pró-inflamatória, pois ativa células natural killer (NK) e promove a diferenciação de Th1, sendo de fundamental importância na resposta imune celular contra patógenos (TRINCHIERI, 1994; MA
et al., 2016).
As ciclooxigenases (COX) apresentam duas principais isoformas denominadas de COX-1 e COX-2. Elas atuam na conversão do ácido araquidônico em prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos (prostanoides), que são uma família mediadores lipídicos gerados em resposta a estímulos inflamatórios (SMYTH et al., 2009). As enzimas COX existem nas formas constitutivas e induzíveis. A COX-1 é uma enzima constitutiva, expressa em várias células e produz prostanoides na maioria dos tecidos (KIRKBY et al., 2016). É considerada uma molécula protetora devido ao seu papel na homeostase do tecido, através de modulação da proliferação celular, angiogênese e agregação plaquetária, pela produção de tromboxano (CHANDRASEKHARAN; SIMMONS, 2004). Diferentemente da forma constitutiva, a enzima COX-2 é uma isoforma induzível (BISHOP-BAILEY et al., 2006). Sua expressão é aumentada através de estímulos extracelulares ou intracelulares em resposta a LPS, IL-1, TNF-α, fator de agregação plaquetária (PAF) (MEDEIROS et al., 2010; FONT-NIEVES et al., 2012). A superexpressão da COX-2 está principalmente associada com respostas inflamatórias exacerbadas (LIND et al., 2017).
O fator de crescimento β (β) possui três isoformas β1, β2 e TGF-β3, sendo moléculas com efeitos pleiotrópicos que regulam fisiologicamente diversas respostas biológicas, incluindo proliferação, migração, diferenciação celular e atuam na manutenção da homeostasia (HINCK et al., 2016). A ativação patológica do TGF-β leva à alterações na sua produção relacionadas a várias enfermidades, incluindo neoplasias, fibrose e doenças auto-imunes (MORIKAWA et al., 2016). Foi demonstrado que o aumento de espécies reativas de oxigênio diminui a atividade de TGF-β (HAN et al., 2005; QUAN; FISHER, 2015), e, ainda, que camundongos com deficiência de TGF-β1 desenvolvem inflamação maciça, evidência que caracteriza sua propriedade antiinflamatória (KULKARNI et al., 1993; KIRITSI; NYSTRÖM, 2017). A sinalização de TGF-β é desencadeada após sua ligação aos receptores trans-membrânicos do tipo I (TGF-βRI) ou do tipo II (TGF-βRII), sendo o sinal transmitido por moléculas intracelulares (ZHANG, 2017). As proteínas Smad são os principais mediadores da sinalização do TGF-β para controlar a transcrição de seus genes alvo (DERYNCK et al., 2014).
A IL-10 é uma citocina produzida por uma grande variedade de células, tais como, células dendríticas, macrófagos, mastócitos, células NK, eosinófilos, linfócitos B, linfócitos T CD4 + perfil T regulador (MAURI; BOSMA, 2012). É um componente crítico na manutenção do equilíbrio entre a resposta contra patógenos e controle de danos teciduais. Sua função é limitar a ativação exacerbada de células imunes, de forma a manter a homeostase, regulando a diferenciação ou proliferação de células B, células NK, células T citotóxicas e auxiliares, mastócitos, granulócitos, células dendríticas, células endoteliais (MOORE et al., 2001). A IL-10 é de vital importância na proteção do hospedeiro em doenças autoimunes, alergias entre outras (MA et al., 2016).
Em patologias infecciosas crônicas, como as leishmanioses, ocorre um processo de modulação da resposta inflamatória de forma a favorecer a perpetuação da infecção. Essa característica é relevante principalmente pelo fato da Leishmania ser um patógeno intra-vesicular (SHIRIAN et al., 2014).
1.2 Leishmaniose
1.2.1 Aspectos gerais da leishmaniose
A leishmaniose é uma antropozoonose causada por protozoários do gênero
Leishmania, considerada uma das mais importantes doenças tropicais negligenciadas
(CARVALHO et al., 2017). É um problema de saúde pública com alta morbidade e mortalidade, além da ampla incidência epidemiológica (KEDZIERSKI, 2010). Essa patologia é caracterizada pela grande diversidade clínica que depende das espécies de Leishmanias envolvidas e da resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. Seu complexo ciclo de transmissão inclui diferentes espécies de parasitos, reservatórios e vetores. Existem três tipos de manifestações clínicas principais: visceral (LV), cutânea (LC) e mucocutânea (LMC), sendo a LC a forma mais comum. Nas Américas a LC é conhecida como Leismaniose Tegumentar America (LTA) é causada por diferentes espécies do gênero Leishmania, que acometem pele e mucosas (PAHO/WHO, 2017).
1.2.2 Epidemiologia da leishmaniose
Estima-se que existam 350 milhões de pessoas em risco de contrair a leishmaniose e dois milhões de novos casos ocorrem a cada ano. É uma patologia endêmica em mais de 98 países, afetando principalmente países da África, Ásia e América Latina (PAHO/WHO, 2017).
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) constitui um problema de saúde pública em 85 países, distribuídos em quatro continentes (Américas, Europa, África e Ásia), com registro anual de 0,7 a 1,3 milhão de casos novos. É considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma das seis mais importantes doenças infecciosas, pelo seu alto coeficiente de detecção e capacidade de produzir deformidades (PAHO/WHO, 2017).
No Brasil, a LTA é uma das afecções dermatológicas que merece atenção, devido à sua magnitude, assim como pelo risco de ocorrência de deformidades que pode produzir no ser humano, e também pelo envolvimento psicológico, com reflexos no campo social e econômico, uma vez que, na maioria dos casos, pode ser considerada uma doença ocupacional. Apresenta ampla distribuição com registro de casos em todas as regiões brasileiras (BRASIL, 2017).
A LC é caracterizada por úlcera cutânea, única ou múltipla, cuja principal complicação é a disseminação, por via hematogênica, para as mucosas da nasofaringe, com destruição desses tecidos. A freqüência desta complicação tem sido em torno de 5% dos casos no País (5,55 % em 2014); no entanto, pode superar a 25% dos casos em alguns municípios endêmicos. O período de incubação da doença no ser humano é, em média, de dois a três meses, podendo variar de duas semanas a dois anos (BRASIL, 2017).
No período de 1995 a 2014, verificou-se uma media anual de 25.763 casos novos registrados de LTA e coeficiente de detecção médio de 14,7 casos/100 mil habitantes no Brasil (Figura 2). O coeficiente mais elevado foi no ano de 1995, quando atingiu 22,94 casos por 100 mil habitantes (BRASIL, 2017).
Figura 2 – Casos confirmados de leishmaniose tegumentar americana, Brasil – 1980 a 2014
Fonte: SVS/MS (2017).
A leishmaniose cutânea (LC) é a forma clínica mais frequente de LTA e está amplamente distribuída. Os dez países com maior número de casos são Afeganistão, Argelia, Brasil, Colômbia, Etiópia, Irã, Nicarágua, Peru, Sudão e Síria, e juntos representam 75% da incidência global de LC (PAHO/WHO, 2017).
A endemia da LC afeta 18 países das Américas. Foi realizado um levantamento de 2005 até 2015 pela OMS em países americanos (PAHO/WHO 2017), e neste período, foram notificados 845.775 casos, 41,65% no Brasil, 40,25% dos casos foram registrados na sub-região andina, 19,7% na Colômbia, 15,45% na América Central e 13,12% no Peru, representando 74,45% do total de casos relatados. Em 2015, 46.082 casos foram registrados nesses países, representando um taxa de incidência de 17 casos por 100.000 habitantes. Colômbia (7.541), Peru (5.459) e Brasil (19.395) relataram o maior número de casos detectados (Figura 3).
Figura 3 – Casos de leishmaniose cutânea, de acordo com sub-região das Américas, 2001-2015
Fonte: Pan American Health Organization/World Health Organization (2017)
1.2.3 Protozoário do gênero leishmania
A Leishmania é um protozoário pertencente à família Trypanosomatidae, parasito intracelular obrigatório das células do sistema fagocítico mononuclear, com duas formas principais: uma extracelular, flagelo exteriorizado chamada de promastigota, encontrada no tubo digestivo do inseto vetor, e outra intracelular, flagelo interno chamada de amastigota, observada nos tecidos dos hospedeiros vertebrados (ORYAN; AKBARI, 2016).
O gênero Leishmania é dividido em dois subgêneros Leishmania e Viannia, onde 15 das 22 espécies patogênicas para o homem foram identificadas nas Américas (PAHO/WHO, 2017). No Brasil, foram identificadas sete espécies, sendo seis do subgênero Viannia e uma do subgênero Leishmania. As três principais espécies são: L. (V.) braziliensis, L.(V.) guyanensis e
L.(L.) amazonensis e, mais recentemente, as espécies L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) lindenberg e L. (V.) shawi, identificadas em estados das regiões do Brasil (BRASIL, 2017).
A L. (V.) braziliensis foi a primeira espécie de Leishmania descrita como agente etiológico da LTA. É a mais importante, não só no Brasil, mas em toda a América Latina. Tem ampla distribuição, desde a América Central até o norte da Argentina. Esta espécie está amplamente distribuída em todo o território brasileiro (ODONNE et al., 2017).
Os vetores do gênero Leishmania são insetos fêmeas hematófagos denominados flebotomíneos, pertencentes à Ordem Díptera, Família Psychodidae, Subfamília
Phlebotominae. Nas Américas, o gênero Lutzomyia é de grande importância, com cerca de 400
envolvidos na transmissão das diferentes espécies de Leishmania na Região. São conhecidos popularmente, dependendo da localização geográfica, como mosquito-palha, tatuquira, birigui, entre outros (TONELLI et al., 2017).
São considerados hospedeiros, as espécies de animais que garantem a circulação das leishmânias na natureza. A infecção acomete um grande número de espécies de mamíferos, como marsupiais, edentados, roedores, primatas. Alguns desses animais podem apresentar doença crônica com manifestações semelhantes aos humanos, com acometimento preferencial de mucosas das vias aerodigestivas superiores (FRANCESQUINI et al., 2014).
1.2.4 Fisiopatogenia da leishmaniose
Durante a hematofagia, as fêmeas de flebotomíneos inoculam as formas infectantes do parasita (promastigotas metacíclicas). Após a inoculação, as promastigotas precisam sobreviver aos mecanismos inatos de defesa do hospedeiro. As mudanças bioquímicas ocorridas durante a metaciclogênese conferem às promastigotas uma resistência aumentada à lise pelo sistema Complemento. Substâncias presentes na saliva dos flebotomíneos podem também favorecer a infecção. A saliva da fêmea do flebotomíneo infectado parece conseguir induzir supressão da resposta pro-inflamatória local, o que pode levar a uma maior extensão e gravidade das lesões (LIU; UZONNA, 2012). Foi demonstrado que o aumento da infectividade está associado com a capacidade da saliva de inibir a produção de óxido nítrico (NO), peróxido de hidrogênio (TITUS et al., 2006), produção de citocinas tais como IL-12 e IFN-γ e induzir o aumento da produção de IL-10, IL-4, IL-6 e prostaglandina E (PGE) 2, propiciando a sobrevivência do parasito (CARREGARO et al., 2013).
As promastigotas de Leishmania são rapidamente fagocitadas por neutrófilos e macrófagos após serem inoculados pelo vetor. No reconhecimento inicial, as espécies de
Leishmania dependem de certos receptores presentes em macrófagos, incluindo receptores do
sistema Complemento (RCs), receptores de manose (RM), receptores de fibronectina, receptores de Fcγ (FcγRs) e de reconhecimento de padrão do tipo Toll-like (TLRs), que podem também impactar no curso da infecção (UENO; WILSON, 2012). Em relação aos TLRs os subtipos TLR2, TLR3 (FLANDIN et al., 2006), TLR4, TLR9 (MAJUMDER et al., 2014) e TLR7 (PAUN et al., 2011) contribuem com o reconhecimento de Leishmania levando à ativação das vias de sinalização intracelular, necessárias para iniciar a resposta inflamatória e controle da proliferação parasitária (FARIA et al., 2012).
Durante as primeiras horas de infecção, embora as leishmânias sejam encontradas principalmente em neutrófilos, elas não se transformam em amastigotas no interior destas células. A diferenciação ocorre nos macrófagos, principais células hospedeiras do parasito, o que permite sua proliferação. Entretanto, essas mesmas células são responsáveis pela eliminação da infecção, após sua ativação por linfócitos T CD4+ helper. Os parasitos internalizados permanecem dentro de fagolisossomas, organela derivada da fusão do fagossoma com lisossoma, responsáveis pela destruição de microrganismos. Dessa forma, os macrófagos são importantes para o estabelecimento da infecção e persistência do parasita no hospedeiro (BEATTIE; KAYE, 2011).
Estudos comprovam que as respostas imunes inatas e adaptativas estão implicadas diretamente na resistência ou na susceptibilidade à infecção (ZAMORA-CHIMAL et al., 2017). Uma resposta caracterizada pelo perfil de linfócito T helper 1 (Th1) que produz IFN-γ, TNF-α e TNF- ,está associado com resistência da infecção por Leishmania (KAIKO et al., 2008; ESPIR et al., 2014). Em contraste, a susceptibilidade à doença ou a incapacidade de controlar a lesão está relacionada com uma resposta mediada por IL-10, bem como por citocinas secretadas pelo perfil de linfócito T helper 2 (Th2) caracterizado pela principal citocina IL-4, entre outras (NYLÉN; GAUTAM, 2010). Em todas as formas clínicas da leishmaniose, a resposta imunológica celular do hospedeiro é gravemente prejudicada, particularmente a capacidade de proliferação de células T, havendo uma redução de sua função citotóxica (KAYE; SCOTT, 2011).
Na fisiopatogenia da leishmaniose, os macrófagos apresentam função dinâmica, sendo células hospedeiras, apresentadoras de antígeno para o sistema imune e efetoras para a destruição do parasito. As respostas de macrófagos aos parasitos podem gerar perfis distintos. São eles o fenótipo M1 com funções inflamatórias e uma atividade leishmanicida relevante e o fenótipo M2 com propriedades anti-inflamatórias conferindo susceptibilidade à infecção (MUKHOPADHYAY et al., 2015). Os macrófagos M1 são estimulados pelos linfócitos Th1, produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS), através da ação da óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e produção de TNF-α, IL-1β e IL-12, que ampliam as respostas imunes do perfil Th1 (OSORIO et al., 2012). Estudos demonstraram que a resposta Th1 é associada à produção de IL-2, IFN-γ e TNF-α, estando ligada à resistência ao patógeno (MILLS; LEY, 2014).
Os macrófagos M1 adquirem propriedades necessárias para a destruição de patógenos invasores, estimulando a resposta imune inata, porém parasitos de Leishmania desenvolvem mecanismos para resistir às funções microbicidas destas células (OLIVIER et al.,
2005), reprogramando o macrófago infectado para um estado alternativo de ativação, o fenótipo M2 (BHATTACHARYA et al., 2015). Essas células passam a produzir citocinas do perfil Th2 que antagonizam as propriedades microbicidas de macrófagos M1. Esse perfil celular favorece a multiplicação das amastigotas, levando à ruptura da célula, de forma a liberar os parasitos para infectarem outros macrófagos, propagando a infecção (LIU; UZONNA, 2012). A capacidade migratória de células fagocíticas infectadas também pode desempenhar um papel importante na disseminação da doença (BELHADJ et al., 2016).
O equilíbrio crítico entre o perfil Th1 versus Th2 determina a progressão da doença (INIESTA et al., 2002). A IL-10, induzida durante a infecção, inibe a atividade microbicida de macrófago, reduzindo a geração de NO e produção de citocinas pró-inflamatórias. Portanto, a reprogramação do macrófago permite que os parasitos de Leishmania alterem a resposta imune inata e proliferem dentro de seus fagolisossomas (GANNAVARAM et al., 2016).
Linfócitos Th17 também exercem importante papel em infecções por Leishmania, atuando na migração, recrutamento e ativação de neutrófilos. Seu desenvolvimento ocorre a partir da secreção de baixos níveis de TGF-β e IL-6 por macrófagos. Sua ação é caracterizada pelas funções das citocinas produzidas tias como, IL-17, IL-21, IL-22 e IL-23. Estas citocinas induzem células imunes e não imunes a produzirem CXCL-8 (quimiocina de neutrófilos), fator estimulador de granulócitos e monócitos (GM-CSF), entre outros, o que favorece a produção, estimulação e maior número de neutrófilos nas lesões (KORN et al., 2009).
Os macrófagos, repletos de amastigotas, ficam desvitalizados e rompem-se, liberando o parasito, que serão, em um processo contínuo, fagocitados por novos macrófagos. Ocorre então a disseminação hematogênica para outros tecidos ricos em células do sistema mononuclear fagocitário (Figura 4).
A infecção do vetor ocorre quando as fêmeas, ao realizam a hematofagia ingerem macrófagos infectados Leishmania (CIARAMELLA; CORONA, 2003). No intestino dos insetos vetores, as formas promastigotas reprodutivas, não infectantes (promastigotas procíclicas), prendem-se à parede do tubo digestivo do inseto vetor. A seguir, passam por um processo denominado metaciclogênese, onde sofrem modificações bioquímicas em sua superfície, perdendo assim sua capacidade de adesão ao epitélio do intestino médio do flebotomíneo. Como resultado, as formas infectantes do parasito (promastigotas metacíclicas) deixam o intestino e migram para a faringe e cavidade bucal, e assim são transmitidas ao hospedeiro vertebrado durante a hematofagia (ODONNE et al., 2017).
Figura 4 – Ciclo da leishmaniose
Fonte: Traduzido de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2017)
1.2.5 Tratamento da leishmaniose
Para o tratamento da leishmaniose, existem poucos medicamentos disponíveis e com limitações terapêuticas importantes. A quimioterapia de primeira escolha baseia-se nos antimoniais pentavalentes, que são antimoniato de meglumina (Glucantime®) e estibogluconato de sódio (Pentostam®), sendo este último não comercializado no Brasil. A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que a dose desse antimonial seja calculada em miligramas de antimônio pentavalente (Sb+5) por quilograma de peso corporal por dia (mg
Sb+5/kg/dia) por via endovenosa ou intramuscular. O mecanismo de ação é devido à inibição
da glicólise e da oxidação dos ácidos graxos, acompanhada da redução na produção de ATP e GTP (SOUZA et al., 2010; BRASIL, 2017).
O tratamento padrão causa efeitos adversos relevantes, como artralgia, mialgia, anorexia, náuseas, vômitos, plenitude gástrica, epigastralgia, pirose, dor abdominal, pancreatite, prurido, febre, fraqueza, cefaleia, tontura, palpitação, insônia, nervosismo, choque pirogênico, edema, insuficiência renal aguda e comprometimento hepáticoe cardiovascular (BRASIL,
2017), além da alta toxicidade gerada pelo uso continuo desses fármacos. Outra característica são os protocolos de tratamento prolongados que, em sua maioria, requerem suposte ambulatorial e hospitalização, gerando aumento de custos e diminuição de qualidade de vida do paciente (MALTEZOU, 2010).
O desenvolvimento de resistência parasitária também é uma problemática, principalmente em situações de co-infecção com HIV (BRASIL, 2014). Na Índia, foi relatado alta taxa de resistência aos antimoniais pentavalentes (FREITAS et al., 2016).
Outros fármacos utilizados são anfotericina B, anfotericina B lipossomal, pentamidina, miltefosina e paromomicina que também poussem inconvenientes e efeitos colaterais, além do alto custo (SUNDAR; CHAKRAVARTY, 2013; WHO, 2017).
A terapêutica convencional é mais eficaz quando existe uma a resposta adequada do sistema imunológico do hospedeiro (CROFT et al., 2006; KUMAR et al., 2017). Em busca de aperfeiçoar o tratamento existente, a pesquisa por novos medicamentos que estimulem a imunidade celular e possuam atividade leishmanicida são de grande importância para a população acometida.
1.3 Plantas medicinais
O uso de espécies vegetais para o tratamento de enfermidades é uma prática que acompanha o ser humano desde os primórdios da civilização, e baseia-se em tradições ensinadas através das gerações. No Brasil, o uso das plantas medicinais foi disseminado pelos indígenas e, associou-se posteriormente com a cultura provenientes de europeus e africanos (HELMSTÄDTER; STAIGER, 2014). Esforços para manter o conhecimento dos medicamentos à base de ervas e suas aplicações práticas levou à redação de livros, os conhecidos precursores das atuais farmacopéias, enquanto o objetivo de classificar as plantas com propriedades medicinais levou à construção de inúmeros herbários (ZUNIC et al., 2017). O Brasil possui um grande potencial para a descoberta de novas alternativas terapêuticas, principalmente devido a sua rica biodiversidade, uma vez que 67% das espécies vegetais do mundo encontram-se nas florestas tropicais brasileiras, cuja área corresponde a 7% da superfície da terra (BRASIL, 2012). Apenas 8% desta vegetação foi pesquisada, e cerca de 1.500 espécies foram avaliadas em relação à suas propriedades medicinais (PAREDES et al., 2016).
Estima-se que em mais de 80% dos cuidados com saúde em países em desenvolvimento são utilizandas de práticas tradicionais (WHO, 2011). A grande maioria da
população brasileira (80%) consome apenas 37% dos medicamentos disponíveis no mercado, sendo que existem aqueles que dependem quase que exclusivamente dos produtos de origem natural. Devido a esses dados, a OMS prioriza a pesquisa farmacológica de produtos naturais para o tratamento de enfermidades (DEY et al., 2012).
As plantas medicinais possuem grande variedade de substâncias com atividade biológica, devido à complexidade de sua constituição química e da biossíntese de metabólitos secundários. Esses compostos são de grande relevância como protótipos para o desenvolvimento de fármacos (RIBEIRO et al., 2014). Estima-se que aproximadamente 40% dos medicamentos atualmente disponíveis foram desenvolvidos direta ou indiretamente a partir de plantas (CALIXTO, 2001; WHO, 2011). Várias pesquisas demonstraram que o produto natural e estruturas provenientes dos mesmos desempenham um papel significativo na descoberta de novos fármacos, no seu processo de desenvolvimento, assim como no melhoramento de terapias existentes. Tais estudos são de extrema relevância para o tratamento de múltiplas patologias que atingem a população mundial (NEWMAN; CRAGG, 2012).
Amoroz (2004) defende que os procedimentos da medicina moderna e tradicional são complementares e contribuem para uma atenção primária à saúde efetiva em população de baixa renda. Dessa forma, o conhecimento sobre a eficácia e propriedades terapêuticas de plantas medicinais contribui significativamente para a disseminação de seu uso, embora, algumas vezes, seus constituintes químicos e princípios ativos não sejam completamente conhecidos (L'OPEZ, 2006).
Estudos multidisciplinares envolvendo etnobotânicos, químicos, farmacólogos, biólogos, agrônomos, entre outros, são necessários para que sejam avaliados do ponto de vista científico as atividades biológicas das plantas medicinais, de forma a incentivar ou não seu uso popular. Faz-se necessário ainda investigar além de seu potencial terapêutico, sua toxicidade, efeitos colaterais, possíveis interações com outros medicamentos, bem como o controle de qualidade em sua produção.
Como parte da pesquisa por novos e melhores medicamentos e baixa toxicidade, o Programa de Doenças Tropicais da OMS vem considerando a investigação do uso de plantas no tratamento de leishmaniose como essencial e prioritária (OMS, 2011).
A atividade leishmanicida de extratos de plantas tem sido avaliada através de estudos in vitro e in vivo, e seus metabólitos ativos pertencem a diversos grupos químicos, tais como, alcalóides, terpenóides, flavonóides (KLEIN et al., 2009).
Alguns estudos evidenciam ação direta e indireta sobre o parasito. Dentre as diversas plantas com potencial leishminicida, a espécie Kalanchoe pinnata demonstrou redução
das lesões em camundongos BALB/c infectados por L. amazonensis, através do aumento da produção de NO por macrófagos (DA SILVA et al., 1999). Tabernaemontana catharinensis, através de fração etanólica rica em alcalóides, demonstrou efeito citotóxico sobre L. amazonensis (SOARES et al., 2007). O óleo essencial de Plectranthus amboinicus apresentou ação sobre as formas promastigotas e amastigotas de L. braziliensis. O extrato etanólico de folhas de Astronium fraxinifolium demonstrouação in vitro e in vivo em modelo de hamster infectado com L. braziliensis (LIMA et al., 2014). Compostos derivados de plantas como harmina e quercetina também foram encapsulados em lipossomas e testados frente a
Leishmania donovani, aumentando a eficácia em relação a sua forma livre (LALA et al., 2004).
1.3.1 Astronium fraxinifolium Schott ex.Spreng
Astronium fraxinifolium Schott ex. Spreng (Figura 1) pertence à família
Anarcadiaceae, sendo popularmente conhecida como gonçalo-alves, pau-gonçalves, gonçaleiro, gonçalavo, aroeira-do-campo, chibata, sete cascas, aroeira vermelha e ubatã (LORENZI, 2014; SALOMÃO; SILVA, 2006). A espécie não se encontra em risco de extinção (IBAMA, 2014). É uma árvore presente no México, Argentina, Bolívia, Brasil e Paraguai (IBGE, 2002; LORENZI, 2014). No Brasil, ocorre principalmente nas regiões do Cerrado no Brasil Central, Nordeste e na Amazônia (LORENZI, 2014).
Astronium fraxinifolium Schott ex. Spreng (Figura 5) é encontrada em terrenos
rochosos e secos, onde forma agrupamentos descontínuos. Floresce durante os meses de agosto e setembro e produz anualmente grande quantidade de sementes, facilmente disseminadas pelo vento (LORENZI, 2002).
Figura 5 – Fotografia de A. fraxinifolium. A: Planta A. fraxinifolium; B: Folhas e flores de A.
fraxinifolium
Fonte: A: Arquivo do Laboratório de Farmacognosia da Universidade de Brasília, B: Herbário Prisco Bezerra, Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, Brasil.
A família Anacardiaceae compreende cerca de 76 gêneros e 600 espécies com distribuição geográfica nas áreas tropicais e subtropicais, sendo que desses, 15 gêneros e cerca de 70 espécies estão presentes no Brasil (SAWANGCHOTE et al., 2009). Essa família é reconhecida por seus representantes alimentícios, como a manga (Mangifera indica L.), o caju (Anacardium occidentale L.), a seriguela (Spondias mombin L.) e o pistache (Pistacia vera L.) (JUDD et al., 2007; LORENZI, 2008). Do ponto de vista econômico, destaca-se por apresentar madeira de boa qualidade, incluindo gonçalo-alves (Astronium fraxinifolium Schott ex.Spreng.), aroeira do sertão (Myracrodruon urundeuva Allemão), aroeira branca (Lithraea
molleoides Engl.) e braúna (Schinopsis brasiliensis Engl.) (MONTANARI et al., 2012; VOGL;
MITCHELL, 1996).
Na medicina popular, folhas são utilizadas no tratamento de úlceras da pele e possui ação antisséptica (LORENZI, 1992; ALMEIDA et al., 1998; SALOMÃO; SILVA, 2006). A casca é utilizada para o tratamento de bronquite, diarréias e hemorróidas (CORRÊA, 1978; LORENZI, 1992).
Na literatura, encontram-se várias pesquisas que relatam funções biológicas de espécies de Anacardiaceae como, atividade antibacteriana do óleo essencial de Astronium
fraxinifolium contra Escherichia coli, Bacillus cereus e Staphylococcus (MONTANARI et al.,
2012), antifúngica dos extratos de diclorometano e metanólicos das raízes e casca de Lannea
Barteri (KONÉ et al., 2011; SINGH et al., 2010), antiulcerogênica do extrato hidroalcoólico
das folhas de Anacardium occidentale (KONAN; BACCHI, 2007), anti-inflamatória do extrato acetato de etila da casca de Myracrodruon urundeuva (VIANA et al., 2003). PINTO et al. (2010) verificaram que extrato metanólico das folhas possui atividade fungicida contra
Colletotrichum lindemuthianum. Bonifácio et al. (2015) avaliaram potencial ação contra Candida albicans em formulação contendo nanopartículas recobertas com extrato
hidroalcoólico das folhas e casca. Lima et al. (2014) demonstraram uma importante atividade leishmanicida de extratos etanólicos das folhas, entrecasca e casca da planta, sendo capazes de inibir o crescimento de L. (V.) braziliensis, tanto em estudos in vitro como in vivo.
Estudos de caracterização fitoquímica do óleo essencial das folhas de A.
fraxinifolium identificaram como componentes majoritários, o (Z)-β-ocimeno, (E)-β-ocimeno,
biciclogermacreno, limoneno, α-terpinoleno e viridifloreno (MONTANARI et al., 2012). As pesquisas dos metabólitos secundários de espécies de Anacardiaceae ainda são insuficientes para elucidar possíveis mecanismos de ação dessas plantas. Aproximadamente 7% das espécies conhecidas foram investigadas quanto à caracterização fitoquímica e atividade biológica. Os lipídeos fenólicos e os flavonóides são as classes de metabólitos secundários típicas dessa família. Também podem ser encontrados em espécies de Anacardiaceae, terpenos, esteróides e xantonas (CORREIA et al., 2006; AGUILAR-ORTIGOZA; SOSA, 2004).
É importante observar, no entanto, que uma parte da família Anacardiaceae é considerada tóxica e causadora de dermatite de contato grave, pois apresentam em sua composição alquilcatecóis, alquilresorcinóis e biflavonoides, que são tipos de fenois com propriedades alergênicas. São encontrados normalmente nas folhas e cascas do gênero
Astronium os alquilcatecóis e os biflavonoides (AGUILAR-ORTIGOZA et al., 2003;
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
2.1 Justificativa
Com o surgimento de cepas resistentes ao tratamento padrão e as coinfecções, os atuais desafios no manejo terapêutico das leishmanioses dizem respeito à urgência de pesquisa em novos fármacos que apresentem via de administração confortável, menor tempo de tratamento e efeitos colaterais. As plantas medicinais surgem como potencial arsenal terapêutico alternativo de baixo custo e com possível eficácia terapêutica. Relatos de metabólitos secundários de plantas com atividade leishmanicida têm sido descritos e incluem flavonóides, cumarinas, taninos, saponinas e alcalóides (CHEUKA et al., 2017). Nosso grupo de pesquisa recentemente demonstrou a atividade leishmanicida em modelos experimentais in
vitro e in vivo de A.fraxinifolium frente a L. (V.) braziliensis (LIMA et al., 2014). Devido a
esses fatos, o presente trabalho visou estudar os possíveis mecanismos de ação de Astronium
fraxinifolium Schott na inflamação e na infecção por L. (V.) braziliensis em modelos
experimentais in vitro. 2.2 Objetivos
2.2.1 Objetivo geral
Avaliar mecanismos de ação in vitro de Astronium fraxinifolium Schott em processos inflamatórios induzido por lipopolissacáride e infecciosos induzidos por Leishmania
(Viannia) braziliensis.
2.2.2 Objetivos específicos
• Obter e realizar a investigação dos constituintes químicos do extrato etanólico da entrecasca de A. fraxinifolium (EEAF);
• Analisar a atividade antioxidante in vitro do EEAF; • Avaliar a citotoxicidade in vitro do EEAF;
• Determinar a capacidade do EEAF de alterar a produção de óxido nítrico e das citocinas TNF-α e TGF-β em sobrenadantes de cultura de células RAW 264.7 estimuladas com LPS;
• Avaliar a capacidade de EEAF alterar a expressão de mRNA para COX-2, iNOS, TGF-β em células RAW 264.7 estimuladas com LPS;
• Analisar a capacidade de EEAF alterar a expressão protéica de COX-2 em células RAW 264.7estimuladas com LPS;
• Avaliar a capacidade leishmanicida de EEAF frente às formas promastigotas de L. (V.)
braziliensis;
• Determinar a capacidade leishmanicida de EEAF sobre células RAW 264.7 infectadas com as formas amastigotas de L.(V.) braziliensis.
• Dosar a concentração de ânion superóxido, TNF-α, IL-12, IL-4, IL-10 e TGF-β em sobrenadantes de cultura de células RAW 264.7 infectadas e tratadas com EEAF. • Avaliar a presença de lisossomos em células RAW 264.7 infectadas com L.(V.)
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção e preparação do EEAF
A entrecasca de Astronium fraxinifolium foi coletada na cidade de Lavras da Mangabeira (06°45'12"S 38°57'52"O 239m), Ceará, Brasil. Sua exsicata (54265) encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra, Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, Brasil.
O material vegetal (1kg) foi submetido à secagem em estufa com circulação de ar a 45ºC por 48 h. Posteriormente, o mesmo passou por processo de moagem e maceração com etanol absoluto por 7 dias à temperatura ambiente. O extrato foi filtrado e concentrado em evaporador rotativo sob pressão reduzida a 40ºC (Rendimento de 1,8%).
3.2 Análise fitoquímica do EEAF
3.2.1 Quantificação de fenóis totais
O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteau (SINGLETON et al., 1965). O extrato foi solubilizado em metanol, obtendo-se a concentração de 0,3 mg/mL. Foram adicionados 100µL da amostra diluída a 500µL de solução Folin-Ciocalteu, sendo, a seguir, a solução agitada por 30 segundos. Posteriormente, foram acrescentados 6 mL de água destilada e 2 mL de solução de bicarbonato de sódio a 15%. A mistura foi novamente agitada por 1 minuto e o volume completado com água destilada para 10 mL de solução. Após 2 h de repouso ao abrigo da luz, foi efetuada a leitura a 750 nm em espectrofotômetro (Genesys 10s, Thermo Scientific). O experimento foi realizado em triplicata. Realizou-se uma curva padrão, utilizando-se ácido gálico (Sigma-Aldrich, USA), para quantificação de fenóis totais nas amostras. Os resultados foram expressos em mg de equivalentes de ácido gálico por g de extrato (mg/g).
3.2.2 Quantificação de flavonoides
Para a quantificação de flavonoides na amostra vegetal, preparou-se uma solução de 60 mg da amostra em 10 mL de etanol. Misturou-se um volume de 2 mL desta solução (concentração de 6 mg/mL) com 1 mL de solução de cloreto de alumínio a 2,5%. Em seguida,
o volume foi completado para 25 mL com etanol. Após 30 min, foi realizada a leitura das absorbâncias em 425 nm, utilizando-se um espectrofotômetro (Genesys 10s, Thermo Scientific). O experimento foi realizado em triplicata. Uma curva padrão foi preparada, tendo como padrão a quercetina (Sigma-Aldrich, USA). O teor de flavonóides foi determinado e o resultado expresso em mg EQ (equivalente de quercetina) por 100g de extrato (VENNAT et
al., 1992).
3.2.3 Quantificação de taninos
A determinação dos taninos foi realizada pelo método colorimétrico de Folin-Denis, conforme AOAC (Association Of Official Analytical Chemists), 1995. Utilizou-se o extrato, na concentração de 50mg/mL. Em seguida, foi adicionado 1 mL do extrato a 1 mL do reagente de Folin-Denis.
Reagente de Folin-Denis: 20 g de tungstato de sódio, 4 g de ácido fosfomolíbdico e 10 mL de ácido fosfórico em 150 mL de água destilada. Transcorridas 2 h, a solução foi resfriada à temperatura ambiente e diluída em balão volumétrico de 200 mL.
A suspensão foi agitada e mantida em repouso por 3 minutos. Em seguida, adicionou-se 1mL de solução de carbonato de sódio 8%. O tubo foi novamente agitado e, após esse procedimento, a solução foi deixada em repouso por 2 h. O experimento foi realizado em triplicata. A absorbância do extrato foi medida em espectofotômetro (Genesys 10s, Thermo Scientific) em comprimento de onda 725 nm. O ácido tânico (Sigma-Aldrich, USA) foi utilizado como padrão e os resultados foram expressos em mg de equivalentes do ácido tânico por 100 g.
3.2.4 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A cromatografia líquida de alta performance (HPLC-DAD) foi realizada em sistema com Shimadzu Prominence Auto Sampler (SIL-20A) (Shimadzu, Kyoto, Japão), equipado com bombas alternadas de Shimadzu LC-20AT conectadas a um desgaseificador DGU 20A.
Amostras de Astronium fraxinifolium e de padrões foram injetadas em uma coluna de fase reversa Phenomenex C18 (4,6 mm x 250 mm) com partículas de diâmetro igual a 5 𝜇m. A fase móvel A e B era constituída de água Milli-Q acidificada para o pH de 3,0 com solução de ácido acético 2% e acetonitrila, respectivamente. O gradiente de solvente usado foi: 0 min,
