FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
KELY KARINA BELATO
Efeitos antineoplásicos e anticélulas-tronco tumorais in vitro da sinvastatina em 3 subtipos moleculares distintos de carcinoma mamário humano: um
estudo imunocitoquímico e metabolômico
CAMPINAS 2019
KELY KARINA BELATO
“Efeitos antineoplásicos e anticélulas-tronco tumorais in vitro da sinvastatina em 3 subtipos moleculares distintos de carcinoma mamário humano: um
estudo imunocitoquímico e metabolômico”
Tese apresentada ao programa de Pós Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos de obtenção do título de Doutora em Farmacologia.
Orientador: ANDRÉ ALMEIDA SCHENKA
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA KELY KARINA BELATO SOB ORIENTAÇÃO DO
PROF. DR. ANDRÉ ALMEIDA SCHENKA
Campinas 2019
Programa de Pós Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
“A Ata da Defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
ORIENTADOR: PROF. DR. ANDRÉ ALMEIDA SCHENKA
BANCA EXAMINADORA DE DEFESA DE DOUTORADO
KELY KARINA BELATO
MEMBROS:
1. Dr. André Almeida Schenka 2. Dra. Larissa Bastos Eloy da Costa. 3. Dra. Noeme Sousa Rocha
4. Dr. André Lisboa Rennó 5. Dr. Rodrigo Fabrizzio Inácio
Dedico este trabalho aos meus pais Valdenir e Benedita pelo amor incondicional, pelo incentivo a persistir sempre, pela educação e pelas demais condições que me permitiram chegar onde cheguei.
“Success is not final, failure is not fatal: it is the courage to continue that
counts. Success is stumbling from failure to failure
with no loss of enthusiasm.”
Agradecimentos
À DEUS, a razão suprema.
Aos meus pais e sobrinhos, Maria Fernanda, Mariana, Marllon e Luiz Miguel, por sempre transmitirem alegria. A convivência com vocês, o apoio, o carinho e incentivos constantes me ajudaram e ainda ajudam na formação dos princípios que norteiam minha vida.
Aos meus cachorrinhos que me doaram seu amor incondicional: Laika (in memorian), Bruce (in memorian), Loren e a recém-adotada Milly.
Aos professores Drs. Stephen Hyslop, Andre Renno e Gabriel Anhê que participaram da banca de aprovação de doutorado.
À Profa. Dra. Valéria Barbosa pela orientação e ajuda providencial nos experimentos de cultivo celular, imunocitoquímica e metabolômica.
Ao Professor Dr. André Almeida Schenka: pela oportunidade e pela confiança depositada em meu trabalho (mesmo ciente de todas as dificuldades que poderiam interferir em sua realização), pela transmissão de seu conhecimento científico e experiência profissional, pela orientação e apoio.
Ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP.
À CAPES, pelo apoio financeiro que tornou possível a realização deste trabalho. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Aos Professores Drs. Larissa Bastos Eloy da Costa, Edson Antunes e Stephen Hyslop pela imensa contribuição no exame de qualificação.
Aos membros que constituem a banca de defesa, que disponibilizaram seu tempo e atenção a este trabalho.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, muito obrigada!
RESUMO
As estatinas são um grupo de drogas rotineiramente utilizadas no tratamento de dislipidemias, incluindo as hipercolesterolemias primárias e secundárias. As estatinas exercem seus efeitos através da inibição da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMGCoA redutase). O câncer de mama é uma das principais causas de morte por neoplasia maligna no sexo feminino no mundo todo e, por esse motivo, um importante objeto de pesquisa envolvendo o uso de células-tronco neoplásicas (CTN) como alvo farmacológico primário. Segundo evidências cumulativas, as CTNs apresentariam um papel fundamental no desenvolvimento e manutenção das neoplasias malignas, especialmente frente a pressões seletivas terapêuticas. As CTNs exercem tais funções graças à capacidade de autorrenovação, diferenciação multilinhagem, baixo índice proliferativo e expressão de transportadores transmembrana de efluxo. Em estudos prévios, nosso grupo confirmou os efeitos antineoplásicos e anti-CTN in vivo da sinvastina utilizando modelo experimental murino. Contudo, até o momento, escassos trabalhos têm avaliado esses efeitos em tumores humanos (nenhum deles avaliando o papel do subtipo molecular da neoplasia ou as vantagens de uma possível associação com quimioterápicos clássicos). Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivos investigar os efeitos citotóxicos e anti-CTN do fármaco sinvastatina sobre as linhagens celulares MCF-7; MACL-1 e MGSO3. Células dessas linhagens, submetidas a (1) tratamento controle (ausência de fármaco), (2) sinvastatina, (3) doxorrubicina (quimioterápico padrão), (4) uma combinação sinvastatina/doxorrubicina (cada qual em sua respectiva dose de IC25), foram avaliadas: em ensaios de citotoxicidade/viabilidade celular (MTT), quanto a expressão de antígenos de CTNs clássicos (OCT3/4 e SOX-2) e relacionados a ciclo celular (ki67 e ciclina-D1) por imunocitoquímica, e por meio de estudo metabolômico. No presente trabalho, foi possível confirmar os efeitos antineoplásicos da sinvastina, demonstrando sua associação com efeitos anti-CTN e inibitórios do ciclo celular. Tais efeitos não parecem sofrer influência significante por parte do subtipo molecular de carcinoma. Não se observou benefício nítido na associação da sinvastatina com o fármaco referência (doxorrubicina). Do ponto de vista exometabolômico, diferenças estatisticamente significantes foram encontradas entre as 3 linhagens quanto ao seu exometaboloma basal. Finalmente, efeitos pouco expressivos sobre o perfil
exometabolômico foram observados com o uso de sinvastatina e doxorrubicina apenas na linhagens MACL-1 e MGSO-3.
Palavras-chave: câncer de mama, célula-tronco neoplásica, sinvastatina, doxorrubicina, citotoxicidade, metabolômica, imunocitoquímica.
ABSTRACT
Statins are a group of drugs which are frequently used in the treatment of dyslipidemias, including primary and secondary hypercholesterolemias. Their effects are based on the inhibition of 3-hidroxyl-methylglutaril-coenzyme A reductase (HMGCoA reductase). Breast cancer is one of the mais causes of death by malignancy among women worldwide, and because of that it is considered na important research theme and a potential application for the concept of cancer stem cells (CSCs)as primary pharmacological targets. According to cumulative evidence, CSCs have a major role in the development and progression of malignant neoplasms, especially those facing selective therapeutic pressure. CSCs play their role thanks to their ability of self-renewal, multilineage differentiation, low proliferative rates and the expression of membrane eflux transporters. In previous studies, our group has confirmed some the antineoplastic and anti-CSC effects in vivo, using a murine model. However, so far, only few studies have assessed this effects in human tumors (and none of them looking into the role of molecular subtypes of breast cancer or the advantages of a possible association with classic chemotherapeutic agents). In this context, the present study aims to investigate the cytotoxic and anti-CSC effects of simvastatin on MCF-7, MACL-1 and MGSO3 cell lines. Cell samples from these cell lines were submited to control, simvastatin, doxorubicin or combination treatments and assessed for immunoexpression of CSC (OCT3/4 and SOX-2) and cell cycle markers (ki67 and ciclina-D1), as well as changes in metabolomic profile. In this study, we were able to confirm the antineoplastic effects of simvastatin, while demonstrating their relationship with anti-CSCs and anti-proliferation effects. Such effects do not seem to be affected by the molecular subtype of cancer. Furthermore, there was no significant benefit when simvastatin was associated to the reference drug (doxorubicin). Statistically significant differences between cell lines were seen regarding their basal exometabolome. Only minor exometabolic alterations were observed in MACL-1 e MGSO-3 after different pharmacological treatments.
Keywords: breast cancer, cancer stem cell, simvastatin, doxorubicin, cytotoxicity, metabolomics, immunocytochemistry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura mamária. Fotomicrografia e esquema ilustrativo das células e estruturas mamárias.
Figura 2. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais
incidentes estimados para 2018. 22
26
Figura 3. Curva de dose resposta de doxorrubicina e sinvastatina 43 Figura 4. Comparação dos valores de IC50 de Doxorrubicina e
Sinvastatina em linhagens de carcinoma mamário humano (MCF-7, MACL-1 e MGSO-3)
44
Figura 5. Comparação dos valores de IC50 de Doxorrubicina e Sinvastatina em linhagens de carcinoma mamário humano (MCF-7, MACL-1 e MGSO-3)
46
Figura 6. Percentual de morte celular por linhagem de carcinoma mamário humano (MCF-7, MACL-1 e MGSO-3)
48
Figura 7. Imagens representativas de células de carcinoma mamário humano (24 horas).
50
Figura 8. Imagens representativas de células de carcinoma mamário humano (72 horas).
51
Figura 9. Frequência percentual de positividade para marcadores CTN (Oct3/4 e sox2) em células MCF7
54
Figura 10. Frequência percentual de positividade para marcadores CTN (Oct3/4 e sox2) em células MACL1
54
Figura 11. Frequência percentual de positividade para marcadores CTN (Oct3/4 e sox2) em células MGSO3
56
Figura 12. Imagens ilustrativas da qualidade das imunorreações utilizadas na detecção do marcador OCT3/4 (linhagem: MCF-7). Imunoperoxidase, aumento original 400X.
57
Figura 13. Imagens ilustrativas da qualidade das imunorreações utilizadas na detecção do marcador SOX2 (linhagem: MCF-7). Imunoperoxidase, aumento original 400X.
58
Figura 14. Frequência percentual de positividade para marcadores de proliferação (Ki67) e ciclo celular (Ciclina D1) em células MCF7.
Figura 15. Frequência percentual de positividade para marcadores de proliferação (Ki67) e ciclo celular (Ciclina D1) em células MACL1.
61
Figura 16. Frequência percentual de positividade para marcadores de proliferação (Ki67) e ciclo celular (Ciclina D1) em células MGSO3
62
Figura 17. Imagens ilustrativas da qualidade das imunorreações utilizadas na detecção do marcador Ki67 (linhagem: MCF-7). Imunoperoxidase, aumento original 400X.
63
Figura 18. Imagens ilustrativas da qualidade das imunorreações utilizadas na detecção do marcador ciclina D1 (linhagem: MCF-7). Imunoperoxidase, aumento original 400X.
64
Figura 19. Frequência percentual de positividade para marcadores de CTN (Oct3/4 e sox2), proliferação (Ki67) e ciclo celular (Ciclina D1) em células MCF-7, MGSO-3 e MACL1.
66
Figura 20. Cromatograma de íons totais da fração aquosa analisada no modo positivo. MCF7.
Figura 21. Cromatograma de íons totais da fração aquosa analisada no modo positivo. MACL-1
Figura 22. Cromatograma de íons totais da fração aquosa analisada no modo positivo. MGSO-3.
Figura 23. Metabolômica: análise univariada (One-way ANOVA, seguido de LSD de Fisher) – diferenças entre linhagens.
Figura 24. Metabolômica: Scores plot entre componentes principais (PCs) selecionados – diferenças entre linhagens.
Figura 25. Metabolômica: Scores plot entre componentes selecionados do modelo gerado pela análise PLS-DA – diferenças entre linhagens.
Figura 26. Parâmetros referentes à validação cruzada da classificação gerada pela análise PLS-DA, utilizando quantidades diferentes de componentes (1, 2 e 3 componentes).
Figura 27. Scores VIP obtidos a partir da análise PLS-DA: diferenças entre linhagens.
Figura 28. Análise univariada II: diferenças entre linhagens (metabólitos selecionados). 68 69 70 73 71 76 74 78 77 79 79 84 82
Figura 29. Scores plot entre componentes principais (PCs) II: diferenças entre linhagens (metabólitos selecionados).
Figura 30. Scores plot entre componentes selecionados do modelo gerado pela análise PLS-DA II: diferenças entre linhagens (metabólitos selecionados).
Figura 31. Parâmetros referentes à validação cruzada II da classificação gerada pela análise PLS-DA
Figura 32. Scores VIP obtidos a partir da repetição da análise PLS-DA.
Figura 33. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento). Gráfico ilustrando valores de p em função dos valores de pico (mz/rt).
Figura 34. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento). Scores plot entre componentes principais (PCs).
Figura 35. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento). Scores plot entre componentes selecionados do modelo gerado pela análise PLS-DA.
Figura 36. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento). Parâmetros referentes à validação cruzada da classificação gerada pela análise PLS-DA.
Figura 37. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento). Scores VIP obtidos a partir da análise PLS-DA.
Figura 38. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes). Gráfico ilustrando valores de p em função dos valores de pico (mz/rt).
Figura 39. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes). Scores plot entre componentes principais (PCs).
Figura 40. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes). Scores plot entre componentes selecionados do modelo gerado pela análise PLS-DA. 83 84 85 86 90 92 94 95 96 98 100 102
Figura 41. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes). Parâmetros referentes à validação cruzada da classificação gerada pela análise PLS-DA.
Figura 42. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes). Scores VIP obtidos a partir da repetição da análise PLS-DA.
Figura 43. Linhagem MCF-7 (discriminação entre grupos de tratamento). Gráfico ilustrando valores de p em função dos valores de pico (mz/rt).
Figura 44. Linhagem MCF-7 (discriminação entre grupos de tratamento). Scores plot entre componentes principais (PCs) selecionados.
Figura 45. Linhagem MCF-7 (discriminação entre grupos de tratamento). Scores plot entre componentes selecionados do modelo gerado pela análise PLS-DA
Figura 46. Linhagem MCF-7 (discriminação entre grupos de tratamento). Parâmetros referentes à validação cruzada da classificação gerada pela análise PLS-DA.
Figura 47. Linhagem MCF-7 (discriminação entre grupos de tratamento). Scores VIP obtidos a partir da análise PLS-DA.
Figura 48. Linhagem MCF-7 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes). Gráfico ilustrando valores de p em função dos valores de pico (mz/rt).
Figura 49. Linhagem MCF-7 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes).
Figura 50. Linhagem MCF-7 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes).
Figura 51. Linhagem MCF-7 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes).
Figura 52. Linhagem MGSO-3 (discriminação entre grupos de tratamento). Gráfico ilustrando valores de p em função dos valores de pico (mz/rt). 103 104 107 109 111 112 113 115 117 119 120 122
Figura 53. Linhagem MGSO-3 (discriminação entre grupos de tratamento). Scores plot entre componentes principais (PCs).
Figura 54. Linhagem MGSO-3 (discriminação entre grupos de tratamento). Scores plot entre componentes selecionados do modelo gerado pela análise PLS-DA.
Figura 55. Linhagem MGSO-3 (discriminação entre grupos de tratamento). Parâmetros referentes à validação cruzada da classificação gerada pela análise PLS-DA.
Figura 56. Linhagem MGSO-3 (discriminação entre grupos de tratamento). Scores VIP obtidos a partir da análise PLS-DA.
Figura 57. Linhagem MGSO-3 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes). Gráfico ilustrando valores de p em função dos valores de pico (mz/rt). Figura 58. Linhagem MGSO-3 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes). Scores plot entre componentes principais (PCs).
Figura 59. Linhagem MGSO-3 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes). Scores plot entre componentes selecionados do modelo gerado pela análise PLS-DA.
Figura 60. Linhagem MGSO-3 (discriminação entre grupos de tratamento utilizando 15 metabólitos mais importantes).
125 127 128 129 131 133 135 136
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estimativas para o ano de 2018 das taxas brutas e ajustadas 26 Tabela 2. Valores de IC50 (µg/mL) (média ± SD) de Sinvastatina e Doxorrubicina
43
Tabela 3. Identificação e características do metabolito encontrado na Linhagem MCF-7.
73
Tabela 4. Metabolitos encontrados em MACL-1 e MGSO-3 74 Tabela 5. Metabolitos com maior potencial discriminante entre tipos de 88 linhagem.
Tabela 6. Resultados da análise post-hoc utilizando o teste LSD de Fisher. 98 Tabela 7. Linhagem MACL-1 (discriminação entre grupos de tratamento). 105 Tabela 8. Resultados da análise post-hoc utilizando o teste LSD de Fisher. 122 Tabela 9. Diferenças entre grupos de tratamento (MGSO3): metabólitos 123 significantes na análise univariada (anotação).
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 20
1.1. Câncer de mama ... 20
1.2. Impacto epidemiológico do câncer ... 22
1.3. Células-tronco neoplásicas ... 27 1.4. Doxorrubicina ... 28 1.5. Sinvastatina ... 29 1.6. Linhagens celulares ... 30 1.7. Metabolômica ... 31 1.8. Justificativas: ... 31 2. OBJETIVOS ... 33 2.1. Objetivo geral ... 33 2.2. Objetivos específicos ... 33
3. MATERIAL & MÉTODOS ... 34
3.1. Locais principais de realização dos experimentos ... 34
3.2. Fármacos ... 34
3.3. Linhagens celulares ... 34
3.4. Cultivo cellular ... 35
3.5. Delineamento do estudo ... 36
3.6. Ensaio de citotoxicidade celular: MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio brometo) ... 37
3.7. Obtenção das amostras (Cell-block/pellet) e Imunocitoquímica ... 37
3.8. Morte celular/Apoptose ... 38
3.9. Análise exometabolômica ... 39
3.10. Análise Estatística ... 39
4. RESULTADOS ... 42
4.1. Ensaio de citotoxicidade/viabilidade celular ... 42
4.1.1. Influência do subtipo molecular no efeito de diferentes tratamentos sobre a viabilidade celular (IC50 definido pelo MTT) ... 45
4.2. Morte celular ... 47
4.3. Expressão de marcadores de Sox2, Oct3/4, Ciclina D1 e Ki67 ... 53
4.4. Influência do subtipo molecular no efeito de diferentes tratamentos sobre a expressão imunocitoquímica de marcadores CTN, de proliferação e ciclo celular ... 65
4.5. Efeito da sinvastatina sobre o perfil exometabolômico das 3 linhagens ... 67
5. DISCUSSÃO ... 139
5.1. Ações antineoplásicas e antiCTN dos fármacos testados ... 139
5.2. Análise metabolômica ... 140
6. CONCLUSÕES ... 144
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer de mama
A mama é um órgão constituído por tecido contendo células epiteliais luminais (ductais e acinares) e células mioepiteliais/basais. A organização destas células se dá através de ductos e estruturas acinares/alveolares que possuem a função de produzir e secretar leite . A glândula mamária figura entre os órgãos que não estão totalmente desenvolvidos após o nascimento, passando por diversas modificações estruturais e funcionais durante a puberdade e a vida adulta (em particular, durante a fase lútea do ciclo menstrual, gravidez e lactação). Em tese, todos os tipos celulares encontrados na mama podem sofrer mutações sucessivas, levando ao desenvolvimento de câncer mamário ( AL- HAJI & CLARKE, 2004 ; WOODWARD et al., 2005 ; VILLADSEN et al., 2007; KLONISCH et al., 2008; SOLTANIAN and MATIAN, 2011).
O câncer compreende um conjunto de doenças de grande impacto epidemiológico, no mundo todo, tanto pela elevada prevalência, como pela significante mortalidade (DAWOOD et al., 2014). O câncer de mama, em especial, representa a neoplasia maligna mais prevalente e a segunda em mortalidade no sexo feminino, tanto no Brasil como no mundo (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA, 2018). Apesar da diminuição das taxas de incidência e mortalidade observadas nas últimas décadas em países desenvolvidos (como resultado direto de melhorias nas estratégias de diagnóstico, tratamento e epidemiologia), foi detectada uma tendência de crescimento em países em desenvolvimento como o Brasil (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA, 2018). Além disso, a sobrevida de pacientes com tumores mamários em estágio avançado ainda é baixa em todos os países, independentemente de seu status socio econômico (FERLAY, 2015). Desse modo, é fundamental a pesquisa de novas estratégias terapêuticas visando o combate ao câncer de mama.
Nas neoplasias malignas, de uma forma geral, a transformação maligna está associada a múltiplas alterações genéticas sequenciais (REYA et al., 2001). Por isso, o câncer é considerado uma doença genética, mesmo quando não envolve anomalias
genéticas herdadas (germinativas). Tais alterações podem resultar tanto no favorecimento de oncogenes/proto-oncogenes (por exemplo, através de amplificações gênicas), como no desfavorecimento de genes guardiões ou supressores tumorais (por exemplo, através de mutações pontuais ou deleções) (REYA et al., 2001). Dentre os fatores de risco que podem favorecer ou acelerar as alterações genéticas mencionadas anteriormente, destacam-se: (1) exposição aumentada a hormônios sexuais (em particular, hosrmônios estrogênicos, endógenos ou exógenos), (2) menopausa tardia, (3) obesidade, (4) dieta rica em lipídios, (5) resistência periférica à insulina acompanhada de hiperinsulinemia, (6) sedentarismo, (7) nível socioeconômico elevado, (8) alterações genéticas herdadas (e.g., mutações germinativas), etc. (CHABNER et al., 2005; KLONISCH et al., 2008 ; TEMEL et al., 2010; DAWOOD et al., 2014).
Atualmente, com base no perfil de expressão gênica ou, alternativamente, na fenotipagem por técnica imuno-histoquímica, o câncer de mama pode ser classificado em cinco subtipos moleculares: (1) luminal A (RE+ e/ou RP+, índice de proliferação celular avaliado pelo ki67 inferior a 14%), (2) luminal B (RE+ e/ou RP+, e ki67>14% ou positividade para o produto do oncogene HER2/neu), (3) HER2 /neu positivo (apenas positivo para esse marcador) e (4) triplo-negativo/ basal-like (negativo para RE, RP e HER/neu, na sua grande maioria associado a imunoexpressão de marcadores de célula basal. Tais subtipos refletem diferenças não apenas na expressão de receptores de estrogênio (ER)/progesterona (PR) e de fator de crescimento epidérmico humano tipo 2 (HER2/neu), mas também nas taxas de metástase e recorrência pós-tratamento (SØRLIE et al., 2001; POLYAK et al., 2006 OLIVEIRA et al., 2010; de SOUZA & SCHENKA, 2015).
De acordo com (CAMPBELL & POLYAK, 2007), foram apresentados algumas hipóteses sobre a origem e manutenção do câncer, uma hipótese que apresentou destaque, foi a teoria de que um dado tumor maligno poderia se desenvolver a partir das células-tronco (CTs). Acredita-se que as células-tronco poderiam acumular erros em seus ácidos nucleicos originando células tronco neoplásicas (CTNs).
Estas células neoplásicas podem resistir a diversas modalidades terapêuticas anti-neoplásicas, além de pré-dispor a metástase e aumentar a heterogeneidade do tecido . A transformação de uma célula da mama sadia em uma célula cancerosa, envolve diversos processos, tendo como uns dos principais a alteração nos sinais intracelulares das vias de transdução, oferecendo à célula maligna maior
sobrevivência e aumento dos fatores de crescimento (AL- HAJJ et al., 2003; ABRAHAM et al., 2005; COLLINS et al., 2005; LI et al., 2007; O’ BRIEN et al., 2007). A expressão de marcadores CTN em tumores mamários humanos foi demonstrada e quantificada por meio de técnica imuno-histoquímica e também através da análise de imagem, onde foi possível confirmar a relevância clínico-patológica e prognóstica nesta análise. (OLIVEIRA et al., 2017). Em um trabalho do nosso grupo (RENNÓ et al., 2015), foi possível não apenas comprovar a ocorrência destes marcadores em um modelo murino de câncer mamário (ortotópico e induzido por carcinógeno químico – o DMBA), como também desmonstrar que o número células neoplásicas positivas para marcadores CTN pode variar (diminuir) com o uso off-label de certo fármacos utilizados na terapêutica cardiovascular (no caso, mais especificamente, com o uso de sinvastatina). Portanto, temos dados mostrando a importância fisiopatológica e prognóstica das CTNs em seres humanos e animais, assim como a susceptibilidade dessas células a certos medicamentos, como por exemplo a sinvastatina.
Figura 1. Estrutura mamária. Fotomicrografia e esquema ilustrativo das células e estruturas mamárias. (WOODWARD et al., 2005).
1.2. Impacto epidemiológico do câncer
De acordo com dados divulgados pelo INCA (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA, 2018), as estimativas mundiais em 2012, mostram que ocorreram 14,1 milhões de casos novos de câncer e 8,2 milhões de óbitos secundários a essa doença. Houve um discreto predomínio do sexo masculino, tanto na incidência (53%) quanto na mortalidade (57%). De modo geral, as maiores taxas de incidência foram observadas em países desenvolvidos
(América do Norte, Europa Ocidental, Japão, Coreia do Sul, Austrália e Nova Zelândia). Taxas intermediárias são observadas na América do Sul e Central, no Leste Europeu e em grande parte do Sudeste Asiático (incluindo a China). As menores taxas são observadas em grande parte da África e no Sul e Oeste da Ásia (incluindo a Índia). Enquanto nos países desenvolvidos predominam os tipos de câncer associados à urbanização e ao desenvolvimento (pulmão, próstata, mama feminina, cólon e reto), nos países de baixo e médio desenvolvimento, ainda é alta a ocorrência de neoplasias malignas associadas a agentes infecciosos (e.g., colo do útero, estômago, esôfago, fígado).
Os tipos de câncer mais incidentes no mundo são: o de pulmão (1,8 milhão), mama (1,7 milhão), intestino (1,4 milhão) e próstata (1,1 milhão). Nos homens, os mais frequentes são: o de pulmão (16,7%), próstata (15,0%), intestino (10,0%), estômago (8,5%) e fígado (7,5%). Em mulheres, as maiores frequências são encontradas na mama (25,2%), intestino (9,2%), pulmão (8,7%), colo do útero (7,9%) e estômago (4,8%). Estima-se para o Brasil, no biênio 2018-2019, a ocorrência de 600 mil casos novos de câncer, para cada ano. (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA, 2018). Exceto o câncer de pele não melanoma (cerca de 170 mil casos novos), deverão ocorrer em torno de 420 mil casos novos . Um nvo cálculo corrigido para o sub-registro, aponta a ocorrência de 640 mil casos novos, essas estimativas refletem o perfil de um país que possui os cânceres de próstata, pulmão, mama feminina, cólon e reto entre os mais incidentes, e ainda assim, apresenta altas taxas para os cânceres do colo do útero, estômago e esôfago. (MATHERS et al., 2003).
A distribuição da incidência por região geográfica mostra que as regiões Sul e Sudeste concentram 70% da ocorrência de casos novos; sendo que, na região Sudeste, encontra-se quase a metade dessa incidência. Ocorre uma grande variação na magnitude e nos tipos de câncer entre as diferentes regiões do Brasil. Nas regiões Sul e Sudeste, o padrão da incidência mostra que predominam os cânceres de próstata e de mama feminina, assim como os cânceres de pulmão e de intestino. A região Centro-Oeste, apesar de semelhante, apresenta os cânceres do colo do útero e de estômago entre os mais incidentes. Nas regiões Norte e Nordeste, apesar de também apresentarem os cânceres de próstata e mama feminina entre os principais, a incidência dos cânceres do colo do útero e estômago tem impacto importante nessa população. A região Norte é a única do país onde as taxas dos cânceres de mama e
do colo do útero são semelhantes entre as mulheres. (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA, 2018).
Especificamente falando do câncer de mama, são estimados cerca de 59.700 casos novos deste câncer, para cada ano do biênio 2018-2019, com um risco estimado de 56,33 casos a cada 100 mil mulheres (Tabela 1). (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA, 2018). Excluindo os tumores de pele não melanoma, esse tipo de câncer também é o primeiro mais frequente nas mulheres das regiões Sul (73,07/100 mil), Sudeste (69,50/100 mil), Centro-Oeste (51,96/100 mil) e Nordeste (40,36/100 mil). Em termos globais, excluindo-se os cânceres de pele não melanoma, o câncer de mama constitui o tumor maligno mais incidente entre as mulheres, com uma estimativa, para o ano de 2012, de 1,67 milhão de casos novos diagnosticados, o que corresponde a 25,2% de todos os tumores malignos femininos e a uma taxa de incidência de 43,3/100 mil. Considerada a primeira causa de morte por câncer entre as mulheres, sendo estimadas 522 mil mortes para 2012, o que representa 14,7% de todos os óbitos. Embora tenha uma taxa de mortalidade maior do que qualquer outro câncer (12,9/100 mil), o câncer de mama tem letalidade relativamente baixa, dado que a taxa de mortalidade é menor que um terço da taxa de incidência. É o mais prevalente, com aproximadamente 8,7 milhões de sobreviventes previstos em 2012 .Observa-se uma variabilidade na incidência segundo as regiões do mundo, com taxas variando de 27,0/100 mil na África Central e Ásia Oriental a 92,0/100 mil na América do Norte. Em relação a sobrevida é mais alta, nas regiões desenvolvidas, a variabilidade das taxas de mortalidade é menor, 6,0/100 mil na Ásia Oriental a 20,0/100 mil na África Ocidental. (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA, 2018).
Existe uma tendência de crescimento de incidência na maioria das regiões do mundo (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA, 2018). Entretanto, nos países altamente desenvolvidos, a incidência atingiu uma estabilidade seguida de queda na última década. Ainda nesses países, as taxas de mortalidade apresentaram uma tendência de declínio desde o final da década de 1980 e início de 1990, refletindo uma combinação de melhoria na detecção precoce, por meio de rastreamento populacional, e intervenções terapêuticas mais eficazes .Em 2015, no Brasil, ocorreram 15.403 óbitos por câncer de mama. Múltiplos fatores estão envolvidos na etiologia do câncer de mama: idade da primeira menstruação
menor do que 12 anos; menopausa após os 55 anos; mulheres que nunca engravidaram ou nunca tiveram filhos (nuliparidade); primeira gravidez após os 30 anos; uso de alguns anticoncepcionais e terapia de reposição hormonal (TRH) na menopausa, especialmente se por tempo prolongado; exposição à radiação ionizante; consumo de bebidas alcoólicas; dietas hipercalóricas; sedentarismo; e predisposição genética (pelas mutações germinativas principalmente nos genes de alto risco, BRCA1 e BRCA2). (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA, 2018).
Em países que apresentam renda de baixa a média, o diagnóstico do câncer de mama ocorre em estágios mais avançados da doença, aumentando a morbidade relacionada ao tratamento, comprometendo a qualidade de vida e reduzindo a sobrevida dos pacientes (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA, 2018). Com o interesse de modificar esse cenário, o controle do câncer de mama tem sido uma das prioridades na agenda da Política Nacional de Saúde do Brasil. Desta forma, o Ministério da Saúde, por meio da publicação “Diretrizes para a Detecção Precoce do Câncer de Mama no Brasil”, recomenda a identificação da doença em estágios iniciais por intermédio das estratégias de detecção precoce, pautadas nas ações de rastreamento e diagnóstico precoce. A mamografia bienal para as mulheres na faixa etária de 50 a 69 anos é a estratégia de rastreio mais indicada, enquanto o diagnóstico precoce é formado pelo tripé: população alerta para os sinais e sintomas suspeitos; profissionais de saúde capacitados para avaliar os casos suspeitos; e sistemas e serviços de saúde preparados para garantir a confirmação diagnóstica oportuna e com qualidade (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA. INCA, 2018).
Tabela 1. Estimativas para o ano de 2018 das taxas brutas e ajustadas a de incidência por 100 mil habitantes e do número de casos novos de câncer, segundo sexo e localização*.
Fonte: INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA. INCA, 2018.
Figura 2. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2018 por sexo, exceto pele não melanoma. Fonte: INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA. INCA, 2018.
1.3. Células-tronco neoplásicas
As células-tronco neoplásicas (CTNs) são assim chamadas pois conservam não apenas características fenotípicas de células-tronco adultas, como também características funcionais fundamentais como a capacidade de autorrenovação e o potencial de multilinhagem (KLONISCH et al., 2008).Vários trabalhos têm associado as CTNs à capacidade de algumas malignidades de resistir às principais modalidades terapêuticas antineoplásicas, como a quimioterapia e a radioterapia (KAKARALA and WICHA, 2008). Essas modalidades parecem atuar de forma mais eficaz sobre células diferenciadas da neoplasia que estão em ciclo celular, mas não sobre as CTNs (que geralmente estão em G0).
Além de estarem implicadas em resistência terapêutica, as CTNs parecem estar associadas a outras variáveis biológicas significantes como a capacidade de migração celular (deslocamento de células neoplásicas após separação espontânea do tumor parental); a invasividade em tecido conjuntivo (capacidade de se deslocar no tecido conjuntivo, dissolvendo ou destruindo barreiras naturais, como fibras colágenas, células estromais e células imunes, em geral através da produção de enzimas e/ou substâncias citotóxicas); a atividade pró-angiogênica (capacidade de estimular a proliferação de novos vasos a partir de um leito capilar pré-existente, facilitando a nutrição do tumor primário e o acesso de células invasoras ao sistema circulatório); e a tumorigenicidade (capacidade de estabelecer-se e dar origem a um novo tecido neoplásico, em um novo sítio anatômico do organismo de origem ou em um novo organismo vivo (heterotransplante ou xenotransplante), relacionada a expressão de moléculas de adesão, homing e à resistência a mecanismos de defesa inatos e imunológicos locais) (KAKARALA and WICHA, 2008; CHARAFE- JAUFFRET et al., 2009).
As características biológicas mencionadas acima estão diretamente associadas à capacidade de metastatização, um evento que caracteriza o estágio mais avançado das neoplasias malignas, onde a probabilidade de cura e a sobrevivência com qualidade de vida estão consideravelmente reduzidas. Desse modo, a presença e proporção de CTNs em uma neoplasia maligna parecem estar associadas a comportamento biológico mais agressivo e maior resistência as terapêuticas indicadas para o tratamento dessas neoplasias.
1.4. Doxorrubicina
As antraciclinas são um grupo de agentes quimioterapêuticos altamente eficazes usados no tratamento de vários tipos de câncer (SHABALALA et al., 2017). A doxorrubicina (DOXO) é um antibiótico da classe antraciclina com atividade antineoplásica ampla e potente, isolado primeiramente do Streptomyces peucetius. É usado com sucesso no tratamento de câncer de mama, sarcoma, leucemia, tumores sólidos e cânceres hematológicos em humanos e animais (PEIRIS et al., 2017). O mecanismo de ação do DOXO envolve inibição da síntese de DNA, RNA e enzima topoisomerase II que bloqueia a transcrição e replicação do DNA, com liberação de proteínas apoptóticas e produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) (AKOLKAR et al., 2017). No entanto, DOXO está frequentemente associada a cardio e mielotoxicidade, dose-dependentes que representam uma limitação importante ao seu uso clínico. O efeito cardiotóxico está associado à produção de radicais livres e peroxidação lipídica, destruição mitocondrial, liberação de aminas vasoativas, apoptose e acúmulo de altos níveis de ERO que prejudicam o miocárdio (AKOLKAR et al., 2017). A cardiotoxicidade é cumulativa e irreversível, ocorrendo de forma aguda ou crônica e compreende insuficiência cardíaca congestiva irreversível, arritmias e cardiomiopatia dilatada.
Complicações cardiovasculares são efeitos colaterais bem documentados das antraciclinas. DOX pode prejudicar a função de bombeamento do ventrículo esquerdo e levar a cardiomiopatia dilatada e insuficiência cardíaca congestiva (IC), resultando na interrupção do tratamento e agravamento do prognóstico do paciente (CHATTERJEE et al., 2010; DAMIANI et al., 2016). Além disso, o risco de desenvolver cardiotoxicidade subsequente aumenta com a dose do DOX recebido. Do ponto de vista clínico, os pacientes tratados com DOX podem exibir remodelação, incluindo vasta vacuolização citoplasmática, edema do retículo sarcoplasmático e desordem miofibrilar (MITRY et al., 2016). Atualmente, nenhum medicamento é capaz de prevenir eficazmente a cardiotoxicidade induzida por DOX sem diminuir sua atividade antitumoral. Os numerosos mecanismos subjacentes à cardiotoxicidade induzida por DOX são os seguintes: i) estresse oxidativo, ii) dano ao DNA e seus efeitos subseqüentes, e iii) disfunção autofágica ou fluxo autofágico prejudicado (SHABALALA et al., 2017).
1.5. Sinvastatina
O grupo de fármacos conhecidos como estatinas (ou vastatinas) consiste em pouco mais de oito compostos, onde se destacam: a pravastatina, a sinvastatina e a lovastatina (que derivam naturalmente da fermentação fúngica), a fluvastatina, a atorvastatina, a cerivastatina, a rosuvastatina e a pitavastatina (que são compostos sintéticos) (YIN et al., 2018). As estatinas são tradicionalmente usadas para a redução dos níveis séricos de lipídios, especialmente, em individuos com doença cardiovascular (GOLDSTEIN et al., 2015; YIN et al., 2018). Vale observar que, dentre as duas estatinas mais comumente prescritas (sinvastatina e atorvastatina), a sinvastatina destaca-se em termos de número de prescrições anuais para o tratamento da hipercolesterolemia (GOLDSTEIN et al., 2015; YIN et al., 2018).
O mecanismo de ação das estatinas consiste na inibição da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase, que catalisa formação de mevalonato, etapa limitante da velocidade de produção do colesterol e de outros isoprenoides no fígado (GOLDSTEIN et al., 2015; ALQUDAH et al., 2018; YIN et al., 2018). Através deste mecanismo, esses fármacos são capazes de reduzir os níveis de colesterol LDL em até 60% (PAPADOPOULOS et al., 2011). Além do efeito inibitório sobre a produção de colesterol, inúmeros autores nas últimas décadas têm relatado ações antineoplásicas pleiotrópicas (proliferação, apoptose, anti-angiogênese, etc.) (CAMPBELL et al., 2006 ; ZANDARFINO et al., 2013).
A sinvastatina é um membro da família das estatinas que se destaca não apenas pelas ações hipocolesterolêmicas, mas também pelo potencial antioxidante, anti-inflamatório, imunomodulador e antineoplásico (KOCHUPARAMBIL et al., 2011). A sinvastatina demonstrou efeito anticancerígeno significativo contra diferentes tipos de neoplasias malignas, incluindo pulmão, cólon, pâncreas, mama, pele, fígado, bexiga, rim, mieloma múltiplo e câncer de próstata (JAKOBISIAK and GOLAB, 2010). Dados obtidos de estudos baseados em seres humanos revelou que a sinvastatina poderia reduzir o risco de desenvolvimento de ou morte por câncer de próstata (YU et al., 2014; BABCOOK et al., 2016). Os efeitos antitumorais da sinvastatina parecem ser complexos e pleiotrópicos, isto é, podem envolver diferentes estruturas subcelulares e vias moleculares superponíveis. Drogas antineoplásicas com efeitos pleiotrópicos, em geral, mostram-se mais eficazes na prática clínica, dado
que a resistência terapêutica se desenvolve com maior dificuldade. (GHOSH- CHODHURY et al., 2010; SCHOINTUCH et al., 2014, SEKINE et al., 2017).
Estudos clínicos avaliando o uso da sinvastatina na terapia de pacientes com câncer são escassos e ainda insuficientes para a demonstração de um efeito claro (ZHANG et al., 2015). Estudos pré-clinicos evidenciando melhor tais efeitos antineoplásicos, bem como seu mecanismo são necessários para estimular e fomentar estudos clínicos que poderiam levar ao redirecionamento (repurposing) deste fármaco. Cumpre destacar que o redirecionamento (reaproveitamento) de drogas já introduzidas no mercado, especialmente em um país em desenvolvimento como o Brasil, é uma prática altamente desejável, uma que vez corta custos inerentes ao desenvolvimento medicamentos e envolve menores riscos de toxicidades.
1.6. Linhagens celulares
As linhagens seguintes linhagens celulares foram utilizadas neste estudo:
− MCF-7 (derivada de carcinoma mamário humano metastático em pleura, modelo para o subtipo molecular luminal de carcinoma mamário, ou seja, carcinoma positivo para receptor de estrógeno [RE+] e/ou de progesterona [RP+], primeira linhagem de carcinoma mamário humano desenvolvido (1970), modelo rico em células tronco (CD44+/CD24- e CD133+).
− MGSO-3 (derivada de carcinoma ductal in situ, posteriormente transformado em carcinoma mamário invasivo, modelo para o subtipo molecular HER2+, ou seja, carcinoma positivo para a superexpressão do oncogene HER2/neu e negativo para RE e RP): linhagem desenvolvida a partir de carcinoma ductal invasivo mamário.
− MACL-1 (derivada de carcinoma ductal invasivo primário, modelo para o subtipo molecular triplo negativo/basal-like, ou seja, carcinoma negativo para RE, RP e HER2.
1.7. Metabolômica
A identificação de assinaturas moleculares específicas de doenças, principalmente no câncer, através de plataformas baseadas em ômicas tem contribuído muito para a compreensão da patogênese de inúmeras doenças (STOEHER et al., 2014). As abordagens baseadas em 'ômicas', incluindo genômica, proteômica e transcriptômica, têm sido amplamente utilizadas para entender a biologia dos tumores. A metabolômica, desenvolvida recentemente e que faz parte das plataformas "ômicas", está emergindo rapidamente no campo da pesquisa sobre o câncer. O metaboloma, que se refere ao conjunto total de metabólitos finais de um sistema vivo, é o produto final de todos os processos biológicos. Assim, a identificação de alterações metabolômicas utilizando a abordagem metabolômica tem um enorme potencial de impactar a terapêutica do câncer (PISANT et al., 2014; LI et al., 2019; ALKREATHY et al., 2019).
A metabolômica e o câncer compartilham uma estreita conexão, pois as células tumorais sofrem rearranjos metabólicos profundos em numerosos processos fisiológicos voltados para a remodelação tecidual, crescimento tumoral e processo de metastatização. Embora as alterações metabolômicas sejam em geral mera consequência da transformação genômica adaptada pelas células neoplásicas, em alguns casos, podem ser consideradas como a principal causa do câncer. A metabolômica pode fornecer insights únicos sobre a regulação de metabólitos/pequenas moléculas e as vias de sinalização subjacentes a vários processos biológicos (PLAYDON et al., 2019).
1.8. Justificativas:
a) Importância epidemiológica do câncer de mama.
b) Falha terapêutica (mesmo em países desenvolvidos, a despeito de todos os esforços), especialmente em pacientes em estágio avançado.
c) Escassez de trabalhos avaliando o impacto do subtipo molecular de carcinoma mamário humano sobre a resposta terapêutica (antineoplásica e anti-CTN) à sinvastatina.
d) Escassez de trabalhos evidenciando diferenças metabolômicas expressivas.entre subtipos moleculares de câncer de mama.
e) Escassez de trabalhos caracterizando as alterações metabolômicas ocasionadas pela sinvastina e pela doxorrubicina em linhagens humanas de carcinoma mamário. Vale lembrar que fármaco em teste no trabalho (sinvastatina), apresenta um baixo custo em relação ao seu efeito, além da baixa toxicidade.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Contribuir para a caracterização dos efeitos anti-neoplásicos e anti-CTN da sinvastatina em modelo experimental in vitro de carcinoma mamário humano.
2.2. Objetivos específicos
1. Confirmar e caracterizar ações anti-neoplásicas e anti-CTN da sinvastatina e da doxorrubicina (fármaco referência), em uso isolado ou combinado, utilizando ensaio de viabilidade celular (MTT), morte celular/apoptose (análise automatizada da marcação por iodeto de propídio/Hoechst 33342), imunodetecção de marcadores de CTN, de proliferação celular (Ki67) e de ciclo celular (ciclina D1 ).
2. Verificar a influência do subtipo molecular de carcinoma mamário sobre a ação anti-neoplásica e anti-CTN de sinvastatina, doxorrubicina ou da combinação desses fármacos, utilizando 3 linhagens de carcinoma mamário humano (representativas de 3 subtipos moleculares distintos).
3. Descrever modificações no perfil exometabolômico usual das 3 linhagens celulares mencionadas abaixo, após tratamento in vitro com sinvastatina, doxorrubicina, ou com a combinação desses compostos.
3. MATERIAL & MÉTODOS
3.1. Locais principais de realização dos experimentos
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Ciências Morfológicas e Moleculares (LCiMM) do Departamento de Farmacologia/FCM/Unicamp (responsável: Prof. Dr. André A. Schenka), em colaboração com o Laboratório de Espectrometria Atômica do Instituto de Química/Unicamp (responsável: Profa. Dra. Solange Cadore).
3.2. Fármacos
− Sinvastatina. Aspecto físico: pó branco, cristalino, inodoro; fórmula química: C25H38O5; peso molecular: 418,574 g/mol; grau de pureza 97-99% (HPLC); característica adicional: padrão de referência analítico, número de referência química CAS 79902-63-9. Origem: laboratório de manipulação privado (Laboratório Passiflora, farmacêutico responsável: Valdir Venciguerra CRF-SP 10.054).
− Doxorrubicina (cloridrato de doxorrubicina). Aspecto físico: pó liofilizado vermelho-alaranjado (frasco-ampola de 10mg); fórmula química: C27H29O11; peso molecular: 543,46 g/mol; grau de pureza 98-100% (HPLC); número de referência química CAS 23214-92-8. Origem: SIGMA.
3.3. Linhagens celulares
− MCF-7 (derivada de carcinoma mamário humano metastático em pleura, modelo para o subtipo molecular luminal de carcinoma mamário, ou seja, carcinoma positivo para receptor de estrógeno [RE+] e/ou de progesterona [RP+]): amostra adquirida da American Type Culture Collection (ATCC).
− MGSO-3 (derivada de carcinoma ductal in situ, posteriormente transformado em carcinoma mamário invasivo, modelo para o subtipo molecular HER2+, ou seja, carcinoma positivo para a superexpressão do oncogene HER2/neu e negativo para RE e RP): linhagem desenvolvida a partir de carcinoma ductal invasivo mamário de paciente brasileira da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte, cuja amostra foi gentilmente cedida pelo Prof. Dawidson Assis Gomes, do Depto de Bioquímica-UFMG.
− MACL-1 (derivada de carcinoma ductal invasivo primário, modelo para o subtipo molecular triplo negativo/basal-like, ou seja, carcinoma negativo para RE, RP e HER2): linhagem desenvolvida a partir de carcinoma ductal invasivo mamário de paciente brasileira da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte, cuja amostra foi gentilmente cedida pelo Prof. Dawidson Assis Gomes, do Depto de Bioquímica-UFMG.
3.4. Cultivo cellular
A linhagem MCF7 foi mantida em frascos de cultura de tecido (75cm2) contendo meio de cultura RPMI 1640 (R 6504, Sigma), com 10% de soro fetal bovino (16000-044, Gibco), 2% de Glutamax (35050-061, Gibco), 1% de Piruvato de sódio (S8636, Sigma) e 0,2% de Penicilina-Streptomicina (15070-073, Gibco). As células foram incubadas a 37ºC e o pH do meio foi mantido numa atmosfera umidificada com CO2 a 5%.
As linhagens MGSO-3 e MACL-1 foram cultivadas em frascos de cultura celular (de 75cm2) contendo DMEM (Life Technologies) complementado com 10% de soro fetal bovino (16000-044, Gibco), 2% de Glutamax (35050-061, Gibco), 1% de Piruvato de sódio (S8636, Sigma) e 0,2% de Penicilina-Streptomicina (15070-073, Gibco). As células foram mantidas em atmosfera umidificada, a 37oC, com CO2 a 5%.
Os cultivos foram realizados em colaboração com os laboratórios: (1) do Prof. Wilson Nasdruz (experimentos preliminares), (2) Laboratório Multiusuário de Cultivo Celular da FCM sob a responsabilidade da Biologista Amanda Roberta Almeida (experimentos preliminares), (3) da Profa. Solange Cadore (Instituto de Química) e (4) LCiMM.
3.5. Delineamento do estudo
− Etapa 1: determinação das curvas de inibição de proliferação celular dos fármacos sinvastatina (SNV) e doxorrubicina (DX), utilizando as linhagens de carcinoma mamário humano propostas e o método MTT (vide a seguir).
− Etapa 2: cada linhagem celular foi submetida a tratamentos com SNV, DX ou a combinação SNV + DX (em suas respectivas doses de IC25 [dose capaz de inibir o crescimento de 25% das células]). Em seguida, as células foram coletadas e submetidas aos seguintes protocolos:
a) de obtenção de cell blocks, técnica que envolve fixação em formalina neutra tamponada e inclusão em parafina e visa a obtenção de secções citológicas próprias para a realização de ensaios de imunocitoquímica (visando a detecção de marcadores CTN, de proliferação e ciclo celular) b) de quantificação de apoptose (vide adiante).
c) de exometabolômica (vide adiante).
Na etapa 2, as células foram cultivadas em placas de 6 poços e separadas, aleatoriamente, em amostras representativas dos seguintes grupos:
− Controle (células sem tratamento),
− DX (células tratadas com doxorrubicina, fármaco de referência)
− SNV (células tratadas com sinvastatina)
− SNV + DX (células tratadas com sinvastatina e doxorrubicina) Os experimentos da Etapa 2 foram realizados usando a concentração de IC25 de cada fármaco proposto para cada linhagem celular. Todos os experimentos foram realizados em triplicatas (3 experimentos independentes).
3.6. Ensaio de citotoxicidade celular: MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio brometo)
Cada linhagem celular descrita acima, foi distribuída em placas de 96 poços (100µL de células/poço com meio de cultura) com o número de células de acordo com cada curva de crescimento, e tratadas com os compostos-teste, combinados (com doxorrubicina) e isolados em concentrações de 100-0,0001µg/ml. Após 72 h de incubação com os fármacos em estudo, as placas foram centrifugadas a 2000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi removido e, em seguida, acrescentado o MTT (Sigma, M5665) 5mg/mL dissolvido em tampão PBS (Sigma P4417). As placas foram incubadas por 4 h a 37ºC, em atmosfera umidificada a 5% CO2. Após esse período, as amostras foram centrifugadas, o sobrenadante, removido, e os cristais de formazan, dissolvidos em 100 µL de álcool isopropílico. A absorbância foi feita no leitor de placas SpectraMax 340PC 384 (Molecular Device, 1311 Orleans Drive Sunnyvale, CA 94089) a 570nm. No controle negativo, foi esperada uma viabilidade celular de 100%. O experimento foi realizado em triplicatas e os resultados apresentados em valores de média ± desvio padrão.
3.7. Obtenção das amostras (Cell-block/pellet) e Imunocitoquímica
As células de culturas em semi-confluência foram submetidas à centrifugação por 10 min, a 1500 rpm. Após remoção do sobrenadante, foram adicionadas 3 gotas de plasma canino, 3 gotas de tromboplastina e 3 gotas de cloreto de cálcio a 10%. Uma vez formado o coágulo, o mesmo foi transferido para tubo plástico, contendo formaldeído a 4% tamponado e após um período de fixação de 24h, o coágulo foi transferido para uma solução de etanol a 70% e encaminhado para inclusão em parafina.
Cortes de 4 μm feitos a partir dos blocos de parafina (cell blocks) foram colocados em lâminas previamente lavadas, desengorduradas e tratadas em solução de organosilano a 25% em acetona (3-ainopropiltrietoxi-silano, Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO, Estados Unidos da América; cod. A3648). As secções foram desparafinizadas e submetidas à recuperação antigênica, utilizando uma panela a
vapor T-fall em tampão citrato de sódio (pH 6,0) por 30 min a 95ºC e, a seguir, lavadas em água corrente. As amostras foram incubadas com os anticorpos primários: anti-Oct3/4 (N1Nk, monoclonal de camundongo, RTU, Leica), anti-Sox-2 (EP103, monoclonal de coelho, 1:25, BioSB), anti-Ki67 (SP6, monoclonal de coelho, 1:200, BioSB), anti-ciclina D1 (AM29, monoclonal de camundongo, 1:250, Thermo Fisher), overnight. As amostras foram incubadas com o sistema de revelação baseado em polímero Sistema de detecção o NovoLink™ Max Polymer Detection System (cod # RE7260-k, Leica Biosystems) por 1 h a 37ºC. Em cada bateria de reações, 1 secção do cell block não incubada com o anticorpo primário, foi usada como controle negativo. A detecção e captura das colorações citológicas foi feita em regiões de hotspots usando o microscópio Nikon Eclipse 50i (objetiva de 40X) acoplado a uma câmera CMOS de 5Mpx da marca Motic, sendo realizadas 3 capturas por amostra. As quantificações manuais foram feitas no software Image J (NIH, USA), de forma independente, por 2 observadores (cegos ao tratamento), sendo os resultados representados como a média dos dois observadores. Os resultados de positividade foram expressos em % de células positivas para cada marcador (média dos 2 observadores).
3.8. Morte celular/Apoptose
As células MCF-7 (20.000 céls/poço) e MACL1 e MGSO3 (15.000 céls/poço) foram cultivadas em placas Greiner de 96 poços. Cada poço recebeu 100µl de meio + substância-teste por 24 horas e/ou 72 horas. Após esse tempo, o meio de cultura/poço foi descartado. As células foram lavadas com PBS e, em seguida, foi adicionado Iodeto de Propídio na concentração de 5µg/mL (BD Pharmigen) e o corante Hoescht 33342, também a 5µg/mL (Sigma Aldrich). Após 15 minutos de exposição a 37ºC, as placas foram encaminhadas para a obtenção de imagens fluorescentes no ImageXpress (Microconfocal High-Content Imaging Systems, Molecular Devices). A análise foi feita pelo ImageXpress (MetaXpress software, Molecular Devices, EUA).
3.9. Análise exometabolômica
Para esse estudo foi usado também placa de 6 poços. Após 24 horas de exposição aos fármacos propostos para cada linhagem celular, removeu-se o meio de cultura. As células foram lavadas com PBS, e em seguida foi adicionado metanol 10%. As células foram submetidas a agitação em vortex por 15 minutos. O sobrenadante foi colhido e mantido a -80ºC, assim como os pellets, até o momento de análise no espectrômetro de massas (Agilent 6550 q-TOF, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, EUA) do laboratório do Prof. Marcos Nogueira Eberlin do Instituto de Química/Unicamp.
3.9.1 Anotação de Metabólitos
As principais características discriminantes das análises de LC-MS foram selecionadas a partir de análise multivariada (vide abaixo), e sua anotação foi feita de acordo com a massa exata (m/z) do íon protonado ou desprotonado e de seus espectros de fragmentação. Os arquivos de dados .txt com m/z e abundância relativa dos íons obtidos dos espectros de MS e MS/MS foram enviados para o software Monodata base (Mass bank of North America, http://mona.fiehnlab.ucdavis.edu), que fornece fórmulas moleculares dos íons precursores com base na massa precisa, razão isotópica e espectro de íons do produto. Os bancos de dados de espectros: MassBank (http://www.massbank.jp/), o HMDB (http://www.hmdb.ca/) e o pubchem (http:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) foram usados para identificação dos perfis de fragmentação de metabólitos e para confirmação da anotação do metabólito.
3.10. Análise Estatística
No que diz respeito à análise de citotoxicidade, bem como as variáveis derivadas de análise imunocitoquímica, as diferenças entre os grupos foram avaliadas utilizando o ANOVA seguido pelo teste post hoc de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e o nível de significância (p) foi estabelecido em 0.05. Para a confecção de gráficos e aplicação dos testes mencionados acima, foi
utilizado o programa SPSS para Windows (versão 15.0, IBM, USA) ou o GraphPad Prism (versão 5.0, GraphPad Inc., EUA).
Com relação à metabolômica, foi utilizada análise univariada/ multivariada. Para essa análise, os dados metabolômicos foram baseados no processamento de dados do LC-MS usando Análise Qualitativa MassHunter (Software Agilent 6550 q-TOF, Santa Clara, CA, EUA), no qual dados originais brutos foram convertidos para o formato mzData. Os arquivos mzData foram enviados para o XCMS online para posterior processamento de dados (https://xcmsonline.scripps.edu/). O software XCMS foi usado para detecção das características, retenção do tempo de correção, alinhamento e análise univariada. A análise foi feita usando os dados emparelhados com as seguintes definições: detecção das características da onda com 5ppm de desvio máximo tolerado m/z, largura mínima do pico 5s, largura máxima do pico 20s, limiar de sinal/ruído 6, abundância do filtro de ruído 0, prefiltro de abundância 100, 0.01 mz diff e método de integração tipo 1. Foi utilizada uma correção temporal rápida com tamanho de passo de 1 m/z (profStep) para gerar os perfis. Outros parâmetros de alinhamento foram: 0,015 mzwid; 0,5 minfrac; largura mz: 0,015; bw: 5.
Os testes t paramétricos (teste de Welch) e o teste de variância ANOVA foi realizado para identificar características significantes com um limiar de valor p < 0,05 e um limiar de threshold (características altamente significantes) de 1,5. O arquivo csv do processamento XCMS foi carregado para o MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca/) para análise estatística de dados multivariada. O arquivo continha uma lista de características (m/z, tempos de retenção e intensidades) para todas as amostras de cada tipo celular, tratados e controles. O processamento de dados aplicou uma verificação de integridade, verificação de valores faltantes, filtro de dados e normalização antes da análise estatística. A presença de valores omissos ou características com valores constantes (isto é, todos os zeros) foi verificada. E a filtragem de dados usando a faixa de interqualíticas (interquantile range (IQR)) foi aplicada para remover variáveis próximas à linha de base ou limites de detecção e variáveis com valor quase constante.
Para discriminar controles e tratamentos das três linhagens celulares com base em seus perfis de metabolitos de LC-MS, as análises de componentes principais (PCA), análises discriminantes de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) e análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA) foram realizadas
utilizando o software MetaboAnalyst 3.0. Para identificar as características moleculares relacionadas à variação entre os grupos de amostras, foram aplicadas as parcelas de carregamento correspondentes e a importância variável na projeção (VIP). A validação dos modelos de classificação obtidos pela análise multivariada foi feita para confirmar a capacidade de classificação e previsão dos modelos. Os dados foram permutados 100 vezes, e Q2 e R2 foram usados como critério de qualidade do critério.
4. RESULTADOS
4.1. Ensaio de citotoxicidade/viabilidade celular
A citotoxicidade da sinvastatina em linhagens de carcinoma mamário humano foi avaliada após 72 horas, usando o ensaio de MTT (Mosmman, 1983) que se baseia na redução do sal Tetrazolium ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) de cor amarela, pela enzima hidrogenase succínica presente na mitocôndria da célula neoplásica, a qual adquire uma coloração violácea que é avaliada por espectrofotometria a 570nm. Nesse estudo, observamos que a sinvastatina reduziu a viabilidade celular do tumor em células de, MCF-7, MGSO-3 e MACL-1, de modo dependente da concentração (dose-dependente). Os diferentes níveis de toxicidade desencadeados pela sinvastatina foram observados para cada tipo de linhagem celular em concentrações de 0,0001 a 100 µg/mL (em escala logarítmica) (vide Figura 3A e 3B). Para comparações entre linhagens, utilizamos como parâmetro de referência, concentração de fármaco capaz de reduzir 50% da viabilidade (IC50) (Tabela 2). Em princípio, a figura 3 e a Tabela 2 parecem mostrar que a linhagem MCF-7 seria menos sensível à sinvastatina que as demais linhagens, contudo, essas diferenças não atingiram significância estatística (vide Figura 5, no tópico 4.1.1.).
Figura 3. Curva de dose resposta de doxorrubicina e sinvastatina. As concentrações usadas nesse experimento foram de 0,0001 a 100µg/mL (escala de Log10). Após 72 horas, cada linhagem celular foi incubada com MTT. O resultado foi expresso em media±SD em dois experimentos independentes (e em quintuplicatas).
Tabela 2. Valores de IC50 (µg/mL) (média ± SD) de Sinvastatina e Doxorrubicina em linhagens celulares de carcinoma mamário humano, após 72 horas.
Ao compararmos o efeito antineoplásico entre o quimioterápico convencional (doxorrubicina) e sinvastatina, vimos que a doxorrubicina ainda tem efeito citotóxico maior. Vale ressaltar, no entanto, os valores de IC50 do fármaco em estudo (sinvastatina) ficaram abaixo de 30 µg/mL (ponto de corte recomendado pelo NCI americano para reconhecimento de susbstâncias com potencial antineoplásico) (Figura 4).
MCF-7 MACL-1 MGSO-3
Doxorrubicina 0,221±0,183 0,093±0,017 0,028±0,013
Sinvastatina 5,39±0,161 1,955±2,0 2,57±2,0
Figura 4. Comparação dos valores de IC50 de Doxorrubicina e Sinvastatina em linhagens de carcinoma mamário humano (MCF-7, MACL-1 e MGSO-3). Foi realizado o teste t-student para comparar os valores de IC50 entre os tratamentos Doxorrubicina e Sinvastatina, após 72 horas (MTT), com *p<0,05.
4.1.1. Influência do subtipo molecular no efeito de diferentes
tratamentos sobre a viabilidade celular (IC50 definido pelo MTT)
Observamos que não houve diferença significante entre as linhagens celulares quanto aos valores de IC50 de Doxorrubicina e/ou Sinvastatina (Figura 5).
Figura 5. Valores médios de IC50 de doxorrubicina e sinvastatina: comparação entre linhagens. Ausência de diferenças estatisticamente significantes. As barras expressam Média + DP. Foi usada ANOVA + Bonferroni para comparar os valores de IC50 entre os subtipos moleculares, após 72 horas (MTT), com *p<0,05.
4.2. Morte celular
Para esse estudo, a análise de morte celular em MCF-7, MACL-1 e MGSO-3 foi realizada usando o ensaio de coloração nuclear Hoechst 33342 (células viáveis) e o iodeto de propídio (PI). O PI cora as células mortas que perderam a integridade da célula, pois se intercala nas fitas de DNA da célula e mostra cor vermelha quando observado sob um microscópio fluorescente. Por isso, as células mortas são identificadas pela coloração vermelha/fluorescente de iodeto de propídio, após as células terem sido tratadas com o fármaco de interesse (t=24 e 72hs). Após 24 horas de exposição dos respectivos fármacos, vimos que não houve uma redução significante no percentual de células nas três linhagens celulares. Os percentuais de células mortas ficaram em torno de 2%. Após 24 horas de exposição aos fármacos -Doxorrubicina, Sinvastatina ou a combinação Doxorrubicina+Sinvastatina- todos na respectiva concentração de IC25, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos de tratamento (Figuras 6A, 6B, 6C e 7).
Em 72 horas, vimos que as células MCF-7 e MACL-1 não foram afetadas por nenhum dos fármacos na concentração de IC25 (figuras 6D, 6E e 8). No entanto, houve redução no número de células viáveis de MGSO-3 quando tratadas com Sinvastatina. Além disso, ao compararmos os tratamentos Sinvastatina e a combinação (IC25 Doxorrubicina+IC25 Sinvastatina), observamos que houve diferença significante (Figura 6F). Essas diferenças não foram consideradas como biologicamente relevantes. Foram observadas também alterações morfológicas após a marcação com Hoechst 33342 e IP nas células, principalmente em MCF-7 e MACL-1 após 24 e 72 horas na concentração de IC25 de cada fármaco proposto, além da combinação (Figuras 7 e 8).
