UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
MIGUEL DOMINGOS RAMOS JUNIOR
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NOVOS SISTEMAS CARREGADORES DE FÁRMACOS BASEADOS EM NANOPARTÍCULAS DE OURO
DENDRONIZADAS
CAMPINAS 2019
MIGUEL DOMINGOS RAMOS JUNIOR
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NOVOS SISTEMAS CARREGADORES DE FÁRMACOS BASEADOS EM NANOPARTÍCULAS DE OURO
DENDRONIZADAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Química Orgânica.
Orientador(a): Profa. Dra. CÁTIA CRISTINA CAPELO ORNELAS MEGIATTO
CAMPINAS 2019
O arquivo digital corresponde à versão final da Dissertação defendida pelo aluno MIGUEL DOMINGOS RAMOS JUNIOR e orientada pela Profa. Dra. CÁTIA CRISTINA CAPELO ORNELAS MEGIATTO.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Igor Dias Jurberg (Instituto de Química - Unicamp e presidente da banca)
Prof. Dr. Caio Costa Oliveira (Instituto de Química - Unicamp)
Prof. Dr. Lucidio Cristovão Fardelone (Faculdade de Engenharia Química - Unicamp)
A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno Miguel Domingos Ramos Junior, aprovada pela Comissão Julgadora em 13 de Setembro de 2019.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
Agradeço aos meus pais e minha família pela oportunidade concedida e apoio
a Ellen Tavares e a Maria Aparecida pelo apoio e insistência para que eu concluísse essa etapa
a minha orientadora pela orientação e paciência Profa Dra Cátia Ornelas
aos meus colegas de laboratório pela convivência e ajuda, Diego Bertuzzi, Gabriel Perli, Dr Tiago Branco, Dra Carolyne Braga, Celso Okada
ao grupo, Profa Dra Maria Izabel Bueno, Dra Juliana Terra, Dr Alexandre Antunez, Prof Dr José Augusto por me mostrarem o caminho da pesquisa e ciência
aos meus professores, em especial Prof Dra Camila Rezende, Prof Dr Celso Bertran, Prof Dr Fábio Gozzo, Prof Dr Francisco Pessine, Prof Dr Gildo Jr, Prof Dr Ivo Raimundo, Prof Dr José Fracassi, Prof Dr Leandro Martinez, Prof Dr Nelson Morgon, Profa Dra Regina Buffon, Prof Dr Rene Afonso, Prof Dr Rogério Custódio, Prof Dr Ronaldo Pilli por dedicarem um pouco mais além do tempo da sala de aula para responder minhas dúvidas sobre o sistema mundo
ao grupo do Prof Dr Valtencir Zucolotto pelo fornecimento das Nanoflores
a Dra Claudia Franulovic Campos pela ajuda para que eu pudesse continuar o mestrado à FAPESP, pelo financiamento das pesquisas desenvolvidas no laboratório, bem como esse trabalho.
CNPQ,pelo financiamento das pesquisas desenvolvidas no laboratório, bem como esse trabalho.
FAEPEX, pelo financiamento das pesquisas desenvolvidas no laboratório, bem como esse trabalho.
CAPES, pelo financiamento das pesquisas desenvolvidas no laboratório, bem como esse trabalho.
IQ-Unicamp pelo financiamento ao laboratório, do fornecimento do espaço físico e pela oportunidade de desenvolver mestrado em uma universidade de excelência.
Resumo
O uso de nanomateriais para a detecção precoce, diagnóstico preciso e tratamento de câncer e outras doenças vem sendo estudado nas últimas décadas. Dendrímeros e nanopartículas de ouro têm inúmeras potenciais aplicações em nanomedicina devido ao tamanho nanométrico, biocompatibilidade e possibilidade de multifunctionalização. Em particular, devido à elevada biocompatibilidade e ao efeito de Surface Plamon Ressonance (SPR) as nanopartículas de ouro têm suscitado o interesse de muitos grupos de pesquisa na área da nanomedicina. O SPR confere às nanopartículas de ouro (AuNPs) propriedades de absorção e emissão de luz adequadas para aplicação em molecular imaging in vitro e in
vivo, permitindo acompanhar a localização e a evolução das células doentes. Para alguns
tipos de tumores o efeito SPR é usado para causar hipertermia localizada dentro das células cancerígenas (aplicação de radiação às nanopartículas, que emitem calor causando um pequeno aumento na temperatura local), causando a morte celular. O uso das AuNPs para hipertermia localizada tem aplicação no tratamento de vários tipos de câncer.
O objetivo deste trabalho de pesquisa foi combinar as propriedades e vantagens dos dendrímeros com as potencialidades das AuNPs de forma a obter nanopartículas de ouro dendronizadas multifuncionais com potencial aplicação em nanomedicina. A primeira parte do trabalho foi dedicada ao desenvolvimento de uma nova metodologia sintética para obter dendrons multifuncionais com grupos ortogonais. Com estes novos dendrons construiu-se dendrímeros trifuncionais e pentafuncionais com estrutura bem definida inéditos na literatura. A segunda parte do trabalho foi dedicada ao desenvolvimento de uma metodologia para ligar os dendrons a vários tipos de AuNPs para obter AuNPs dendronizadas.
Abstract
The use of nanomaterials for early and precise diagnosis, and treatment of cancer and other diseases has been thoroughly studied in the last decades. Dendrimers and gold nanoparticles have numerous potential applications in nanomedicine due to their nanometric size, biocompatibility and possibility of multifunctionalization. In particular, due to the high biocompatibility and the Surface Plamon Ressonance (SPR) effect, gold nanoparticles (AuNPs) have boosted the interest of many research groups in the nanomedicine area. The SPR effect gives AuNPs light absorption and emission properties suitable for applications in molecular imaging in vitro and in vivo, enabling the visualization of the locations and evolution of the diseased tissues. For some types of tumors the SPR effect can be used to cause localized hyperthermia inside cancer cells (application of radiation into the AuNPs that emit heat causing a small increase in the local temperature), causing cellular death. The use of AuNPs for localized hyperthermia has application for the treatment of several types of cancer.
The main goal of this research work was to combine the properties and advantages of dendrimers with the potentialities of the AuNPs in order to obtain multifunctional dendronized gold nanoparticles with potential applications in nanomedicine. The first part of the work was dedicated to the development of a new methodology to obtain multifunctional dendrons with orthogonal groups. Using these new dendrons, we have built trifunctional and pentafunctional dendrimers with well-defined structure unprecedented in the literature. The second part of the work was dedicated to the development of a methodology to attach the dendrons to several types of AuNPs to obtain dendronized AuNPs.
SUMÁRIO INTRODUÇÃO………...10 Nanotecnologia………..……...10 Nanomedicina………..11 Dendrons e Dendrímeros………...15 Nanopartículas de Ouro………...23
Nanopartículas de Ouro Dendronizadas………...27
RESULTADOS E DISCUSSÃO………29
Desenvolvimento de uma metodologia para sintetizar dendrons trifuncionais…...29
Síntese de dendrímeros trifuncionais e pentafuncionais com estrutura bem definida...44
Síntese de nanopartículas de ouro dendronizadas...………...48
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS………...56
MATERIAIS E MÉTODOS………...57
Reagentes………...57
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)………57
Espectroscopia de Massas………...57
DLS………...58
SÍNTESES………....58
Síntese do 6-nitroexanol (composto 2)………...58
Síntese do ácido 6-nitrohexanoico (composto 3)………...59
Síntese do composto 4………...59
Síntese do composto 10………...61 Síntese do composto 5………...…62 Síntese do composto 13………...63 Síntese do composto 14………...64 Síntese do composto 12………...65 Síntese do composto 8………...66 Síntese do composto 9………...67 Síntese do composto 11………...68
Síntese do dendron nitrotriéster A………..69
Síntese do dendron nitrotriácido B……….69
Síntese do dendron aminotriéster C………....70
Síntese do dendron nitrononaéster D………...70
Síntese do dendron aminononaéster………...71
Síntese do dendrímero core protegido………...71
Síntese do dendrímero dendri-(COOH)18………....72
Síntese do dendrímero trifuncional 16………...73
Síntese do dendrímero trifuncional desprotegido 17………....74
Síntese do dendrímero pentafuncional 18………...75
Síntese do dímero do ácido tioglicólico ………...76
Síntese do tiodendrímero protegido 19………...76
Síntese do tiodendrímero desprotegido 20………....77
Síntese do tiodendrímero trifuncional 21………...77
Síntese do tiodendrímero trifuncional 22………...78
Acoplamento Tiodendrímero-1 - Nanoflores………78
Acoplamento Tiodendrímero trifuncional 21 – Nanopartículas 40nm……...……78
INTRODUÇÃO
1.1. Nanotecnologia
Nanotecnologia é um ramo da ciência que estuda e desenvolve materiais em escala nanométrica, ou seja, da ordem de 10-9 m.[1] As definições formais de dispositivos nanométricos geralmente requerem que o dispositivo ou os seus componentes essenciais sejam sintéticos (feitos pelo homem) e apresentem pelo menos uma dimensão com o tamanho entre 1-100 nm. No entanto, definições menos restritivas em termos de tamanho têm sido debatidas e aceitam materiais com pelo menos uma dimensão menor do que 1 micrômetro. Paralelamente ao debate da definição de nanoescala, um grande número de objetos com tamanho nanométrico tem sido desenvolvido, as suas propriedades intensamente estudadas e testados para uma variedade de aplicações.[1-2]
De uma forma geral, os nanomateriais apresentam propriedades inéditas e interessantes, por isso vêm sendo estudados para aplicações em várias áreas da ciência[1], engenharia[2] e medicina[3-4], como por exemplo, para novos catalisadores[5], células fotovoltaicas, eletrônica[6], biossensores[7-8], dispositivos de diagnóstico[9] e vetorização de fármacos[10-11].
As propriedades inovadoras dos nanomateriais devem-se essencialmente a três fatores importantes: o tamanho nanométrico, a elevada área de superfície e o confinamento quântico.[1] O tamanho nanométrico permite que estes materiais penetrem poros muito reduzidos podendo exercer as suas funções complexas em locais que materiais maiores não poderiam executar, como por exemplo nanoporos de substratos, superfície de proteínas ou o meio intracelular. Em nanomateriais, a área de superfície em relação ao volume é muito grande, sendo que muito mais átomos estão expostos na superfície, tornando o material significativamente mais reativo. Este fator implica que mais átomos podem, por exemplo, formar mais ligações com moléculas adsorvidas amplificando a sua atividade; este fator é decisivo no desenvolvimento de materiais inovadores na área da catálise, sensores e vetorizadores de fármacos. [12-14]
O confinamento quântico aparece na escala nanométrica resultando em propriedades ópticas e elétricas distintas dos materiais análogos macroscópicos. Este fenômeno ocorre essencialmente em nanopartículas metálicas, cujos elétrons estão
confinados e têm a sua energia descrita em níveis discretos. Por esse motivo, por exemplo, nanopartículas constituídas por átomos de ouro apresentam uma cor bem diferente do amarelo do ouro macroscópico, que varia entre o rosa e o azul dependendo do tamanho e formato das nanopartículas.[15]
As propriedades que emergem desses fenômenos têm despertado interesse em novos nanomateriais para aplicações em todas as áreas do conhecimento. Um tipo de material muito discutido atualmente é a nanopartícula de ouro que, primordialmente há milhares de anos atrás, era utilizada para fazer sofisticadas taças[16], hoje tem sido aplicada em catálise e na nanomedicina, melhorando tratamentos existentes ou ainda criando novas formas de lidar com doenças, como o câncer.[17-21]
1.2. Nanomedicina
Os recentes avanços em nanotecnologia e técnicas analíticas avançadas proporcionam atualmente as melhores condições de todos os tempos para grandes desenvolvimentos e avanços de investigação científica na área médica e áreas relacionadas com a saúde humana e biociências.[1-10] Estes avanços juntamente com o alinhamento interdisciplinar entre a física, a química e a biologia transformaram a investigação científica em biociências numa área que consegue prever as propriedades dos componentes celulares baseada em dados moleculares e/ou atômicos. A integração de técnicas analíticas inovadoras capazes de “ver” na escala nanométrica e/ou atômica, em conjunto com o rigor tecnológico e teórico das ciências exatas, engenharia e matemática que são capazes de construir dispositivos na escala nanométrica tem resultado num conjunto importante de novos conhecimentos importantes para a pesquisa na área médica. O conjunto destes novos conhecimentos de nanotecnologia aplicados à medicina são chamados de nanomedicina.
O papel extremamente importante conferido à nanomedicina está relacionado ao fato da mesma oferecer promessas na prevenção e/ou tratamento de doenças, no aperfeiçoamento de diagnósticos médicos e de métodos terapêuticos e, também, na regeneração de tecidos. [22-23] A pesquisa na área da nanomedicina tem trazido esperança para vários problemas globais, através de uma variedade de novos dispositivos nanométricos para aplicação em biossensores para detecção de vírus e bactérias e identificação de biomarcadores a baixas concentrações, agentes de diagnóstico precoce e
eficaz de vários tipos de câncer, sistemas vetorizadores de fármacos para tratamentos inovadores contra o câncer e outras doenças, e novas vacinas.
O conceito de Nanomedicina catalisou uma mudança de paradigma na química medicinal, na qual, muitos pesquisadores mudaram o foco das suas pesquisas para desenvolver novas formas de administrar e direcionar os fármacos já existentes em vez de procurar novos candidatos a fármacos. A driving force para esta mudança de paradigma consiste no fato de que a esmagadora maioria dos candidatos a fármacos com atividade promissora não passa nos estudos clínicos, porque a molécula não alcança eficientemente o alvo pretendido, ou seja o tecido doente do corpo humano.
Os nanomateriais trazem importantes benefícios para a área de drug delivery (vetorização de fármacos) devido ao seu tamanho nanométrico e à sua multivalência. Sistemas de vetorização de fármacos baseados em nanomateriais geralmente causam um aumento significativo na acumulação de fármaco nos tecidos doentes através de direcionamento ativo ou através do efeito de permeação amplificada (enhanced permeation effect; efeito EPR), reduzindo os efeitos adversos colaterais de fármacos de moléculas pequenas (Figura 1). No direcionamento ativo a superfície do nanomaterial é funcionalizada com grupos que se ligam especificamente aos receptores dos tecidos doentes aumentando a seletividade e proximidade do nanomaterial contendo o fármaco ao local alvo. O direcionamento através do efeito EPR baseia-se no fato de que o tamanho do gap na parede celular endotelial de tecidos saudáveis é em torno de 2-6 nm, enquanto que, em tecidos doentes como tecidos tumorais o gap entre as células varia entre 20-500 nm. Os sistemas vetorizadores de fármacos podem então ser estruturados de forma a apresentarem um tamanho maior do que os poros dos tecidos saudáveis (para evitar a penetração nestes tecidos), para que estes penetrem apenas nos tecidos doentes através dos poros desordenados destes tecidos, aumentando a seletividade e acumulação dos fármacos nos tecidos doentes (Figura 1).
Outras vantagens importantes dos nanomateriais incluem o melhoramento da solubilidade, estabilidade, biodistribuição e farmacocinética dos fármacos, resultando num aumento da sua eficácia. Além disso, o tamanho dos nanocarreadores pode ser usado para evitar/diminuir os processos de eliminação usados pelo corpo: maiores que 14 nm evitam a eliminação pelo rim, menores que 200 nm evitam a eliminação pelo fígado. A adição de grupos hidrofílicos na periferia tais como cadeias de polietilenoglicol, minimizam a eliminação/interação com o sistema imunológico (Figura 1).
Figura 1. Representação esquemática de: efeito EPR (esquerda); direcionamento ativo para receptores
específicos de células cancerígenas (centro); tipos de eliminação de fármacos pelo corpo (direita).
Nas últimas décadas, uma enorme variedade de tipos de nanomateriais têm sido desenvolvidos e publicados na literatura, que incluem: lipossomas, dendrímeros, nano hidrogéis, fulerenos, nanotubos de carbono, pontos quânticos, nanopartículas poliméricas, rotaxanas, e nanopartículas metálicas.
Entre os recentes avanços na nanomedicina, um dos mais revolucionários e que têm recebido enorme atenção diz respeito ao desenvolvimento de nanocarreadores multifuncionais, que são dispositivos em nanoescala capazes de realizar simultaneamente múltiplas funções, que normalmente inclui imagem em tempo-real da sua localização, direcionamento específico para os tecidos doentes e a entrega controlada de um determinado fármaco. As vantagens de se utilizar estes nanomateriais são inúmeras, as quais vão desde a proteção de substâncias ativas dos fenômenos de degradação e liberação controlada do material incorporado (ex.: fármaco), até à detecção de doenças e a distribuição precisa de uma dada substância em locais específicos pré-determinados, como num tumor. Por exemplo, tem sido demonstrado que múltiplos tipos de drogas terapêuticas e/ou agentes de diagnóstico (p.ex.: agentes de contraste) podem ser incorporados no mesmo nanocarreador para possibilitar uma combinação entre terapia e leitura em tempo real sobre a eficácia do tratamento. Hoje em dia, os nanocarreadores multifuncionais ocupam uma posição de destaque no tratamento do câncer. [22-24] Muito embora o uso destes nanomateriais multifuncionais para algumas das aplicações propostas seja ainda bem recente, é notável a importância de se conhecer com maior profundidade estes dispositivos.
Os nanocarreadores multifuncionais (também chamados de nanotransportadores) são, geralmente, compostos por três componentes principais: o material suporte, o agente biologicamente ativo e/ou a substância que é incorporada para ser carregada, e a superfície, conforme é mostrado na Figura 2.[22] Uma grande quantidade de materiais pode representar
o componente suporte de um nanocarreador, os quais, de um modo geral, podem ser subdivididos de acordo com a natureza química como orgânicos, inorgânicos e híbridos. Nanocarreadores orgânicos incluem lipossomas, dendrímeros, nanotubos de carbono, nanopartículas poliméricas e fulerenos. Com relação aos inorgânicos, podem ser mencionadas as nanopartículas metálicas e as de sílica.[24-26] Por sua vez, um exemplo de nanocarreador híbrido envolve partículas de óxido de ferro paramagnéticas encapsuladas em nanopartículas poliméricas.[27] Neste sentido, a seleção do material suporte do nanocarreador é altamente dependente das propriedades dos agentes biologicamente ativos a serem carregados, tais como: lipofilicidade, carga e tamanho; de forma a proporcionar uma interação adequada com o material suporte.
Material suporte Substância a ser carregada Fármaco A Fármaco B Agente de imagem Grupo solubilizante Modificador de superfície PEG (polietilenoglicol) Molécula alvo
Figura 2. Ilustração esquemática de um nanocarreador multifuncional. O material suporte do nanocarreador
pode ser orgânico (tais como lipossomos e nanopartículas poliméricas), inorgânico (como nanopartículas de ouro) ou híbrido (combinação de materiais orgânicos e inorgânicos). As substâncias a serem carregadas podem ser fármacos, DNA, agentes de imagem e grupos solubilizantes. Os modificadores de superfície
podem ser resíduos de polietilenoglicol (PEG) combinados com moléculas alvo.[27]
As substâncias a serem transportadas pelos nanocarreadores geralmente são fármacos (moléculas pequenas), ácidos nucléicos (DNA, siRNA, pDNA, etc), proteínas, e/ou agentes de imagem (moléculas fluorescentes ou radioativas) os quais podem estar encapsulados, adsorvidos à superfície ou ligados covalentemente ao nanocarreador por meio de ligações facilmente quebráveis em meio celular através de estímulos específicos. Dependendo das funções desejadas, é possível incorporar em um nanocarreador mais do que um agente terapêutico, visando, por exemplo, a possibilidade de realizar combinações terapêuticas. No entanto, quando há mais de uma substância a ser distribuída, suas
interações também devem ser consideradas, pois podem levar a uma possível toxicidade.[28] Ao nanocarreador podem também ser acoplados agentes solubilizantes e/ou moléculas alvo. Quando os nanomateriais carregam simultaneamente o agente terapêutico e o agente de imagem, estes são capazes de realizar em simultâneo o diagnóstico e tratamento de determinada doença; a estes materiais chamam-se nanomateriais teranósticos (terapia + diagnóstico).
Trabalhos recentes têm estudado o efeito das diferentes formas geométricas dos nanomateriais, incluindo as esféricas, cúbicas, cilíndricas, prismas, em forma de estrela, entre outras, na sua atividade biológica. Os resultados têm indicado que a morfologia dos nanocarreadores desempenha um papel fundamental na internalização celular e consequentemente na eficiência terapêutica.[29]
A principal influência do formato é baseada na área de contato dos nanomateriais com as membranas celulares, a qual está diretamente relacionada com o seu processo de internalização. Sem dúvida, as nanopartículas esféricas são os nanomateriais mais amplamente utilizados, devido às suas estabilidades termodinâmicas intrínsecas, assim como às grandes áreas de contato.11 No entanto, Vácha et al. (2011)[30] observou que, embora nanopartículas esféricas sejam bons candidatos para a entrega de fármacos, estruturas anisotrópicas podem proporcionar maior eficiência devido a maiores razões entre a área superficial e volume, as quais, por sua vez, podem resultar numa configuração mais favorável para a ligação com as células da membrana. Fréchet e colaboradores também demonstraram que estruturas ramificadas/dendronizadas possuem melhor capacidade de internalização celular que os seus análogos esféricos. Por esta razão esta tese de mestrado foi dedicada ao desenvolvimento de carregadores de fármacos baseados em dendrímeros e nanopartículas de ouro dendronizadas que possuem morfologia anisotrópica e dendronizada. Note-se que os dendrímeros, embora sejam considerados esferas em estudos teóricos, sabe-se que estes não são esferas, mas antes possuem estrutura globular dinâmica o que confere anisotropia.
1.3. Dendrímeros e Dendrons
A palavra dendrímero tem origem do grego dendron que significa árvore e mero que significa partes, em associação com a sua estrutura ramificada que se assemelha aos
galhos de uma árvore. Dendrímeros são macromoléculas globulares monodispersas, com alto grau de ramificações, que são construídas passo a passo resultando em estruturas bem definidas. Os dendrímeros possuem um core dendrítico que fica no centro da molécula e onde se iniciam as ramificações, os braços ou ramos, os pontos de ramificação os quais definem as camadas dos dendrímeros e as suas gerações (uma camada corresponde a um dendrímero de primeira geração; duas camadas corresponde a um dendrímero de segunda geração, e assim sucessivamente), e os grupos terminais (Figura 3). Os dendrons são partes de dendrímeros, que possuem uma estrutura do tipo ABx, sendo A o grupo funcional do ponto focal e Bx os grupos funcionais dos grupos terminais das ramificações (Figura 3).
Figura 3. Dendrímeros e dendrons: (a) representação esquemática de um dendrímero, as camadas coloridas
definem a geração do dendrímero; (b) exemplo da estrutura química de um dendrímero, um dendrímeros poliamidoamina (PAMAM); (c) representação esquemática de um dendron; (d) exemplo da estrutura química
de um dendron poliamida com o grupo amina no ponto focal e ácidos protegidos como grupos terminais.
A química dos dendrímeros iniciou-se em 1978, por Vogtle e colaboradores, quando eles realizaram a repetição de uma sequência de duas reações: adição de Michael de
acrilonitrila a aminas, seguida da redução do grupo nitrila, resultando numa molécula ramificada com estrutura controlada e grupos repetidos em cada camada (Figura 4).[31] Nos anos 1980´s Tomalia e colaboradores usaram uma estratégia sintética semelhante mas como começaram a partir de uma diamina, obtiveram moléculas simétricas ramificadas, dendrímeros poliamidoamina (PAMAM) (Figura 4).[32]
Figura 4. Síntese divergente utilizada por Vögtle em 1978 (mostrada na parte de cima da imagem). Dendrímero PAMAM desenvolvido por Tomalia e colaboradores que consiste num dendrímero de 4ª geração
com 32 grupos terminais do tipo amina (parte de baixo da imagem).
A síntese de dendrímeros crescendo a partir de um core para a periferia, como as descritas anteriormente, chama-se de síntese divergente (Figura 5). Em 1990, Fréchet e colaboradores desenvolveu uma estratégia sintética na qual constrói os dendrons separadamente e no final liga os dendrons ao core; esta estratégia sintética chama-se de convergente (Figura 5).[33] Ambas as estratégias sintéticas apresentam vantagens e desvantagens. Na síntese divergente, a construção das gerações mais elevadas resulta em alguns defeitos na periferia dos dendrímeros porque as reações ficam menos eficientes nas grandes moléculas devido à dinâmica dos dendrímeros (alguns terminais tendem a ocupar o espaço interno ficando indisponíveis para reagir). No entanto, dendrímeros gigantes apenas
são possíveis de construir com a síntese divergente. Na síntese convergente, como se trabalha com dendrons, que são moléculas menores, obtêm-se moléculas mais perfeitas, mas não é possível atingir a síntese de gerações mais elevadas porque nos dendrons maiores o grupo focal começa a ficar indisponível para reagir com core dendrítico. É necessário ponderar as características, vantagens e desvantagens de cada estratégia sintética na hora de delinear a síntese de um determinado dendrímero levando em consideração o tipo de dendrímero esperado e as suas propriedades.
Figura 5. Representação esquemática da síntese de dendrímeros através da estratégia divergente e estratégia convergente.
Até meados dos anos 80´s os dendrímeros eram chamados de moléculas em cascata, macrômeros topológicos, polímeros starbust, arborols, micelas unimoleculares, macromoléculas ramificadas ou polímeros em estrela densos. O nome dendrímero foi cunhado em 1990 no artigo Tomalia no Angewandte Chemie, no qual ele previu muitas das
propriedades e aplicações dos dendrímeros que ainda não tinham sido exploradas, e que o foram nos anos seguintes.
Nas sínteses desenvolvidas por Vogtle e Tomalia, em cada ponto de ramificação, o número de braços do dendrímero é multiplicado por dois, chamada de conectividade 1🡪2. Em 1985. Newkome e colaboradores reportou o primeiro exemplo de síntese de dendrímeros no qual o número de grupos terminais é multiplicado por três em cada geração, chamada de conectividade 1🡪3.
Para manter os dendrímeros monodispersos e obter estruturas quasi-perfeitas, é crucial usar reações eficientes e seletivas de forma a evitar a formação de espécies não desejadas e consequentemente dendrímeros com defeitos na estrutura, que são impossíveis de separar dos dendrímeros perfeitamente funcionalizados. O número de defeitos na estrutura dendrítica final depende totalmente da eficiência das reações usadas na sua construção e funcionalização. Tem havido um esforço constante para melhorar a eficiência das reações e para desenvolver novos protocolos para a síntese e funcionalização de dendrímeros. Atualmente, a construção e funcionalização de dendrímeros pode ser realizada usando uma variedade de reações estabelecidas, tais como: acoplamentos amida e éster, reação de Williamson, adição de Michael, cicloadição alcino azida catalisada por cobre (CuAAC), cicloadição alcino azida promovida por tensão de anel (SPAAC), metátese de olefinas cruzada, e fotoreação tiol-eno. A escolha da sequência de reações, tipo de building blocks, estratégia sintética, geração e tipos de grupos funcionais terminais definem as propriedades do dendrímero final, como o tamanho, forma, massa molar, viscosidade, solubilidade e consequentemente as suas aplicações.
Nas extremidades funcionalizáveis de um dendrímero se pode acoplar agentes de tratamento[34-36,38], agentes de imagem[37-38], vetorizadores[38-41] e etc. Com isso o
dendrímero se torna num sistema vetorizador de fármacos, que pode carregar esses compostos até um tecido doente específico. A multifuncionalização dos grupos terminais tem sido um desafio constante na literatura, uma vez que, a síntese de dendrímeros multifuncionais vem sendo majoritariamente realizada através da abordagem estatístico-aleatória. Esta estratégia sintética consiste na adição sucessiva não controlada de diferentes moléculas aos grupos terminais de dendrímeros homofuncionais, levando a misturas complexas de dendrímeros (Figura 6). Dessa forma não há reprodutibilidade de resultados
dificultando a aprovação em testes clínicos como o de farmacocinética, uma vez que as moléculas que seriam utilizadas não teriam estrutura definida.
Figura 6. Representação da multifuncionalização estatístico-aleatória de um dendrímero. A proporção do
dendrímero substituído como desejado é muito inferior ao número total de dendrímeros produzidos.
Neste contexto, é crucial o desenvolvimento de estratégias sintéticas para obter dendrons e dendrímeros que apresentem número e localização controlados de grupos funcionais diferentes e ortogonais para ligação seletiva de fármacos, agentes de imagem e/ou outras moléculas relevantes para a aplicação desejada.
A síntese de dendrímeros multifuncionais com estrutura bem definida tem sido um desafio constante nesta área. Na literatura, é possível encontrar muitos exemplos de síntese de dendrímeros bem definidos com duas funções. Na figura 7, está representada a síntese de um dendrímero bifuncional, desenvolvido por Newkome e colaboradores[42], usando a reação de Michael entre um nitroalcano e derivados acrilatos. Dendrímeros multifuncionais com estrutura bem definida, contendo três ou mais grupos funcionais diferentes são mais escassos na literatura e constituem um desafio atual na área de pesquisa de síntese de dendrímeros; alguns exemplos de dendrímeros multifuncionais estão mostrados na figura 8.
Figura 7. Newkome e colaboradores propuseram a síntese de um dendrímero bifuncional usando um dendron do tipo AB2C1 composto por 2 ácidos carboxílicos protegidos e um grupo álcool, sintetizado através da adição
de Michael entre um nitroalcano e derivados acrilatos.
Neste trabalho será apresentada uma metodologia para síntese de dendrons trifuncionais usando a reação de Michael entre nitroalcanos e derivados acrilatos. Para construção de um dendrímero, muito se utiliza, como foi visto no trabalho de Vögtle[43] e
também no de Tomalia[44], a Reação de Michael. Esta reação leva o nome do cientista que
primeiro explorou esta reação. Arthur Michael. Publicou um trabalho em 1887 para formação de derivados de ciclopropano.[45] Essa reação se dá pelo ataque de um
nucleofílico em um carbono beta de um composto com uma carbonila alfa-beta insaturada. Esta reação é utilizada, geralmente, para se formar ligação do tipo C-C, embora nos trabalhos de Vögtle e Tomalia o nucleófilo era um nitrogênio, ou seja, com isso há formação de uma ligação N-C.
Figura 8. Exemplos de dendrímeros multifuncionais com estrutura bem definida contendo três ou mais grupos funcionais. a) Dendrímero multifuncional baseado em triazina desenvolvido pelo grupo de Prof. Simanek. b) Dendrímero fullerene-cored sintetizado com a reação de Bingel–Hirsch. c) Dendrímero
fluorescente trifuncional.
d) Dendrímero contend 54 grupos ácido carboxílico, 9 grupos azida e 9 corantes fluorescentes no NIR.
Dendrímeros tem sido, por si só, apresentado como importantes candidatos em aplicações biomédicas como vetorizador de fármacos, entregador de genes e imageamento
in vivo. A possibilidade de multifuncionalização das ramificações permite ligar fármacos,
agentes de vetorização, moléculas para se controlar solubilidade, entre outras, individualmente ou combinadas, possibilitando tanto o diagnóstico quanto a utilização terapêutica. Sua baixa polidispersidade melhora o controle da farmacocinética em testes in
vitro e in vivo, mantendo a reprodutibilidade. Ainda neste trabalho vamos tentar combinar
as vantagens das estruturas dendríticas com as potencialidades das nanopartículas de ouro através da síntese de nanopartículas de ouro dendronizadas.
1.4 Nanopartículas de ouro
Durante milhares de anos apenas dois usos principais foram dados ao ouro minerado: (a) fabricação de jóias, relógios, ornamentos e artigos decorativos para demonstrar status; (b) confecção de moedas ou barras para ser utilizado como dinheiro para a aquisição de bens. O ouro foi eleito para estas duas aplicações porque objetos feitos com ouro têm uma grande durabilidade, uma vez que ele não oxida facilmente.
Desde o começo da década de 70, com o desenvolvimento de técnicas microscópicas mais sofisticadas incluído a microscopia eletrônica[46], as nanopartículas de ouro vêm sendo estudadas em nanoescala para aplicações no campo da nanotecnologia e da nanomedicina[47-50]. Em especial, as nanopartículas de ouro têm tido o seu potencial explorado como vetorizador de fármacos[51-53], agentes de diagnósticos e de imagem[54-55], sensores[46,56-57] e aplicações terapêuticas[58-64] (Figura 9).
Figura 9. Representação ilustrativa de nanopartículas de ouro (esquerda) que tem o tamanho de um vírus
(direita). Note que as AuNPs de tamanho nanométrico, em particular com 40 nm apresentam uma cor rosada.
O tamanho nanométrico das nanopartículas de ouro (AuNPs) conferem ao ouro uma grande área superficial. A superfície das nanopartículas podem ser decoradas com diversos tipos de grupos funcionais e moléculas de interesse, incluindo fármacos, através de ligações do ouro com o grupo tiol (-SH) presente na molécula a ser ligada.[65] Como as nanopartículas de ouro, são inertes no corpo humano, elas apresentam elevada
biocompatibilidade.[12] Então, as AuNPs apresentam grande potencial como sistemas carreadores de fármacos[66] (Figura 10).
Figura 10. Representação esquemática de: (A) funcionalização de AuNPs com uma droga; uma droga é
funcionalizada com o grupo tiol, que forma uma forte ligação com a nanopartícula de ouro, gerando a AuNP funcionalizada; (B) a AuNP funcionalizada é internalizada nas células onde a droga é liberada.
Na escala nanométrica a natureza da ligação do ouro faz com que haja elétrons que se movimentam livremente pela superfície da nanopartícula. Quando se emite luz no comprimento do infravermelho próximo (NIR), esses elétrons respondem a este estímulo entrando em ressonância com a radiação. Este fenômeno é chamado de Surface Plasmon Resonance (SPR).[67]
Na superfície das AuNPs pode-se ligar moléculas que se ligam preferencialmente na superfície de células tumorais (grupos direcionadores). Ao incidir a radiação NIR sobre as AuNPs que estão ligadas às células tumorais, estas absorvem a luz e emitem calor causando um aumento de temperatura localizado (hipertermia). Esta pequena variação na temperatura das células causa a morte celular apenas das células afetadas pela hipertermia, ou seja pelas células tumorais às quais as AuNPs estão ligadas (Figura 11). [68]
Figura 11. Representação esquemática do uso de AuNPs para causar a morte de células tumorais por
hipertermia: (A) a nanopartícula de ouro é decorada com moléculas que são reconhecidas pelas células tumorais (grupos direcionadores); (B) os grupos direcionadores se ligam às células doentes aproximando as AuNPs das células-alvo; (C) radiação NIR é absorvida pela AuNP que emite calor causando um aumento da
temperatura local, matando as células tumorais.
Michael Faraday, que passou parte do século 19 estudando a luz e sua interação com a matéria, desenvolveu uma metodologia para fazer colóides de ouro utilizando HAuCl4, em uma solução de fósforo em dissulfeto de carbono, que permitiu um estudo mais detalhado das nanopartículas de ouro. Durante os seus experimentos com ouro, ele notou uma solução bem avermelhada: uma cor bem diferente do ouro macroscópico. Desde então novas metodologias têm sido desenvolvidas para se obter colóides de ouro dos mais diversos formatos e tamanhos; incluindo esferas, bastões, prismas, cubos, estrelas, flores, ouriços, etc (Figura 12).
Figura 12. Imagens de microscopia de AuNPs de várias morfologias. Entre elas bastões largos e finos,
ouriços, triângulos e tetraedro, quadrados e cubos. Boisselier E, Astruc D. “Gold nanoparticles in
nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity.” Chem Soc Rev. 2009
As AuNPs possuem algumas propriedades que despertam interesse em aplicações na área médica, como baixa reatividade e toxicidade, biocompatibilidade, que têm levado estudos dessas nanopartículas até testes clínicos. Também apresenta propriedades ópticas (como Surface Plasmon Resonance), que aumentam o interesse na utilização dessas nanopartículas como agentes de imagem (diagnóstico) e terapêutica.
De acordo com a teoria de Mie, um campo eletromagnético pode induzir uma oscilação ressonante nos elétrons livres da superfície da nanopartícula. Parte da luz é absorvida e parte é espalhada. Os elétrons começam a responder ao campo devido à proporção absorvida, e começam a oscilar na nanopartícula. Quando a frequência do campo que incide é igual à frequência de oscilação se atinge um estado de ressonância. Isso faz com que parte da energia absorvida seja emitida na forma de calor (Figura 13). Esta faixa de frequência que levam os elétrons à ressonância é conhecida como banda plasmônica, e pode ser manipulada mudando a morfologia da nanopartícula, para absorver e emitir em variados comprimentos de onda, tornando-a uma agente de imagem.
Figura 13. Na figura observamos elétrons livres na superfície da nanopartícula (esquerda). Quando incidido
um campo eletromagnético adequado induz uma ressonância desses elétrons (centro). A energia dissipada desta ressonância aquece a nanopartícula (direita).
Conjugados funcionalizados de AuNPs também têm tido um avanço significativo no campo da nanotecnologia, devido ao seu potencial para aplicações como vetorizador de fármacos, diagnóstico e imageamento, sensores e agentes de tratamento. Dendrons e dendrímeros têm sido vastamente utilizados na funcionalização de nanopartículas de ouro, desde o desenvolvimento de uma metodologia para encapsular nanopartículas por Tomalia e Crooks.
1.5. Nanopartículas de Ouro Dendronizadas
As AuNPs podem ser funcionalizadas com vários tipos de moléculas pequenas, polímeros, dendrímeros e dendrons. AuNPs funcionalizadas com dendrons na sua superfície chamam-se de nanopartículas de ouro dendronizadas (Figura 14). O desenvolvimento de nanopartículas com dendrímeros e dendrons acoplados é interessante devido ao controle da dimensão do núcleo e a possibilidade de multifuncionalização controlada da extremidade.
Com a síntese da nanopartícula de ouro e do dendrons realizadas separadamente, de forma que a nanopartícula não cresça junto com o dendron, há um melhor controle sobre o tamanho e a distribuição dos conjugados. Nanopartículas também têm sua estabilidade em meio biológico aumentada.
As propriedades da grande área superficial em razão do volume, estabilidade, biocompatibilidade, baixa toxicidade faz dessas partículas funcionalizadas muito atrativas para aplicações biomédicas.[70-72]
Figura 14. Representação esquemática da estrutura de uma nanopartícula de ouro dendronizada.
Nanopartículas de ouro funcionalizadas podem ser importantes no transporte de ácidos nucleicos em gene therapy,[73] que junto com quimioterapia são os métodos mais usuais de combate ao câncer[74-77]. Funcionalizados por dendrons, AuNP podem ter suas
propriedades beneficiadas, reduzindo a degradação dos compostos transportados[78], melhorando a vetorização de fármacos e genes, ou ainda diminuindo a toxicidade, fazendo das nanopartículas efetivas no tratamento em alguns tipos de câncer[79-82]. Possíveis aplicações no combate de alguns tipos de câncer vêm sido estudados, como pela absorção de luz na faixa do infravermelho próximo, que eliminam células de câncer de mama pelo efeito fototérmico das nanoestruturas.[83]
2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste trabalho de pesquisa tentou-se combinar as propriedades e vantagens dos dendrímeros com as potencialidades das AuNPs de forma a obter nanopartículas de ouro dendronizadas multifuncionais com potencial aplicação em nanomedicina. A primeira parte do trabalho foi dedicada ao desenvolvimento de uma nova metodologia sintética para obter dendrons multifuncionais com grupos ortogonais. Com estes novos dendrons construiu-se dendrímeros trifuncionais e pentafuncionais com estrutura bem definida inéditos na literatura. A segunda parte do trabalho foi dedicada ao desenvolvimento de uma metodologia para ligar os dendrons a vários tipos de AuNPs para obter AuNPs dendronizadas.
2.1.Desenvolvimento de uma metodologia para sintetizar dendrons trifuncionais
Durante este projeto foi proposta a síntese de três dendrons trifuncionais, a partir da nitrocicloexanona, usando duas rotas sintéticas diferentes (Figura 15). A abertura do anel da nitrocicloexanona foi realizada em condições redutivas obtendo o 6-nitroexanol (composto 2), e em condições oxidativas gerando o ácido 6-nitroexanóico (composto 3), que são moléculas lineares que possuem um grupo nitroalcano. Os hidrogênios vizinhos ao grupo nitro são hidrogênios ácidos, ou seja, em meio básico se comportam como doadores de Michael.
A abertura redutiva do anel da nitrocicloexanona 1 foi realizada, como sugere Ballini,[7] gerando o ácido 6-nitrohexanóico 3 com 75% de rendimento após purificação por coluna cromatográfica. O produto foi obtido puro na forma de um óleo amarelo pálido e caracterizado por RMN de 1H e 13C e espectrometria de massas confirmando a sua estrutura (Figura 16).
A abertura do anel em condições oxidativas, usando água e NaOH, fornece o 6-nitrohexanol 2 com rendimentos maiores do que 95% sem a necessidade de purificação por coluna. O produto foi obtido puro após a extração com água e DCM e caracterizado por RMN de 1H e 13C e espectrometria de massas confirmando a sua estrutura (Figura 17).
Ambos os espectros de RMN de 1H dos compostos 2 e 3 apresentam um tripleto a 4,37 ppm referente aos CH2 vizinhos ao grupo -CNO2. No espectro de RMN de 1H do
composto 2 se observa um tripleto em 3,55 ppm referente aos CH2 vizinhos ao grupo –OH, enquanto que no espectro do produto 3 esse CH2 aparece em 2,55 ppm porque estão vizinhos ao grupo COOH.
Figura 15. Esquema da síntese dos três dendrons trifuncionais sintetizados. Dendrons 12 e 15 foram obtidos
Nas figuras 16 e 17 estão identificados todos os sinais de 1H dos compostos 2 e 3 demonstrando que os espectros dos produtos obtidos correspondem às estruturas propostas. Estes produtos também foram caracterizados por RMN de 13C e espectrometria de massas.
.
Figura 16. Espectro de RMN de ¹H do 6-nitrohexanol 2.
É importante salientar que a abertura do anel em condições oxidativas fornece o ácido 6-nitroexanóico puro em rendimento quase quantitativo e sem necessidade de purificação por coluna (Figura 17). Então, por causa da maior facilidade na preparação e dos rendimentos superiores, o ácido 6-nitroexanóico foi mais frequentemente utilizado nas nossas sínteses do que o 6-nitroexanol.
Os produtos 2 e 3 possuem dois hidrogênios “ácidos” (indicados nas figuras 16 e 17 como H1), então estes compostos foram usados como doadores de Michael, na síntese dos dendrons trifuncionais.
A etapa mais desafiadora da síntese do dendron trifuncional foi a síntese dos monoaductos de Michael 4 e 5, uma vez que quando realizado nas condições típicas desenvolvidas por Newkome, usando solvente orgânico (THF) e triton-B como base, os
dois hidrogênios são substituídos e apenas se isola o diaducto de Michael gerando dendron bifuncional.
Figura 17. Espectro de RMN de ¹H do ácido 6-nitrohexanóico 3.
Para conseguir realizar a monossubstituição, o solvente orgânico foi substituído por água. Quando se usa um solvente polar prótico a base fica solvatada, fazendo com que o raio efetivo da base aumente. Sendo assim, após a primeira substituição, a base não abstrai o outro hidrogênio favorecendo a formação do produto monossubstituído. Mais do que favorece, o produto dissubstituído não foi identificado nesta reação, embora outros produtos laterais formados foram detectados. Possivelmente formou-se o produto de eliminação, fazendo com que o rendimento da reação para o produto desejado seja entre 50 e 55%. Rendimento este muito próximo do rendimento de Newkome e colaboradores assim como Weck e colaboradores para formação do dendron do tipo AB2C, em THF.[11] A mudança na multiplicidade do hidrogênio em 4,56 ppm indicou a mono substituição de Michael (Figura 18).
Figura 18. Espectro de RMN de ¹H e região do HSQC correspondente ao sinal do hidrogênio e carbono
vizinhos ao grupo nitro do composto 5.
A multiplicidade do hidrogênio em 4,56 ppm, que era um tripleto no ácido 6-nitroexanóico, se tornou um sinal de segunda ordem, indicando a mono adição do acrilato na molécula. Analisando o espectro de RMN de 2D HSQC (Figura 18) fica claro que este sinal corresponde ao hidrogênio ligado ao carbono vizinho ao grupo nitro. Deste modo foi obtido um dendron bifuncional com um hidrogênio passível de sofrer outra substituição: DenBi-H 5.
Este sinal de segunda ordem é um sinal do tipo dddd, uma vez que o hidrogênio ligado ao carbono vizinho do grupo nitro tem um acoplamento do tipo ³J com quatro hidrogênios diasterotópicos. O sinal lembra um hepteto, porém é a sobreposição dos sinais dos hidrogênios, como mostra a figura 19.
Figura 19: Sobreposição de sinais do tipo dddd, formando um sinal de segunda ordem, que lembra um
hepteto.
Esta etapa precursora à do dendron trifuncional foi otimizada estudando-se a cinética da reação. Para tal, a reação para formação do composto 5 foi realizada em água deuterada (D2O) num tubo de RMN, e os espectros de RMN de 1H foram adquiridos em vários tempos de reação. Desta forma foi possível acompanhar o crescimento do sinal de segunda ordem (formação do produto 5) e o decréscimo do sinal do tripleto (consumo do material de partida 3), medidos nos intervalos de tempo demonstrados na figura 20.
Figura 20. Espectros de RMN de ¹H na região do hidrogênio ligado ao carbono vizinho ao grupo nitro.
Foi observado que a partir de 4h de reação, um subproduto começa a se formar (triplete a 4,43 ppm, Figura 20) e que a formação desse subproduto é mais acentuada a partir de 48h, que foi o tempo ótimo da reação (Figura 21). Com um tempo mais longo se pode observar que o produto lateral é favorecido (Figura 21). Este produto lateral pode ser produto de eliminação, uma vez que a base utilizada é uma base forte, porém o produto lateral não foi isolado nem caracterizado.
A otimização das condições reacionais para obtenção do composto 5 foi realizada variando a base, temperatura, solvente e proporções entre os reagentes. Os rendimentos são relativos e estão apresentados na tabela 1.
Utilizando apenas as integrais do sinal de segunda ordem, calibrado para 1.00, foi então medida a integral do tripleto. Com isso considera-se que todo o hidrogênio do tripleto é consumido para formação do sinal de segunda ordem, por isso os rendimentos marcados com (*) são muito discrepantes, já que a formação de um produto lateral, como mostrado nas duas últimas figuras é significativo. A reação em metanol utilizando triton-B como base também tem rendimentos interessantes e não deve ser descartado como síntese, porém a condição reacional onde se usa água e NaOH foi considerada superior pelo custo e pelas condições mais amenas para se manipular.
Usando uma metodologia semelhante, realizamos a síntese usando o 6-nitrohexanol como produto de partida para obtenção do produto 4. O produto 4 foi obtido com 55% derendimento e caracterizado por RMN de 1H e 13C e espectrometria de massas (Figura 21).
Tabela 1. Otimização das condições reacionais para a síntese do composto 5; rendimentos relativos determinados por RMN do produto.
t(h) Solvente Nitroácido (mmol) Base (1.5 eq) Eq t-butil acrilato T ºC Tripleto\ Hepteto(1) Rendimento relativo(%) 6 D2O 0,05 NaOD 2 r.t 4,4 18,5 12 D2O 0,05 NaOD 2 r.t 2,54 28,2 24 D2O 0,05 NaOD 2 r.t 1,74 36,5 48 D2O 0,05 NaOD 2 r.t 1,31 43,3 72 D2O 0,05 NaOD 2 r.t 1,21 45,2 96 D2O 0,05 NaOD 2 r.t 0,69 59,2* 216 D2O 0,05 NaOD 2 r.t 0,29 77,5* 72 H2O 0,37 NaOH 1 r.t 25,92 3,7 72 H2O 0,37 NaOH 2 r.t 1,98 33,6 72 H2O 0,37 NaOH 4 r.t 1,7 37,0 72 MeOH 0,10 Triton-B 2 r.t 0,14 87,7 72 THF 0,10 Triton-B 2 r.t 0,0 72 H2O 0,10 NaOH 2 80 ---- 0,0 72 H2O 0,10 Triton-B 2 80 ---- 0,0 72 H2O\ MeOH 0,10 NaOH 2 r.t 2,43 29,2 72 H2O\ MeOH 0,10 Triton-B 2 r.t 0,14 87,7
Figura 22. Espectro de RMN de ¹H do composto 4.
No espectro de RMN do composto 4 se observa o sinal em 4,55 ppm parecido com um hepteto semelhante ao do composto 5. A maior diferença entre os espectros dos compostos 4 e 5 é a presença do sinal em 3,56 ppm que corresponde aos hidrogênios vizinhos ao grupo –OH do composto 4.
Foram realizadas várias reações do nitroácido com outros aceptores de Michael. Entre eles o ácido acrílico e uma acrilamida carregando um N-glicol, no entanto nem o ácido acrílico nem a acrilamida reagiram nas mesmas condições do t-butilacrilato. Partiu-se então para o uso de outros ésteres de acrilato incluindo o trietilenoglicol acrilato. Neste caso, a reação ocorreu, porém o meio básico prótico hidrolisou parte do éster. No RMN de 1H do produto bruto (Figura 23), se pode ver que a reação ocorreu devido ao aparecimento do sinal em 4,55, no entanto a tentativa de isolar o produto mostrou que o fragmento HGly não estava mais conectado no dendron devido a hidrólise básica do éster.
Figura 23. Espectro de RMN de ¹H do produto bruto da reação da mono adição com Glicol acrilato.
A baixa solubilidade do produto 4 e 5 em água poderia ter sido o fator chave da mono substituição, porém no caso do produto com o glicol acrilato, que é solúvel em água, a reação também é favorecida. Como o produto tem uma alta solubilidade em água, devido ao grupo glicol, a hipótese da base solvatada é reforçada por este resultado.
A síntese dos dendrons trifuncional foi realizada a partir dos compostos 5 fazendo uma segunda adição do tipo Michael, desta vez em THF, para que a base possa abstrair o segundo hidrogênio vizinho ao grupo nitro, utilizando a acrilato cetona. Desta forma foi obtido o produto 7 que apresenta trifuncionalidade contemplada por um grupo éster, um grupo cetônico e um álcool. O álcool foi protegido, utilizando anidrido acético, para evitar reações laterais quando o dendron for acoplado num core de dendrímero. Haveria competição após a redução, já que tanto o álcool quanto o grupo amino, proveniente da redução do grupo nitro, são nucleófilos. O composto 7 foi caracterizado por RMN de 1H (Figura 24) e 13C e espectrometria de massas.
Figura 24. Espectro de RMN de ¹H do dendron trifuncional 7.
A partir do composto 5 foi realizada a síntese do dendron trifuncional 8. A segunda substituição foi feita com trietilenoglicol acrilato. Desta forma, o dendron tem os seus três braços com funcionalidades diferentes. A caracterização foi feita por RMN e espectroscopia de massas (Figura 25 e Figura 26).
No espectro de RMN de 1H do composto 8, se pode observar os sinais das três funcionalidades do dendron. Hidrogênios marcados com HA são os hidrogênios referentes a ramificação que contendo o ácido carboxílico. Os hidrogênios marcados com Hgly corresponde a ramificação referente ao éster glicol e, finalmente, os marcados com Ht carregam o grupo éster terc-butílico. Desta forma temos o dendron da forma AB1C1D1.
Figura 26. Espectro de massas do composto 8.
O espectro de massas do composto 8, no modo negativo, apresenta o pico molecular esperado para o dendron trifuncional, e além disso foi observada a total compatibilidade entre a simulação teórica da distribuição isotópica e o obtido experimentalmente, confirmando o sucesso da síntese do dendron 8.
O grupo ácido carboxílico ácido do dendron 8 foi posteriormente protegido com trimetilsililetanol, formando o produto 9, para impedir a futura reação lateral do ácido com o grupo amino do ponto focal (proveniente da redução do grupo nitro). O espectro do RMN de 1H do composto 9 está apresentado na figura 27.
Figura 27. Espectro de RMN de ¹H do composto 9.
Com o ácido carboxílico protegido o grupo nitro foi, então, reduzido. Para evitar a ciclização do grupo amina com o éster glicol, a redução foi feita em meio acidificado com ácido para-toluenossulfônico. Desta forma, a amina formada se encontra protonada, impedindo o ataque nucleofílico da amina nessa carbonila. Dessa forma obteve-se o produto 11 com rendimento quase quantitativo, que foi caracterizado por RMN de 1H (Figura 28).
Figura 28. RMN de ¹H do composto 11.
Mais um dendron foi sintetizado a fim de construir, posteriormente, um dendrímero com cinco funções diferentes, que podem ser trabalhadas separadamente. A síntese foi feita
a partir da rota redutiva (representada na figura 15) para que fosse obtido o dendron trifuncional 12. O dendron foi caracterizado por RMN de próton (Figura 29), carbono e espectroscopia de massas.
Figura 29. Espectro de RMN de 1H do dendron 14. Cada ramificação tem um sinal correspondente de mesma
cor.
2.2. Síntese de dendrímeros trifuncionais e pentafuncionais com estrutura bem definida
Usando os dendrons trifuncionais descritos na secção anterior, foi possível sintetizar dendrímeros trifuncionais e pentafuncionais inétidos na literatura. Para tal, os dendrons foram sucessivamente adicionados a um dendrímero poliamida simétrico homofuncional com dezoito grupos terminais do tipo ácido carboxílico (dendri-(COOH)18). O dendrímero a ser multifuncionalizado foi construído a partir da adição de Michael do terc-butil acrilato no nitrometano, formando o dendron nitrotriester A (Figura 30). O dendron nitrotriester A passa por uma redução formando o aminotriéster B, e parelamente o nitrotriacido C é obtido a partir da hidrólise ácida do composto A. Os dendrons B e C reagem através de um acoplamento de amida formando o dendron de geração 2 D (Figura 30). O grupo nitro do dendron D foi reduzido a amina, e então acoplado, também via amidação, a um linker
diácido formando um dendrímero que é posteriormente desprotegido em meio ácido, resultando no dendri-(COOH)18 (Figura 30).
Figura 30. Esquema de síntese usada para construir o dendri-(COOH)18.[13]
O dendron trifuncional 11 foi usado na síntese de o dendrímero trifuncional 16 com estrutura bem definida. Os dois grupos ácidos podem ser desprotegidos seletivamente e funcionalizados de acordo com a aplicação desejada. O braço contendo o grupo etilenoglicol já tem a sua função definida na molécula, que é melhorar sua solubilidade em meio aquoso. O backbone do dendrímero usado nesta síntese é constituído por ligações amida e foi sintetizado usando uma metodologia previamente publicada pelo nosso grupo.[13] O dendron trifuncional foi, então, acoplado às extremidades do dendrímero através de ligação amida entre o grupo amina do ponto focal do dendron e os grupos terminais ácido carboxílico do dendrímero. Desta forma foi obtido um dendrímero com as três funcionalidades diferentes nas extremidades (Figura 31), distribuídos de forma simétrica e bem definida. A aleatoriedade não faz parte da construção deste dendrímero contendo, nas extremidades, três grupos funcionais diferentes, sendo dezoito unidades de cada grupo funcional no total de cinquenta e quatro grupos terminais. Este produto foi caracterizado por RMN de 1H, 13C e 2D (Figura 32).
Figura 31: Estrutura do dendrímero trifuncional 16 com estrutura bem definida.
Figura 32. Espectro de RMN de ¹H do dendrímero trifuncional.
Foi feito um espectro de RMN DOSY do dendrímero trifuncional, para se certificar que os sinais presentes no espectro e suas integrais não correspondiam as possíveis impurezas, além de fornecer informações adicionais para caracterizar o composto, como o raio hidrodinâmico e o coeficiente de difusão (Figura 33). O espectro de RMN DOSY mostra que todos os picos pertencem à mesma molécula com o mesmo coeficiente de difusão em clorofórmio deuterado, apresentando um raio hidrodinâmico aproximado de 2,5 nm, ou seja, um diâmetro de aproximadamente 5,0 nm.
Figura 33. Espectro de RMN DOSY do dendrímero trifuncional 16 e respectivos valores de coeficiente de
difusão e raio hidrodinâmico calculados a partir do espectro usando a relação de Stokes-Einstein.
Para demonstrar a ortogonalidade dos grupos funcionais do dendrímero, procedeu-se com a desproteção procedeu-seletiva de apenas um dos procedeu-seus grupos terminais. No caso, o ácido protegido com o éster terc-butílico foi desprotegido usando ácido fórmico. O espectro de RMN de 1H do dendrímero desprotegido mostra que a desproteção ocorreu sem interferir nas demais funcionalidades. O RMN de próton deste dendrímero (17) é muito parecido com do dendrímero trifuncional 16, porém nota-se o desaparecimento do singlete em 1,44 ppm, referente aos hidrogênios do terc-butil (Figura 34).
Figura 34. Estrutura e espectro de RMN de 1H do dendrímero trifuncional desprotegido 17.
Ao ácido carboxílico livre do dendrímero 17, acoplou-se o dendron trifuncional 12 resultando no dendrímero 18 que apresenta um número controlado de cinco funcionalidades diferentes: 18 ETG, 18 ácidos protegidos com EtTMS, 18 ácidos protegidos com tBu, 18 aldeídos protegidos e 18 álcoois protegidos com grupo acetato (Figura 35). O RMN de 1H
do dendrímero pentafuncional 18 está apresentado na Figura 36. Todos os grupos funcionais presentes no dendrímero 18 são ortogonais e podem ser desprotegidos seletivamente e sequencialmente de forma a poderem ser acopladas as funções de interesse para a aplicação desejada.
Figura 35. Síntese do dendrímero pentafuncional 18 a partir do dendrímero trifuncional 17 e o dendron 12.
Figura 36. Espectro de RMN de 1H do dendrímero pentafuncional 18 com metilenos internos e grupos
externos atribuídos.
2.3. Síntese de nanoparticulas de ouro dendronizadas.
Dendrons multifuncionais podem ser acoplados em nanopartículas de ouro, funcionalizando o ponto focal com o grupo tiol. Com isso temos nanopartículas
dendronizadas e multifuncionais, sendo promissoras em nanomedicina. A multifuncionalização controlada destas extremidades é um desafio e é imprescindível para avanços nesta área, visando a versatilidade para aplicação desta tecnologia.
Para a construção de nanopartículas dendronizadas foram sintetizados dendrons que possuíam um grupo tiol no ponto focal. A síntese foi feita de forma divergente, a partir do ácido tioglicólico. Ácido tioglicólico teve seu grupo tiol oxidado, com iodo em peróxido de hidrogênio, formando a ponte dissulfeto.O grupo tiol fica protegido na forma de dissulfeto e evita reações laterais nas etapas posteriores. A reação dos grupos ácido do dímero de ácido tioglicólico com o dendron aminotriester resultou no dendrímero 19, que é um dímero de dendrons ligados pela ponte disulfeto (Figura 37). O espectro de RMN de 13C do dendrímero 19 encontra-se na Figura 38. O carbono vizinho à ponte de sulfeto, C5 na figura, está mostrado perto de 43,0 ppm. Caso o grupo tiol não tivesse sido oxidado, C5 estaria abaixo de 30 ppm. Estes dados confirma a estrutura do dímero/dendrímero 19.
Figura 37. Síntese do dendrímero 19, que é um dímero de dendrons ligados pela ponte disulfeto.
As extremidades do dendrímero 19, com grupos tert butis, foram desprotegidas resultando no dendrímero 20 com seis ramificações tendo como grupo terminal ácido carboxílico. Dois dendrons trifuncionais diferentes foram acoplados ao dendrímero 20, resultando nos dendrímeros trifuncionais 21 e 22 repectivamente (Figura 39). Ambos os dendrímeros foram caracterizados por RMN de 1H. Os espectros explicitam bem o core similar entre as duas moléculas e os grupos terminais diferentes (Figuras 40 e 41).
Figura 39. Esquema de reações para obtenção dos dendrímeros/dímeros trifuncionais 21 e 22.
Figura 40. Espectro de RMN de ¹H do tiodendrímero trifuncional 21. As ramificações terminais têm seus
Figura 41. Espectro de RMN de ¹H do tiodendrímero trifuncional 22. Os sinais estão correlacionados à
molécula desenhada ao lado.
Dois tipos de nanopartículas de ouro (AuNPs) foram modificadas com os dendrímeros 21 e 22 descritos acima, resultando em nanopartículas de ouro dendronizadas através da quebra das pontes dissulfeto. Nanopartículas esféricas de 40 nm (da Sigma-Aldrich), estabilizadas em solução tampão de citrato, foram modificadas com o tiodendrímero trifuncional 22. Nanoflores de ouro de 200 nm obtidas pelo grupo do professor do IF-USP-SC, Prof. Dr. Valtencir Zucolotto, estabilizadas com PEG-Tiol (Figura 42), foram modificadas com tiodendrímero trifuncional 21 e um dendron fornecido pelo colaborador Diego Bertuzzi, carregado de grupos glicóis, mostrado na figura 43.
Figura 43. Estrutura química do dendron 23 com grupo tiol no ponto focal, sintetizado pelo colega Diego
Bertuzzi, usado na modificação das nanoflores de ouro.
A primeira substituição feita nas nanoflores foi realizada com o tiodendrímero trifuncional 21. Após adição do dendrímero à solução contendo as nanoflores de ouro, a solução reacional ficou sob agitação durante 48 h para promover a substituição do ligante tiol. As nanopartículas estavam estabilizadas com PEG-Tiol que foi substituído pelo dendron tiol trifuncional resultante da quebra da ligação disulfeto do dendrímero 21. Se pode observar uma mudança no tamanho médio da partícula (Figura 44). Na figura se pode observar a mudança na distribuição do tamanho das nanoflores. As nanoflores estabilizadas com PEG-Tiol têm com um diâmetro hidrodinâmico médio de 95 nm. Após a substituição com os dendrímeros o tamanho médio passou a ser 105 nm. Embora a variação do tamanho das nanoflores seja pouco significativa após a substituição do dendron, é possível ver uma diferença na distribuição do tamanho e uma mudança considerável no valor do potencial Zeta. O potencial Zeta diminuiu, em módulo, de -26,0 ± 8,1 mV para -4,7 ± 3,3 mV.
Figura 44. Dados de DLS obtidos para as nanoflores estabilizadas com PEG-tiol (esquerda) e com os
dendrons 21 (direita).
Ainda utilizando as nanoflores, o dendron 23 foi usado para promover a troca de ligante e obter as nanoflores dendronizadas (Figura 45). Assim, o dendron 23 foi adicionado a uma nova porção de nanoflores estabilizadas com PEG-tiol. A funcionalização das nanoflores com os dendrons é evidenciada pelos dados de potencial Zeta que mudaram de -26,0 ± 8,1 mV para -58,4 ± 5,9 mV, devido aos grupos ácidos carboxílicos terminais que são carregados de carga negativa, causando o aumento no módulo do potencial. O tamanho também tem uma grande variação. Os grupos ácidos carboxílicos exigem uma grande camada hidrodinâmica para neutralizar a carga na superfície das nanoflores, com isso o diâmetro hidrodinâmico das nanoflores aumenta após a substituição.
Figura 45. Representação esquemática das nanoflores de ouro funcionalizadas com o dendron 23.
As nanoflores de ouro funcionalizadas com o dendron 23 também foram caracerizadas por microscopia de transmissão eletrônica (TEM) e microscopia eletrônica de varrimento
